JPH02197A - 単一ポリペプチド鎖結合分子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の背景） この発明は、米国特許出願番号第０９２１１０号（１９
８７年９月２日出願）および同第９０２９７１号（１９
８６年９月２日出願）の発明を含む。

これらの内容を引用して説明の一部とする。

（発明の分野） この発明は、抗体の可変領域の３次元折り畳み、それ故
その結合能および特異性を有する単一ポリペプチド鎖結
合分子に関する。またこの発明は遺伝子工学によるこれ
らの分子の製造方法も含む。

（先行技術の記載） 現代の分子生物学および免疫学の出現は、高度に再生可
能な形態および低コストでの生物学的活性材料の大量生
産の可能性をもたらした。すなわち、所望の天然蛋白質
をコードする遺伝子配列を単離し、複製（クローン）し
、適当な調節制御シグナルを有する異質宿主、例えば細
菌、酵母（または真菌）またはほ乳類セルライン培養物
中に導入する方法である。シグナルが活性化されると、
遺伝子は転写および翻訳され、所望の蛋白質を発現する
。こうして、前記の有用な生物学的活性材料、例えばホ
ルモン類、酵素類または抗体はクローンされ、異質宿主
中において発現される。

この方法に伴う問題の一つは、それが分子生物学の「−
遺伝子、−ポリペプチド鎖」原理により制限されること
である。すなわち、−遺伝子配列は単一ポリペプチド鎖
をコードする。しかしながら、多くの生物学的活性ポリ
ペプチドは２個またはそれ以上の鎖を有するアグリゲー
ト（集合体）である。

例えば、抗体は２個の重鎮および２個の軽鎖を有する３
次元アグリゲートである。同様に、例えば大きな酵素、
例えばアスパラギン酸トランスカルバミラーゼの場合、
６個の触媒鎖および６個の調節鎖を有するアグリゲート
であり、これらの鎖は互いに異なる。異質宿主において
組換えＤＮＡ技術によりかかる複合材料を製造するため
には、異なる種類のポリペプチド鎖の各々１つをコード
する遺伝子をクローンおよび発現することが必要になる
。これらの遺伝子は別々の宿主において発現され得る。

次いで、各宿主から生成したポリペプチド鎖を再アグリ
ゲートさせ、溶液中で一緒にして折り畳みを形成させな
ければならない。別法として、アグリゲートの２個また
はそれ以上のポリペプチド鎖をコードする２個またはそ
れ以上の遺伝子を同時に同じ宿主において発現させるこ
ともでき、その結果、発現後に生物学的活性を有する天
然構造への再折り畳みおよび再会合が行なわれる。しか
しながら、この方法は、幾つかの例で示された通り、多
種多様な宿主におけるポリジーンの発現を必要とする。

これらの方法は有効ではないことが判明した。

２個またはそれ以上の遺伝子を同じ有機体において発現
させる場合でも、それらの必要量を全て発現させること
は非常に困難である。

ポリジーン発現によるマルチマーポリペプチド形成の古
典的な例は、抗体の組換えＤＮＡ技術による発現である
。すなわち、重鎖および軽鎖の遺伝子を適当な宿主に導
入して発現させ、次いでこれらの個々の鎖を官能性抗体
分子として再アグリゲートさせる方法である［例えば、
ムンロ、［ネイチ＋−Ｊ（Ｎａｔｕｒｅ）、３１２巻、
５９７頁（１９８４年）、モリソン、［サイエンスＪ（
Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）、２２９巻、Ｉ２０２°（１９８５
年）、およびオイ等、［バイオテクニクスＪ（Ｂ　ｉｏ
Ｔ　ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、４巻、２１４頁（１９８６
年）、ウッド等、「ネイチャー」（Ｎ　ａｔｕｒｅ）、
３１４巻、４４６−４４９頁（１９８５年）参照］。

抗体分子は、各々重鎖および軽鎖を含む２種の一般的に
認められた領域を有する。これらの領域は、問題の特異
的抗原との結合に関与するいわゆる「可変」領域、およ
び生物学的エフェクタ一応答、例えば補体結合等に関与
するいわゆる「不変」領域である。不変領域は抗原結合
に必ずしも必要ではない。不変領域を抗体分子から分離
すると、生物学的活性（すなわち結合）可変領域が得ら
れた。

抗体の可変領域は軽鎖および重鎖から成る。軽鎖および
重鎖可変領域を異質宿主においてクローンし、発現させ
、それらの結合能を維持する［ムーア等、ヨーロッパ特
許公開第００８８９９４号（１９８３年９月２１日公開
）］。

さらに、構造がＸ線結晶学により決定されたあるクラス
の抗体およびそれらのＦａｂフラグメントは全て、異種
の場合でも、超可変セグメントにおけろ大きな差異にも
拘わらず密接に類似した可変領域を示すことがこれまで
に充分確立されている。

免疫グロブリン可変領域は、結合ループにおける突然変
異に対して寛容であると思われる。その後、超可変領域
における以外、重鎖および軽鎖の両方により決定される
抗体のいわゆる「可変」領域の殆とは事実それらの３次
元配列において全く不変である。例えば、ツーバー、「
サイエンスＪ（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３３巻、７０２−
７０３頁（１９８６年）参照。

当業界では、３次元における蛋白質の研究に関して議論
がなされ、それらの構造の修正が提案されているが［例
えば、パン・ブルントによる論文「プロティン・アーキ
テクチャー：ブザイニング・フロム・ザ・グラウンド・
アップ」、「バイオテクノロジーＪ（Ｂ　ｉｏＴ　ｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ）、４巻、２７’ｌ−２８３頁（１９８
６年４月）参照コ、多重鎖構造から単鎖構造を生成させ
る（ただ１５、単鎖構造は多重鎖アグリゲートの３次元
構造を保持するものとする）問題は、満足できる程には
取り組まれていない。

遺伝子配列の製造、それらの複製、発現制御領域との結
合、それによるベクターの形成および適当な宿主の形質
転換方法が充分に理解された技術であれば、遺伝子工学
により、抗体分子の多重鎖可変領域の特徴および結合能
を有する単一ポリペプチド鎖結合蛋白質の製造が可能で
あるということは事実上非常に有利である。

（発明の要旨） 第一にこの発明は、抗体可変領域からの２種の天然アグ
リゲート状であるが化学的に独立した軽お上び重ポリペ
プチド鎖を、２種のポリペプチド鎖から成る元の構造と
非常に類似した３次元構造に折り畳める単一ポリペプチ
ド鎖に変換させるための化学構造を決定するコンピュー
ターベースシステムおよび方法に関する。

次いでこの方法から得られた単一ポリペプチド鎖を用い
て、それをコードする遺伝子配列を製造電ることができ
ろ。次に遺伝子配列を適当な宿主において複製し、さら
に制御領域と結合させ、それが発現され得ろ発現宿主へ
形質転換することができる。再折り畳み後、生成した単
一ポリペプチド鎖結合蛋白質は、抗体の可変領域の最初
の２種（重鎖および軽鎖）のポリペプチド鎖のアグリゲ
ートの結合特性を有している。

従って、この発明は、抗体の軽鎖および重鎖アグリゲー
ト可変領域の結合特異性と実質的に類似した結合特異性
を有する単一ポリペプチド鎖結合分子を包含する。

この発明はまた、上述の単一ポリペプチド鎖をコードす
る遺伝子配列、前記遺伝子配列を含むクローニングおよ
び発現ベクター、前記ベクターにより形質転換された宿
主および前記宿主における括礎的遺伝子配列の発現によ
る前記ポリペプチドの製造方法を含む。

またこの発明は、診断、治療、インビボおよびインビト
ロのイメージング、精製並びにバイオセンサーにおける
使用を含む、結合蛋白質に関する用途を包含する。この
発明はまた、上述の診断、イメージング、精製もしくは
バイオセンサー適用において使用される固定化形態また
は検出可能なラベル形態の単鎖結合分子を包含する。こ
の発明はまた、動物、例えば人間の患者の特定部位に送
達される、単一ポリペプチド鎖結合分子と治療剤、例え
ば薬剤または特定毒素とのコンジュゲートを包含する。

先行技術によりモノクローナルもしくはポリクローナル
抗体またはその可変領域フラグメントに関して構想され
た用途は本質的に全てこの発明の分子に関して当てはま
るものと考えられ得る。

在来の抗体を凌ぐ単鎖の利点は、サイズが小さく、安定
性が高く、コストが著しく低いことである。単鎖抗体の
サイズが小さいと、体の免疫反応が抑制されるため、治
療適用の安定性および効果が高められ得る。逆に、工学
的技術により、単鎖抗体を抗原性の高いものにし得る。

安定性が高くコストが低いと、バイオセンサーおよび蛋
白質精製ソステムにおける有用性が高くなり得る。単鎖
抗体は、小さくて単純な蛋白質であるが故、さらに蛋白
質工学による修飾により、その結合アフィニティーおよ
びその特異性の両方を改善することが容易である。改善
されたアフィニティーにより診断および検出および検出
ンステムの感度は高められ、改善された特異性により観
察された不正確なボッチイブの数は減少する。

（図面の簡単な記載） 以下、特許請求の範囲で定義したこの発明についてさら
に理解を深めるため、本文および後の図面により説明を
行う。

第１図は、この発明の直列プロセッサー・モードのハー
ドウェア用のブロックダイアグラムである。

第２図は、この発明のハードウェア用の代替具体例のブ
ロックダイアグラムである。

第３図は、この発明の３段階ジェネラルステップのブロ
ックグイアゲラムである。

第１１図は、単一リンカ−態様における部位選択段階に
おけるステップのブロックダイアグラムである。

第５Ａ図は、部位選択工程の説明に使用される２種の天
然アグリゲート抗体可変領域Ｆｖポリペプチド鎖の軽鎖
りおよび重鎖Ｈを概略的に２次元で簡単ｊこ表わしたも
のである。

第５Ｂ図は、■抗体の可変領域の軽鎖Ｌ　（−−−−）
および重鎖Ｈ（−）を示す２種のアグリゲートしたポリ
ペプチド鎖の３次元的関係を２次元的に表したものであ
る。

第６Ａ図は、残基タウＩおよび残基シグマｌの位置を示
す２種のポリペプチド鎖の簡単な２次元概略図である。

第６Ｂ図は、残基タウｌおよび残基シグマｌの２種のポ
リペプチド鎖の実際の関係を２次元的に表したものであ
る。

第７図は、非常に簡単な概略的手法で、各々残基タウ■
および残基シグマＩにおける軽鎖りおよび重鎖Ｈに存在
し得る様々な部位間で可能な方向を示すリンカ−の概念
を示す。

第８Ａ図は、単鎖抗体を製造させるリンカ−１（・・）
により２種の別々の鎖（（重））および（（軽））を−
緒に結合する単鎖抗体の簡単な２次元概略図である。

第８Ｂ図は、リンカ−１を用いて２種のアグリゲートし
たポリペプチド鎖を結合することにより製造された単鎖
抗体を示す２次元表示図である。

第９図は、正確なスパンに関する候補（ｃａｎｄｉｄａ
ｔｅ）選択のブロックダイアグラムを示す。

第１０図は、Ｎ末端からＣ末端への正確な方向に関する
候補選択のブロックダイアグラムを示す。

第１１図は、ギャップ（ｇａｐ）の方向と候補の方向の
比較を示す。

第１２図は、両端における正しい方向に関する候補選択
のブロックダイアグラムを示す。

第１３図は、２リンカ−の具体例に関する部位の選択の
ブロックダイアグラムを示す。

第１４図は、候補をランク付けし得る規則の例を示す。

第１５Ａ図は、第一の結合されるべき２部位を示す、Ｆ
ｖ軽鎖りの可変領域およびＦｖ重鎖■］の可変領域を２
次元で簡単に表したものを示す。

第１５Ｂ図は、結合されるべき第二の部位が見出され得
る領域および第一対の部位の間のリンカ−を示す、Ｆｖ
軽鎖りの可変領域およびＦｖ重鎖■１の可変領域間の３
次元的関係を２次元的に表したものを示す。

第１６Ａ図は、結合されるべき第二部位が見出され得る
領域および第一対の部位の間のリンカ−を示す、Ｆｖ軽
鎖りの可変領域およびＦｖ重鎖ト■の可変領域を２次元
的に簡単に表したものを示す。

第１６Ｂ図は、結合されるべき第二部位が見出され得る
領域および第一対の部位の間のリンカ−を示す、Ｆｖ軽
鎖りの可変領域およびＦｖ重鎖１−１の可変領域間の３
次元的関係を２次元的に表したものを示す。

第１７Ａ図は、第ニリンカーおよび失われた天然蛋白質
部分を示す、Ｆｖ軽鎖りの可変領域およびＦｖ重鎖Ｈの
可変領域を２次元的に簡単に表したものを示す。

第１７Ｂ図は、第ニリンカーおよび失われた天然蛋白質
部分を示す、Ｆｖ軽鎖りの可変領域およびＦｖ重鎖■］
の可変領域間の３次元的関係を２次元的に表したしのを
示す。

第１８図は、完全な構造を示す、Ｆｖ軽鎖りの可変領域
およびＦｖ重鎖Ｈの可変領域を２次元的に簡単に表した
ものを示す。

第１９図は、この発明の並列処理モードのブロックダイ
アグラムを示す。

第２０Ａ図は、５部分（ｐｉｅｃｅ）の分子構造を示す
。最上のセグメントは長い線により結合された２個のペ
プチドで構成される。ペプチド間の間隙は１２．７Ａで
ある。各ペプチドの第１のＣはＸ軸上に存在する。２個
のドツトは各ペプチドにおける標争的基準点を示す。

ギャップの下部には、４つのリンカ−候補（標識１．２
．３および４）がアルファ炭素を結合する線により示さ
れている。全ての場合において、第１および最後から２
番目のアルファ炭素は、８゜ＯＡの間隔をおいた、Ｘ軸
に平行した線上に存する。ただし、リンカ−１における
ドツト間の空間はギャップの場合よりもかなり小さいも
のとする。

第２０Ｂ図は、ギャップの第１ペプチドと一直線に並ん
だリンカ−２，３および４の開始ペプチドを示す。明確
にするため、リンカ−をそれらの本来の位置に対して垂
直に移動させた。

ギャップの第１ペプチドからギャップの第２ペプチドへ
のベクターはＸ軸に沿って存在し、リンカ−３および４
について対応するベクターもまたＸ軸に沿って存在する
。しかしながら、リンカ−２は上方および右方を指すこ
のベクターを育するため、リンカ−２は無効である。

第２０Ｃ図は、リンカ−３および４の最初と最後のペプ
チドを構成する１０個の原子を示す（これらはギャップ
からの対応する原子に対して最小二乗性適合度を有す）
。これらのペプチドは中に描かれている。ただし、ギャ
ップおよびリンカ−４において、最後のペプチドは下方
を指し、大体紙の平面に存在する。しかしながら、リン
カ−３の場合、この最後のペプチドは下方および左を指
し、約９０度回転しているため、カルボニル酸素は観察
者の方を指す。すなわちリンカ−３は無効である。

ＢおよびＣ部分は、準備された標準的立体観察背により
観察され得るステレオダイアダラムである。

第２１図は、マウス抗うｊ、成長ホルモン（ＢＧｌ−１
）モノクローナル抗体の重鎖に関する配列のヌクレオチ
ド配列および翻訳を示す。

第２２図は、第２１図の場合と同じモノクローナル抗体
の軽鎖に関する配列のヌクレオチド配列および翻訳を示
す。

第２３図は、第２１図および第２２図に示された可変重
鎖配列（ｐＧＸ３７７２）を含むプラスミド制限酵素地
図および可変軽鎖配列（ｐＧＸ３７７３）を含むプラス
ミド制限酵素地図である。

第２４図は、この発明の方法に従い製造された単一ポリ
ペプチド鎖結合蛋白質のヌクレオチド配列およびその翻
訳配列を含む構造のＴＲＹ４０を示す。

第２５図は、単鎖結合蛋白質を携える発現ベクターｐＧ
Ｘ３７７６の制限酵素地図を示す（その配列は第２４図
に示されている）。これおよび後続のプラスミド地図に
おいて（第２７図および第２９図）、斜線部分はプロモ
ーターＯＬ　／　ＰＲ配列を表し、塗り潰した部分は重
鎖可変領域配列を表す。

第２６図は、この発明の別の単鎖結合蛋白質、ＴＲＹ６
１の配列を示す。

第２７図は、第２６図に示された遺伝子配列を携える発
現プラスミドｐＧＸ４９０４を示す。

第２８図は、この発明の別の単鎖結合蛋白質、ＴＲＹ５
９の配列を示す。

第２９図は、第２８図に示された遺伝子配列を（Ｊ（え
る発現プラスミドｐＧＸ４９０８を示す。

第３０Ａ、３０１３．３０Ｃおよび３０Ｄ（立体）図は
、実施例Ｉにおいて詳細に説明されている、二重結合の
単鎖抗体ＴＲＹ４０の設計および構造を示す。

第３１Ａおよび３１Ｂ（立体）図は、実施例２において
詳細に説明されている、単一結合の単鎖抗体ＴＲＹ６１
の設計および構造を示す。

第３２’Ａおよび３２Ｂ（立体）図は、実施例３におい
て詳細に説明されている、単一結合の単鎖抗体ＴＲＹ５
９の設計および構造を示す。

第３３図は、実施例４において説明されており、ＴＩＩ
ＹＩ０４ｂの配列を示す。

第３４図は、単一リンカ−構造を有する発現ベクターｐ
ＧＸ４９１０の制限酵素地図を示す（その配列は第３３
図に示されている）。

第３５図は、ストリップｌがＴＲＹ６１を表し、ストリ
ップ２がＴＲＹ４０を表す、Ｂ　Ｇ　Ｈ結合活性に関す
る検定結果を示す。

第３６図は、実施例４において説明されており、ＴＲＹ
５９蛋白質と３Ｃ２モノクローナルのＦａｂ部分のきっ
抗結果を示す。

第３７図は、単鎖結合分子のうし成長ホルモンセファロ
ース（ＢＧＨ−セファロース）との結合能力を示す。

第３８図は、ＢＧＨ結合に関するこの発明の単鎖結合分
子とのＦａｂ抗体フラグメントのきっ抗能力を示すきっ
抗血線を表す。

第３９．４０および４１図は、単鎖結合分子、各々１８
−２−３／ＴＲＹ　２０２’、ｌ　８−２−３／ＴＲＹ
５９および４−４−２０／ＴＲＹ２Ｏ２’のアミノ酸お
よびヌクレオチド配列を示す。

第４２図は、４−４−２０モノクロ一ナル抗体（Ａ）、
この抗体から製造されたＦａｂフラグメント（Ｉ３）お
よび４−４−２０／ＴＲＹ２Ｏ２’蛋白質（Ｃ）と結合
したフルオレスセインの吸収プロフィールを示す。

［好ましい具体例の詳細な記載］ （目録） １．概要。

■、ハードウェアおよびソフトウェア環境。

■、単一リンカー具体例。

Ａ、有望な（ｐｌａｕｓｉｂｌｅ）部位選択。

Ｂ、候補の選択。

１、Ｎ末端およびＣ末端間の適切な距離による候補の選
択。

２、Ｎ末端およびＣ末端からの適切な方向による候補の
選択。

３、末端間の適切な配向による候補の選択。

Ｃ１候補のランク付けおよび削除。

■、二重および多重リンカ−具体例。

Δ、有望な部位選択。

Ｂ、候補選択および候補拒絶段階。

■、並行処理具体例。

■、遺伝子配列の製造および発現並びに用途。

１、ｖ！１要 第−にこの発明は、所定の抗体可変領域からの天然アグ
リゲート状であるが化学的に独立した２種の重および軽
（ＨおよびＬ）ポリペプチド鎖を、２種のポリペプチド
鎖から成る元の構造と非常に類似した３次元構造に折り
畳める単一ポリペプチド鎖に変換し得ろ化学構造（リン
カ−）を決定および表示するコンピューターベースシス
テムおよび方法に関する。以下、この最初の構造を１天
然蛋白質」と称する。

この発明の３つのジェネラル・デザイン・ステップの第
１ジエネラル・ステップは、結合される有望な部位の選
択を含む。単一リンカ−の場合、基準を用いて２種のポ
リペプチド鎖（可変領域のトＩおよび■、）の各々にお
ける有望な部位を選択すると、その結果１）天然蛋白質
鎖からの残基の最小の喪失および２）安定性に関する必
要性と両立し得る最少数のアミノ酸を有するリンカ−が
もたらされる。一対の部位は架橋または結合されるべき
ギャップを画定する。

単一リンカ−が２つの面記目標を達成し得ない場合、２
またはそれ以上のリンカ−による方法が採用される。単
一リンカ−による場合および２またはそれ以上のリンカ
−による場合の両方？こおいて、第２ジエネラル・ステ
ップにおける使用に対して１個より多いギャップが選択
され得る。

この発明の第２ジエネラル・ステップは、データベース
を調べて、第１ジエネラル・ステップにおいて選択され
た有望なギャップを満たし得るリンカ−を決定すること
を含み、その結果第３ジエネラル・ステップ用に候補が
登録され得る。具体的には、データベースは３次元構造
が既知である多数のアミノ酸配列を含む。第２ジエネラ
ル・ステップでは、このデータベースを調べることによ
り、どのアミノ酸配列かギャップ（複数もあり得る）に
架橋して天然（すなわち最初のアグリゲート）可変領域
分子の３次元特性の大部分を保持する有望な−ポリペプ
チド構造を生成し得るかを見出す。

可能な各リンカ−の試験が３つのジェネラル・サブステ
ップで行なわれる。第１ジエネラル・サブステップは可
能な候補の鎖長を利用する。

具体的には、候補のスパンまたは長さ（スカラー虫）を
各ギャップのスパンと比較する。候補の長さおよびいず
れか１つのギャップのスパン間の差が選択された量未満
である場合、この発明ではこの候補に関して第２ジエネ
ラル・サブステップを続行させる。第２０Ａ図は、１つ
のギャップおよび４つの可能なリンカ−を示す。第１リ
ンカ−については、そのスパンがギャップのスパンと全
く異なるため、第１ジエネラル・サブステップは行われ
ない。

第２ジエネラル・サブステップ、すなわち方向に関する
サブステップでは、候補の開始ペプチドを各ギャップの
開始ペプチドと並べる（ａｌ　ｉｇｎ）。

具体的には、候補の開始ペプチドにおける選択された数
の原子を回転させ、剛体として翻訳し、各ギャップの開
始ペプチドにおける対応する原子に最も良い状態で適合
させる。候補リンカ−の開始ペプチドから候補リンカ−
の終止ペプチドへの３次元ベクトル（いわゆるリンカ−
の方向）を、各ギャップの開始ペプチドから同ギャップ
の終止ペブヂドーの３次元ベクトル（いわゆるギャップ
の方向）と比較する。これら２つのベクトルの端部が互
いの前以て選択された距離内に入る場合、この発明では
この候補リンカ−に関して第２ジエネラル・ステップの
第３ジエネラル・サブステップを続行させる。

第２０１３図は、１つのギャップおよび３つのリンカ−
を示す。リンカ−は全て正しいスパンを有し、開始ペプ
チドは一直線に並べられている。第２リンカ−について
は、その方向がギャップの方向と全く異なるため、第２
ジエネラル・サブステップは行なわれない。他の２種の
リンカ−については、第２ジエネラル・ステップの第３
ジエネラル・ザブステップを続行さける。

この発明の第２デザイン・ステップの第３ジエネラル・
サブステップでは、各リンカ−の末端ペプチドの配向を
各ギャップの末端ペプチドの配向と比較する。具体的に
は、候補の開始ペプチドから選択された数の原子（３，
４または５、好ましい具体的では５）十候補の終止ペプ
チドから同じく選択された数の原子（３，４または５、
好ましい具体的では５）を剛体とする。ギャップの１っ
からの対応する原子（すなわち、開始ペプチドから５お
よび終止ペプチドから５）を第２剛体とする。これら２
種の剛体を最小２乗法適合（ｆｉｔ）により重ね合わせ
る。この適合度の誤差が前以て選択された値未満である
場合、候補は第２ジエネラル・ステップの第３ジエネラ
ル・サブステップを通過し、この発明の第３ジエネラル
・ステップに進められる。誤差が前以て選択された値と
等しいかそれを越える場合、次のギャップを試験する。

全ギャップを試験した結果充分良好な適合度を見出せな
かった場合、候補を切り捨てる。

この発明の第３ジエネラル・ステップでは、有望性の最
も高いしのから低いものまで、リンカ−候補のランクづ
けを行う。最も有望性の高い候補は、ギャップの１つの
有望な２部位を架橋して単一ポリペプチド鎖を形成し得
るフラグメントである。ただし、この架橋は、２種の最
初から化学的に異なる鎖のアグリゲートの天然折り畳み
から形成された単一ポリペプチド鎖の３次元折り畳みを
歪めることは殆どない。

この発明のボｊ記第３ジェネラル・ステップにおいて、
専門的オペレーターは、会話形コンピューターーグラフ
ィックス方法を用いることにより、最ら有望性の高いも
のから低いものまでリンカ−候補のランクづけを行う。

このランクづけは、天然蛋白質の全保持部分を有するリ
ンカ−候補間の相互作用を観察することにより行なわれ
る。このランクづｌすには一連のルールを用いる。これ
らのエキスパート・システムのルールはシステム中に組
込まれ得ろため、リンカ−は、使用されたエキスパート
・システムのルールをそれらが満足させた後のみ表示さ
れる。

この発明はプログラム化され得るため、ある種のエキス
パート・ルールを第３ジエネラル・ステップの第１ジエ
ネラル・サブステップとして使用するごとにより、専門
オペレーターによる視覚検分以前に候補のランクづけを
行い、不適当な候補を削除することができる（すなわち
第３ジエネラル・ステップの第２ジエネラル・サブステ
ップとなる）。これらのエキスパート・ルールは、最も
有望性の高いものから低いものまで候補をランクづけす
る際に専門的オペレーターの助けとなる。これらのエキ
スパート・ルールは、この発明のシステムおよび方法に
より製造されたリンカ−に関する実験データに基づいて
修正され得る。

最も有望な候補は、リンカ−の無作為選択が行なわれた
場合に製造されたしのよりも、抗体可変領域の重鎖およ
び軽鎖で構成される最初の構造と非常に類似した３次元
構造への折り畳みの確率がかなり顕著に高い（無作為選
択と比べて１００万またはそれ以上）遺伝学的に生成可
能な単一ポリペプチド鎖結合分子である。こうして、こ
の発明のコンピューターベースシステムおよび方法を利
用して、天然アグリゲート状態であるが化学的に異なる
ポリペプチド鎖を所望の単鎖に変換する１種またはそれ
以上のリンカ−を使用することにより単一ポリペプチド
鎖を製造することができろ。

選ばれた候補は、無作為選択処理を用いて得られる場合
よりも正しい折り畳みの確率がかなり顕著に高い結合鎖
構造を使用者に提供する。これは、遺伝子工学により実
際に処理されるべき候補の数が相当ｍ減少するため、所
望の単一ポリペプチド鎖を製造する遺伝子工学面が著し
く抑えられることを意味する。最ら存留な候釉を用いて
実際の分子を遺伝子工学的に処理することができる。

様々な候補のパラメータは後の使用に備えて記憶され得
る。それらはまた、適当な媒介手段（紙、磁気テープ、
カラースライド等）に可視化または記録された状態で使
用者に提供され得る。設計工程で使用された様々なステ
ップの結果もまた後の使用または検査に備えて記憶され
得ろ。

この発明の設計段階は、アミノ酸配列構造データベース
、使用される様々な適用プログラムおよび評価されてい
る可能なリンカ−候補のパラメーターを記憶し得る記憶
装置を有する常用のミニコンピユータ−・システムで行
なわれる。

ミニコンピユータ−ＣＰＵを適当な直列処理構造により
会話形コンピューター・グラフィックス・デイスプレィ
システムと接続する。一般的には、会話形コンピュータ
ーーグラフィックス・デイスプレィ・システムは、常駐
３次元適用ソフトウェアおよび付随した入出力装置を有
するデイスプレィ端末、例えばＸ／Ｙプロッター、位置
制御装置（ポテンショメーター、Ｘ−ｙタブレットまた
はマウス）およびキーボードを何する。

会話形コンピューターーグラフィックス・デイスプレィ
・システムにより、専門オペレーターはこの発明の設計
工程において評価されている化学構造を見ることができ
る。グラフィックスおよびプログラムを用いてギャップ
を選択しくジェネラル・ステップｌ）、候補のランクづ
けを行う（ジェネラル・ステップ３）。本質的に、それ
は、単一リンカ−による具体例の場合も２種またはそれ
以上のリンカ−による具体例の場合も同じ方式で処理す
る。

例えば、この発明の第１ジエネラル・ステップの間、コ
ンピューター−グラフィックス会話形デイスプレィ・シ
ステムにより、専門オペレーターは、天然アグリゲート
状態であるが化学的には異なる２種のポリペプチド鎖を
可視的に表示することができる。コンピューター−グラ
フィックス・デイスプレィ・システムに常駐された３次
元ソフトウェアを用いると、２種の異なるポリペプチド
鎖の可視的表示を思い通りに操作することができる。例
えば、観察されている鎖（複数も可）の部分は電子工学
的に拡大され得、この拡大はズームモードで実施され得
る。逆に、画像を縮小することもでき、この縮小もまた
リバース・ズームモードで行なわれ得る。分子の部分の
位置を翻訳することが可能であり、表示された分子を３
本の軸（ｘ、　ｙおよび２）のいずれか１つを中心に回
転させることができる。

鎖における特定原子は電子ポインターにより選択され得
る。選択された原子は適当なテキストによりラベルされ
得る。天然蛋白質またはリンカ−の特定部位は、色また
はテキストまたは明るさにより確認され得る。鎖の不要
部分を表示されている画像から削除することにより、鎖
（複数も可）の選択曲のみを表す可視画像を専門オペレ
ーターに提供することができる。指示または名称により
選択された原子を３次元デイスプレィの中心に置くこと
ができる。後続ローテーションはオリジンとして選択さ
れた原子を用いる。これらおよび他のデイスプレィ面は
、構造設計工程の遂行能力を高める鎖の部分の可視表示
能力を専門オペレーターに提供する。

この発明の一方法は連続的コンピューター構造を利用す
る。この装置を用いる前記構造は、ギャップの特定選択
を目的とする３つのジェネラル・ステップにおいて要求
される様々な操作を遂行するために約４〜６時間の機械
およびオペレーター時間を必要とする。明らかに、その
時間のかなりの部分はコンピューター・システムによる
必要なコンピューター・ステップの遂行に要する時間で
あるため、時間を著しく減らすことが望ましい。

この発明の別の方法は並行処理構造を利用する。

この並行処理構造は必要なコンピューター・ステップの
遂行に要する時間を著しく減少させる。多数のノードを
有するハイパーキューブを用いることにより、選択され
た部位において可能な様々なリンカ−を迅速にエキスパ
ート・システム・オペレ−ターに提出して評価させるこ
とができる。

２００〜３００の既知蛋白質構造が存在するため、並行
処理方法が利用され得る。最近では、１０２４　個もの
コンピューターノードを有するコンビコーターが市販さ
れている。

並行処理方法を使用すると、観察されたペプチド構造の
データベースを存在するコンピューターノードと同じ多
くの部分に分割することができる。

例えば、各々２１９個のアミノ酸を有する１９５の蛋白
質の構造が存在する場合、１９５ｘ２１８のジペプチド
、＋９５Ｘ２１７のトリペプチド、＋９５Ｘ２＋６のテ
トラペプチド等の構造が存在することになる。ある鎖長
ｎ以下のペプチドが全て抜粋され得る。例えば、ｎが３
０である場合、１９５ｘ３０ｘ２０４のペプチドが存在
する。

勿論、蛋白質の長さは多様であるが、平均鎖長２００（
例）を有する蛋白質は１ｏＯＸ４００存在し、アミノ酸
３０個以下（または他に妥当な数があればその数）の長
さのペプチドリンカ−の場合、１ｏｏｏｏｏｏ〜４００
００００ペプチド構造が存在する。−旦ペブチドが抜粋
され、それらが由来する蛋白質によりラベルされろと、
使用可能なコンピューター・ノード間で可能な限り均等
に全ペプチドを自由に分割することができる。

並行処理方法の操作は以下の通りである。既知ペプチド
のデータベースを使用可能なノード間に分割する。各ギ
ャップを全ノードに送る。各ノードはギャップを受は入
れ、それに割り当てられたペプチドに対してそれを試験
し、ギャップに適合するため候補リンカ−であるペプチ
ド全てに関する情報を返す。ペプチドおよびギャップを
突き合わせる試験が各ノードにおいて独立して進行する
ため、探索はノード数に等しい因子によりさらに速く進
む。

この発明の第１態様では、単一リンカ−を用いることに
より、天然アグリゲート状であるが化学的には異なる重
鎖および軽鎖を、２種のポリペプチド鎖から成る元の構
造に非常に類似した３次元構造に折り畳める単一ポリペ
プチド鎖に変換ずろ。

第２態様では、２種またはそれ以上のリンカ−を用いる
ことにより、２種の重鎖および軽鎖を所望の単一ポリペ
プチド鎖に変換する。この発明を用いるこれらの態様の
各々に伴う段階を下記説明で明らかにする。

一旦単鎖結合蛋白質の正確な配列がコンピューター補助
方法により定められると、当技術分野の熟練台によく知
られている方法により、それをコードする基礎的遺伝子
配列を製造することが可能である。

この遺伝子配列を製造する場合、新たに完全な配列を合
成することにより合成りＮＡを使用することが可能であ
る。別法として、記載の通り、所望の抗体の軽鎖および
重鎖のある保存部分をコードするｃＤＮＡ配列を得、ペ
プチドリンカ−をコートする必要な配列の手段によりそ
れらを一緒にスプライソングすることが可能である。

また当業界で公知の方法により、生成した配列は、良く
知られたクローニング・ベクターおよび良く知られた宿
主を用いることにより増幅され得る。さらに、増幅され
た配列は、正確さをチエツク後、プロモーターおよびタ
ーミネータ−・シグナルに結合され、適当な発現ベクタ
ーに挿入され、宿主（例、原核生物または真核生物宿主
）に形質転換され得る。細菌、酵母（または池の真菌）
またはほ乳類細胞が使用され得る。それ自体または融合
ポリペプチドの一部として発現後、別に当業者に知られ
ている通り、単鎖結合蛋白質を適当な条件のｐＨ，イオ
ン強度、温度およびレドックス・ポテンシャルで生理学
的溶液中において再び折り畳ませ、標準的精製方法によ
り精製する。これらには当業者に公知の様々な異なるタ
イプのクロマトグラフィーが含まれる。

こうして得られた精製単鎖結合蛋白質は、診断、イメー
ジング、バイオセンサー、精製並びに治療用途および組
成物において、それ自体、検出可能なラベル形態、固定
化形態または薬剤もしくは池の適当な治療剤とコンジュ
ゲートした状態で使用され得る。本質的に、抗体または
その可変領域フラグメントに関して予見される用途は全
てこの発明の分子に当てはまるものと考えられ得る。

Ｉ＋　、ハードウェアおよびソフトウェア環境この発明
のハードウェア而のブロックダイアグラムを第１図に示
す。中央処理装置（ＣＰＵ）＋０２を第１バス（マスバ
ス１０４と称す）および第２バス（ユニバス＋０６と称
す）に接続する。ＣＰＵ１０２に適した形態は、マサチ
ューセッツ、メイナードのディジタル・エクイップメン
ト・コーポレーション製造のパックス（ＶａＸ）ｌ　Ｉ
　／７８０モデルである。しかしながら、適当なタイプ
のＣＰＵであれば全て使用され得る。

バス１０４はＣＰＵＩＯ２を複数の記憶装置に接続する
。最善の方法では、これらの記憶装置はテープ・ドライ
ブ・ユニット１０６を含む。テープ・ドライブ・ユニッ
ト＋０６を用いて、例えばその３次元構造が既知である
アミノ酸配列のデータベースをシステム中にロードする
ことができる。

テープ・ドライブ１０６に適した形態は、ディジタル・
エクイブプメント・コーポレーション製モデルＴＵ７８
ドライブであり、これは１２５インチ／秒の速度で作動
し、＋６００−６２５０ビット／インチ（ＢＰＩ）のデ
ュアル・キャパシティーを有する。しかしながら、適当
なタイプのテープ・ドライブであれば全て使用され得る
。

別の記憶装置は、参照番号＋０８により一般にラベルさ
れた一対のハードディスク装置である。

ディスク・ドライブ１０８に適した形態には、例えば１
デイスク当たり２５６メガバイトの記憶容量を有する、
２種のディジタル・エクイップメント・コーポレーショ
ン製Ｒｍ０５デイスク・ドライブがある。別のディスク
・ドライブ・システムもまた連続処理モードで提供され
、参照番号１１０によりラベルされている。このディス
ク・ドライブ・システムもまたバス１０４によりＣＰＵ
ＩＯ２に接続される。ディスク・システム１１０に適し
た形態には、例えばＩディスク当たり４５０メガバイト
の記憶容量を有する３種のディジタル・エクイップメン
ト・コーポレーション製モデルｎａ８１ハードデイスク
ドライブがある。

ダイナミック・ランダム・アクセス・メモリーらまた、
バス＋０４によりＣＰＵＩＯ２に接続されたメモリー・
ステージ１１２により提供される。

適当なタイプのダイナミック記憶装置であれば全て使用
され得る。連続処理モードでは、記憶装置は、Ｄ　Ｅ　
ＣモデルＥｃｃ記憶装置において使用されている複数の
半導体記憶装置で構成される。適当なタイプのダイナミ
ック記憶装置であれば全て使用され得る。

ディスク・ドライブ＋０８および１１０は、幾つかの異
なるブロックの情報を記憶する。例えば、それらは、テ
ープ・ドライブ１０６により読み込まれるアミノ酸配列
および構造を含むデータベースを記憶する。それらはま
た、この発明の手順に従いデータベースを探索するのに
必要なアプリケーション・ソフトウェア・パッケージを
記憶する。

またそれらは、ソフトウェアのドキュメンテーションお
よび実行可能プログラムを記憶する。この発明により製
造され、構造的に検査される仮定的分子は、データベー
スにおいて蛋白質構造を表すのに使用されるフォーマッ
トと同じフォーマットで表される。このフォーマットを
用いて、これらの仮定的分子もまた、構造設計工程間の
使用および前記工程完了後の後続使用を目的として、デ
ィスク・ドライブ１０８および１１０により記憶される
。

ディジタル・エクイップメント・コーポレーション製Ｖ
ＡＸ／ＶＭＳ　　ＤＥＣオペレーティング・システムは
、多くの利用者に使用され得、ファイル・システムの完
全さを保証する。それは、プログラマ−が使用される記
憶１について心配しないで済む仮想記憶装置を提供する
。最初のソフトウェアは、ＶＡＸ／ＶＭＳオペレーティ
ング・システムのバージョン３．０〜３．２の下で開発
された。

最近では連続処理モードはバージョン４．４に基づいて
作動している。ＤＥＣエディターおよびＦＯＲＴＲＡＮ
コンパイラ−が使用された。

ＣＰＵ　Ｉ　０２をバス１０６によりマルヂブレクサー
１！４に接続する。マルチプレクサ−は、複数の装置を
バス１０６によりＣＰＵ１０２に接続させ得る。マルチ
プレクサ−１１４に適した形態は、ディジタル・エクイ
ップメント・コーポレーション製モデルＤｚ１６ターミ
ナル・マルチプレクサ−である。好ましい具体例では、
これらのマルチプレクサーのうち２種が使用される。マ
ルチプレクサ−１１４は、ターミナル（第１図では示さ
れていない）およびダッシュ線を引いたボックス１１６
により示されたコンピューター−グラフィックス・デイ
スプレィ・システムへの連続転送（例えば、１９．２キ
ロボーて）をサポートする。

コンピューター−グラフィックス・デイスプレィ・シス
テム１１６は電子ステージ＋１８を含む。

電子ステージ１１８は、ＣＰＵ　１０２により製作され
た視覚画像を受は入れる場合およびデイスプレィ（一般
的には！インポルピングカラー月２０で利用者へそれを
表示する場合に使用される。コンピューター−グラフィ
ックス・デイスプレィ・システム１１６の付随サブシス
テムと接続された電子ステージ１１８は、下記の通り特
定機能の局所制御を備える。電子システム１１Ｂの適当
な形態は、ユタ、ツルトレークシティーのエバンス・ア
ンド・サザーランド・コーポレーション製のＰＳ３２０
モデルである。デイスプレィ１２０に適した形態は、エ
バンス・アンド・サザーランド製の２５インチ・カラー
モニターまたは１９インチ・カラーモニターである。

ダイナミック・ランダム・アクセス・メモリー１２２を
電子ステージ１１８に接続する。メモリー１２２は、電
子システム１１８による下記画像の局所制御の提供を可
能にする。さらに、常用デザインのキーボード＋２４を
、に／ｙタブレット１２６および複数のダイアル１２８
と同様、電子ステージ１１８に接続する。連続処理モー
ドにおけるキーボード１２４、ｘ／ｙタブレット１２ｆ
３およびダイアル１２８もまた、エバンス・アンド・サ
ザーランドから人手される。

上記のコンピューター生成グラフィックス・システム１
１６は、ＣＰＵ　Ｉ　０２から表示されるべき画像を受
は取る。それは表示された画像に対する局所制御を提供
するため、所望の特定利用者開始機能が遂行され得る。

例えば次の通り。

（１）ズーム（表示されている画像のサイズを拡大また
は縮小するため）、 （２）クリッピング（表示されている画像の側部、面部
または後部が除去される）、 （３）明暗度深度キューイング（見る人からさらに遠い
対象を減光させろことにより、表示されている画像にお
いて望ましい深度効果を与える）、（４）表示されてい
る分子のプロッティングに使用される対応システムの３
軸のいずれか１つにおける画像の翻訳、 （５）表示されている画像の３方向のいずれか１方向に
おける回転、 （６）画像の論理セグメントのオン／オフ式制御。

例えば、天然蛋白質のアルファ炭素を結ぶ線は一つの論
理セグメントであり得る。天然蛋白質の残基の一部また
は全部におけるラベルは、第２論理セグメントであり得
る。リンカ−（複数もあり得る）のアルファ炭素のトレ
ースは第３セグメントであり得る。さらに天然蛋白質の
リンカ−（複数もあり得る）および隣接残基の炭素、窒
素、酸素および硫黄原子を結合する棒線画は第４論理セ
グメントであり得る。利用者が一度にこれらの全てを見
たいと思うことは殆ど無い。むしろまず低倍率で最初の
２つのセグメントを見ることにより、オペレーターは正
しい判断を行う。次いでラベルを消し、リンカ−炭素ト
レースを出す。−旦リンカーの全体像を見ると、オペレ
ーターは高倍率に拡大し、さらに詳細に処理するセグメ
ントに切り替える。

（７）最も詳細な論理セグメントにおける原子の選択。

現代グラフィックスの力にも拘わらず、オペレーターは
たちまちあまりの詳しさに圧倒され得る。すなわち、オ
ペレーターは１個の原子を選び、その原子の半径、一般
的には６オングストローム（ただし、他の半径ら使用さ
れ得る）の範囲内のアミノ酸全部を見ようとする。利用
者はまた、選ばれた原子の特定半径内に含まれるアミノ
酸に加えて、ある種のアミノ酸か含まれることを条件と
して述べ得る。

（８）表示されている画像の様々な部分の色を変えるこ
とにより、ビジュアル・キューイングを用いて見る人に
特定の情報を示すことができる。

上述の通り、最近この発明の連続処理モードは、ＣＰ　
Ｕ　Ｉ　０２と共に使用されるＶａｘ／Ｖｍｓオペレー
ティング・システムのバージョン４．４に基づくアプリ
ケーション・ソフトウェアを使用している。アプリケー
ション・プログラムは、オレゴン、ニージーン、オレゴ
ン大学のテリー・バイヤーにより１９７４年に書かれた
ＦＬＥＣＳ（フォートラン・ランゲージ・ウィズ・エク
ステンディブド・コントロール・セクションズ）プログ
ラム言語を用いてプログラム化された。ＦＬＥＣＳｊよ
フォートラン・プレプロセッサ−であり、これはさらに
論理的なプログラミングを可能にする。連続処理モード
で使用されたコードは全てＦＬＥＣＳで開発された。し
かしながら、この発明は他のオペレーティング・システ
ムおよびプログラム言語を包含するものとする。

コンピューター−グラフィックス・デイスプレィ・シス
テム１１６のカラーデイスプレィ１２０で表示された巨
大分子は、ＦＲＯＤＯのバージョン５．６の大規模に修
正されたバージョンを利用する。ＦＲＯＤＯは巨大分子
の表示および操作プログラムである。ＦＲＯＤＯは、蛋
白質結晶学における組立およびモデル作成を目的として
、における西ドイツ、ミュンヘン、マックス・ブランク
・インスティテユート・フォー・バイオケミストリーで
ジョーンズにより書かれた。ＦＲＯＤＯバージョン５．
６は、コマンド・ファイルにより駆動されるように修正
された。次いでプログラムを書いてコマンド・ファイル
を作成した。それは電子ステージ＋１８により使用され
、カラーデイスプレィ１２０上の画像を表示および操作
する。やはり適当なタイプのプログラムであれば全て、
巨大分子の表示および操作に使用され得、その座標はＣ
ＰＵＩＯ２によりコンピューター−グラフィックス・デ
イスプレィ・システム！！６に提供され設計文書化およ
びメモは、カリフォルニア、パサデナのカイン・ファー
バー・アンド・ゴートンからのＰＤＬ（プログラム・デ
ザイン・ランゲージ）を用いて書かれた。やはり、適当
なタイプのプログラムであれば全て設計文書化およびメ
モに使用され得る。

第２図は、この発明のハードウェア・システムの改良バ
ージョンに関するブロックダイアグラムを示す。同番号
は第１図の同項目を示す。第１図の連続処理モード・シ
ステムおよび第２図の改良システム間の違いのみを後述
する。

ＣＰＵ１０２’は、ディジタル・エクイップメント・コ
ーポレーション（ＤＥＣ）製のＶａｘｌｌ／７８０の最
新バージョンである。ＶＡＸ製品系におけろＤＥＣ製の
最新処理装置は、第１図の連続処理モードに示されたバ
ージョンよりら約１０倍速い。

第１図の２つのＲｍｏ　５デイスク・ドライブ１０８の
代わりに、第２図の具体例は５つのＲＡ８１ディスク・
ドライブ・ユニット１１０°を使用している。これは、
現在のシステムをさらに上のステートのアート・ディス
ク・ドライブ・ユニットに向上させるためであり、その
結果記憶能力が大きくなり、アクセスも速くなる。

連続処理装置１０６をコンピューター−グラフィックス
・デイスプレィ・システム＋１６の電子ステージ１１８
°に直接接続する。第２図の具体例における並列インタ
ーフェースは、第１図の連続処理モードの連続インター
フェース方法に取って代わるものである。これにより、
ＣＰＵＩＯ２゜および電子ステージｔｔＳ°間のインク
ラクションが速くなるため、専門オペレーターへのデー
タ表示を速くすることができる。

カラー・デイスプレィ１２０の前にステレオ・ビューア
−２０２゛を配置する。ステレオ・ビューア−２０２゛
の適当な形態は、ユタ、ツルトレークシティーのテラビ
ットにより製造されている。

ステレオ・ビューア−２０２°は、現在分子の回転によ
り達成され得るものよりも優れた３−Ｄ知覚対象を専門
オペレーターに提供する。

さらに、この具体例は、ＦＲＯＤＯ巨大分子デイスプレ
ィ・プログラムの代イつりに一連の関連した仮定的分子
を示すべく設計されたプログラムを用いろ。

この新しいプログラムがさらに速くオペレーションを遂
行する結果、関連した仮定的分子が充分短時間で専門オ
ペレーターに提示され得るため、オペレーターにとって
検査は以前より面倒なものではなくなる。

プログラムを修正することにより、明確な規則が製作さ
れる構造により破られていたこの発明の第２ジエネラル
・ステップにおいて候補の削除が可能になる。例えば−
規則は、リンカ−における原子が天然構造における原子
に１オングストロームよりも近付く場合、候補は自動的
に削除されるというものであり得る。

さらに、分子の表面接近能が測定され得、溶媒と接触し
ている疎水性残基に基づいたスコアが測定され得る。疎
水性残基を計算した後、候補をランク付けすることによ
り、望ましくない候補は自動的に削除され得る。蛋白質
は、この発明において一切周囲の問題を伴わずに設計さ
れる。蛋白質は殆ど常に水溶液中に存在する。事実、蛋
白質結晶は、蛋白質分子間の空間を満たす２０％〜９０
％の水分および溶解塩分を含む。ある種のアミノ酸は、
水溶液と好ましい相互作用を起こす側鎖を有しくセリン
、トレオニン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アス
パラギン酸、グルタミン酸、プロリン、アスパラギンお
よびグルタミン）、いわゆる親水性である。他のアミノ
酸は、非極性で水と望ましくない相互作用を起こす側鎖
を有しくフェニルアラニン、トリプトファン、ロイシン
、イソロイシン、バリン、メチオニンおよびチロシン）
、いわゆる疎水性である。天然蛋白質では、現水性アミ
ノ酸は、溶媒と接触して、殆ど常に表面上に存在する。

疎水性アミノ酸は、殆ど常に他の疎水性アミノ酸と接触
して蛋白質の内側に存在する。

残りのアミノ酸（アラニン、グリシンおよびシスティン
）は、蛋白質の内側およびそれらの表面上の両方に存在
する。この発明の設計は、可能な限り天然蛋白質と似て
いるべきであり、従って可能な限り疎水性残基を内側に
配置し、親水性残基を外側に配置する。

プログラムをｆｌ用して各仮定構造に関するエネルギー
を算出することができろ。さらに、プログラムに仮定分
子に対する局所調節を行わせることにより、エネルギー
を最小限にすることができる。

最後に、分子力学を用いて仮定分子の特に不安定な部分
を確認することができろ。存在するプログラムは各仮定
構造について名目的エネルギーを計算することはできろ
が、前記計算が折り畳める配列および折り畳めない配列
間の区別をし得ろことはまだ立証されていない。エネル
ギー最小限化ら現存プログラムにより達成され得るが、
エネルギー最小限化もまた、折り畳める配列および折り
畳めない配列間の区別をすることはできない。最近の分
子力学シミュレーションでも、蛋白質の実際の折り畳み
または折り畳み解除を刺激するのに充分なほど長くは継
続され得ないため、安定および不安定分子間の区別をす
ることはできない。

コンピューター生成デイスプレィ・システム１１６にお
ける２メガバイトの記憶装置１２８°を加えることによ
り、幾つかの異なる分子がデイスプレィ・レベルで記憶
され得る。次に、これらの分子はカラー・デイスプレィ
１２０においてあちこちに切り換えられ得るため、専門
オペレーターは、専門的決定をしながら連続してそれら
を見ることができる。第２図に示されている並列インタ
ーフェースにより、座標はＣＰＵ　Ｉ　Ｏ２°からコン
ピューター生成デイスプレィ・システム１１６の電子ス
テージ１１８°へ速く移動され得る。

この発明の並列処理構造の具体例を■部において後述す
る。この並列構造の具体例は一層速い分析および表示を
提供する。

■、単一リンカー具体例 本発明のこの第１具体例は、単一リンカ−を用いて天然
アグリゲート状態ではあるが化学的に異なる重鎖および
軽鎖ポリペプチド鎖を、２種のポリペプチド鎖から成る
最初の構造に非常に類似！−た３次元構造に折り畳める
単一ポリペプチド鎖に変換ずろことができろ化学構造を
決定および表示するものである。

Ａ、有望な部位の選択 第３図の非常に一般化されたブロックダイアグラム・フ
オームに示されたこの発明の有望な部位の選択ステップ
３０２には２つの主な目標が存在する。第１目標は、第
２鎖上の第２の有望な部位から最少距離である第１鎖上
の第１の有望な部位を選択することである。第１鎖上の
第１点および第２鎖上の第２点は有望な部位を含む。

部位選択の第２目標は、天然蛋白質の喪失が最少限で済
む有望な部位を選択することである。天然蛋白質は、可
変領域の２種のアグリゲートしたポリペプチド鎖から成
る本来の蛋白質である。幾つかのアミノ酸を代えずに、
２つの鎖を１つの鎖に変換することは化学的に不可能で
ある。第１領域のカルボキシ末端および第２領域のアミ
ノ末端間にアミノ酸を１個だけ加えても、これらの末端
に通常存在する電荷は失われる。抗体の可変領域では、
ｆ］およびＬ鎖の末端はあまり接近していない。一方の
鎖のカルボキシ末端を他方のアミノ末端に結合する仮定
リンカ−は、天然可変領域構造と似ていない。かかる構
造は不可能ではないが、天然蛋白質の小部分を切り取る
ことにより、天然蛋白質と似ている小型リンカ−がギヤ
ツブ満たす方が妥当である。１個またはそれ以上の残基
を一方の端から除去しても、多くの天然蛋白質はそれら
の構造を保持することが知られている。

この具体例では、単一リンカ−（有望な２つの部位を架
橋または結合して単一ポリペプチド鎖を形成させるアミ
ノ酸配列または架橋）のみを使用する。第４図は、単一
リンカ−における有望な部位の選択に使用されるステッ
プをブロックダイアグラム形式で示す。第４図のステッ
プは、第３図のステップ３０２の好ましい具体例である
。

領域！をステップ４０２において選ぶ（第４図参照）。

天然アグリゲート状であるが化学的には異なる２種のポ
リペプチド鎖の概略図を第５Ａ図に示す。説明を目的と
するため、Ｌは抗体可変領域の軽鎖（第１ポリペプチド
鎖）であり、領域１であるらのとする。第５Ａ図で示し
た通り、軽鎖りは左側、および重鎖Ｈは右側に存在する
。

次のステップ４０４は、領域２の選択であり、これは、
図示した通り、第５Ａ図の右側の抗体可変領域の重鎖Ｉ
（である。

選択されるリンカ−は、領域ｌ（軽鎖Ｌ）から領域２（
重量Ｈ）に向かう。リンカ−は、単一ポリペプチド鎖の
一部となるに従い、それが結合しているポリペプチドと
同じ指向性をもたなければならない。すなわち、リンカ
−のアミノ末端は、領域ｌのあるアミノ酸のカルボキシ
末端と結合しなければならず、リンカ−のカルボキシ末
端は領域２のある残基のアミノ末端と結合しなければな
らない。第４図のステップ４０６により示した通り、領
域１における出発点（第１部位）を選択する。出発点は
、領域１のＣ（カルボキシのＣ）末端に近くなるように
選択される（このアミノ酸をタウ１と称す）。Ｃ末端に
近いタウ１を選んで天然蛋白質構造の喪失を最少限に抑
えることが重要である。

残基タウｌを第６Ａ図において２次元的に図示する。ま
たそれを自然にアグリゲートしているが化学的には異な
るＨおよびＬポリペプチド鎖の２次元的表示法で第６Ｂ
図にも示す。

次に、第４図のステップ４０８により示した通り、領域
２のＮ（アミノのＮ）末端に近い最終点（第２部位）を
選ぶ。最終部位は、シグマ！と命名された領域２のアミ
ノ酸である。アミノ酸シグマｌを領域２のＮ末端に近く
することにより、天然蛋白質構造の喪失を最少限に抑え
ることが重要である。アミノ酸シグマｌを第６Ａ図にお
いて概略的に示し、第６Ｂ図においてより現実的に示す
。

第７図は、リンカ−が領域ｌにおけるアミノ酸タウｌの
第１部位から領域２におけるアミノ酸シグマ１の第２部
位へ向かうという概念を簡単な形式で示す。第７図に示
す通り、複数の可能な第１部位および複数の第２部位が
存在する。コンピューター・プログラムは、領域！の各
アミノ酸に関して領域２における最も近いアミノ酸の同
定および距離を含む表を供給する。このプログラムは、
アミノ酸全体の位置としてアルファ炭素の位置を用いる
。専門オペレーターは、第１部位、タウｌであるべき領
域１における有望なアミノ酸のリスト、および第２ｇ５
位、シグマ１であるべき領域２における有望なアミノ酸
のリストを製作する。全ての有望な部位タウＩから全て
の有望な部位シグマｌへとリンカ−を求める。専門オペ
レーターは、天然蛋白質の安定性にとっである種のアミ
ノ酸が他のアミノ酸の場合よりも重要であるということ
の決定において部位タウ！およびシグマｌを選択すると
きには合理的な判断を下さなければならない。すなわち
オペレーターは、現実には最も近い部位ではない部位を
選択することもあり得る。

この発明により完全に設計された蛋白質分子は、アミノ
酸タウｌまでの（軽鎖りの）領域１１リンカ−（第８Ａ
図および第８Ｂ図において方向指示線により示す）並び
にアミノ酸シグマｌから重鎖ＨのＣ末端までの領域２で
構成される。代表例では、第８Ａ図および第８Ｂ図に示
す通り、結果的に下記の天然蛋白質の喪失が起こる。

天然蛋白質における第１喪失は、残基タウｌの後の残基
から領域１（軽鎖Ｌ）のＣ末端の範囲である。天然蛋白
質の第２喪失は、領域２（重鎖Ｈ）のＮ末端からシグマ
１の前のアミノ酸の範囲である。

第８Ａ図から明らかであるが、リンカ−１の導入により
、２種の天然アグリゲート鎖から単一ポリペプチド鎖が
生成される。このポリペプチド鎖は領域ＩのＮ末端から
始まる。第８Ｂ図に関すれば、鎖は、天然軽鎖りの殆ど
全配列を通ってアミノ酸タウｌに達する。次いで、リン
カ−は、ごく僅かに先端を切られた領域１のカルボキシ
末端をごく僅かに先端を切られた領域２の残基シグマｌ
に結合する。最少用量の天然蛋白質しか除去されず、ま
た可能な限り構造的に適合するリンカ−を選択している
ため（この発明のジェネラル・ステップ２および３に関
連して後述する）、生成した単一ポリペプチド鎖は、２
種のポリペプチド鎖から成る最初の構造と非常に類似し
た３次元構造に折り畳める確率が非常に高い（リンカ−
を無作為に選択した場合よりら数倍高い）。

単一ポリペプチド鎖は、元の抗体の結合部位と非常に類
似した結合部位を含む一層安定した蛋白質を提供する。

こうして単一ポリペプチド鎖は、ただ１個の鎖から成る
が、抗体の結合部位を維持しているポリペプチドを生成
させるために、天然２種ポリペプチド鎖可変領域から製
造され得る。

この発明の方式では、専門オペレーターはコンピュータ
ーからの最少限の手助けにより部位を選択する。コンピ
ューターは「他の領域で最も近い残基」の表を提供する
。コンピューターは下記の方法でさらに役立つものとな
り得る。

（り抗体の可変領域（Ｆｖ領領域に関して保存された可
変性残基のリストを作成。ＦｖからＰｖへと変化する残
基は、多くの異なるＦｖ配列において保存されている残
基の場合よりも結合にかなり適した出発または終止部位
である。

（２）溶媒接近能のリストの作成。溶媒に曝されたアミ
ノ酸は、天然構造内で変化したアミノ酸よりも天然構造
を不安定化する恐れをあまり伴わずに置換され得る。曝
されたアミノ酸の方が出発または終止結合に適している
。

複数の可能な第１部位（領域Ｉまたは軽鎖Ｌ）の各々に
関して、有効な複数の第２部位（領域２または重鎖Ｈ）
が存在する（第７図および第８Ａ図参照）。第２部位を
領域２のＮ末端近くに選ぶほど、有望な第１部位のいず
れか１つへの距離は増加する。また、第１部位を領域ｌ
のＣ末端近くに選ぶほど、有望な第２部位のいずれか１
つへの距離は増加する。リンカ−の短さおよび天然蛋白
質の保持の間のこのきっ抗は、専門オペレーターが結合
されるべきギャップを選ぶ際に解決すべき点である。ギ
ャップのリストにおいて余分の部位が含まれることに関
するペナルティ−は次の通りである。

（１）ジェネラル・ステップ２における探索に時間をか
ける、および （２）その中の多くがステップ３において確実に拒絶さ
れろにせよ、ステップ２を通過する候補を増やす。ステ
ップ３は現在マニュアル・ステップであるため、これは
かなり重いペナルティ−である。

第８Ｂ図は、領域１のＣ末端付近の様々な部位および領
域２のＮ末端付近の様々な部位間に起こり得る結合を方
向を示す矢印により概略的に示す。

Ｂ、候補の選択 単一リンカ−具体例において使用されるこの発明の３つ
のジェネラル・ステップの２番目では、領域１の部位！
と領域２の部位２を結合する有望な候補を非常に大きな
候補群から選択する。候補を選び出すこの方法により、
専門オペレーターおよび／またはエキスパート・システ
ムに比較的小さな候補群が提供され、後記０項の通り、
この発明の第３ジエネラル・ステップにおいて最も見込
みの高いものから最も見込みの低いものまでがランク付
けされる。

現在、−股領域において、２．０オングストロームまた
はそれより高い解像度で測定された、約２５０種の蛋白
質構造が存在する。これらの非常に複雑な分子の構造は
、高度科学技術、例えばＸ線結晶学、中性子回折および
核磁気共鳴を用いて決定される。構造決定により各蛋白
質のデータファイルが作成される。例えばプルヅクヘブ
ン・プロティン・データ・バンク（Ｂ　Ｐ　Ｄ　Ｂ）は
、蛋白質構造情報の宝庫である。ＢＰＣＢの各ファイル
は異なるタイプの多くの記録を含む。これらの記録は下
記の情報を有する。

（１）蛋白質名および標準分類番号、 （２）蛋白質を人手した有機体、 （３）寄贈者の名前および住所、 （４）各ポリペプチド鎖のアミノ酸配列（既知であれば
）、 （５）ジスルフィドの結合性（もしあれば）、（６）補
欠分子族の名称および結合性（もしあれば）（７）文献
への引用、 （８）記録された座標から結晶学的座標への転換、（９
）測定された各原子の座標。

座標が決定された各原子には少なくとも１つの記録が存
在する。幾つかの蛋白質の幾つかの部分は不規則であり
、Ｘ線を回折しないため、実体的な座標は提供され得な
い。すなわち、座標を有する原子が数個のみまたは全く
無い配列でアミノ酸が存在し得る。座標は、矩形デカル
ト・グリッドにおいてオングストローム単位（１０００
０００００オングストローム＝ＩＣｉ）で与えられる。

蛋白質の幾つかの部分が１個より多い空間的立体配置を
採り得ろため、原子の中には２個またはそれ以上の座標
を有するものもあり得る。かかる場合には、各代替位置
について分割占有部分が与えられる。程度に差があるに
せよ自由に原子は動きまわる。Ｘ線データは、温度（デ
バイ・ウォーラーとしても知られている）因子として記
録される原子運動の評価を提供し得る。

暗にまたは明白に下記データを含む他のデータベースが
あれば、それらも同じく有用である。

（１）各ポリペプチド鎖のアミノ酸配列、（２）ジスル
フィドの結合性（もしあれば）、（３）補欠分子族の名
称および結合性（もしあれば）（４）観察された各立体
配置における各原子の座標（Ｘ−ｙｚ　ｚ）、 （５）各原子の分割占有部分、 （６）各原子の温度因子。

蛋白質は通常水溶液中に存在する。蛋白質の構造は殆ど
常に結晶状蛋白質に関して決定されるが、蛋白質間の直
接接触は全く稀である。蛋白質結晶は２０％〜９０％（
容量）の水分を含む。すなわち普通は、溶液蛋白質の構
造は結晶の場合と同一であると仮定される。現在では、
蛋白質の溶液構造はごく細部においてのみ結晶構造とは
異なるということか一般的に認められている。すなわち
、原子の配位が与えられれば、各原子の溶媒接近能を全
く容易に計算することができる。

さらに、座標は暗に蛋白質中の電荷分布を与える。これ
は仮定的分子（天然蛋白質および１個またはそれ以上の
リンカ−で構成される）が指定どおりに折り畳めるか否
かを評価する場合に有用である。構造が既知である一般
的蛋白質は、アミノ酸１００〜３００の範囲でアミノ酸
の鎖（２１タイプのアミノ酸が存在する）を含む。

既知蛋白質分子に見出されるこれらのアミノ酸単独また
は他のアミノ酸との組合わせは、各々２つの部位を架橋
するフラグメントとして使用され得る。既知蛋白質分子
が使用される理由は、リンノ１−または架橋に既知蛋白
質フラグメントを使用し得るからである。

既知構造の蛋白質が２５０種のみの場合でさえ、可能な
既知フラグメントの数は莫大である。リンカ−は１〜２
０または３０個のアミノ酸長であり得る。リンカ−に存
在し得るアミノ酸の最大数をｒＬｍａｘｊとする（例え
ば、Ｌ　ｍａｘは２５であり得る）。

ｒＮａａｊアミノ酸の蛋白質の場合を考えると、蛋白質
はｔｏｏ〜８００の範囲のＮａａを有し、２５０が一般
的である。この蛋白質からＮａａ−１異種２アミノ酸リ
ンカー１Ｎａａ−２異種３アミノ酸リンカー　・・およ
び正確にＬ　ｍａｘアミノ酸を含む（Ｎａａ＋　ｌ　−
Ｌｍａｘ）異種リンカ−を選択することができろ。Ｌ　
ｍａｘを含むリンカ−またはそれより少ないリンカ−の
総数はｒＮｌｉｎｋＪである。

Ｎａａが２５０でＬ　ｍａｘが２５の場合、Ｎ１１ｎｋ
は５９７５である。既知蛋白質の敗かｒＮＩ）ｒｏｔｊ
である場合、リンカ−の総数、「Ｎ１１ｎｋ−合計」は
、次の通りになる。

ｋ−１，Ｎｐｒｏｔ　　　　　　　　ｊ＝１．　Ｌｍａ
ｘｋ−１，Ｎｐｒｏｔ ［式中、Ｎ　ａａ（ｋ）は第に蛋白質におけるアミノ酸
の数である１ ２５０の蛋白質の場合（各々平均２５０のアミノ酸を含
宵、Ｌ　ａ＋ａｘは２５に設定）、Ｎ！ｉｎｋ合計は１
４２５０００である。

これは既知構造のリンカ−の数である。長さＬｍａｘ以
下の可能なアミノ酸配列の数ｆｆＮｌ１ｎｋ−可能」と
弥す）を考えると、それはかなり大きい。

Ｌｍａｘ＝２５、 Ｎ１１ｎｋ−可ｆＦＩ−＝３５３．２０４．５４７．３
６８．４２１．０５２．６３１．５７８．９４７．３６
８．４２０ ＝３．５３＊　ｌ　Ｏ” すなわち、既知ペプチドフラグメントを用いると、可能
性が２６分の１に縮小される。既知ペプチドフラグメン
トによる適当な探索により、さらに可能性が５分の１に
縮小される。

本質的に、この発明は可能な候補のリストを縮小するた
めの選択戦略を採用する。これは、ステップ工程におけ
る好ましい形での説明に従い行なわれる。この３ステツ
プ工程は、この工程の３つの各ステップの説明で示す通
り、可能な候補のデータベースから最ら有望な候補を抜
粋するのに必要とされるコンピューター時間を著しく減
らす。これは、候補全てを一括して検査する必要のある
、候補のデータベース全体を通る連続探索と好対照をな
す。この発明では、各候補のある特定のパラメーターを
調べ、これらのパラメーターを用いて候補のサブグルー
プを作成し、次いで他のパラメーターを用いてこれを調
べる。こうして、コンピューター処理速度は著しく増加
する。

この発明の最善の方法では、プルックヘブン・ナショナ
ル・ラボラトリ−にューヨーク、ロングアイランド、ア
ップトン）により作成および増補された蛋白質データベ
ースが使用される。このデータベースはプルックヘブン
・プロティン・データベース（ＢＰＤ［３）と呼ばれろ
。それは、この発明に必要とされる物理および化学パラ
メーターを提供する。候補リンカ−は、プルックヘブン
・プロティン・データベースまたは３次元蛋白質構造の
他の供給源から人手され得るものと理解すべきである。

これらの供給源は正確に蛋白質を示さなければならない
。現在の具体例では、２．５オングストロームまたはそ
れより高い解像度で測定され、適当に精製されたＸ線構
造が使用された。

各ペプチドを、標準結合長および角度を有する標準平面
ペプチドと置き換える（最小２乗法適合）。

標準ペプチド（例、シスペプチド類）と正確にはマツチ
しないペプチドはリンカ−の開始または終止には使用さ
れないが、途中には存在し得る。

アミノ酸のある最大数（Ｌｍａｘ）以下の各配列を候補
とする。好ましい具体例では、アミノ酸の最大数（Ｌ　
ｍａｘ）を３０に設定する。しかしながら、この発明は
この数に限定される訳ではなく、関連した蛋白質工学環
境下において望ましい最大数であれば全て使用され得る
。

１、Ｎ末端およびＣ末端間の適切な距離を有する候ｈｌ
ｉの選択。

候補選択段階における第１ステツプは、使用されている
蛋白質データベースに存在する候補リンカ−全部からＮ
末端およびＣ末端間に適切な距離を有する候補リンカ−
を選択することである。第９図は、選択パラメーターと
して距離を利用するこの候補選択工程を構成するステッ
プをブロックダイアグラム形式で示す。

第９図に関すると、ブロック９０２で示す通り、第１部
位のペプチド単位に応じた標準点を選択する。

またブロック９０４で示す通り、第２部位のペプチド単
位に応じた標準点も選択する。ただし、最善の方法では
、第１および第２部位のペプチド単位の幾何的中心が使
用されるが、所望により、任意の他の標準点も使用され
得るものとする。

次いで、ブロック９０６で示す通り、リンカ−により架
橋されるべきギャップを画定する第！および第２部位の
２種のペプチドの標準点間の距離を計算する。このスカ
ラー距離値はいわゆるギャップのスパンである。ただし
、このスカラー値は方向に関する情報を一切含まないも
のとずろ。

次に、ステップ９０８で示す通り、可能なリンカ−候補
の両端の距離を計算する。特定候補の両端の距離はいわ
ゆる候補のスパンである。ただし、可能な各リンカ−候
補は候補スカラー値のスパンを有するものとする。

距離選択候補選択工程における最終ステップは、ステッ
プ９１０である。ステップ９１０では、候補値のスパン
とギャップ値のスパンとの差が予め選択された量（この
予め選択された量はＭａｘＴｒＳＱＦＩＴ誤差である）
を越える候補が排除される。

この発明の最善方法では、ＭａｘＬＳＱＦｒＴ誤差に関
して予め選択された量は０．５０オングストロームであ
る。しかしながら、他の適当な値があればそれも使用さ
れ得る。

ここまでは、単一ギャップに関して議論が行なわれた。

事実、専門的利用者は幾つかのギャップを選択すること
が多く、探索はそれらの全てを使用する。各候補のスパ
ンと各ギャップのスパンとを予め設定された許容値内で
適合するまで比較するか、またはギャップのリストを徹
底的に検討する。候補がギャップのどれとも適合しない
場合、その候補は排除される。候補がいずれかのギャッ
プと適合する場合は、それを次の段階に進める。

発明者らは、可能なリンカ−候補を選択するために第１
パラメーターとして距離を使用すると、可能な候補の数
が著しく減少し、必要とされるコンピューター時間が最
少限に抑えられることを測定した。減少量に関すると、
代表例（２０以下のアミノ酸から成るリンカ−を使用）
は、蛋白質データベース中の７６１９０５の可能な候補
から始まる。適切な距離のパラメーターを用いるこの候
補選択により、この可能な候補の数は約６３７２７に選
び抜かれる。後述する通り、距Ｍｉｄ択操作は、この選
択ステップ３０４を構成する他の２つのステップよりも
かなり少ないコンピューター時間しか必要としない。

適切な距離によるこの候補選択の結果は、架橋または結
合されるべきギャップと比べて適切な長さを呈する群（
いわゆる候補の第１群）である。この候補の第１群は、
距離基準のみを用いて蛋白質データベースから選択され
る。

２、Ｎ末端からＣ末端への適切な方向を有する候補の選
択 本質的にこのサブステップでは、第９図に関連して記載
した距離選択サブステップにより作成された可能な候補
の第１群から可能な候補の第２群を作成する。Ｎ末端残
基（すなわち第１部位）に関するギャップのＣ末端残基
（すなわち第２部位）の配向と比べて、Ｎ末端残基（す
なわち開始残基）に関するリンカ−のＣ末端残基（すな
わち最終残基）の配向に従い候補の第２群が選択される
。第２０Ｂ図参照。こうして、この方向評価は、望まし
くない分子の歪曲発生を最少量にするためにリンカ−の
アミノ末端アミノ酸をギャップの第１部位に重ね合わせ
る場合、リンカ−の鎖がギャップの第２部位付近で終わ
るか否かを決定する。

第１θ図を再び参照すると、可能な候補の第２群の作成
に使用される第１ステツプはステップ１００２である。

ステップ１００２では、局所座標システムが選択された
ギャップの１つのＮ末端残基を基礎として確立される。

例えば、第１アルフア炭素を原点、第２アルフア炭素を
正のＸ軸上に設定した、Ｎ末端残基の第１アルフア炭素
からＮ末端残基の第２アルフア炭素に亙る局所Ｘ軸が採
用され得る。カルボニル酸素が正のｙ座標を有するＸｙ
面に存在するように局所Ｙ軸が選択される。局所Ｚ軸は
ＸをＹに交差させることにより作成される。次に、ステ
ップ１００４で示す通り、ギャップのＣ末端残基におけ
る標準基準点を設け、その球面極座標を局所システムで
計算する。標準基準点は、Ｃ末端ペプチド（この出願全
体を通して、ペプチド、残基およびアミノ酸は互換的に
使用される）における原子のいずれか１つまたはそれら
の位置の平均であり得る。ステップ１００２および１０
０４をギャップのリストにおける全てのギャップについ
て繰り返す。ステップ１００６で示す通り、局所座標系
は候補の一つのＮ末端残基を基礎として確立される。こ
の局所座標系は、ギャップの各々に基づいて確立された
局所座標系に使用された方法と同様にして確立されなけ
ればならない。様々な局所系が使用され得るが、同じ定
義を首尾一貫して使用しなければならない。ステップ１
００８では、標準基準点は現候補のＣ末端残基に見出さ
れる。この標準点は、ギャップに関して使用された方法
と同様にして選択されなければならない。標準点の球面
極座標は候補の局所系で計算される。（この局所座標系
の使用は全ギャップおよび全候補の回転および翻訳と完
全に同等であるため、開始ペプチドは原点の標準位置に
存在する）。ステップ＋０１０では、ギャップ・ベクト
ルの球面極座標（γ、θ、φ）を候補ベクトルの球面極
座標（γ、θ、φ）と比較する。ステップ１０１２では
、予め設定されたしきい値が適用され、２つのベクトル
が十分厳密に一致する場合、ステップ１０１４に進み、
候補の第２群に含まれる候補を登録する。現時点では、
この予め設定されるしきい値は０．５オングストローム
にセットされているが、他の値も使用され得る。ステッ
プ！０１４から、−足飛びにステップ１０２２へ進む（
下記参照）。他方、ステップ１０１２で比較されたベク
トルが十分には近くない場合、ステップ１０Ｉ６におい
てリストに列挙された次のギャップ・ベクトルに移動す
る。それ以上ギャップが列挙されていない場合、候補の
否定が行なわれるステップ１０１Ｂに進む。さらにギャ
ップが存在する場合、ステップ！０２０はギャップ・カ
ウンターをインクリメントし、ステップ１０１０に戻る
。ステップ１０１４または１０１Ｂから、全ての候補が
検査されたか否かを確かめるステップ１０２２に進む。

検査されていない場合、ステップ１０２４は候補カウン
ターをインクリメントし、ステップ＋００６に戻る。全
ての候補が検査された場合、ステップ！０２６は終了で
ある。

第１１図は、ギャップの方向と候補の方向との比較の概
念を示す。

発明者らは、７６１９０５の可能な候補が蛋白質データ
ベースに含まれている上記の例において、このステップ
の選択工程は、第１群における約６３７２７の候補を第
２群における約５０の候補に減らすことを測定した。ま
た発明者らは、スカラー距離パラメーターと関連して前
述したコンピューター処理時間単位に関して、このステ
ップの選択の遂行には約４〜５コンピユーター処理時間
単位を要することを測定した。すなわち、方向選択工程
は距離選択工程よりも長い時間を要するため、まず距離
選択、次に方向選択を実施すると、コンピューター処理
時間が保たれることになり得る。

３、両末端に適切な配向を有する候補の選択このステッ
プでは、ギャップの片方の端におけるペプチド基間の相
対的配向と比較した、候補の片方の端におけるペプチド
基間の相対的配向の評価を用いて、第１０図のステップ
１０１６の第２群に属する候補を選択して有望な候補の
第３群を作成する。ステップＩ２０！では、（第１２図
）ペプチドは、３．４または５個の原子により表される
ものとする（下記参照）。具体的には、ステップ１２０
２”？？ｌｉ、第２　ｆｉ’ｃＤ候？１ｆｆ（ステップ
１０１４　）の一つが試験に用いられる。ステップ１２
０４では、第１ペプチドの３〜５個の原子を選択して第
１ペプチドの配向を定める。原子が同一線上にない限り
、３原子で充分であるが、４または５個の原子を用いる
と、後の最小２乗法適合度において重複決定がなされる
ため、座標における誤差が補正される。例えば、４原子
、Ｃアルファ、Ｃ，ＮおよびＣベータの選択を仮定する
。次に、ステップ１２０６では、選択された候補の最終
ペプチドから対応する３、４または５個の原子を選択す
る。

これらの６．８または１０個の原子は３次元対象を画定
する。ステップ１２０Ｂでは、ギャップの一つを選択す
る。ギャップから対応する６、８または１０個の原子を
選択する。ステップ１２！０では、候補からの原子とギ
ャップからの原子に最小２乗法を適用する。この最小２
乗法は、２種の３次元対象を重ねるための自由度を許容
する。

方の対象を固定し、他方を自由に移動させるものとする
。３自由度は自由対象の中心の運動を制御する。他の３
自由度は自由対象の配向を制御する。

ステップ！２１２では、最小２乗法適合結果を調べる。

二乗平均（ＲＭＳ）誤差が予め設定されたあるしきい値
未満である場合、候補は考慮されているギャップに対し
て優れた適合度を有するため、ステップ＋２１４におけ
る第３群に登録される。

他方、ＲＭＳ誤差が予め設定されたしきい値より大きい
場合、ステップ１２１６におけるリストに別のギャップ
が存在するか否かをチエツクする。

存在する場合、次のギャップを選択し、ステップ１２０
８に戻る。リストにそれ以上ギャップが存在しない場合
、第２群からの現候補はステップ１２＋８において拒絶
される。ステップ１２２０では、第２群にさらに候補が
存在するが否かをチエツクする。存在する場合、新しい
候補を選択し、ステップ！２０１に戻る。それ以上候補
が存在しない場合、それで終了する（ステップ＋２２２
）。また、長さ２０個以下のアミノ酸から成るリンカ−
が１２．７オングストロームの距離を有する単一ギャッ
プに対して探索された代表例については、蛋白質データ
バンクは７６１９０５の可能なリンカ−を含んでいた。

これらのうち６３７２７が距離試験を通過した。方向試
晧では５ｏ候補以外全てが削除された。配向試験は、Ｒ
ＭＳ誤差が０゜５オングストロームに等しいがまたはそ
れ未満である！候補しか通さなかった。ＲＭＳ誤差が０
５オングストロームないし０．６オングストロームの範
囲である別の２つの候補も存在した。さらに、発明者ら
は、第３群として選択すべきか否かを決定するための第
２群の各候補の評価には約２５コンピユーター処理時間
単位が必要であることを測定した。候補選別の３つのス
テップに関して発明者らが選択した順序については、ｌ
候捕当たりの所要時間を後のステップよりも先のステッ
プの方が短くなるように選んだものとする。しかしなが
ら、候補選択に使用されたステップの順序は変更され得
、さらに望ましい選別工程が追加され得る。論理的には
、ステップ１および２を省略し、第１２図に示された最
小２乗法適合を全候補に行い、同じ候補リストに到達し
得るが、コンピューター処理における費用がかさむ。こ
れは、コンピューター処理時間は充分にあるが、記憶容
量が不充分である並列処理の場合に実施され得る。

適切な配向が候補の両端間に存在するか否かを決定する
別の方法（図示せず）は、ギャップの最終ペプチドにお
ける原子と比べて候補のＣ末端における原子のみを検査
することである。ステップ２では、発明者らは候補の第
１ペプチドをギャップの第１ペプチドと一直線に並べた
。これを行った後は、単に候補のＣ末端の原子をギャッ
プの第２ペプヂドと比較するだけでよい。上記最小２乗
法は誤差を均等に分布させるが、この方法は、誤差が全
てＣ末端に現れるため、上述の方法よりも劣っている。

Ｃ１候補のランク付けおよび削除 第３図で示す通り、この発明の第３ジエネラル・ステッ
プは、有望性の最も高いものから低いものに及ぶ有望候
補のランク付けを行い、並びにエキスパート・オペレー
ターおよび／またはエキスパート・システムにより採用
された基準に基づいて有望とは思われない候補を削除す
る段階である。

最善の方法では、第３群の候補（ステップ１２１４）が
エキスパート・オペレーターに提示され、続いてそのオ
ペレーターは、コンピューター−グラフィックス・デイ
スプレィ・システム＋１６を用いてそれらを３次元的に
表示させ得る。次いで、エキスパート・オペレーターは
、蛋白質化学に関する知識および架橋されているギャッ
プに関する有望な候補の物理的関係に基づいて候補に関
する決定を行い得る。この分析法を用いることにより、
有望性の最も高いものから低いものまで第３群の有望な
候補のランク付けを行うことができる。これらのランキ
ングに基づき、遺伝子工学にとって最も有望な候補が選
択され得る。

代表例に関連して面述した通り、ステップ１２１４の第
３群に該当する候補は一般的にごく僅かしか存在しない
（１００未満）。従って、現在の専門オペレーター（例
えば、化学における理学土丹を有する）は、一般的にこ
の有望候補数をｌＯ〜１５の群に選別し得る。その後、
さらに専門的なオペレーターおよび／またはエキスパー
ト・システムであればその数をさらに選別することがで
きる。こうして、この発明の方法と同様の選択方法を使
用しなかった場合には何口、何千またはそれ以上の候補
を試験する必要があるのと比べて、実際に試験を要する
のはごく僅かの有望な候補だけで済む。この方法は、単
鎖分子の工学技術的製造速度を何倍ら速め、費用および
他の損害を何倍も減らす。

しかしながら、ある種の状況では、この第３ジエネラル
・ステップにおける自動ランク付けは正当化され得る。

例えば、これは、専門オペレーターが第３群に属するご
く僅かの候補しか提供されなかった場合、またはランキ
ング選択並びに以前の工学技術活動および／または実際
の遺伝子工学実験に由来する以前の経験に基づいた候補
の削除を行う際に専門オペレーターの補助が望ましい場
合に起こり得る。

第１３図を参照すると、ブロック１３０２で示す通り、
仮定的分子（候補）の座標リストが自動的に作成される
。次いで、専門オペレーターは、第１の色を用いて天然
蛋白質の領域ｌからの残基を表示させることができる。

カラー・デイスプレィ１２０は、残基の領域ｌにおける
存在場所の視覚表示を専門オペレーターに提供し得る。

これをブロック１３０４により示す。

次いで専門オペレーターは、ブロック１３０６で示す通
り、カラー・デイスプレィ＋２０で第２の色を用いて天
然蛋白質の領域２からの残基を表示させ得る。第２の色
を使用すると、領域１からの残基と領域２からの残基と
の識別を助ける視覚表示が利用者に提供される。

ランク付けされているリンカ−（候補）は選択された色
で表示され得る。この色はステップ１３０４の第１色お
よび／またはステップ１３０６の第２色とは相異し得る
。また、この視覚的カラー表示を使用することにより、
専門オペレーターは天然蛋白質の領域ｌおよび２の残基
を区別ずろことができる。このリンカ−候補のデイスプ
レィをブロック１３０８により示す。

専門オペレーターに提供されたカラー・デイスプレィ１
２０上の最初の画像は、−船釣に残基全部に関するアル
ファ炭素を示す。これをブロック１３！０により示す。

さらに、最初の画像は、残基およびリンカ−およびリン
カ−の前の１残基およびリンカ−後の１残基に関する主
鎖および側鎖を示す。これをブロック１３＋２により示
す。

また専門オペレーターは、天然蛋白質またはリンカ−候
補に存する他の原子を意のままに描かせることができる
。上記コンピューター−グラフィックス・デイスプレィ
・システムｌ１６に関連して総括的に述べた通り、オペ
レーターの指令により、分子は回転、翻訳および拡大ま
たは縮小され得る。

第１３図のブロックダイアグラムは、面述のステップの
各々が連続方式で遂行されることを示す。しかしながら
、これは単に説明を目的としているにすぎない。オペレ
ーターは、第３群の有望な候補のランキングに関して望
ましい任意の順序で意のままにこれらのステップのいず
れか１つまたはそれ以上および他のステップも遂行し得
るということを理解すべきである。

最も有望性の高いものから低いものまでの候補のランク
付けおよび第３群からの残存候補の削除を行うときに、
専門オペレーターおよび／またはこの第３ジエネラル・
ステップで使用されるエキスパート・システムは、この
選択工程において幾つかの異なるルールおよびガイドラ
インを採用し得る。これらのルールおよびガイドライン
の例には、第１４図に関連して記載する下記のものがあ
る。ただし、第１４図のブロックは様々なルールおよび
／または基準を示しており、必ずしもボックスが登場す
る順序では使用されないものとする。

示された順序は単に説明を目的としているに過ぎない。

他のルールおよび／または基準も同様にランキング工程
において使用され得る。

ステップ１４０２で示す通り、リンカ−の原子が天然蛋
白質構造の保持原子との最少許容間隔よりも近い場合、
候補は拒否され得る。最善の方法では、最少許容間隔は
２．０オングストロームに設定される。ただし、他の値
ら選択され得るものとする。所望によりこのステップは
自動化され得るため、専門オペレーターはこの削除工程
を手動的に行う必要がない。

ブロック１４０４で示す通り、疎水性残基が溶媒に対し
て高い曝露性を有する場合、候補はペナルティ−を科さ
れ得る。フェニルアラニン、トリプトファン、ブロック
、ロイシン、イソロイシン、メチオニンおよびバリンの
側鎖は水と好ましい相互作用を起こさないため、いわゆ
る疎水性である。

蛋白質は通常食塩水溶液中に存在する。溶媒は極性分子
（Ｈ，Ｏ）およびイオンを成分とする。

現水性残基が溶媒に対して低い曝露性を有する場合、候
補はペナルティ−を科され得る。セリン、トレオニン、
アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタ
ミン、リジン、アルギニンおよびプロリンの側鎖は水と
好ましい相互作用を起こすため、いわゆる親水性である
。親水性残基に関するこのペナルティ−・ステップをブ
ロック１４０６により示す。

ブロック１４０８で示す通り、疎水性残基が溶媒に対し
て低い曝露性を有する場合、候補は昇格され得ろ。

ブロック＋４１０で示す通り、親水性残基が溶媒に対し
て高い曝露性を有ずろ場合、候補は昇格され得る。

ブロック！４！２で示す通り、主鎖が水素結合を形成し
得ない場合、候補はペナルティ−を科され得る。

主鎖が溶媒領域中に無用な突出を呈している場合、候補
はペナルティ−を科され得る。無用な突出は、残存天然
蛋白質と明白な相互作用を一切起こさないものである。

これをブロック１４１４により示す。

ブロック１４１６で示す通り、主鎖が螺旋を形成する場
合、候補は昇格され得る。螺旋は自動安定性を示す。す
なわち、螺旋状のリンカ−は、その主鎖極性原子（０お
よびＮ）がリンカ−内で水素結合を形成するため、安定
性が高い。

ブロック１４１８で示す通り、主鎖が存在するベータ・
シートに対して適合するベータ・シートを形成する場合
、候補は昇格され得る。ベータ・シートの鎖は互いに安
定化させる。存在するベータ・シートを広げるようなベ
ータ・シート立体配座でリンカ−が見出された場合、こ
の相互作用はリンカ−および天然蛋白質の両方を安定化
する。

別の専門設計ルールは、主鎖に沿った望ましくない位置
に立体化学的巨大（バルキー）側鎖を有する候補にペナ
ルティ−を科する。さらに、バルキー側鎖をそれより小
さいバルキー側鎖と置き換えることにより、バルキー側
鎖を有する候補を「救済する」ことが可能である。例え
ば、側鎖が巨大置換基、例えばロイシンまたはイソロイ
シンを含む場合、可能な設計ステップでは、このアミノ
酸を最小のバルキー側鎖であるグリシンと置き換える。

他のルールおよび／または基準も第３ジエネラル・ステ
ップ３０６の選択工程で使用され得、この発明は上記ル
ールおよび／または基準７こ限定される訳ではないもの
とする。例えば、−旦リンカーが選択されても、さらに
優れた３−Ｄ適合度を達成するために、追加、削除、ま
たは前述の通り、そこに存在する１個またはそれ以上の
アミノ酸の修正を行うことも可能である。

■、二重および多重リンカ−の具体例 上記■項ではこの発明による単一リンカ−の具体例を記
載した。この項では、この発明による二重および多重リ
ンカ−の具体例について記載する。

簡略化するため、この具体例と単一リンカ−の具体例の
顕著な差異のみをこの項では記載および／または添付図
面で説明する。従って、単一リンカ−の具体例に関する
本文および図面を参照するべきである。

Ａ、有望な部位の選択 結合されるべき部位間の距離を最少限にし、天然蛋白質
の喪失を最少限に抑えるという２つの主な目標は、上記
単一リンカ−具体例の場合と同様、二重および多重リン
カ−具体例における部位選択にも当てはまる。

第１５Ａ図は、天然アグリゲート状であるが、化学的に
は異なる２種のポリペプチド鎖から単一ポリペプチド鎖
を生成させるためのリンカ−の使用に関する２次元的簡
略図を示す。第１５Ｂ図は、第１５Ａ図の２種の鎖の３
次元表示を２次元的に示す。第１５ＡおよびＢ図を参照
すると、適当な部位の決定における第１ステツプは、領
域２のＣまたはＮ末端に近い領域ｌの部位を見つけるこ
とである。説明を目的とするため、第１５Ａ図および第
１５Ｂ図に示す通り、最ら有望な位置は領域２のＣ末端
であると仮定する。領域１における残基をタウｌと称し
、領域２における残基をシグマ１と称す。

第１６Ａ図および第１６Ｂ図は、それぞれ２つの鎖の簡
単な２次元プロット、および２つの鎖の３次元表示の２
次元プロットである。それらについては、有望な部位が
どのようにしてこの例の状況で第２リンカ−に関して選
択されるかという説明と関連づけて使用する。

第２リンカ−に対する有望な部位の発見に関する第１ス
テツプは、軽鎖においてタウ１の旧にある領域ｌの残基
を見つけることである。この残基は残基タウ２とする。

第１６Ａ図にはその上部が示され、第１６Ｂ図にはその
右中間部分が示されている。

第２リンカ−に関する部分選択工程における次のステッ
プは、領域２のＮ末端付近の領域２の残基を見つけるこ
とである。この残基は残基タウ２とする。再び第１６Ａ
図および第１６Ｂ図を参照してシグマ２の位置を確認す
る。

すなわち第２リンカ−（リンカ−２）は、タウ２からシ
グマ２に及ぶ。これを第１７Ａ図および第１７Ｂ図に示
す。ただし、これら２つのリンカ−により形成される鎖
は首尾一貫して適切な方向を有するものとする。第１８
図は、２つのリンカ−を用いて２つの独立した鎖を結合
することにより形成された単一ポリペプチド鎖を簡単な
２次元形式で示す。ただし、概略的に記載された上記方
法は天然蛋白質の喪失を最少限に抑えるものとする。

第１７図に示す完全に設計された蛋白質は、Ｎ末端から
タウ２までの領域１１リンカ−２、シグマ２からシグマ
Ｉまでの領域２、リンカ−１およびタウｌからＣ末端ま
での領域監で構成される。第１７図に示す矢印は鎖の方
向を示す。

第１７図は、２つのリンカ−の利用により失われた残基
が、（ａ）領域２のＮ末端からシグマ２の前の残基まで
、および（ｂ）シグマｌの後の残基から領域２のＣ末端
まで、および（ｃ）タウ２の後の残基から領域夏のタウ
１の旧の残基までであることを示す。

２つのリンカ−例において一方のリンカ−が非常に長い
場合、タウ２からシグマ１の後の領域２の残基に結合し
得る。次に、第３リンカ−（図示せず）を領域２のＣ末
端付近の残基から領域２のＮ末端付近の残基までの間に
結合させる。

さらに、単一リンカ−または一対のリンカ−が２つの領
域を１つの鎖に結合させる形式で、２つのリンカ−を用
いて領域の一方を再結合することもできる。

Ｂ、候補選択および候補拒絶ステップ 複数リンカ−例におけるリンカ−のランク付けは、幾つ
かの考慮すべき点があることを除いて単一リンカ−例の
場合と同じステップに従う。

（１）結合されるべき２つ（またはそれ以上）のギャッ
プの各々に関して複数のリンカ−が存在し得る。

ギャップＡに関するリンカ−の各々とギャップＢに関す
るリンカ−の各々の組合わせ全てを考慮しなければなら
ない。

（２）リンカ−間の相互作用を考慮しなければならない
。

リンカ−の組合わせを考慮しなければならないため、個
々のリンカ−のランキングを用いて各ギャップに対する
非常に有望なリンカ−を少数に削減する。各ギャップに
関して候補が３つしかない場合、９Ｎの可能な構造が存
在する。

リンカ−間の相互作用を調べ、不適当な候補を排除する
工程は、上記のルールを適用することにより自動化され
得る。

■、並行処理の具体例 第１９図は、この発明で使用され得る並行処理方法をブ
ロックダイアグラム形式で示す。

第１９図に示す通り、フレンドリ−・シリアル・プロセ
ッサー１９０２を第１バス１９０４により複数のデータ
記憶装置および人力装置に結合する。単に説明を目的と
するだけであるが、具体的には、テープ・インプット・
ステージ１９０６をバス１９０４に接続することにより
、使用されている蛋白質データベースのパラメーターを
システム中に読み取らせる。高記憶容量のディスク・ド
ライブ・システム１９０８（例えば、５ギガビツトの記
憶容量を有する）もまたバス１９０４に接続する。操作
的には、記憶容量がさらに大きい場合で乙、在来設計の
光学ディスク・ストレージ・ステージ１９１０がバス１
９０４に接続され得る。

双方向性バス１９１４を介してフレンドリ−・シリアル
・プロセッサー１９０２に接続されるハイパーキューブ
１９１２の目標は、探索の一層速い遂行および一層自動
的な候補の削除の２面を有する。

例えば２１０〜２１６ノードを有するハイパーキュ−ブ
１９１２が並行処理に使用される。現在、１０２４以下
のコンピューター処理ノードを有ずろコンピューターが
入手可能である。すなわち、各ノードは約１４００の候
補リンカ−を保持するだけでよく、使用可能な機械の局
所的記憶で充分である。これがハイパーキューブ１９１
２の概念である。ハイパーキューブ並行処理方法を用い
ると、蛋白質データベースは、存在するコンピューター
処理ノードと同じ多くの部分に分割され得る。各ノード
は特定の既知蛋白質構造に割り当てられる。

リンカ−により架橋されるべきギャップの幾何的構造は
、バスＩ９！４を介してフレンドリ−・シリアル・プロ
セッサー１９０２によりハイパーキューブ・ステージ１
９１２に送られる。次いで、ハイパーキューブ１９１２
における各ノードは、割り当てられた特定候補リンカ−
に関する幾何的パラメーターを処理する。すなわち、本
発明のこの方法で行なわれる連続方式とは反対に、候補
は全て並列方式で検査され得る。この結果、本発明の第
２ステツプ３０４により評価され得る候補の（ｌ首付け
において、かなり迅速な位置付けかなされろ（発明者ら
は、常套技術を用いても処理速度を６時間から３分にし
得るものと信する）。

・■行処理具体例に関する別の利点は、候補の一層自動
的な選別を可能にするのに充分な速度が提供されること
である。これは、分子力学およびエネルギー最小限化を
用いて達成される。現在、これは連続処理コンピュータ
ー（例えばクレイおよびサイバー製のスーパーコンピュ
ーター機種）で６実施され得るが、並行処理方法は、ス
ーパーコノピユータ一方法を用いる場合よりもかなり迅
速かつ安価に分子力学およびエネルギー最小限化を遂行
する。

特に、非常にａ利にスカラー計算に関してスーパーコン
ピューターに匹敵する安価なコンピューター処理ノード
を有するハイパーキューブ・コンピューターが存在する
。使用されたポテンシャル関数は多くのデータ依存ブラ
ンチを有するため、分子力学およびエネルギー最小限化
は部分的にのみベクトル化可能である。

■、遺伝子配列の組立および発現並びに用途この明細書
に記載された方法により生成されたポリペプチド配列は
、遺伝子コードの適用により、それをコードする遺伝子
配列を生じさせる。しかしながら、コードの縮重がある
と、多くの場合任意の１アミノ酸に対して多数の可能な
コドンが存在する。従って、当業界の熟練者には充分理
解されていることであるが、所望の有機体におけろコー
ドについて最適化された遺伝子配列の生成においてコド
ン慣用ルールが利用され得る［例えば、油付、［ジャー
ナル・オブ・モレキュラー・バイオロジーＪ（Ｊ、　Ｍ
ｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ、）、１５１巻、３８９−４０９
頁（１９８１年）参照］。

−船釣に、出発点として最初の抗体の可変領域の軽鎖お
上び重鎖から得られたＣＤＮＡ配列の利用が可能である
。次に、これらの配列は、この発明の方法により解明さ
れたペプチドリンカ−候補をコードする遺伝子リンカ−
手段により結合され得る。前述の通り、遺伝子配列は新
たに完全に合成され得るか、またはｃＤＮＡのフラグメ
ントは合成リンカ−と−緒に結合され得る。

可変領域の１−１およびＬ鎖をコードする配列の生成に
は、大きな供給源のハイブリドーマおよびそれらの対応
するモノクローナル抗体が使用され得る。既に述べた通
り、所定の種類に属する抗体の殆どの「可変コ領域は、
ある特定の高変異性ループを除き、事実それらの３次元
的折り畳みパターンにおいて全く不変であるということ
がよく知られている。すなわち、この発明の単鎖結合蛋
白質の特定の結合特異性を選択および決定するためには
、高変異性領域の蛋白質配列（および基礎的遺伝子配列
）の決定のみが必要になる。高変異性領域は結合分子に
より異なるが、可変領域の残りの領域は所定の種類の抗
体については依然として不変である。

供給ｌｎ＋ＲＮＡは広範囲のハイブリドーマから入手さ
れ得る。例えば、カタログ「ニーティーシーソー・セル
ラインズ・アンド・ハイブリドーマズＪ（ＡＴＣＣＣｅ
１ｌ　Ｌｉｎｅｓ　ａｎｄ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ）（
１９８４年１２月、アメリカン・タイプ・カルチャ−・
コレクション、２０３０９バークローン・ドライブ、ロ
ックビル、メリーランド２０８５２、ニーニスエイ）５
−９頁参照。そのカタログに列挙された広範な種類の抗
原と反応性を示すモノクローナル抗体を産生ずるハイブ
リドーマは、コレクションから入手され得、この発明に
おいて使用可能である。特に興味深いのは、ウィルス性
抗原、癌関連抗原、リンパ球抗原等と反応性を示す抗体
を産生ずるハイブリドーマである。これらのセルライン
および同様の性質を有する他のセルラインを利用するこ
とにより、可変領域をコードするｍＲＮＡをコピーし、
またはモノクローナル抗体自体からアミノ酸配列を決定
することができる。工学処理されるべき抗体の特異性は
、本来の選択工程？こより決定される。抗体の種類は、
当業界の熟柿者に知られている基準により決定され得る
。３次元構造の存在する種類が一つである場合、高変異
性領域（または相補的決定領域）の配列を置換するだけ
でよい。置換配列は、ｍＲＮＡのＤＮＡコピーのアミノ
酸配列またはヌクレオチド配列から誘導される。

特に、この発明の方法を適用する前に必ずしも各可変領
域の３−■）構造を結晶化および決定する必要はないも
のとする。高変異性ループのみが可変領域から可変領域
へ激しく変イつるため（残りの部分は所定の種類の抗体
の可変領域の３−Ｄ構造において不変である）、既知ま
たは各種抗体に関して決定されるべき構造から多くの単
鎖３−Ｄ構造を生成することか可能である。

例えば、この出願における実施例で生成されるリンカ−
（例、ＴｒｔＹ４０、ＴＩＩＹ６１ＳＴＲＹ５９または
ＴＲＹ　２０２°、下記参照）は、ＩｇＡクラスの抗体
のＦｖ領領域対するものである。それらは所望の特異性
を有する抗体であれば全て普遍的に、特に抗体がＩｇＡ
クラスに属する場合に使用され得る。

この発明の分子の製造に用いられる発現媒体にはプラス
ミドおよび他のベクターがある。一般には、宿主細胞と
融和性のある種類に由来するレプリコンおよび制御配列
を含むベクターを宿主と共に使用する。ベクターは本来
レプリコン部位、および形質転換された細胞において表
現型選択を与え得る特定遺伝子を含む。例えば、エシェ
リヒア・：］　！Ｊ　（Ｅ、　ｃｏｌｉ）は、エシェリ
ヒア・コリ種由来のプラスミド、ｐＢ１３２２を用いて
容易に形質転換される。ｐＢ１３２２は、アンピシリン
およびテトラサイクリン耐性遺伝子を含むため、形質転
換細胞を確認するための容易な手段を提供する。

ＰＢＲ３２２プラスミドまたは他の微生物プラスミドも
また、微生物によりそれ自体の蛋白質発現に使用され得
るプロモーターを含むか、またはこれを含ま仕ろべく修
正されなければならない。組換えＤＮＡ構築において最
も常用されるそれらのプロモーターには、ベータラクタ
マーゼ、ラクト−ス・プロモーター系、ラムダファージ
・プロモーターおよびトリプトファン・プロモーター系
がある。これらは最ら一般的に使用されているが、発見
された他の微生物プロモーターら使用され得る。

例えば、単鎖結合蛋白質の遺伝子構造は、バクテリオフ
ァージ・ラムダの左方向プロモーターの制御下に配置さ
れ得る。このプロモーターは、制御され得る最強の公知
プロモーターの一つである。

制御はラムダ・リプレッサーにより行なわれ、隣接制限
部位は公知である。

単鎖抗体の発現もまた、非形質転換状態の有機体に対し
て相同性であり得る他の調節配列の制御下に行なわれ得
る。例えば、ラクトース依存形エシェリヒア・コリ染色
体ＤＮＡは、酵素ベータ・ガラクトシダーゼを同化する
ことにより、ラクトース利用を仲介するラクトースまた
は１ａｃ（ラクトース要求）オペロンを含む。ｌａｃ制
御要素は、Ｅ。

ｃｏｌｉに感染性のバクテリオファージ・ラムダｐｌａ
ｃ５から入手され得る。ｌａｃプロモーター−オペレー
ター系はＩＰＴＧにより誘導され得る。

他のプロモーター／オペレーター系またはその一部分も
同様に使用され得る。例えば、コリシンＥｌ、ガラクト
ース、アルカリ性ホスファターゼ、トリプトファン、キ
シロース、タック（ｔａｃ）等も使用され得る。

特に興味深いのは、Ｏ／Ｐ　ハイブリッド・うＬＲ ムダ・プロモーターの使用である（例えば、■９８３年
９月３日付、米国特許出願番号第５３４９８２号参照−
この明細書に引用して説明の一部とする）。

他の好ましい宿主は、組織培養においてインビトロまた
は動物においてインビボ培養されたは乳類細胞である。

は乳類細胞は、正しい折り畳みまたは正しい部位でのグ
リコジル化を含めて免疫グロブリン蛋白質分子に翻訳後
修飾を提供する。

宿主として有用であり得るは乳類細胞には、線維芽細胞
由来の細胞、例えばＶＥＲＯもしくはＣＨＯ−Ｋ１１ま
たはリンパ様細胞由来の細胞、例えばハイブリドーマ５
Ｐ２１０−ＡＧ　１４もしくはミエローマＰ３ｘ６３Ｓ
ｇ８、およびそれらの誘導体がある。

幾つかの可能なベクター系が、は乳類細胞においてクロ
ーンされた単鎖結合蛋白質の発現に利用され得る。ある
種のベクターは、動物ウィルス、例えぼうし乳頭腫ウィ
ルス、ポリオーマウィルスまたは５Ｃ４０ウイルス由来
の染色体外プラスミドの自律的複製を提供するＤＮＡ要
素を利用する。

別の種類のベクターは、宿主細胞染色体への所望の遺伝
子配列の組込みを利用する。それらの染色体中へ導入さ
れたＤＮＡを安定的に組込ませる細胞は、薬剤耐性遺伝
子、例えばＥ、　ｃｏｌｉ（エシェリヒア・コリ）ＧＰ
ＴまたはＴ　ｎ　５　ｎｅｏも導入することにより選択
され得る。選択可能なマーカー遺伝子は、直接的に発現
されるべきＤＮＡ遺伝子配列に結合され得るか、または
共形質転換により同じ細胞中に導入され得る。また追加
要素も単鎖結合蛋白質ａ＋ＲＮＡの最適合成に必要とさ
れる。これらの要素には、スプライス・シグナル並びに
転写プロモーター、エンハンサ−および終止シグナルが
含まれ得る。前記要素を組み込むｃＤＮＡ発現ベクター
には、岡山により記載されたもの［「モレキ５６セル・
バイオｏ　Ｊ（Ｍｏｌｅｃ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、
）、３巻、２８０頁（１９８３年）］、その他がある。

別の好ましい宿主は酵母である。酵母は、それがグリコ
ジル化を含む翻訳後ペプチド修飾をも行い得るという実
質的な利点を提供する。酵母における所望の蛋白質の製
造に利用され得る強力なプロモーター配列および高コピ
ー数のプラスミドを利用する幾つかの組換えＤＮＡ戦略
が存在する。

酵母はクローンされたは乳類遺伝子生成物においてリー
ダー配列を認識し、リーダー配列を含むペプチド類（す
なわち前ペプチド類）を産生ずる。

グルコースを多く含有する培地で酵母を生長させると大
量に生成されるグルコース分解性酵素をコードする能動
的発現遺伝子からのプロモーターおよび終止要素を組み
込む一連の酵母遺伝子発現系が使用され得る。既知のグ
ルコース分解性遺伝子もまた非常に有効な転写制御シグ
ナルを提供し得る。例えば、ホスホグリセレートキナー
ゼ遺伝子のプロモーターおよびターミネータ−シグナル
が使用され得る。

当業界でよく知られている通り、−旦単鎖結合分子遺伝
子を有する株が構築されると、これはまた化学薬剤また
は照射を用いる突然変異生成技術に付され得る。こうし
て得られたコロニーから、高い結合アフィニティーを有
する結合分子を生成するものを求めることが可能である
。事実、コンピューターの助けを借りて設計された第１
リンカ−が活性分子を製造できない場合、これを含む宿
主株に突然変異生成処理を行い得る。次に、抗原を結合
し得る突然変異分子は常用検定によりスクリーニングさ
れ得る。

この発明の発現され再び折り畳まれた単鎖結合蛋白質は
、標準的免疫診断方法を実施するため、検出可能なラベ
ル、例えば放射性原子、酵素、ビオチン／アビジンラベ
ル、発色団、化学発光ラベル等によりラベルされ得る。

これらの方法には、きっ抗的および免疫測定（またはサ
ンドイッチ）検定が含まれる。これらの検定は、診断試
料における抗原の検出に利用され得る。きっ抗的および
／またはサンドイッチ検定において、この発明の結合蛋
白質はまた、不溶性固相、例えばビーズ、試験管または
他のポリマー性材料に固定化され得る。

イメージング処理の場合、この発明の結合分子は、不透
明薬剤、例えばＮＭＩ’ｉｌコントラスト剤またはＸ線
コントラスト剤によりラベルされ得る。

蛋白質へのラベルまたはイメージング薬剤の結合方法お
よび蛋白質を不溶性固相に結合させる方法は、当業界に
おいてよ（知られている。また再び折り畳まれた蛋白質
は、ラベルされるかまたは酵素もしくは毒素と結合され
た場合には治療、および、製品、特にバイオテクノロジ
ー工業により製造された製品の精製に使用され得る。蛋
白質はまたバイオセンサーにも使用され得る。

総括的にこの発明に関する記載を行ったが、下記の実施
例により、この発明に対する理解がさらに深められると
思われる。ただし、これらの実施例は説明を目的とし、
特記しない限り限定を意図するものではない。

［実施例］ これらの実験において、コンピューター補助による設計
に使用された基本的Ｆｖ３−Ｄ構造は、ＩｇＡクラスの
抗ホスホリルコリンミエローマ抗体、ＭＣＰＣ−６０３
の構造であった。この抗体のＸ線構造はブルックヘブン
・データベースから一般的に人手される。

これらの実施例における出発材料は、マウス抗うし成長
ホルモン（ＢＧＩ−１）を産生ずるモノクローナル抗体
セルライン３Ｃ２であった。この抗体は、ガンマ１重鎖
およびカッパ軽鎖を有するＩｇＣＩである。重鎖および
軽鎖配列のｃＤ　Ｎ　Ａ’をクローンし、ＤＮＡ配列を
決定した。成熟重鎖および成熟軽鎖に関するヌクレオチ
ド配列並びにこれらの配列の翻訳をそれぞれ第２１図お
よび第２２図に示す。

重鎖および軽鎖配列の可変領域のみを含むプラスミドを
製造した。部位突然変異法により、成熟配列の第１コド
ンの前にＣｌａｌ部位およびＡＴＧ開始コドン（ＡＴＣ
ＧＡＴＧ）を導入した。重鎖のコドン１２３および軽鎖
のコドン１０９の後に、Ｈｉｎｄｌ１１部位および終止
コドン（ＴＡＡＧＣＴＴ）を導入した。ＶＬ配列を含む
プラスミドはｐＧＸ３７７２であり、Ｖｌｌを含むプラ
スミドはｐＧＸ３７７３である（第２３図）。

当業界の熟練者公知の方法により下記例の組立ておよび
製造を行った。

実施例１ 単鎖結合分子の製造 Ａ、コンピューター設計 次のステップにより２−リンカ−例（ＴＲＹ４０と称す
）を設計した。

まず、軽鎖は重鎖の場合よりもかなり容易にエンエリヒ
ア・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）中で作り得ることが観察され
た。従って、軽鎖から始めることに決定した。（将来は
、重鎮におけるターン（回転）部および軽鎖の出口鎖間
に非常に類似した接触が存在ずろため、重鎖から始まる
例を確実に作成することができると思われろ）。

ＭＯＰＣ−６０３抗体からのＦｖの軽鎖および重鎖領域
を示す立体的第３０Ａ図を参照。不変領域は除く。上部
に軽鎖のアルファ炭素を結ぶ線を引く。軽鎖のアミノ末
端は、後方および図の中心から約１０時であり、ｒＮＪ
と標識されている。図の右端において、不変領域に向か
う通路を示す矢印は約２時である。重鎖のアルファ炭素
を結ぶ線は軽鎖の下である。重鎖のアミノ末端は、見る
人に向かって約７時であり、これもまたｒＮＪと標識さ
れている。約４：３０には、不変領域への重鎖通路を示
す矢印が示されている。

抗原結合部位は、左方、約９時および右方へ上（軽鎖）
および下（重鎖）を投影する２つのループ間である。

アルファ炭素トレースに加えて、非水素原子全部を描い
た３つの部分がある。これらの鎖は大体平行で右上方か
ら左下方に位置する。それらは、（ａ）軽鎖のプロリン
４６〜プロリン５０、（ｂ）重鎖のバリン１１１〜グリ
シン＋１３、（ｃ）重鎖のグルタミン酸Ｉ〜グリシン１
０である。

重鎖のトリプトファン１１２および軽鎖のプロリン５０
間の接触は非常に好ましいと思イつれる。

すなわち、これら２種の残基は保存されるべきであると
決定した。トリプトファン＋１２（重鎖）またはその次
に位置する残基をプロリン５０（軽鎖）またはその次に
位置する残基に結合する幾つかのリンカ−を求め、見つ
けた。立体的第３０Ｂ図は、さらに詳細にＴＲＰ１１２
Ｈの周囲の領域を示す。

文字ｒｒＪは、Ｔｒ？Ｐ　Ｉ　Ｉ　２およびＰＲ０５０
Ｌの側鎖間を表す。この接触の保持が望まれた。文字ｒ
ｑＪは、不変領域に向かうカルボキシ末端鎖を標識する
。ＰＲＯ５０Ｌに結合するリンカ−が見出されるのはこ
の鎖からである。

一旦＋　１２１−１を５０１．に結合するリンカ−を選
択すると、軽鎖の第１セグメントから重鎮の開始部分に
リンカ−を結合させる必要がある。ただし、Ｐ１１０４
６ＬはＰｆ１０５０Ｌに向かって鎖を回転させるものと
する。この回転は非常に有用であるため、ＰＲＯ４６Ｌ
の保存が決定された。すなわち第２リンカ−は４６Ｌの
後および５０Ｌの前で始まらなければならない（ストレ
ッチ・マーク「ｓ」で記す）。リンカ−の探索は、残基
４６Ｌ、４７１、または４８Ｌのいずれか一つで開始さ
れた。鎖か既に５０Ｌに向かって回転し、重鎖のアミノ
末端から離れていたため、残基４９Ｌで始まるリンカ−
は考慮されなかった。残基ＩＨ〜！０■４のいずれか−
っで終わるリンカ−を探した。

第３０Ｃ図は、結合構造を詳細に示す。Ｔ　ＲＩ）１１
２Ｉ−１およびＧＬＹ１１３Ｈの後に、配列ＰＲＯ−Ｇ
ＬＹ−９ＥＲが導入され、次いでＰＲ０５０Ｌが並んだ
。コンピューター・プログラムを用いて、リンカ−の原
子およびＦｖの保存部分の原子間の短い接触を捜した。

ＳＥｎのベータ炭素およびＰＲ０５０Ｌ間に一つの短い
接触が存在するが、小さな動きがそれに変化を与える。

この第１リンカ−は、ｒｘＪと標識された点から［ｙｊ
と標識された点に及ぶ。第２リンカ−は、ｒｖＪからｒ
ｗＪまでである。ただし、疎水性残基（Ｉ　ＬＥおよび
ＶＡＬ）の大部分は内側に存在する。外側にはＰ　ｌ−
Ｉ　Ｅが存在する。さらに、本来あるべき通り、２個の
りジン残基およびアスパラギン残基を溶媒に曝す。

第３０Ｄ図は、単鎖中に結合された分子全体を示す。

Ｂ、遺伝子組立 これらの組立を作成し、エシェリヒア・コリ宿主を用い
てそれらを含むプラスミドを生成した。

−旦組立てられると、この配列は、所望の有機体で使用
される発現媒体なら全てに挿入され得る。

第１の組立は、次の配列、Ｍｅｔ−［Ｌ−鎖ｌ−４１］
１１ａ　−Ａｌａ　−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ　−Ｌｙ
ｓ−Ａｓｎ目Ｉ−鎖８−１０５］−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓ
ｅｔ−［Ｌ−鎖４５−１０９］を有する蛋白質を生成す
るＴＲＹ４０（２リンカ−構造）であった。ヌクレオチ
ド配列およびその翻訳を第２４図に示す。３−■）分析
が、異なる特異性（抗ホスホリルコリン）を有するが可
変領域において類似した構造を有するＭ　ＣＰＣ−６０
３抗体のＦｖ領領域行なわれたとしても、ＴＲＹ４０に
おける高可変領域（ＴＲＹ６１．５９および１０４Ｂと
同様、下記参照）は、ＩｇＧ１抗Ｉ３　Ｇ　ｌ−１抗体
に対応する。

次の方法で、プラスミドｐＧＸ３７７２およびｐＧＸ３
７７３における抗体配列を結合してＴ　Ｉｔ　Ｙ２Ｏの
配列が得られた。使用されたプラスミドは、ＤＮＡ複製
のＭ１３バクテリオファージ・オリジンを含んだ。これ
らのプラスミドを含む宿主をバクテリオファージＭＩ３
により重感染させると、２タイプの子孫が生成され、一
方は単鎖ゲノムを含み、他方はプラスミドＤＮＡの特異
的環状単鎖を含む。このＤＮＡは、後のオリゴヌクレオ
ヂド部位突然変異誘発実験用に鋳型を提供した。鋳型Ｄ
ＮＡは２種のプラスミドから製造された。Ｅｃ。

Ｒ１部位を、ｐＧＸ３７７２’を生成する部位突然変異
によりｐＧＸ３７７２におけるＶ）Ｉ配列のコドン８の
前に導入した。この構造からの鋳型を製造し、ＸｂａＴ
部位を、ｐＧＸ３７７２°を生成するｖ１１１００コド
ン１０５の後に導入した。

ＥｃｏＲＩおよびＸｂａ１部位を、ｐＧＸ３７７３’を
生成する部位突然変異によりＶ、配列のコドン４１およ
び４５の間のｐＧＸ３７７３中に導入した。

リンカ−配列の対合を始めるために、プラスミドｐＧ　
Ｘ　３７７３’（ＶＬ）ＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＸｂ
ａｌで開裂し、うしアルカリ性ホスファターゼで処理し
た。このＤＮＡを、２種の制限酵素により開裂されたプ
ラスミドｐＧＸ３７７２“（Ｖｌｌ）から精製されたＥ
ｃｏＲＩ−Ｘｂａｌフラグメントに結合した。生成した
プラスミドｐＧＸ　３７７４は、ＥｃｏＲＩおよびＸｂ
ａｌ制限部位により結合された正しい順序ての軽鎖およ
び重鎖配列を有した。正しいリンカ−配列を骨格に挿入
するため、ｐＧＸ３７７４鋳型ＤＮＡを製造した。Ｅｃ
ｏＲＩ接合点を除去し、−１１ｅ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａ
ｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−をコードするリンカ−
を、プラスミドｐＧＸ３７７４°を生成する部位突然変
異により挿入した。鋳型ＤＮＡをこの構造から製造し、
Ｘｂａ１部位を補正し、プラスミドｐＧＸ３７７５を生
成ケる部位突然変異により〜Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　ｌｙ　−
Ｓ　ｅｒをコードするリンカ−を挿入した。ＤＮＡ配列
配列上り第２４図で列挙した通り、この配列は正しいこ
とが判明した。

単鎖ポリペプチドを発現させるために、配列、例えばＣ
１ａｌ〜ｌ−１ｉｎｄｌｌｌフラグメントをベクターｐ
ＧＸ３７０３中に挿入した。これは、ｏ　Ｌ／　ｐ　Ｒ
ハイブリッド・ラムダ・プロモーターの制御下に配列を
並べた（米国特許出願第５３４９８２号、１９８３年９
月２３日）。発現プラスミドはｐＧＸ３７７６である（
第２５図）。プラスミドｐＧＸ３７７６を、熱感受性ラ
ムダファージ・リプレッサーを含む宮主に形質転換した
。、３０℃で成長させると、ＴＲＹ４０蛋白質の合成が
抑制される。温度を４２℃に上昇させ、８−１６時間イ
ンキュベーションすることにより合成を誘発した。クー
マシーブルーで染色されたポリアクリルアミドゲル電気
泳動図で評価すると、細胞蛋白質合計７．２％の比率で
蛋白質が製造されていた。

実施例２ 単鎖結合分子の製造 Ａ、コンピユークー設計 ｌリンカ−例（ＴＲＹ６１と称す）を下記のステップに
より設計した。

Ｆｖの軽鎖および重鎖領域を示す立体的第３１Ａ図参照
。不変領域は除去する。軽鎖のアルファ炭素を結ぶ線を
引く。軽鎖のアミノ末端は、後方および図の中心付近に
位置し、ｒＮＪと標識されている。図の右端では、軽鎖
の不変領域に向かう通路を示す矢印が約２時に位置する
。重鎖のアルファ炭素を結ぶ線は軽鎖の下である。重鎖
のアミノ末端は見る人に向かって約９時にあり、これも
またｒＮＪと標識されている。約４：３０には、その不
変領域に向かう重鎖通路を示す矢印が存在する。

アルファ炭素トレースに加えて、非水素原子を全て描い
た２つの部分がある。これらの部分は軽鎖における最後
の敗残基および重鎖におけろ最初の１０残基である。こ
れらの残基の全ての対の間にリンカ−を求めたが、これ
らの領域は広く離れているためごく僅かしか見出されな
かった。

第３１Ｂ図は、正確な場所のリンカ−を示す。

ただし、分子は軽鎖のアミノ末端から重鎖のカルボキシ
末端鎖に進むものとする。また、抗原結合領域は左方、
リンカ−から分子の反対側に位置する。

Ｂ、遺伝子構造 ＴＲＹ６１（単一リンカ−例）の配列は、Ｍｅｔ［Ｌ−
＆ｃ１　ｌ−１０４１−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−５ｅ
ｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ　−１１ｅ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｌ
ａ−Ｖａｔ　−１（ｉｓ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−［Ｈ−鎖７
−１２３コである。ヌクレオヂド配列およびその翻訳を
第２６図に示す。

ＴｌＩＹ６１を組立てるため、プラスミドｐＧｘ３７７
２°ＤＮＡをＣ１ａｌおよびＥｃｏＲｒにより開裂し、
うしアルカリ性ホスファターゼで処理した。このＤＮＡ
をｐＧＸ３７７３からのＣ１ａｌ〜Ｈｉｎｄｌｌｌフラ
グメント並びにリンカ−配列をコードし、Ｈｉｎｄｌｌ
ｌおよびＥｃｏＲｒ端を有する２つのオリゴヌクレオチ
ドに結合すると、リンカ−は正しい配向でのみ結合され
得る。生成したプラスミドｐＧＸ３７７７を用いて鋳型
ＤＮＡを製造した。

このＤＮＡを部位突然変異に用いることにより、抗体配
列内側のＨｉｎｄｌ１１部位を除去した。正しい構造の
ｐＧＸ３７７７’を用いることにより、部位突然変異に
用いる鋳型ＤＮＡを作成し、ＥｃｏＲ１部位を除去した
。ＴＲＹ６１コード配列を含む最終構造ｐＧＸ３７７８
からのＣｌａ　Ｉ　〜Ｈ１ｎｄｌｌｌフラグメントをＤ
ＮＡ配列決定により確認した。Ｃ１ａ　Ｉ　〜Ｈ１ｎｄ
ｌｌｌをｐＧＸ３７０３発現ベクター中に導入した。こ
のプラスミドはｐＧＸ４９０４と呼ばれる（第２７図）
。このプラスミドをＥ、　Ｃｏｔｉ宿主に形質転換した
。このプラスミドを含む株を誘発したら、単鎖蛋白質は
細胞蛋白質を合計〉２％の割合で製造した。

実施例３ 単鎖結合分子の製造 Δ、コンピューター設計 ｌリンカ−例（ＴＲＹ５９と称す）を下記のステップに
より設計した。

Ｆｖの軽鎖および重鎖領域を示す立体的第３２Ａ図参照
。不変領域は除去する。上方に軽鎖のアルファ炭素を結
ぶ線を引く。軽鎖のアミノ末端は、後方および図の中心
から約１０時に位置し、ｒＮＪと標識されている。図の
右端では、軽鎖の不変領域に向かう通路を示す矢印が約
２時に位置する。重鎖のアルファ炭素を結ぶ線は軽鎖の
下である。重鎖のアミノ末端は見る人に向かって約８時
にあり、これらまたｒＮＪと標識されている。約４３０
には、その不変領域に向かう重鎮通路を示す矢印が存在
する。

アルファ炭素トレースに加えて、非水素原子を全て描い
た２つの部分がある。これらの部分は軽鎖における最後
の敗残基および重鎖における最初の１０残基である。こ
れらの残基の全ての対の間にリンカ−を求めたが、これ
らの領域は広く離れているためごく僅かしか見出されな
かった。

第３２Ｂ図は、正確な場所のリンカ−を示す。

ただし、分子は軽鎖のアミノ末端から重鎖のカルボキシ
末端鎖に進むものとする。また、抗原結合領域は左方、
リンカ−から分子の反対側に位置する。

ＴＲＹ５９における最終点の選択は、ＴＲＹ　６１と非
常に類似している。この鎖長を有するリンカ−は稀であ
る。非常によく適合し、２リンカ−例（ＴＩＩＹ４０）
に関して見出され得る目標に達し得ない短いリンカ−間
のきっ抗および１個のみリンカ−を有するという要求（
この方が正確に折り畳めると思われる）は、ＴＲＹ５９
の受は入れにおいて明白である。リンカ−は第３２Ｂ図
のｒＡＪ点から「Ｊ」点に及ぶ。５個の残基の後、リン
カ−は螺旋状になる。しかしながら、ｒｘＪ点の位置で
、ＩＬＥ残基の側鎖は軽鎖の部分と接触する。従って、
その残基は実際の構造ではＧＬＹに変換された。

ＩＣ遺伝子構造 ｉ’　ＲＹ　５９　（単一リンカ−構造）の配列は、Ｍ
ｅｔ［Ｉ７−鎖１−１０５］−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ
−ＧｌｙＳｅｒ　−Ｖａｌ　−Ｓｅｒ　−Ｓｅｒ　−Ｇ
　ｌｕ　−Ｇ　Ｉｎ　−ＬｅｕＡ　Ｉａ　−Ｇ　Ｉｎ　
−Ｐｈｅ　−Ａｒｇ　−Ｓｅｒ　−Ｌｅｕ　−Ａｓｐ　
−［Ｈ鎖１−１２３］である。このアミノ酸配列をコー
ドするヌクレオチド配列およびその翻訳を第２８図に示
す。■、配列を含むプラスミドＰＧＸ３７７３からのＢ
ｇｌｌ　〜Ｈｉｎｄｌｌｌフラグメント（時計回りに読
むものとずろ）およびｐＧＸ３７７２からのＣｌａｌ−
８ｇｌｌフラグメント（時計回り）を、ＴＲＹ５９にお
けるリンカ−配列を含むフラグメントを形成し、Ｃｌａ
ｌおよびＨｉｎｄｌｌｌ端を有する２つのオリゴヌクレ
オチドと結合させた。このプラスミド内のＣｌａｌおよ
びＨｉｎｄｌｌｌ接合部を２回の連続部位突然変異によ
り補正し、正しい構造を生成させる。実施例１および２
と同様、このプラスミドからのＣ１ａｌ　〜Ｈｉｎｄｌ
ｌｌフラグメントをＯＬ／　Ｐ　Ｒ発現ベクターに挿入
する。生成したプラスミド、ｐＧＸ４９０８（第２９図
）をエシェリヒア・コリ宿主に形質転換する。この株を
誘発することにより、第２８図の配列（ＴＲＹ５９）に
よりコードされた蛋白質を生成させる。

実施例４ 単鎖結合分子の製造 Ａ、コンピューター設計 この設計では、軽鎖および重鎮可変領域を結合するリン
カ−の別の選択方法を用いた。ひとヘモグロビンから得
られた螺旋状セグメントを選択し、可変軽鎖のカルボキ
シ末端および可変重鎖のアミノ末端間の長い距離をつな
いだ。コンピューター・グラフィックス・システムを用
いてひとヘモグロビンから得られたこのアルファ螺旋を
Ｆｖモデルの後部に置いた。重鎖および軽鎖の各アミノ
およびカルボキシ末端付近に端部を有する螺旋が存在す
るように配慮した。またＦｖに向かって疎水性側鎖およ
び溶媒に向かって親水性側鎖を位置させるように配慮し
た。前記コンピュータ一方法により（実施例１−３）、
可変領域端部およびヘモグロビン螺旋間の結合場所を選
択した。

１３、遺伝子構造 ’ｒ’ＲＹＩ０４ｂ（単一リンカ−構造）の配列は、Ｍ
ａｔ−［Ｌ−鎖１−１０　Ｇ］−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌ
ｙ−’ｌ’ｈｒ−［（ヘモグロビン螺旋）　Ｌ　ｅｕ　
−Ｓ　ｅｔ　−Ｐ　ｒｏ　−Ａ　ｌａ　−Ａｓｐ　−Ｌ
ｙｓ　−Ｔｈｒ＝　Ａｓｎ　−Ｖａｌ　−Ｌｙｓ−Ａｌ
ａ　−Ａ　Ｉａ　−Ｔｒｐ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｌｙｓ　−
Ｖａｌｌ−Ｍｅｔ　−Ｔｈｒ−［Ｈ−鎖３−１２３］で
ある。このアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
およびその翻訳を第３３図に示す。ＶＬ配列を含むプラ
スミドｐｃＸ３７７３からのＢｇｌｌ〜Ｈｉｎｄｌｌｌ
フラグメント（時計回りに読む）およびｐＣＸ３７７２
からのＣｌａｌ〜Ｂｇｌｌフラグメント（時計回り）を
、ＴＲＹ　１０４ｂにおけるリンカ−配列を含むフラグ
メントを形成し、Ｃｌａｌおよびｌ−１ｉｎｄｌｌｌ端
を有する２つのオリゴヌクレオチドと結合させた。この
プラスミド内のＣｌａｌおよびＨｉｎｄｌｌ！接合部を
２回の連続部位突然変異により補正し、正しい構造を生
成させる。実施例１−３と同様、このプラスミドからの
Ｃｌａｌ〜Ｈ１ｎｄｌｌｌフラグメントをＯＬ／ＰＲ発
現ベクターに挿入する。生成したプラスミド、ｐＧＸ４
９１０（第３４図）をエシェリヒア・コリ宿主に形質転
換する。この株を誘発することにより、第３３図の配列
（ＴＲＹ１０４ｂ）によりコードされた蛋白質を生成さ
せる。

実施例５ 蛋白質の精製 ＴＲＹ４０ＳＴＲＹ６１、ＴＲＹ５９およびＴＲＹ１０
４ｂから得られた単鎖抗原結合蛋白質は不溶性であり、
これらの蛋白質生成に誘発される細胞は、顕微鏡検査に
よると屈折力のある細胞封入体であることを示す。誘発
された細胞を遠心分離により集めた。湿った沈澱をドラ
イアイスにより冷凍し、−２０℃で貯蔵した。冷凍沈澱
を緩衝液に懸濁し、同緩衝液で洗浄し、続いて細胞を同
緩衝液に懸局した。フレンチプレスセルに通すことによ
り、細胞を破壊し、遠心分離および洗浄を繰り返すこと
により、単鎖抗原を含む細胞封入体を精製した。沈澱を
グアニジン−ＨＣＣに可溶化し、２−メルカプトエタノ
ールで還元した。可溶化された材料をゲルろ過カラム、
すなわちセファクリル（商標）Ｓ−３００ｊこ通した。

他の方法、例えばイオン交換クロマトグラフィーら使用
され得る。

実施例６ 蛋白質の折り畳み 精製材料を水に対して透析し、沈澱蛋白質を遠心分離に
より集めた。蛋白質を尿素に可溶化し、２−メルカプト
エタノールで還元した。この変性および可溶化された材
料を、塩および還元剤を含む緩衝液に対して透析し、レ
ドックス・ポテンシャルを確立して領域内（軽鎖および
重鎖可変領域配列に関して各々１つ）ジスルフィド架橋
を形成させた［サクセナおよびウニトランファー、「バ
イオケミストリーＪ（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、）、９巻５０
１５−５０２３頁（１９７０年）］。折り畳まれた蛋白
質をＢＧ　Ｉ−１結合活性について検定した。

実施例７ 結合検定 Ｂ　Ｇ　Ｉ−１を、非特異的蛋白質、例えばうし血清ア
ルブミンまたはリソチーム随伴ニトロセルロースストリ
ップに固定化した。さらに非特異的蛋白質結合を免疫学
的不活性蛋白質、例えばゼラチンによりブロックした。

折り畳まれたＳＣＡをＢ　Ｇ　Ｈ結合能に関して試験し
た。うさぎ抗し鎖（モノクローナルの）抗血清によりＳ
ＣＡを検出した。うさぎ抗体をペルオキシダーゼと結合
したやぎ抗うさぎｒｇＧと反応させた。ペルオキシダー
ゼが存在する場合ペルオキシダーゼと反応して着色反応
を起こす化学薬品と前記ストリップを反応させた。

第３５図は、ＴｎＹ６１（ストリップｌ）およびＴＲＹ
４０（ストリップ２）におけるこのスポット検定の結果
を示す。ストリップ３をアミドブラックで染色すると、
３蛋白賃金部の存在を示した。

他の蛋白質、ＴＲＹ５９、ＴＲＹ　Ｉ　０４ｂもこのス
ポット結果において同様の結果を示した。モノクローナ
ルときっ抗するＳＣＡによるきっ抗検定ら使用され得る
。アフィニティー精製された１および１０７Ｂの’Ｉ’
ＲＹ５９蛋白質と３Ｇ２モノクローナルのＦａｂのきっ
抗結果を第３６図に示す。

この実験のｒｃ５ｏから評価されたアフィニティーは約
１０８であった。データを第１表に要約する。

第１表 単鎖構造により生成された蛋白質の特性ＴＩＹ４０　　
　２　　　　　＋　　　　　−、ＮＤＴｎＹ５９　　　
１　　　　　＋　　　　　＋　　　　　　１０６ＴＩｊ
Ｙ６１　　　１　　　　　　＋　　　　　−ＮＤＴＩＩ
Ｙ１０４ｂ　　　　Ｉ　　　　　　＋　　　　　　＋　
　　　　　　ＮＤ３Ｃ２モノ クローナル　　ＮＡ　　　　十＋　　　　１０’−１０
’ＮＤ−測定されず。

ＮＡ−適用不可能。

この実施例は、この発明の単鎖結合蛋白質が、特異的分
子結合においてモノクローナル抗体と同様に有効である
ことを示す。すなわち、この発明の単鎖結合分子を抗体
（ポリクローナルまたはモノクローナル）または抗体フ
ラグメントと同様に使用することにより、リガンド分子
の存在および／または濃度について検定することができ
る。

実施例８ 抗うし成長ホルモン単鎖抗原結合蛋白質の結合活性 ３ｃ２／’ｒＲｙ５９遺伝子をエシェリヒア・コリにお
いて発現させろと、単鎖蛋白質が不溶性細胞封入体に蓄
積する。これらの細胞封入体からの３Ｃ２／ＴＲＹ５９
蛋白質は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り測定すると、２６０００ダルトンの見かけ分子量を示
した。これは、アミノ酸配列から計算された分子ｆｉ２
６６５２ダルトンとほぼ等しい。

エシェリヒア・コリ細胞ペーストを５０ミリモルのトリ
ス（ｐＨ８、２）、５ミリモルのエヂレンジアミンテト
ラアセテート（ＥＤＴＡ）、０．０４ミリモルのＰＭＳ
Ｆおよび０．１％のβ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ
）に１０倍重９／容量割合で再懸濁し、！６００ｐｓｉ
のフレンチ・プレス・セルに２回通過させて破裂さける
ことにより、３Ｃ２／ＴＲＹ５９発現エシェリヒア・コ
リ細胞を溶菌した。新鮮なＰＭＳＦを初回通過後に加え
た。

超音波処理により細胞残骸をさらに破壊した。細胞抽出
物をリソチーム（Ｉ００μｙ／ｘ１２）およびデオキシ
リボヌクレアーゼＩ（１０μ９／ｆｆ□と１時間室温で
インキュベーションした。粗細胞封入体沈澱を１時間７
５０ｘｙの遠心分離により回収し、出発緩衝液で２回洗
浄し、５０ミリモルのグリシン、ｐｌ−１１０，８，９
モルの尿素、１ミリモルのＥＤ　１”　Ａおよび２０ミ
リモルのＢＭＥに可溶化した［ボス等、［ニュークレイ
ツク・アシッズ・リサーチＪ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ　
Ｒｅｓ、）、１２巻、３７９１頁（１９８４年）］。

可溶化された細胞封入体を１０分間１２０００×９の遠
心分離により透明にし、次いで可溶化緩衝液中１００μ
９／村の最終蛋白質濃度に希釈した。希釈された細胞封
入体を３交換のｌＯ倍容爪の５０ミリモルのグリシン、
ｐｉｆＩＯ，８、！００ミリモルのＫＣｆ！、５．０％
のグリセロール、０゜０５ミリモルのＥＤＴＡ、１ミリ
モルの還元グルタチオンおよび０．２ミリモルの酸化グ
ルタチオンに対して透析した［サクセナ等、［バイオケ
ミストリーＪ（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、）、９巻、５０Ｉ５
頁（１９７０年）］。再生蛋白質を最後に１０倍容量の
燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に対して透析した。

３モルのチオシアン酸ナトリウムを溶離液として用いた
（中性ｐＨ）ＢＧＨ−セファロースにおけるアフィニテ
ィー・クロマトグラフィーにより可溶化再生抗ＢＧ８３
Ｃ２１５９蛋白質を精製した。

還元および非還元の両条件下でＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分析すると、アフィニティー精製
蛋白質は２６０００ダルトンの単一バンドとして泳動す
る。有効に折り畳まれたため、ＢＧＨ−セファロースカ
ラムに結合し得る蛋白質の量は、種々の実験において５
−３０％の間で変化した。チオシアネート溶離後にアフ
ィニティー精製蛋白質が結合活性を保持していることを
立証するため、それを２番目のＢ　Ｇ　Ｈ−セファロー
スカラム上に載せた。第３７図で示す通り、９０％を越
えろ単鎖蛋白質がＢｃＨ−セファロースと結合し、チオ
シアネートにより溶離した。これはアフィニティー精製
蛋白質が抗原結合活性を保持していることを示す。並行
実験において、６つの高可変領域のうち５つの配列が変
えられた修正３Ｃ２１５９遺伝子から生成された単鎖蛋
白質は、ＢＯＨ−セファロースと結合しなかったが、こ
れは結合が抗原結合部位で生じたことを立証している。

３Ｃ２／ＴＩＩＹ５９蛋白質は、ウェスタン・プロット
において精製３Ｃ２軽鎖に対して製造された抗血清と交
差反応し得ることが判ったが、これは、単鎖結合分子が
生物学的結合活性を有することを示すしのであった。

３Ｃ２モノクロ一ナル抗体から単離されたＦａｂフラグ
メントときっ抗させることにより、Ｂ　Ｇ　Ｉ（に関す
る精製３Ｃ２１５９蛋白質の相対的アフィニティーを測
定した。高い量の非標識ＦａｂフラグメントをＣ５５）
−メチオニン標識３Ｃ２１５９蛋白質と混合し、混合物
をＢＧＨ−セファロースとインキュベーションした。イ
ンキュベーション後、結合した放射性標識蛋白質の虫を
測定した。きつ抗曲線を第３８図に示す。放射性標識蛋
白質の結合を５０％阻害したＦａｂの濃度は、放射性標
識蛋白質濃度の半分であった。このことは、３Ｃ２１５
９単鎖蛋白質のＫａが、ＦａｂのＫａの４の係数以内で
あることを示した。この結果は、この発明の単鎖結合分
子の結合活性が抗体の活性と等しいことを示す。

実施例９ 単鎖結合分子の製造 Ａ、コンピューター設計 可変領域構造の後方の溝に適合するペプチドを製造し、
■　およびＶｔ、鎖のリンカ−として使用Ｉ した。このリンカ−は、主として交互のグリシンおよび
セリン残基で構成され、溶解度を高めるために挿入され
たグルタミン酸およびリジン残基を含む。又、■、配列
のカルボキシ末端およびＶＩ。

配列のアミノ末端のアミノ酸を出発および終止点として
選んだ。構造を可視化するためコンピューター・グラフ
ィックスを用いて、ＶＬ！ｌがｖＨＩＩと結合されるま
でリンカ−アミノ酸を同時に加えた。抗フルオレ（ス）
セイン１８−２−３−／ＴＲＹ２Ｏ２°および４−４−
２０／ＴＲＹ２Ｏ２°単鎖蛋白質におけるリンカ−は、
この２番目のタイプの例である。共に出願中の米国特許
出願番号第０９２１４７号記載の方法（この出願を完全
に引用して説明の一部とする）により、このリンカ−を
設計した。

Ｂ、遺伝子組立て ２種の異なる抗フルオレスセインモノクローナル抗体、
１Ｂ−２−３、ＩｇＭ［バラード等、「プロンーディン
グズ・オブ・ザ・ナノヨナル・アカデミ−・オブ・ザイ
エンソーズ・オブ・ニーニスエイＪ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔｌ、　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）、８０巻、
５０７１頁（１９８３年）］および４−４２０．１ｇ０
２ａ［フランツ等、［モレキュラー・イミュノロジーＪ
（Ｍｏ１．　　［ｍｍｕｎｏｌ、）、１８巻、８８９頁
（１９８１年）］の可変領域の配列を用いて、単鎖抗原
結合蛋白質遺伝子を組立てた。その抗体抗原系は十分特
徴が把握されているため［「フルオレスセイン・ハプテ
ン：アン・イミュノロジカル・プローブＪ（Ｆ　１ｕｏ
ｒｅｓｃｅｉｎ　Ｈａｐｔｅｎ：　ａｎ　　Ｅ　ｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｐ　ｒｏｂｅ）中、ボス編、シー
・アール・シー・プレス社、ポカ・シートン（１９８４
年）参照］、単鎖抗原結合蛋白質技術の連続開発用に抗
フルオレスセインモノクローナル抗体を選んだ。

フルオレスセインに対する高いアフィニティーを有する
幾つかの抗フルオレスセインモノクローナル抗体が単離
され、フルオレスセインのクエンチングに基づいた結合
に関する定量的検定が記載されている［ヘロン、［フル
オレスセイン・ハプテン：アン・イミュノロジカル・プ
ローブＪ（Ｆ　１ｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　Ｈａｐｔｅｎ：
　ａｎ　ｒ　ｆｆｉｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｐｒｏｂ
ｅ）中、ボス編、シー・アール・シー・プレス、ポカ・
シートン、４９−７６頁（１９８４年）コ。

各鎖の第１不変領域に相捕的なオリゴヌクレオチドを有
するハイブリドーマ細胞から単離されたＲＮＡにおいて
プライミングすることにより、ＶＬＶＨｃＤＮＡ配列を
合成した。単離されたｃＤＮＡクローンが■５お上びＶ
Ｈ鎖をコードすることを確かめるために、ヌクレオチド
配列から翻訳されたアミノ酸配列を、親抗体のＮ末端ア
ミノ酸配列と比較した。Ｉ　８−２−３／ＴＲＹ２０２
″、＋８−２−３／ＴＲＹ５９および４−４−２０／Ｔ
ＲＹ２Ｏ２’に関する配列をそれぞれ第３９．４０およ
び４１図に示す。

上記抗ＢＧＨ３Ｃ２／ＴＲＹ５９蛋白質の場合と同様に
して、抗フルオレスセイン単鎖抗原結合蛋白質を製造し
、可溶化し、再生させた。再生後、活性＋　１１１−２
−３／ＴＲＹ５９蛋白質をフルオレスセイン・セファロ
ース・アフィニティー・カラムで精製した。結合活性を
検定するため、蛍光を、一定量の１８−２−３／ＴＲＹ
５９蛋白質および＋　８−２−３モノクロ一ナル抗体の
存在下にＩＱｊｌ〜１Ｏ−７モルの範囲のリガンド濃度
で測定した。フルオレスセイン結合蛋白質を加えたとき
に消光したフルオレスセイン蛍光のフラクションは、蛋
白質により結合されたフルオレスセインの定量的尺度で
ある。これらの測定法を用いて、１８−２−３／ＴＲＹ
５９蛋白質および１８−２３モノクロ一ナル抗体に関す
る相対的アフィニティ一定数を計算した。加えられた蛋
白質は全て活性であるものと仮定した。従って、実際の
結合アフィニティーより小さい値が計算により得られる
。＋８−２−３１５９単鎖蛋白質は、結合部位！モル当
たりｌ　８−２−３モノクロ一ナル抗体の場合と同等に
フルオレスセインと結合した。このことは、アフィニテ
ィーが同一であることを示している。＋　８−２−３／
’ｌ”ＲＹ２０２°蛋白質は、！　８−２−３モノクロ
一ナル抗体の場合の０，６Ｘのアフィニティーを有する
ことが測定された。

フルオレスセイン・セファロースにおけるアフィニティ
ー・クロマトグラフィーによる蛋白質の再生および精製
後、抗フルオレスセイン４−４−２０／ＴＲＹ２０２°
蛋白質のアフィニティ一定数（Ｋａ）を測定した。４−
４−２０モノクロ一ナル抗体由来のＦａｂの場合のＢｘ
１０８（！１モルと比べて、４−４−２０／ＴＲＹ２Ｏ
２°蛋白質のＫａは！ＩｘｌＯ’Ｌ１モルである。これ
らのアフィニティ一定数は、詳細な蛍光クエンチング検
定およびデータのスカッヂや−ド分析から測定された。

ワット等［「イミュノケミストリーＪ（Ｉ　ｍｍｕｎｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１４巻、５３３頁（１９７７年
）１は、フルオレスセインを抗フルオレスセイン抗体に
より結合させると、蛍光の吸光スペクトルは、４９３ｎ
ｕｎで最大から約５０５ｎｍ最大に変化することを記載
している。この変化が単鎖抗原結合蛋白質に結合したフ
ルオレスセインにより生じたのか否かを試験ずろため、
励起波長の関数として放射された蛍光により４−４．−
２０／ＴＲＹ２Ｏ２°蛋白質の吸収スペクトルを測定し
た。結果を第４２図に示す。放射スペクトルは４７０−
５１５ｒ＋ｍの励起波長を越えて測定された。左の曲線
は常に遊離フルオレスセインの放射であり、右の曲線は
結合したフルオレスセインの放射である。（Ａ、４−４
２０モノクロ一ナル抗体；Ｂ、４−４−２０Ｆａｂ；ｃ
、　４−４−２０／２０２’蛋白質）。４−４２０／Ｔ
ＲＹ　２０２’蛋白質は、最大４９３〜５０５ｎｍの励
起においてモノクローナル抗体およびＦａｂと類似した
変化を生じさせる。このことは、モノクローナル抗体に
よる結合と同様に、フルオレスセインが４−４−２０／
２０２°蛋白質と結合していることを示す。

これらの結果は、この発明の方法が、生成および可溶化
され得、モノクローナル抗体の場合と特異性およびアフ
ィニティーが等しい生物学的結合活性を呈し得る単鎖結
合分子の構造を同定し得ることを証明している。

上記内容は特に好ましい具体例に関するものであるが、
この発明を限定している訳ではないものとする。当業者
であれば、開示されている具体例に様々な修正を加え得
ること、およびかかる修正もこの発明の範囲内に含まれ
ることは容易に想到し得ることである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、この発明の直列プロセッサー・モードのハー
ドウェア相のブロックダイアグラムである。 第２図は、この発明のハードウェア相の代替具体例のブ
ロックダイアグラムである。 第３図は、この発明の３段階ジェネラルステップのブロ
ックダイアグラムである。 第４図は、単一リンカ−態様における部位選択段階にお
けるステップのブロックダイアグラムである。 第５Ａ図は、部位選択工程の説明に使用される２種の天
然アグリゲート抗体可変領域Ｆｖポリペプチド鎖の軽鎖
りお上び重鎖Ｉ］を概略的に２次元で簡単に表わしたも
のである。 第５Ｂ図は、１抗体の可変領域の軽鎖Ｌ　（−−−−−
）および重鎖Ｈ（−）を示す２種のアグリゲートしたポ
リペプチド鎖の３次元的関係を２次元的に表したもので
ある。 第６Ａ図は、残基タウｌおよび残基シグマ１の位置を示
す２種のポリペプチド鎖の簡単な２次元概略図である。 第６Ｂ図は、残基タウ１および残基シグマ１の２種のポ
リペプチド鎖の実際の関係を２次元的に表したものであ
る。 第７図は、非常に簡単な概略的手法で、各々残基タウｌ
および残基シグマｌにおける軽鎖りおよび重鎖Ｈに存在
し得る様々な部位間で可能な方向を示すリンカ−の概念
を示す。 第８Ａ図は、単鎖抗体を製造させるリンカ−１（・・・
）により２種の別々の鎖（（重））および（−（軽））
を−緒に結合する単鎖抗体の簡単な２次元概略図である
。 第８Ｂ図は、リンカ−１を用いて２種のアグリゲートし
たポリペプチド鎖を結合することにより製造された単鎖
抗体を示す２次元表示図である。 第９図は、正確なスパンに関する候補（ｃａｎｄ　１ｄ
ａｔｅ）選択のブロックダイアグラムを示す。 第１０図は、Ｎ末端からＣ末端への正確な方向に関する
候補選択のブロックダイアグラムを示す。 第１！図は、ギャップ（ｇａｐ）の方向と候補の方向の
比較を示す。 第１２図は、両端における正しい方向に関する候補選択
のブロックダイアグラムを示す。 第１３図は、２リンカ−の具体例に関する部位の選択の
ブロックダイアグラムを示す。 第１４図は、候補をランク付けし得る規則の例を示す。 第１５Ａ図は、第一の結合されるべき２部位を示す、Ｆ
ｖ軽鎖りの可変領域およびＦｖ重鎖１１の可変領域を２
次元で簡単に表したものを示す。 第１５Ｂ図は、結合されるべき第二の部位が見出され得
る領域および第一対の部位の間のリンカ−を示す、Ｆｖ
軽鎖りの可変領域およびＦｖ重鎖１−１の可変領域間の
３次元的関係を２次元的に俵したものを示す。 第１６Ａ図は、結合されるべき第二部位が見出され得る
領域および第一対の部位の間のリンカ−を示す、Ｆｖ軽
鎖りの可変領域およびＦｖ重鎖Ｈの可変領域を２次元的
に簡単に表したものを示す。 第１６Ｂ図は、結合されるべき第二部位が見出され得る
領域および第一対の部位の間のリンカ−を示す、Ｆｖ軽
鎖りの可変領域およびＦｖ重鎖ＩＩの可変領域間の３次
元的関係を２次元的に表したらのを示す。 第１７Ａ図は、第ニリンカーおよび失われた天然蛋白質
部分を示す、Ｆｖ軽鎖りの可変領域およびＦｖ重鎖■４
の可変領域を２次元的に簡単に表したらのを示す。 第１７Ｂ図は、第ニリンカーおよび失われた天然蛋白質
部分を示す、Ｆｖ軽鎖Ｉ、の可変領域およびＦｖ重鎖Ｈ
の可変領域間の３次元的関係を２次元的に表したものを
示す。 第１８図は、完全な構造を示す、Ｆｖ軽鎖りの可変領域
およびＦｖ重鎖■４の可変領域を２次元的に簡単に表し
たらのを示す。 第１９図は、この発明の並列処理モードのブロックダイ
アダラムを示す。 第２０Ａ図は、５部分（ｐｉｅｃｅ）の分子構造を示す
。 第２０Ｂ図は、ギャップの第１ペプチドと一直線に並ん
だリンカ−２，３および４の開始ペプチドを示す。 第２（）０図は、リンカ−３および４の最初と最後のペ
プチドを構成する１０ｇ１の原子を示す（これらはギャ
ップからの対応する原子に対して最小二乗性適合度を存
ず）。 第２１図は、マウス抗うし成長ホルモン（ＢＧＩＩ）モ
ノクローナル抗体の重鎖に関する配列のヌクレオチド配
列および翻訳を示す。 第２２図は、第２１図の場合と同じモノクローナル抗体
の軽鎖に関する配列のヌクレオチド配列および翻訳を示
す。 第２３図は、第２１図および第２２図に示された可変重
鎖配列（ｐＧＸ３７７２）を含むプラスミド制限酵素地
図および可変軽鎖配列（ｐＧＸ３７７３）を含むプラス
ミド制限酵素地図である。 第２４図は、この発明の方法に従い製造された単一ポリ
ペプチド鎖結合蛋白質のヌクレオチド配列およびその翻
訳配列を含む構造のＴＲＹ４０を示す。 第２５図は、単鎖結合蛋白質を倒える発現ベクターｐＧ
Ｘ３７７６の制限酵素地図を示す（その配列は第２４図
に示されている）。 第２６図は、この発明の別の単鎖結合蛋白質、ＴＲＹ６
１の配列を示す。 第２７図は、第２６図に示された遺伝子配列を携える発
現プラスミドｐＧＸ４９０４を示す。 第２８図は、この発明の別の単鎖結合蛋白質、ＴｆｌＹ
　５９の配列を示す。 第２９図は、第２８図に示された遺伝子配列を携える発
現プラスミドｐＧＸ４９０８を示ず。 第３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｇおよび３０Ｄ（立体）図は、
実施例１において詳細に説明されている、二重績２合の
単鎖抗体ＴＲＹ４０の設計および構造を示す。 第３１Ａおよび３１Ｂ（立体）図は、実施例２において
詳細に説明されている、単一結合の単鎖抗体ＴＲＹ６１
の設計および構造を示す。 第３２Ａおよび３２Ｂ（立体）図は、実施例３において
詳細に説明されている、単一結合の単鎖抗体Ｔ　ＲＹ　
５９の設計および構造を示す。 第３３図は、実施例４において説明されており、Ｔ［え
ＹＩ０４ｂの配列を示す。 第３４図は、単一リンカ−構造を有する発現ベクターｐ
ＧＸ４９１０の制限酵素地図を示す（その配列は第３３
図に示されている）。 第３５図は、ストリップ１がＴＲＹ６１を表し、ストリ
ップ２がＴＲＹ４Ｑを表す、Ｂ　Ｇ　Ｈ結合活性に関す
る検定結果を示す。 第３６図は、実施例４において説明されており、’ｌ’
　ｆｌ　Ｙ　５９蛋白質と３Ｃ２モノクローナルのＦａ
ｂ部分のきっ抗結果を示す。 第３７図は、単鎖結合分子のうし成長ホルモンセファロ
ース（Ｂ　Ｇ　Ｈ−セファロース）との結合能力を示す
。 第３８図は、Ｂ　Ｇ　ｆ−１結合に関するこの発明の単
鎖結合分子とのＦａｂ抗体フラグメントのきっ抗能力を
示すきっ抗曲線を表す。 第３９．４０および４１図は、単鎖結合分子、各々Ｉ　
８−２−３／ＴＲＹ　２０２°、＋８−１３／ＴＲＹ５
９および４−４−２０／ＴｒｔＹ２０２’のアミノ酸お
よびヌクレオヂド配列を示す。 第４２図は、４−４−２０モノクロ一ナル抗体（Ａ）、
この抗体から製造されたＦａｂフラグメント（Ｂ）およ
び４−４−２０／ＴＲＹ２Ｏ２°蛋白質（Ｃ）と結合し
たフルオレスセインの吸収プロフィールを示す。 特許出願人　ジェネックス・コーポレーション代　理　
人　弁理士　青　山　葆　ほか１名八いｑ よ でＨ 芯７と届ν群′″ｒ品 Ｆ／Ｇ、Ｚ２ Ｏコ Ｏコ 用芯花胚覧こ姥傳菖マこス面 顕τこス久＋こ傳頴傳容こ頴＝スｇ Ａχス　ＣＴＣＴＣＣＴに〒　ＧＣＡ　　ＧＣＣＴＣＴ
　　ＧＧＸ　　ＴＴＣ普唸ま簀Ｋｇ田做寓普Ｔに ト〒ど昌ど冨どｌ、、Ｘス講迄 ＦｉＧ、２Ｌ１ ＴＦＩＹ５１ ＳＣａ　ｔｒｙ　６１ く Ｆ／Ｇ、　２６ Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ａ！！ｎ　ＶＯＩ　　Ｌｅｕ　ｎｙ　
Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｐｒ。 ＡＴＧ　　ＧＡＡ　　ＡＡＴ　　ＧＴＧ　ＣＴＣＡＣＣ
ＣＡＧ　　Ｔ口ＴＣＧＡ定ＦＧ　Ａこ擺筋傳ス冨覧ス訴 顕？ＣＡ甜鈷ご妥慨シχス電（認 渇乙胚〒訝ＴＸＣ？ぎドアどＨｈ＾脚脛Ｘ訂毘ｇＡど品
ｆ以Ｓ肩赤苓１８７缶Ｉ窟 ＦＩＧ、２Ｂ −１−芦 正ＹＯ４８ ５ＣＡＴ日Ｙ１０４日、　　ＡＬＬ　　ＯＦ　　Ｖｔ−
ＡＮコ　Ｖｌ−１５５ｓ。 ’Ｊｇ　　？こｌ　２八壬　８占こ　７こε　；冨ｏ　
１．．１ス　旨７ど　＋８８　λ半７　＋后　×３呂　
大８ズ　７呂冨　＝ス２　ｖ竃■@赤　平こ〒　＝ｘ　
　’；Ｉｓ？占Ｉ：ｌｑ 普品７ぬ吾ヌ〒ｎ＾〒害用Ｔ　：ｘ’；　、ｉ。 ＋認Ｕイ巴＾冨χ人壬鞄ス乙貼大工乙？さＦＩＧ、　　
ヲ３ νソチーム ！−り じす 〇ニー　・ 一山〔 ３岩？　　８２０　　：＝ミ　　呂ｇ＝　　え！１　　
写：ゴ−Ｈ＜　　−へり　　＋１＜４　　　ｆ〜−８へ
りＵ　　へ参−０勺に　　Ｃ）　−＜　　　□　−＠　
　　ロ為Ｑ　　Ｏψ（ＪＯ≧８＋ｌ−Ｑ　　　＋”’ｌ
のＥ＠ＩＩ′１つト　　さ−Ｑ　　Ｏ≧Ｑ−−０＜ａ　
　　　＞じ　　　＞ａ　　　　ａＩｊ　　　ｕｈ　　　
、−＋ａじ−銭

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）抗体の軽鎖および重鎖アグリゲート可変領域の結
   合特異性と実質的に類似した結合特異性を有する単一ポ
   リペプチド鎖結合分子。 （２）上記軽鎖および重鎖を結合させて上記単一鎖にす
   る２個のペプチドリンカーを含む、請求項１記載の分子
   。 （３）（ａ）上記軽鎖から誘導されたＮ−末端領域、（
   ｂ）ペプチドリンカー、 （ｃ）上記重鎖から誘導されたペプチド領域（ｄ）第２
   ペプチドリンカー、および （ｅ）上記軽鎖から誘導されたＣ−末端領域を順次含む
   、請求項２記載の分子。 （４）上記軽鎖および重鎖を結合させて上記単一鎖にす
   る１個のペプチドリンカーを含む、請求項１記載の分子
   。 （５）（ａ）上記軽鎖から誘導されたＮ−末端領域、（
   ｂ）ペプチドリンカー、および （ｃ）上記重鎖から誘導されたＣ−末端領域を順次含む
   、請求項４記載の分子。 （６）（ａ）上記重鎖から誘導されたＮ−末端領域、（
   ｂ）ペプチドリンカー、および （ｃ）上記軽鎖から誘導されたＣ−末端領域を順次含む
   、請求項４記載の分子。 （７）上記Ｎ−末端領域（ａ）の前にメチオニン残基を
   含む、請求項３、５または６記載の分子。 （８）検出可能な手段でラベルされた、請求項１記載の
   分子。 （９）固定化形態である、請求項１記載の分子。 （１０）イメージング剤にコンジュゲートされた、請求
   項１記載の分子。 （１１）毒素にコンジュゲートされた、請求項１記載の
   分子。 （１２）請求項１記載の分子をコードする遺伝子配列。 （１３）請求項１２記載の配列を含む組換えＤＮＡ（ｒ
   ＤＮＡ）分子。 （１４）複製可能なクローニングまたは発現媒体である
   、請求項１３記載のｒＤＮＡ分子。 （１５）上記媒体がプラスミドである、請求項１４記載
   のｒＤＮＡ分子。 （１６）請求項１３記載のｒＤＮＡ分子により形質転換
   された宿主細胞。 （１７）細菌細胞、酵母もしくは他の真菌細胞またはほ
   乳類細胞セルライン（インビトロ）である、請求項１６
   記載の宿主細胞。 （１８）抗体の軽鎖および重鎖アグリゲート可変領域の
   結合特異性と実質的に類似した結合特異性を有する単一
   ポリペプチド鎖結合分子の製造方法であって、 （ａ）上記分子をコードする遺伝子配列を準備し、 （ｂ）宿主細胞を上記配列により形質転換し、 （ｃ）上記宿主において上記配列を発現させ、 （ｄ）上記分子を回収する ことを含んで成る方法。 （１９）さらに上記の回収された分子を精製することを
   含む、請求項１８記載の方法。 （２０）上記宿主細胞が細菌細胞、酵母もしくは他の真
   菌細胞、またはほ乳類セルラインである、請求項１８記
   載の方法。 （２１）請求項１８または１９記載の方法により製造さ
   れた結合分子。 （２２）ラベル形態の抗体を使用する免疫検定方法にお
   いて、上記抗体の代わりに請求項８記載の分子を使用す
   ることを含む改良。 （２３）固定化形態の抗体を使用する免疫検定方法にお
   いて、上記抗体の代わりに請求項９記載の分子を使用す
   ることを含む改良。 （２４）上記免疫検定方法が競合的免疫検定法である請
   求項２２または２３記載の改良。（２５）上記免疫検定
   方法がサンドイッチ免疫検定法である請求項２２または
   ２３記載の改良。 （２６）治療剤とコンジュゲートされた抗体を使用する
   免疫治療法において、上記抗体の代わりに請求項１記載
   の分子を使用することを含む改良。 （２７）抗体を用いる免疫アフィニティー精製方法にお
   いて、上記抗体の代わりに請求項１記載の分子を使用す
   ることを含む改良。