JPH0220068B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、自己遮断抗体を検知する方法と、該
方法に用いられる試薬キツトに関する。

多くの通常の生物学的相互作用に際しては、生
体内の各種の物質がその結合サイト（結合部位）
を介して互に結合しなければならない。時には、
遮断抗体（いわゆる自己遮断抗体（auto
blocking antibody））を生成することによつて、
個体の免疫システムが、それらの物質の１つ（結
合剤ないしはレセプタ蛋白質であることが多い）
に対する自己免疫を創り出す。この遮断抗体は、
レセプタ上の相補結合サイトに競合的に吸引され
る。したがつて、レセプタが本来反応すべき相補
物質（いわゆるリガンド（ligand）で、これを蛋
白質であることが多い）に対する結合サイトが減
少することになる。

生成され得る自己遮断抗体系としてよく知られ
た例の一つは、内因性因子とコバラミン（ビタミ
ンB₁₂）との間の相互作用である。内因性因子
（intrinsic factor）とは、胃腸管を介してビタミ
ンB₁₂を吸収するのに寄与する糖蛋白質である。
注入後、ビタミンB₁₂は特定のレセプタサイトを
介して内因性因子と結合し、得られる複合体は該
複合体のレセプタを介して胃腸管に吸収される。

悪性貧血においては、内因性因子を作り且つ分
秘する能力が次第に衰退し最後には消滅してしま
う。悪性貧血と自己免疫抗体（特に、内因性因子
遮断抗体）の存在との間には非常に密接な関係が
ある。

上述のような状況においては、遮断抗体、例え
ば、内因性因子遮断抗体（以下、IF（intrinsic
factor）遮断サイト抗体と称する）の存在を少な
くとも定性的に知ることができるときわめて有用
である。（なお、内因性因子は、少なくとも２種
類の結合サイトを含有すると考えられているが、
そのうちの１種類のみがビタミンB₁₂と複合体を
形成するのに関与する。） 内因性因子−ビタミンB₁₂の問題に関連して、
従来技術においては、IF遮断抗体の存在を検知
するのにラジオアツセイ（放射標識検定）法を用
いることが提示されている。それらの従来技術は
すべて溶解手段を用いるものである。すなわち、
反応試薬を全て溶液状態にするか、少なくとも、
液状媒体中に自由に懸濁させるものである。しか
して、当然のことであるが、IF遮断抗体を利用
して、標識付けした（すなわち、放射性の）ビタ
ミンB₁₂が内因性因子に結合するのを妨げる手段
を用いる。一般的には、内因性因子（すなわち、
内因性因子を含有する胃液）を患者の生体液試料
（例えば、血清）と混合し、しかる後、該混合物
に、標識付けしたビタミンB₁₂を（過剰に）添加
する。次いで、標識付けしたビタミンB₁₂の遊離
状態のものから、結合した標識付ビタミンB₁₂を
分離することが必要となる。そのような分離手段
として、透析、ゲル過、活性炭吸収、およびリ
ン酸ジルコニルゲル吸収が提示されている。この
ように煩雑で時間のかかる分離手段が必要である
ことの他に、溶解手段を基礎とするラジオアツセ
イ法は、多くの患者の試料に内因性のビタミン
B₁₂結合剤が存在することによる困難を伴なう。
すなわち、内因性ビタミンB₁₂結合剤を考慮した
付加的な対照操作を行なつたり、試料から内因性
ビタミンB₁₂結合剤を除去する操作が必要とな
る。

本発明の特定の実施態様に従えば、IF遮断サ
イト抗体の存在を検知するのに従来技術のような
溶解手段を用いることに伴なう問題が克服され、
更に、他の自己遮断抗体を検知するのに有用一般
的な手法が提供される。

すなわち、本発明の目的は、自己遮断抗体の存
在を定性的または定量的に検知する方法を提供す
ることにある。

本発明の他の目的は、IF遮断サイト抗体の存
在を検知する方法を提供することにある。

本発明の更に別の目的は、従来技術のように溶
解法を用いることによる問題を有しない、IF遮
断サイ抗体を検知する方法を提供することに存す
る。

本発明の別の目的は、患者の自己遮断抗体の存
在を定量的または定性的に検知するのに用いられ
る診断用試薬キツトを提供することにある。

本発明の更に別の目的は、患者のIF遮断抗体
の存在を検知するのに用いられる診断用試薬キツ
トを提供することにある。

本発明の更に別の目的は、患者のIF遮断サイ
ト抗体の存在を知り、適当な検量体を含む診断用
試薬キツトを提供することにある。

本発明その他の目的は、以下の発明の詳細な説
明から明らかになるであろう。

本発明に従えば、独自の不動化レセプタを利用
しラジオアツセイ法により、自己遮断抗体が検知
される。

すなわち、本発明は、自己遮断抗体の存在を検
知する方法であつて、 (a) 自己遮断抗体を含有していると考えられる生
体液試料を、該抗体に対する選択的な結合サイ
トを有しかつ不活性（inanimate）担体上に不
動化されたレセプタと混合し； (b) 前記の工程(a)から得られる混合物を、存在す
る前記抗体の質的にすべてが前記レセプタと結
合するのに充分な条件下に培養することによ
り、前記不活性担体に前記遮断抗体が結合した
固体相と、前記遮断抗体を有しない前記生体液
試料からなる液体相とを生ぜしめ； (c) 前記液体相から前記固体相を分離し； (d) その分離された固体相に、前記選択的結合サ
イトに結合するの標識化リガンドからなる液体
を混合し； (e) 前記レセプタの選択的結合サイトのうち前記
遮断抗体に結合していないサイトに前記標識化
リガンドが結合し得るに充分な条件下におい
て、前記工程(d)によつて得られた混合物を培養
して、遮断抗体および標識化リガンドのうち少
なくとも一方が結合した前記不活性担体からな
る第２の固体相と、未結合の標識化リガンドか
らなる第２の液体相とを生ぜしめ； (f) 前記第２の液体相から前記第２の固体相を分
離し；さらに (g) 前記第２の固体相および第２の液体相のうち
の少なくとも一方に存在する標識化リガンドの
量を測定することからなる方法に関するもので
ある。

本発明の好ましい実施態様においては、レセプ
タは蛋白質である。

本発明の他の好ましい実施態様においては、レ
セプタは内因性因子であり、標識付けされたリガ
ンドはビタミンB₁₂である。

更に、本発明の別の好ましい実施態様において
は、試験操作に際しては、陰性の検量用対照物お
よび陽性の検量用対照物が用いられる。

本発明の他の好ましい実施態様においては、不
活性担体として用いられるガラスビーズとレセプ
タを共有結合させる。

上述したように、本発明は、定性的または定量
的に、自己遮断抗体の存在を知るのに有用であ
る。本発明は、IF遮断サイト抗体を分析するこ
とを例にして説明されているが、レセプタが物理
的および（または）化学的に不活性担体に固定さ
れ、また、標識付けリガンドが該支持体に培養さ
れ得る限りは、他の自己遮断サイト抗体、例え
ば、グレービス氏病（甲状線刺激ホルモン用の自
己遮断抗体の存在を知る）、アジソン氏病等にお
ける抗体を分析するのにも等しく有用であると考
えられる。また、本発明は、上述のような分析を
行なう方法のみならず、該方法に用いられる試薬
キツトも提供するものであり、その好ましい態様
においては、２種類の検量体が含まれ、また、所
望に応じて、陽性の対照体が含まれている。

本発明の思想は、不動化したレセプタ（最も多
くは、不動化したレセプタ蛋白質）を用いること
を基礎としている。レセプタは、患者の生体液試
料に存在している任意の自己遮断抗体が吸引され
るような結合サイトを有する物質である。また、
該レセプタは、生体内での生物学的相互作用にお
いてリガンドに結合するのが一般的であるような
物質であることもある。自己遮断抗体（これは、
患者によつて生成される）は、リガンドとレセプ
タとの間において生体内で複合体が生成する（こ
の生成はレセプタ−リガンド結合に用いられるの
に適した結合サイトの少なくとも幾つかにレセプ
タが結合することによつて行なわれる）のを妨害
する。

不活性担体に蛋白質や他のレセプタ物質を固定
する技術は、本明細書で詳述する必要がない程既
に進歩している。各種の不活性粒子やビーズや表
面（例えば、合成（有機）ポリマー、セラミツ
ク、無機粉末、天然ポリマー、セルロース、アガ
ロース等）が使用され得るが、好ましい基体はガ
ラスであり、例えば、米国マサチユーセツツ州メ
ドフイルドのCorning Medical and Scientific
社から入手でき多くのIMMOPHASE分析法で
用いられているようなガラス粒子である。それら
のガラスは、多くの場合、アミノシランによつて
処理され、その多孔度を調整し得るものである。
レセプタは、共有結合を介して基体に結合される
のが通常であり、この際、当該技術分野において
よく知られているように、存在する反応基に応じ
てスペーサ部分が用いられたり用いられなかつた
りする。例えば、当該技術分野において良く知ら
れているようにアミノシラン結合およびグルター
ルアルデヒドを介して、多孔度が調整されたガラ
ス粒子に内因性因子を反応させることができる
（例えば、米国特許第3669841号参照）。適してい
れば、不活性担体上にレセプタを不動化するに際
して、単純な吸着において起こるような、イオン
結合、疎水相互作用、フアンデルワールスカ等を
利用してもよい。

レセプタは、生物組織に見出されるものと本質
的に同じものであるか、または天然に存在するレ
セプタに模凝するようなものを選ぶべきである。
時には、抽出や安定化処理などに際して変性が生
じるが、分析に必要な結合サイトが変わらない限
りは許容できる。勿論、多くの場合、レセプタ
は、人間から得られるものの代わりに、低級動物
から得られる類似物質である。更に、他の天然に
存在する物質を利用することもでき、また、必要
な部分の結合サイトが天然に存在するレセプタの
結合サイトと同じである限りにおいては、合成物
質を用いることもできる。したがつて、予想され
る自己遮断抗体が結合することができるような非
蛋白質系の物質、例えば、イオン交換樹脂、疎水
性物質等をレセプタとすることもある。時には、
レセプタが蛋白質でありながら、結合は蛋白質の
非蛋白質部分（例えば、炭水化物、脂質および
（または）ペプチド部分）を介して生じることも
ある。また、生体外の実験によれば、ガラス粒子
には、蛋白質からなる蛋白質表面に模凝するもの
も存することが示されている。

本発明において次に重要な試薬は、標識付けさ
れたリガンドである。レセプタの場合と同様に、
リガンドは、生体組織に存するものが好ましい
が、生体組織に存するものを変性させたものでも
よく、更には、結合サイトがレセプタと選択的に
結合するのに必要とされるようなものである限り
は、生体組織内においては機能しないような合成
物質であつてもよい。

テストに用いられる患者の試料は、抗体が存在
すると考えられる生体液である。血清や血漿が用
いられるのが通常であるが、試薬や抗体に応じ
て、背柱液、尿、胃液、血液等の他の流体を用い
ることもできる。

本発明は、また、不動化されたレセプタと標識
付けされたリガンドを含有する試薬キツトにも係
り、該試薬キツトは、患者の生体液を不動化され
たレセプタに混合し、次いで、標識付けリガンド
を添加することからなる方法に用いられる。不動
化レセプタと結合する標識付けされたリガンドの
相対量を求めることにより、問題となる特定の自
己遮断抗体の存在を定性的または定量的に評価す
る。

リガンドは、放射性ラベル、酵素ラベル、蛍光
性ラベル等を用いることにより任意の方法に従つ
て標識付けされることができる。

好ましくは、少なくとも、問題となる特定の自
己遮断抗体を全く含有していないことがわかつて
いる陰性の検量体を試薬キツトに含ませておく。
しかしながら、陰性検量体および陽性検量体の双
方を含ませて、患者の試料と共に処理することが
一層好ましい。陽性検量体とは、テストの感度に
応じて陽性反応を与え始めるように予め定められ
た量の自己遮断抗体を含有する試薬である。すな
わち、ある試料が陽性検量体の「陽性」側に存す
るときは、該試料に自己遮断抗体が存在すること
が「陽性（貢定的）」であり、また、ある試料が
「陽性」検量体と「陰性」検量体との中間に存す
るときは「灰色」（すなわち、抗体が存在するこ
とが明確でない）領域に存することになる−後者
の場合、テストの感度に応じて陽性になつたり陰
性になつたりするであろう。所望ならば、強い陽
性の対照体についても操作を行ない、強い陽性結
果を示し（抗体の存在を確実に知り）、他の試薬
に対するダブルチエツクを行なつてもよい。更
に、リガンドに用いるラベル（標識）の種類に応
じて（特に放射性リガンドを用いる場合には）、
バツクグランドの対照操作を行なうこともでき
る。

実施例 次の６成分を有する試薬キツトを用いて、IF
遮断サイト抗体のラジオアツセイを行なう。

Ａ 内因性因子（不動化レセプタ蛋白質） 内因性因子（精製した豚の内因性因子）をガ
ラス粒子に共有結合させたものを、保存剤とし
て0.2％のアジ化ナトリウムを含有する0.03M
のリン酸塩系緩衝液（0.15M、PH7.4）に懸濁
させたもの。

Ｂ 〔 ⁵⁷Co〕ビタミンB₁₂（放射性リガンド） 〔 ⁵⁷Co〕ビタミンB₁₂を、0.001％シアン化
カリウム、ピペツト助剤としてアマランス赤色
染料（２μｇ/ml）、および、保存剤として0.2％
のアジ化ナトリウムを含有する0.1Mのホウ酸
塩緩衝液（PH9.3）に溶解させたもの。

Ｃ ジチオスレイトール（非選択性結合を向上さ
せるための任意成分） 分析に適するような濃度に調整した1.0mlの
ジチオスレイトールを含有するバイアル。

Ｄ 陰性検量体 繊維素除去した人間の血漿から成る。この物質
は、凍結乾燥し、使用する際に再調製され得るよ
うになつている。

Ｅ 陽性検量体 内因性因子に対する遮断抗体を含有する稀薄
な人間の血漿を、抗体陰性と抗体陽性の境界点
（cutoff point）を定める濃度にしたもの。該
血漿の稀薄液は、内因性因子に対する遮断抗体
を含有しない繊維素除去した人間の血漿から分
離したものである。この物質は、凍結乾燥され
ることができて、使用に際して再調製され得
る。打ち切り点は、抗体を有しない正常な試料
約800と、遮断抗体を有する試料約100とを評価
することによつて求められる。正常な試料の平
均からの標準偏差が３となる点における応答を
打ち切り点とする。陽性試料はこの境界には含
まれない。

Ｆ 陽性対照体 この陽性対照体は、陽性検量体と同じ物質か
ら製されるものである。但し、添加する遮断抗
体の量を多くして、分析に際して陽性応答の感
度を高める。

上述の各試薬を貯蔵、再調製または取扱うため
に、当業者にとつて既知の各種の手法が用いられ
る。それらの試薬は、使用時には室温下にある。

検定法（分析法） 機械のバツクグランド、陰性検量体（100μ）
および陽性検量体（100μ）については４回の
操作を行ない、他の試料（各、100μ）につい
ては２回の操作を行なうことが好ましい。しかし
て、それぞれの試料の平均値を用いて以下に記す
ような計算を行なう。

上述の好ましい態様を考慮して、次のようなテ
ストの準備を行なう。

試験管の番号 管の内容物 １〜４ 空（バツクグランドのノイズ用） ５〜８ 陰性検量体 ９〜12 陽性検量体 13〜14 陽性対照体 15〜16 患者の血清試料 すなわち、分析を始めるに当つて、各100μ
の試薬Ｄを含有する管５〜８、各100μの試薬
Ｅを含有する管９〜12、各100μの試薬Ｆを含
有する管13〜14、および、各100μの生体液試
料を含有する管15〜16を用意する。

次に、既知量（0.5ml）の不動化した内因性因
子（試薬Ａ）を、管５〜16に添加する。各管を撹
拌し、しかる後、内因性因子と抗体との間で複合
体が形成する温度において培養（例えば、室温下
で約２時間）する。次いで、各管を遠心分離しデ
カントする。血清中に存在する内因性ビタミン
B₁₂結合性蛋白質は、この工程においてデカンテ
ーシヨンにより除去されることになる。既知量
（1.0ml）の放射性リガンド（試薬Ｂ）を管５〜16
に添加し、更に培養（例えば、室温下において約
１時間）に供する。再び遠心分離を行ない、次い
でデカンテーシヨンを行なう。各管の放射能を測
定する。

もしも患者にビタミンB₁₂が投与されていれ
ば、分析中に患者の試料を処理して（例えば試薬
ＡにビタミンB₁₂結合剤を予め混合しておく）存
在する遊離のビタミンB₁₂を除去することもでき
る。代わりに、不動化された内因性因子を添加す
る前に、管15〜16にビタミンB₁₂を添加してもよ
い。一般的に言えば、2000pｇ/mlまでのビタミ
ンB₁₂を含む血清試料であれば、分析を妨害する
程度の遊離ビタミンB₁₂を含有してはいない。

ジチオスレイトールを用いる場合には、放射性
ビタミンB₁₂溶液の１成分として放射性リガンド
を添加する際に試料に該ジチオスレイトールを添
加する。この成分の使用は、非選択的な結合を向
上させるための任意的なものである。

試料の計算法 用いる数値は全て、平均値からバツクグランド
用の管の平均のカウント数を減じたものである。
このテスト法は定性的なものであるから計算は簡
単である。陰性検量体から得られる１分当りの正
味のカウント数を陽性検量体から得られる１分当
りの正味のカウント数で除すると、1.00よりも大
きな値(A)が得られる。次いで、未知試料の各々か
ら得られる正味のカウント数を、陰性検量体の値
で除することによつて、各未知試料についての数
値が得られる。経験上、分析が有効であるために
は、(A)は1.15か1.15よりも大きくなければならな
い。しかして、未知試料についての上記の値が(A)
よりも小さいか(A)に等しいならば、該未知試料は
抗体に関して陰性であると推定される。他方、未
知試料についての値が(A)よりも大きいならば、該
未知試料は抗体に関して陽性である。勿論、(A)と
1.00との間には「灰色（不確定）」領域が存する。

当業者にとつては、上述の本発明を変更するこ
とは明らかであろう。例えば、培養の条件は広範
囲に変更し得るものであり、所望に応じて洗滌工
程を用いることもでき、また、分離操作は遠心分
離とデカンテーシヨンに限られず、上述と異なる
手法で計算を行なうこともでき、更に、不動化担
体に結合しなかつたリガンドについて得られた値
を用いて陰性および陽性の応答を計算することも
できる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 自己遮断抗体の存在を検知する方法であつ
   て、 (a) 自己遮断抗体を含有していると考えられる生
   体液試料を、該抗体に対する選択的な結合サイ
   トを有しかつ不活性担体上に不動化されたレセ
   プタと混合し； (b) 前記の工程(a)により得た混合物を、存在する
   前記遮断抗体の実質的にすべてが前記レセプタ
   に結合することができるのに充分な条件下に培
   養することにより、遮断抗体が結合した前記不
   活性担体からなる固体相と、前記遮断抗体を有
   しない前記生体液試料からなる液体相とを得； (c) 前記液体相から前記固体相を分離し； (d) 前記選択的結合サイトに結合する標識付けさ
   れたリガンドからなる液体相を、前記分離され
   た固体相と混合し； (e) 前記工程(d)により得た混合物を、前記レセプ
   タの選択的結合サイトのうち前記遮断抗体と結
   合していないサイトに前記標識付リガンドが結
   合し得るに充分な条件下に培養することによ
   り、遮断抗体および標識付リガンドの少なくと
   も一方が結合した前記不活性担体からなる第２
   の固体相と、未結合の標識付リガンドからなる
   第２の液体相とを得； (f) 前記第２の液体相から前記第２の固体相を分
   離し；さらに (g) 前記第２の固体相および前記第２の液体相の
   少なくとも一方に存在する標識付リガンドの量
   を測定すること、 からなることを特徴とする前記方法。 ２ レセプタが蛋白質である特許請求の範囲第１
   項記載の方法。 ３ 対照用に、既知の陰性検量体および既知の陽
   性検量体について操作が行なわれる特許請求の範
   囲第２項記載の方法。 ４ レセプタが内因性因子であり、リガンドがビ
   タミンB₁₂である特許請求の範囲第２項または第
   ３項記載の方法。 ５ レセプタが内因性因子であり、リガンドがビ
   タミンB₁₂であり、陰性検量体が人間の血漿から
   調製され、また、陽性検量体が前記自己遮断抗体
   を含有する人間の血漿から調製される特許請求の
   範囲第３項記載の方法。 ６ 不活性担体がガラス粒子である特許請求の範
   囲第１項〜第４項のいずれか１項に記載の方法。 ７ レセプタが、前記ガラスに共有結合する特許
   請求の範囲第６項記載の方法。 ８ 標識付けが、放射性物質、蛍光性物質または
   酵素を介して行なわれる特許請求の範囲第１項〜
   第３項のいずれか１項に記載の方法。 ９ 自己診断抗体の存在を検知するのに用いられ
   る試薬キツトであつて、前記抗体に対する選択的
   結合サイトを有しかつ不活性担体上に不動化され
   たレセプタと、該選択的結合サイトに結合する標
   識付けされたリガンドとからなる前記試薬キツ
   ト。 １０ レセプタが蛋白質または内因性因子であ
   り、リガンドがビタミンB₁₂であり、人間の血漿
   から調製された陰性検量体と、自己遮断抗体を含
   有する人間の血漿から調製された陽性検量体を含
   む特許請求の範囲第９項記載の試薬キツト。 １１ 前記陽性検量体よりも多量の前記自己遮断
   抗体を含有する人間の血漿から調製された陽性対
   照体を含む特許請求の範囲第１０項記載の試薬キ
   ツト。 １２ 不活性担体がガラス粒子であり、レセプタ
   が該ガラスに共有結合する特許請求の範囲第９項
   〜第１１項のいずれか１項に記載の試薬キツト。