JPH02200700A

JPH02200700A - 新規ｒｅｇ蛋白質

Info

Publication number: JPH02200700A
Application number: JP1022132A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Okamoto; 宏岡本; Yoshiko Itou; 誉子伊藤; Hiroshi Teraoka; 寺岡　宏; Hiroshige Tsuzuki; 続木　博茂; Nobuo Yoshida; 信男吉田
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1989-01-30
Filing date: 1989-01-30
Publication date: 1990-08-08
Also published as: CA2008825A1; DE69014676D1; KR900011786A; GR3014905T3; DE69014676T2; ES2066964T3; DK0383453T3; CA2008825C; EP0383453B1; AU620684B2; EP0383453A1; KR0145325B1; AU4891690A; ATE115184T1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は新規ｒｅｇ蛋白質、該ｒｅｇ蛋白質をフードす
る遺伝子およびその製造法に関する。きらに詳細には、
第１図に示きれるアミノ酸配列のＮ末端から２０番目の
Ｇｌｎから始まり１６５番目のＡｓｎで終わるアミノ酸
配列、または該アミノ酸配列のＮ末端にさらにＭｅｔを
有するアミノ酸配列を有するヒトｒｅｇ蛋白質、該ｒｅ
ｇ蛋白質をフードする遺伝子、きらに該ヒトｒｅｇ蛋白
質をコードする遺伝子を有する発現ベクターを導入した
宿主、好ましくは酵母、を培養し、該培養物からヒトｒ
ｅｇ蛋白質を採取することを特徴とするヒトｒｅｇ蛋白
質の製造法に関する。

従来の技術従来、インスリンを産生ずる膵うンゲルハンス島Ｂ細胞
は極めて再性能に乏しく、これが、−旦Ｂ細胞が傷害さ
れ壊死に陥るとインスリン不足から糖尿病が発症するこ
との主要因と考えられてきた。１９８４年、開本らは９
０％膵切除ラットにニコチン酸アミドなどのポリＡＤＰ
−リボース合成酵素阻害物質を連日投与することにより
膵うンゲルハンス島Ｂ細胞の再生を誘導することに初め
て成功した（　Ｙｏｎｅｍｕｒａ、　Ｙ、　ｅｔ　ａｌ
、、　Ｄｉａｂｅｔｅｓ３３、４０１　（１９８４））
。また、最近ニコチン酸アミドの大量経口投与によりヒ
トインスリン依存性糖尿病の寛解期が延長されることも
報告されてきている（　Ｐｈ、　Ｖａｇｕｅ、　ｅｔ　
ａｌ、　Ｌａｎｃｅｔ　Ｖｏｌ、　ＩＮｏ、　８５３３
．６１９−６２０．１９８７）。

本発明で用いるディファレンシャルハイブリダイゼイシ
ョンに必要な技術はＩａｋａｓａｗａらによって既に確
立されている（Ｔａｋａｓａｗａ、　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ
、　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　３５．１１７８．１９８６）。

即ち、ラット膵Ｂ細胞腫から作成したｃＤＮＡライブラ
リーを、膵Ｂ細胞腫ｐｏｌｙ（Ａ）”ＲＮＡから調製し
たｃＤＮＡと正常群ランゲルハンス島ｐｏｌｙ（Ａ）”
ＲＮＡから調製したｃＤＮＡをプローブとしたディフア
レンジャルハイプリダイゼイションによりスクリーニン
グし、膵Ｂ細胞腫で特異的に発現する遺伝子の単離に成
功している。

本発明者は先にディフアレンジ〜ルハイブリダイセイン
ヨン法を用いてラット再生膵うンゲルハンス島Ｂ細胞で
特異的に発現きれる遺伝子を見出し、さらに該遺伝子を
プローブとして用いて、ヒト膵臓由来ｃＤＮＡライブラ
リーから該遺伝子と相同性を有する遺伝子を見出し、こ
れらをｒｅｇ遺伝子（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　　１
ｅｎｅ）と命名した（　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、
　２６３．２１１１−２１１４１９８８　）。

本発明者らは、さらに、第１図に示される遺伝子−を有
する発現ベクターを酵母に導入し、該酵母を培養してｒ
ｅｇ蛋白質を分泌産生させたところ、得られたｒｅｇ蛋
白質は、第１図に示されるアミノ酸配列のＮ末端から１
番目のＡｌｔ、２１番目のＧｌｙ、２２番目のＧｌｎ、
２３番目のＧＩｕ、２４番目のＡｌａ、２５番目のＧｌ
ｎ、３０番目のＧｉｎ、３１番目のＡｈａまたは３３番
目のＩｌｅから始まるアミノ酸配列を有する蛋白質が産
生された（特願昭６３−１９５７２７）。

−３＝発明が解決しようとする問題点従来、糖尿病の治療法としては、インスリン投与という
対症的療法しかなく、有効性が一時期待されたスルホニ
ルウレアなどの経口糖尿病薬は長期投与によりかえって
膵Ｂ細胞のインスリン産生能を障害し、冠動脈硬化症を
誘発するなどの副作用があった。

問題点を解決するための手段先に本発明者は、膵うンゲルハンス島Ｂ細胞ノ再生増殖
機構を遺伝子レベルで解明するため、ラット再生膵うン
ゲルハンス島Ｂ細胞で特異的に発現きれる遺伝子を探索
し、ラッ）−ｒｅｇ遺伝子を見出した。さらに本発明者
は該ラットｒｅｇ遺伝子をプローブとしてヒトにおける
ｒｅｇ遺伝子を探索し、Ｌト膵ｃＤＮＡライブラリーか
らヒトｒｅｇ遺伝子を見出した。

本発明者らは、該ヒトｒｅｇ遺伝子を微生物宿主中で発
現許せ、ヒトｒｅｇ蛋白質を得るべく鋭意研究を行なっ
た結果、酵母中にて該ヒｈｒｅｇ遺伝子を発現させるこ
とに成功し、得られたヒトｒｅｇ蛋白質を精製しアミノ
酸組成・配列を検討したところ、ＤＮＡ配列から推定さ
れるものと一致した。

さらに本発明者らは、上記酵母により分泌産生されるヒ
トｒｅｇ蛋白質をきらに詳細に検討した結果、全く新規
なアミノ酸配列、即ち、第１図に示されるアミノ酸配列
のＮ末端から２０番目のＧＩｎに始まり１６５番目のＡ
ｓｎで終わるアミノ酸配列を有する新規なｒｅｇ蛋白質
を見出し、本発明を完成するに至った。

プローブとして用いるラットｒｅｇ遺伝子は以下の様に
調製きれる。

■、ラット再生膵ランゲルハンス島の分離（１）９０％
膵切除体重２００〜３００ｇのＷ　ｉ　ｓ　ｔ　ａ　ｒ系雄ラ
ットをエーテル麻酔下に開腹後、帝胆管分節（１）ａｒ
ａｂｉｌｉａｒｙ　ｓｅｇｍｅｎｔ）を除く膵（膵全体
（７）９０％に相当）を切除して開腹した。この９０％
膵切除術は、Ｆｏｇｌｉａ、　Ｖ、　Ｇ、　（Ｒｅｖ、
　Ｓｏｃ、　Ａｒｇｅｎｔ、　Ｂｉｏｌ、　２０、２１
−３７．１９４４）により確立きれ、インスリン依存性
糖尿病モデルの作製に広く用いられている。

９０％膵切除をうけたラットは１ケ月以内に糖尿病状態
に陥る。

（２）　　ニコチン酸アミドの投与９０％膵切除７日前より術後３ケ月まで、０５ｇ／ｋｇ
体重のニコチン酸アミド（５０ｍｇ／ｍｌ生理食塩水）
を−日一回腹腔内に投与した。

このニコチン酸アミド投与により９０％膵切除ラットの
糖尿病状態が予防改善される。

０）　再生ランゲルハンス島の分離上記（１）、（２）により、残存群中でランゲルハンス
島の再生が誘導され、群単位体積あたりの数、ランゲル
ハンス島１個あたりのサイズとも増加する。増加した細
胞の大部分はインスリン産生Ｂ細胞であり、グルカゴン
産生Ａ細胞およびソマトスタチン産生り細胞の数は不変
である（　Ｙｏｎｅｍｕｒａ。

Ｙ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　３３．４０１
　（１９８４））。術後３ケ月目に、９０％膵切除・ニ
コチン酸アミド投与ラットを、ネンブタール麻酔下に開
腹し、残存群をハンクス液で膨化させた後摘出した。摘
出群を、２残存膵当り５ｍｌのハンクス液中で細切後、
１５０ｍｇの牛血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ。

Ｔｙｐｅ　Ｖ　）および４０ｍｇのコラゲナーゼ（Ｉｙ
ｐｅ■、和光紬薬製）を加え、３７℃で３〜５分間振と
うして消化した。消化後５０ｍ１のハンクス液中で懸濁
し、５分間静置させてランゲルハンス島を沈降させた後
、上層の半量を捨て、新たに２５ｍ１のハンクス液を加
え再懸濁した。この懸濁・静置操作を８回繰り返した後
、実体顕微鏡下で再生ランゲルハンス島を採取した。３
２匹の９０％膵切除・ニコチン酸アミド投与ラットから
１３５５個の再生ランゲルハンス島が回収された。上記
の方法は、基本的にＯｋａｍｏｔｏの方法（ＨＯｋａｍ
ｏｔｏ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌ
ａｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３７、４３−６１．１
９８１）に従う。

■、ラット再生膵ラうゲルハンス島ｃｏｍｐｌｅｍｅｎ
ｔａｒｙ　ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）ライブラリーの作製（
１）　　ＲＮＡの分離分離再生ランゲルハンス島を４Ｍチオシアン酸グアニジ
ン、１０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）、０．
５％ラウリルサルコシンナトリウム、０．１Ｍ２−メル
カプトエタノール、１％Ａｎｔｉｆｏａｍ　Ａ　（Ｓｉ
ｇｍａ）中で超音波によりホモジネート後、密Ｊｉ１．
６４のセシウムトリフルオロ酢酸（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
　）上に重層し、２５℃、４４．００Ｏｒｐｍで１４〜
１６時間遠心した。遠心後、ＲＮＡ沈殿を回収した。１
３５５個の再生ランゲルハンス島から８８５μｇ＋１７
）ＲＮＡが得られた（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ、　Ｊ、　Ｍ、
ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１９７９；　１８：５
２９４−９９参照）。

（２）　　Ｐｏ１ｙ（Ａ）”ＲＮＡの分離（１）で得ら
れたＲＮＡからオリゴ（ｄＴンセルロース力ラムクロマ
トグラフイーにより１７．２μｇのｐｏｌｙ（Ａ）＊Ｒ
ＮＡを分離した（　Ｈ，Ａｖｉｖ　＆　Ｐ、Ｌｅｄｅｒ
。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　６９
．１４０８−１４１２．１９７２参照）。

（３）　　ＱＤＮＡライブラリーの作製２μｇの再生ラ
ンゲルハンス島ｐｏｌｙ（Ａ）”ＲＮＡを鋳型とし、オ
リゴ（ｄＴ）をブライマーとして、４０単位の逆転写酵
素と４２°Ｃ２１時間反応させて１８２ｎｇのｃＤＮＡ
　（ｆｉｒｓｔ　５ｔｒａｎｄ）を合成した。得られた
ｃＤＮＡ−ＲＮＡ　ハイブリッドを０，７５単位のＲＮ
ａｓｅＨ，４６単位のＤＮＡポリメラーゼＩ、４単位の
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、２８４ｎｇの２本鎖
ＣＤＮＡを得た。上記のｃＤＮＡの合成は基本的にＵ、
　Ｇｕｂｌｅｒらの方法（Ｇｅｎｅ　２５．２６３−２
６９　（１９８３））による。

ｃＤＮＡ（２本鎖）を１５単位のＥｃｏＲＩメチラーゼ
（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）で処理後
、ＥｃｏＲＩリンカ（４５０ｎｇ）と１７５単位のＩ４
ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）で１３℃４５時間反応させ連
結した。

上記産物を７６単位のＥｃｏＲＩ　（宝酒造）で３７℃
２時間消化後、セファクリルｓ−１ｏｏ５−１ｏｏｏ（
Ｐｈａｒ　）にかけ、ｃＤＮＡと消化リンカ−とを分離
した。ここまでのステップで２１４ｎｇのＥＣ０ＲＩメ
チラ一ゼ処理ＥｃｏＲＩ断片・２本鎖ＣＤＮＡが回収さ
れた。

上記のｃＤＮＡのうち２０ｎｇを１．２３℃１ｇのλｇ
ｔｌＯａｒｍｓ　（ＥｃｏＲＩ消化後アルカリフオスフ
ァターゼで５゛端を脱リン酸化したもの、Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ社製）とＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造、１１６
単位）で、１３℃１５時間で連結させた。連結した入ｇ
ｔｌＯ−再生うンゲＪｌ−ハ’／　ス島ｃＤＮＡを、Ｇ
ｉｇｇｐａｃｋ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用い
てバッキング後、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２由来のＹ１０８
９　（ＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ、　ｖｏｌ、　１．４９
−７８．１９８５、　ＵＲＬ　Ｐｒｅｓｓ）に感染させ
、総計２．８Ｘ１０’の形質転換体を得た。

■、再生ラうゲルハンス島ｃＤＮＡライブラリーのディ
ファレンシャルスクリーニング：再生ランゲルハンス島
で特異的に発現される遺伝子の単離上記■で作製したラ
ット再生ランゲルハンス島ｃＤＮＡライブラリーのうち
任意に選んだ５０００個の独立プラークから、個々にフ
ァージをマイクロタイタープレート（９６穴）中の０　
、５０　Ｄ　ｉ。。相当（７）Ｙ１０８９を含むＮＺＹ
−０，２％マルトース培地（１％ＮＺアミン、０．５％
バクトイ−ストエキストラクト、０．５％塩化ナトリウ
ム、０．２％マルトース）につまようじを用いて接種し
、３７℃で１夜インキユベートして増殖させた。

得られたファージ液を２μｌずつニトロセルロスフィル
ター（５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅ１社
、ＢＡ８５〉にスポットし、ニックトランスレーション
法により１２ｐで標識したラットインスリンＩ［ｃＤＮ
Ａとハイブリダイズさせた。この結果、１６％のクロー
ンがインスリンｃＤＮＡクローンとして同定され、残る
８４％の非インスリンｃＤＮＡクローンを以下のスクリ
ーニングに供した。

ラット再生ランゲルハンス島または無処置ラット正常ラ
ンゲルハンス島ｐｏｌｙ（Ａ＞”ＲＮＡ（１５０ｎｇ）
を４１ｎｇのオリゴ（ｄｌ）１＋−＋ｓ、２０ｍＭｄＡ
ＴＰ、２０ｍＭｄＴＴＰ、２０ｍＭｄＧＴＰ。

２μＭｄＣＴＰ、６０μＣｉ［α−”Ｐ］ｄＣＴＰ（ア
マルシ〜ム）の存在下に１５単位の逆転写酵素（生化学
工業）と、３７゛Ｃで２時間インキュベートする。０３
Ｎ＊酸化ナトリウムでＲＮＡ鎖を分解（１００°Ｃ１２
分）後、生成されたＳｔｐ標識１本鎖ｃＤＮＡをエタノ
ール沈殿法で回収した。この方法により１〜２Ｘ　Ｉ　
Ｏ”ｃｐｍ／μｇ　ｐｏｌｙ（Ａ）”ＲＮＡの比活性を
有するプローブが得られた。

非インスリンｃＤＮＡクローンのファージ液を２μｍず
つ２組のニトロセルロースフィルターにスポットし、フ
ィルターを０．５Ｍ水酸化ナトリウム／１．５Ｍ塩化ナ
トリウム、次いで０５Ｍトリス塩酸（ｐＨ８，０）／１
．５Ｍ塩化ナトリウムで、室温で各５分間処理後、２Ｘ
ＳＳＣ（ｌＸ５ＳＣ，０，１５Ｍ塩化ナトリウム、０．
０１５Ｍクエン酸ナトリウム）に浸した後、８０°Ｃで
２時間固定化した。

固定化したニトロセルロースフィルターを３×ＳＳＣ中
で６５℃３０分、３ＸＳＳＣおよび１×Ｆ　Ｂ　Ｐ　（
Ｄｅｎｈａｒｄｔ゛ｓ　５ｏｌｕｔｉｏｎ、　０　、０
２％ＦｉｃｏｌＬ４００．０．０２％牛血清アルブミン
、０．０２％ボッビニルピロリドン）中で６５℃１時間
反応させた後、１Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリス塩
酸（ｐＨ７，４）、１０ｍＭＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ
、ＩＸＦＢＰ、１０μｇ／ｍｌサケ率丸ＤＮＡ。

２５０μｓ　／　ｍ　Ｉ　　ｐｏｌｙ（Ｕ）　（）ｙル
マシア）中で、６５°Ｃ１時間プレハイブリダイゼーシ
ョンさせた。１組のフィルターはラット再生ランゲルハ
ンス島１）０１ｙ（Ａ＞”ＲＮＡから調製したｃＤＮＡ
（１，５Ｘ１０’ｃｐｍ）をプローブ（前記）とし、他
の１組は無処置ラットから分離した正常ランゲルハンス
島ｐｏｌｙ（Ａ）’ＲＮＡから調製したｃＤＮＡ　（１
，５Ｘ　１０’ｃｐｍ）をプローブ（前記）として、１
Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７，４）
、１０　ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）、０．１％ＳＤＳ
。

２５０μｇ　／　ｍ　Ｉ　　ｐｏｌｙ（Ｕ）中で、６５
℃で１６時間ハイブリダイズさせた。

ハイブリダイゼーション後、フィルターを２×ＳＳＣで
室温で１〜２分間２回洗浄し、０．１ＸＳＳＣ１０，１
％ＳＤＳ中で６５℃、４０分、４回洗浄後、８０℃で１
時間乾燥させた後、−８０°Ｃで１夜オートラジオグラ
フイーを行なった。

その結果、再生ランゲルハンス島ｃＤＮＡと特異的にハ
イブリダイズする１種類のクローンが得られた。

本発明を追試する時には、このスクリーニングは第２図
に示される塩基配列を参照してプローブを作成し使用す
れば、容易に行ない得る。

■、再生ラうゲルハンス島Ｂ細胞で特異的に発現される
遺伝子の構造決定上記■で得られた再生ランゲルハンス島で特異的に発現
きれる遺伝子のｃＤＮＡクローンからファージＤＮＡを
精製後（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ
ｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８２）参照）、Ｅｃｏ
ＲＩで消化し、１％アガロースゲル電気泳動でｃＤＮＡ
挿入物をファージａｒｍｓから分離した。

分離したｃＤＮＡの塩基配列をＭ１３　（ｍｐ１８、ｍ
ｐ１９、ファルマシア）を用いたサンガー法（Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１０１．２０−７
８．１９８３）により決定した。

その結果、再生ランゲルハンス島で特異的に発現きれる
転写物は、ポリ（Ａ＞部分を除き、全長７４９ヌクレオ
チドで、メチオニンに始まりアラニンに終わる１６５ア
ミノ酸残基からなる蛋白質をフードしていた。塩基配列
および推定されるアミノ酸配列を第２図に示す。

Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｈｅｉｄｅｒｂｅｒｇ）　
　、　ＧｅｎＢａｎｋ　　（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ。

Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）　　、Ｎａｔｉｏｎａｌ
　ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄ
ａｔｉｏｎ　（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　ＤＣ）の核酸
・蛋白質データベースのコンピューター探索（Ｗｉｂｕ
ｒ、　Ｗ、　Ｊ、　＆　Ｌｉｐｍａｎ、　Ｄ、　Ｊ、、
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　１９８３．８０，７
２６−７３０の方法による）の結果、今回クローン化さ
れたｃＤＮＡの塩基配列および推定きれたアミノ酸配列
はいずれの既知の遺伝子・遺伝子産物とも異なっており
、５０％以上のｈｏｍｏｌｏｇｙを示す遺伝子・遺伝子
産物はデータベース中に見出きれなかった。

従って、再生ランゲルハンス島ｃＤＮＡライブラリーか
らクローン化されたｒａｇ遺伝子は、従来報告されてい
ない全く新しい遺伝子と対応するものと考えられた。

以上の様にして得られた塩基配列の一部を用いてヒト＠
　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーからヒトｒｅｇ遺伝子を
分離する。

■、ヒトｒｅ　　遺伝子の分離１、ヒト　ｃＤＮＡライブラリーの作ａ）ヒトで再生ランゲルハンス島を調製することは困難
であるため、ヒト手術摘出群からｃＤＮＡライブラリー
を作製した。ラットでは膵組織中にｒｅｇ　　ｍＲＮＡ
が検出きれている。

ｂ）ＲＮＡの分離手術摘出膵を４Ｍチオシアン酸グアニジン、１０ｍＭク
エン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）、０．５％ラウリルサ
ルコシンナトリウム、０．１Ｍ２−メルカプトエタノー
ル）中でポリトロンによりホモジネート後、密度１、６４
のセシウムトリフルオロ酢酸（　Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
上に重層し、２５℃、４４．ＯＯＯｒｐｍで１４〜１６
時間遠心した。遠心後、ＲＮＡ沈殿を回収した。５００
ｍｇの膵組織から２．５２６ｍｇのＲＮＡが得られた（
　Ｃｈａｒｇｗｉｎ，　Ｊ．　Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ　１９７９ｉ　１８：５２９４−９９参照）
。

ｃ　）　Ｐｏｌｙ（Ａ＞’″ＲＮＡの分離ｂ）で得られ
たＲＮＡからオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムクロマト
グラフィーにより１　７．５　６μｇ　（７）ｐｏｌｙ
（Ａ）”ＲＮＡを分離した（　Ｈ．Ａｖｉｖ　＆　Ｐ．
Ｌｅｄｅｒ。

Ｐｒｏｃ．　　Ｎａｔｌ．　　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　　
６９，　　１４０８−１４１２．　　１９７２参照）。

ｄ　）　ｃＤＮＡライブラリーの作製１μｇのヒト膵１）Ｏｂ’（Ａ）”ＲＮＡを鋳型とし、
オリゴ（ｄｌ）をブライマーとして、４０単位の逆転写
酵素と４２℃、１時間反応きせて約１００ｎｇのΦＮＡ
　（ｆｉｒｓｔ　ｓｔｒａｎｄ）を合成した。得られた
ｃＤＮＡ　−ＲＮＡハイブリッドを０．７５単位のＲＮ
ａｓｅｌ、４６単位のＤＮＡポリメラーゼＩ、４単位の
１４ＤＮＡポリメラゼで処理し、約１５０ｎＨの２末鎖
ｃＤＮＡを得た。上記のｃＤＮＡの合成は基本的に１Ｇ
ｕｂｌｅｒらの方法（Ｇｅｎｅ　２５，　２６３−２６
９　（１９８３））による。

ｃＤＮＡ（２本鎖）を１５単位のＥｃｏＲＩメチラーゼ
（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）で処理後
、ＥｃｏＲＩリンカ（４５０ｎｇ）と１７５単位のＴ４
ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）で１３℃４５時間反応させ連
結した。

上記産物を７６単位のＥｃｏＲＩ　（宝酒造）で３７℃
２時間消化後、セファクリルＳ−１０００（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ　）にかけ、ｃＤＮＡと消化リンカ−とを分離
した。ここまでのステップで１７．６ｎｇのＥｃｏＲＩ
メチラーゼ処理ＥｃｏＲＩ断片・２末鎖ｃＤＮＡが回収
きれた。

上記のｃＤＮＡを１．０μｇのλｇｔｌＯａｒｍｓ　（
ＥｃｏＲＩ消化後ア消化リアルカリフォスファターゼを
脱リン酸化したもの、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）とＴ
４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造、１１６単位）で、１３℃１
５時間で連結させた。連結したλｇｔｌｏ−ヒト膵ｃＤ
ＮＡを、Ｇｉｇｇｐａｃｋ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社
製〉を用いてバッキング後、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２由来
のＹ１０８９　（ＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ。

ｖｏｌ、　１．４９−７８．１９８５．　ＩＲＬ　Ｐｒ
ｅｓｓ）に感染させ、総計６Ｘ１０’の形質転換体を得
た。

ａ）ヒトＷ＃ｃＤＮＡライブラリーを０．５０ＤＩ６゜
相当の大腸菌Ｙ１０８９を含むマルトース培地（０，２
％フルドース、１％ＮＺアミン、０．５％バクトイ−ス
トエキストラクト、０５％塩化ナトリウム）中で３７°
Ｃにて１晩増殖させた後、直径１５０闘の寒天培地に１
０６個のプラークを発育ａ−ｔｔニトロセルロースフィ
ルターに移した。

ｂ）ラットｒｅｇの塩基番号７６−１３５（第２図参照
）に相当する６０塩基のオリゴデオキシリボヌクレオチ
ドをアブライドバイオシステムダモデル３８０ＢＤＮＡ
合成機で人工合成し、その５′末端を［７−”Ｐ］ＡＴ
ＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてｓａｐ標識
した。

ｃ）ａ）のフィルターを、０．５Ｎ＊酸化ナトリウム／
１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍトリス−塩酸（ｐ）
Ｉｓ、ｏ　）／１．５Ｍ塩化ナトリウムで室温で各５分
間処理後、２ＸＳＳＣ（ｌＸ５ＳＣ；０．１５Ｍ塩化ナ
トリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）に浸した
後、８０℃で２時間焼結した。このフィルターを６ＸＳ
ＳＣ，５ＸＦＢＰ（ＩＸＦＢＰ、０．０２％フィコール
４００．０．０２％牛血清アルブミン、０．０２％ポリ
ビニルピロリドン）、０１％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍ１
大腸菌ｔＲＮＡ溶涜中で５０°Ｃで４時間プレハイブリ
ダイズさせた後、２ｎｇ／ｍｌのＡｌｐ標識オノゴデオ
キシリボヌクレオチドを含む６ＸＳ　ＳＣ，ＩＸＦＢＰ
、０．１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍ１犬腸菌ｔ　ＲＮＡ
溶液中で５０℃で１２−１６時間ハイブリダイズきせ、
６ＸＳＳＣ１０，１％ＳＤＳで５０″Ｃにて３０分間４
回洗浄した。

ｄ）その結果、１０６個のヒト膵ｃＤＮＡクローン中５
８個のクローンが６０塩基のう・ノドｒｅｇプローブと
ハイブリダイズした。

ｅ）これら陽性クローンのうち最長のｃＤＮＡｉｎｓｅ
ｒｔ（約９００ヌクレオチド）を有するクローンからＤ
ＮＡを分離し、ＥｃｏＲＩで消化後、ｐＢＳベクター（
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）のＥｃ。

Ｒ１サイトにサブクローニングした。このｃＤＮＡは、
内部にＥｃｏＲＩサイトを持つため、その前半部分と後
半部分に分かれてサブクローニングされた。

■、ヒトｒｅ　　　ｃＤＮＡ塩基配列の決定ａ）ｐＢｓ
ベクターにサブクローニングしたｃＤＮＡの塩基配列を
Ｓａｎｇｅｒ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ　１０１．２０−７８．１９８３　）により決定
した。

ｂ）その結果、ヒトｒｅｇ　　ｃＤＮＡはポリ（Ａ）を
除き、全長７４９ヌクレオチドで、メチオニンにはしま
りアスパラギンで終わる１６６アミノ酸残基からなる蛋
白質をコードしていた。

Ｃ）ヒトｒｅｇ遺伝子がコードする蛋白質はう・シトｒ
ｅｇ遺伝子がコードする１６５アミノ酸残基の蛋白質よ
り１アミノ酸残基分長く、コード域のホモロジーは塩基
配列で７５％、アミノ酸配列で６８％であった。

ｄ）ヒトｒｅｇ蛋白質のＮ末端には、疎水性アミノ酸に
富む配列が存在しており、これは分泌蛋白質にみられる
シグナルペプチドに特徴的なものである。即ち、ヒトｒ
ｅｇ蛋白質に於ては、Ｍｅｔ（−１）に始まりＧｉｎ（
２０）、Ｇｌｙ（２１）、Ｇｌｎ（２２）、Ｇｌｕ（２
３）、Ａｌａ（２４）、Ｐｒｏ（２９）、Ｇｉｎ（３０
）、Ａｒｇ（３２）までの配列がシグナルペプチドであ
ると推定された。

得られたｃＤＮＡは、公知の方法により発現できる。例
えば、該ｃＤＮＡを適切なプロモーター（ｌａｃ、’Ｉ
ａｃ、Ｔｒｐ、ＰＬなど）の制御下に適切な発現ベクタ
ー（ｐＫＫ２２３−３、ｐＢｓ、　ｐＤＲ５４０、ｐＤ
Ｒ７２０、ｐＰＬ−１ａｍｂｄａなど）に挿入し、宿主
（Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ−１２ＡＧ−１、ＭＭ２９４、ＤＨ
Ｉ、ＨＢＩＯＩ、Ｃ６００など）に導入して発現させれ
ばよい。ｒｅｇ遺伝子にコードされるｒｅｇ蛋白質を、
酵母や猿細胞などの真核細胞を宿主として用いて発現・
分泌させれば、後の採取精製が容易になる。例えば、酵
母を用いる場合には、発現ベクターとしてｐＧＰＤ−１
、ｐＭＦα８、ＡＡＲ６、ＡＢａｄｅ８、ＡＨ５、ＹＥ
ｐ５２、ｐＡｃＦ３０１、ｐＡＭ８２など様々な公知の
ベクターが使用可能である。ＣＯ５Ｏ５脳細胞用する場
合には、ｐＫｓＶ−１０などの発現ベクターが使用でき
る。上記の宿主−ベクター系に限らず公知の宿主−ベク
ター系はほとんどｒｅｇ蛋白質の発現に適応できるもの
と考えられる。

発現されたｒｅｇ蛋白質は、従来の精製法に従い、遠心
分離、クロマトグラフィー、透析、塩析などを適当に組
み合わせて精製すれば良い。

ヒトｒｅｇ遺伝子から推定されるアミノ酸配列は、その
Ｎ末端付近が疎水性アミノ酸に富み、ジグサルペプチド
であると推定され、上記の配列がシングナルベブチドで
あると推定されていた。しかし、本発明に於ては、上記
の推定とは全く異なる、第１図に示されるアミノ酸配列
のＮ末端から２０番目のＧｌｎから始まるｒｅｇｉ白質
が得られた。従って、本発明は、第１図に示されるアミ
ノ酸配列のＮ末端から２０番目のＧｌｎから始まり１６
５番目のＡｓｎに終わるアミノ酸配列を有する新規なｒ
ｅｇ蛋白質をも提供するものである。またこの蛋白質を
遺伝子組換技術を用いて製造する場合、そのＮ末端に開
始コドン由来のＭｅｔが付随することがある。よって本
発明はきらに上記蛋白質のＮ末端にＭ　ｅ　ｔを有する
蛋白質を包含する。

Ｘ貫忽酵Ｎにおけるヒトｒｅ　　の発現監↓勿発現ベクター構築のための宿主としては、Ａ＋、ｔｈｒ
、ｌｅｕ、　ｔｈｉ、　１ａｃＹ、　５ｕｐＥ、　ｔｏ
ｎＡ）が用いられた。

発現ベクターの宿主としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃ
ｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＡＨ２２（ａ　１ｅｕ２、
ｈｉｓ４、Ｃａｎ１、Ｃｉｒ”）（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　？５．１９．２
９−１９３３　（１９７８）　：特公昭６１−５５９５
１．微工研条寄第３１２号）を用いた。この酵母は予め
ＹＰ、ＤＡ培地（ＬＸ酵母エキス、２ｘポリペプトン、
２ｚグルコス、２０　ｍｇ／ｌアデニン）中で培養して
おいた。

虱曳１．５ｇ／ｌのＫＨ、ＰＯ，を含むＰｉ添加培地（以下
Ｐｉ（＋）培地と略記）および、上記Ｐｉの代わりに１
．５　ｇ／ｌのＫＣＩを含むＰｉ欠損培地（以下Ｐｉ（
−）培地と略記）の調製には、パークホルダー最小培地
（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ’ｓ　ｍｉｎｉｍａｌ　ｍｅｄ
ｉｕｍ、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７７、４
５０４−４５０８　（１９８０））を用いた。

酵　およびリンカ− 制限酵素、１４ＤＮＡリガーゼ、クレノーフラグメント
は宝バイオケミカルズから購入し、Ｘｈ６　Ｉすンカー
はファルマシアから購入した。

プラスミド発現ベクターとしては、酵母−大腸菌シャトルヘクター
ｐＡＭ８２　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８０、１−５　（１９８３）、特公昭
６１−５５９５１：微工研条寄第３１３号〉を用いた。

これは、ＡＲ５１，２μｍｏｒｉと１ａｕ２を有する５
、５Ｋｂの乳ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＤＮＡ断片および
Ａｐ　ｌマーカーとｏｒｉを有する３、７ＫｂのｐＢＲ
３２２断片からなり、さらに、ＰＨ０５プロモーターを
有する２、７Ｋｂの酵母ＤＮＡ断片を有する。

発現ベクターの構築に用いたｐＧＥＭ４は、プロメガバ
イオチク　（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ　（Ｕ、Ｓ
、Ａ、　））力）ら購入した。

ヒトｒｅｇ　　ｃＤＮＡには、その構造遺伝子内にＥｃ
ｏＲＩサイトがあり、従って、　ｐＢｓベクターのＥＣ
０ＲＩサイトに挿入する際には、２つのＥｃｏＲＩ断片
に分かれて挿入されている。

形質転換形質転換はＫｉｍｕｒａらの方法（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ。

１５３、１６３−１６８　（１９８３））に従って行な
われた。

ｌｅｕ　”株は、２ｚ寒天を含むハークホルダー最小培
地上で選択した。

培養と誘導プロモータＰＨ０５は培地中のＰｉ濃度により制御でき
る（Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　１．６７５−６
８０　（１９８２）〉。最初に、酵母を、ヒスチジン（
２０μｇ／ｍｌ）　ヲ加えたＰｉ（＋）培地中で、３０
°Ｃ２日間、好気的に培養した。そのうちの２００μｍ
を、ヒスチジン（２０μｓ／ｍｌ）を加えたＰｉ（−）
培地１０ｍ１に移した。これを同様に培養したところ、
３〜５日後に、ヒトｒｅｇ蛋白質が培地中に検出された
。

発現ベクターの構築発現ベクターの構築は、第３図に示きれる通り常法に従
ってなされた（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８２）参照〉。

ｐＢＳベクターに挿入されたヒトｒｅｇ　　ｃＤＮＡは
、５゛末端断片および３′末端断片の、２つの断片（前
半と後半）に分かれてそれぞれ挿入されている。

まず、５゛末端断片く前半〉を有するｐＢｓヘクターを
Ａｆｌ　ｍで消化し、クレノーフラグメントで処理し、
Ｘｈｏ　Ｉリンカ−を付加してＥｃｏＲＩで消化した。

３′末端断片（後半）を有するｐＢｓベクタは、Ｅｃｏ
ＲＩおよびＸｂａ　Ｉで消化した。ｐＧＥＭ４のＳａｃ
　ＩをＸｈｏ　Ｉリンカ−を用いてＸｈｏ　Ｉサイトと
し、このｐＧＥＭ４（Ｘｈｏ　Ｉ　）に、上記で得られ
た２つのヒトｒｅｇ　　ｃＤＮＡ断片を挿入した。得ら
れたｐＧＥＭ４（Ｘｈｏ　Ｉ　）　ｈｕ　ｒｅｇをＸｈ
ｏ　Ｉおよび１ｉｎｅ　Ｍで消化し、Ｘｈｏ　Ｉとｐｖ
ｕ　ｎ　で消化したｐＡＭ８２に挿入した。このプラス
ミドを、ｐＡＭ８２−ｈｕｍａｎ　ｒｅｇと命名した。

それぞれの制限酵素は、３単位／μｇ　ＤＮＡの濃度で
使用し、３７℃で１時間インキュベートした。

ヒトｒｅ　　蛋白質の産生上記で構築きれたヒトｒｅｇ　　ｃＤＮＡ発現ベクター
をＥ、　ｃｏｌｉ　Ｋ−１２Ｃ６００に導入し、アンピ
ンリン耐性コロニーを選択した。これらの形質転換株を
用いて、プラスミドＤＮＡを大量にＭＷした。

Ｅ、　ｃｏｌｉ中で増殖した組換えプラスミドを、酸Ｎ
宿主Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＡＨ２２に常法に従
って導入し、Ｌｅｕ４コロニーを選択した。

形質転換株は、まず、Ｐｉ（＋）培地１００ｍ’ｌを含
む５００ｍ１三角フラスコ中、３日間、３０℃、３００
ｒｐｍ　（ロタリーシエイカー）で培養した。このうち
の１にを、Ｐｉ（−）培地２．５Ｌを含む５Ｌミニシ〜
−に植菌し、５００ｒｐｍ、ｌｖｖｍ　（Ａｉｒ　２．
５Ｌ／ｍ１ｎ）、３０”Ｃで５日間培養した。培地には
、グルコースを別滅菌後添加し、また消泡剤ポリプロピ
レングリコ−Ａ−２０００を０．４ｍｌル添加した。発
酵時のｐＨを、５．０．５５．６．０．６５．７．０．
７．５．８．０に調整して行なったもの、未Ｈ１４整で
行なったものを合わせ、遠心して、１２．４Ｌの培養液
を得た。

ヒトｒｅ　　蛋白質の精製ｒｅｇ蛋白質を含む培養液（ＩＬ）を、ＩＮ塩酸でｐＨ
３，４に調整した。この溶液に、５０　ｍＭＭ２Ｂ５酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３，４）　（緩衝液Ａ）で平
衡化した１００　ｍｌの　Ｓ−セファロース（ファスト
フロータイブ）を加え、４℃で１６時間穏やかに攪拌し
た。このｒｅｇ蛋白質を吸着したＳ−セファロースをカ
ラム（５ｘ　８　ａｍ）にバックし、０２　Ｍ　ＮａＣ
１ヲ含む緩衝液Ａで洗浄し、０．５　Ｍ　ＮａＣ１を含
む緩衝液Ａで溶出した。５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（１５Ｘゲ
ル）上で約１６．０００の分子量を示すｒｅｇ蛋白質画
分をプールし、４℃で１６時間緩衝液Ａに対して透析し
た。これを、緩衝液Ａで平衡化したＳ−セファロースカ
ラム（０，７ｘ　２５　ｃｍ＞にイ寸し、０．２　Ｍ　
ＮａＣｌを含む緩衝液Ａで洗浄した。

ｒｅｇ蛋白質は、カラムの１０倍量の０２〜０．５Ｍ　
ＮａＣ１を含む緩衝液Ａの線状勾配により溶出した。１
６Ｋ（７）ｒｅｇ蛋白質は０．３８　Ｍ　ＮａＣ１を含
む緩衝液Ａで溶出され、５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（１５Ｘゲ
ル）上で均一であった。精製ｒｅｇ蛋白質は、Ａｍ１ｃ
ｏｎ　ＹＭ−１０ｍｅｍｂｒａｎｅを用いる限外濾過に
より脱塩後、１０ｍＭの酢酸中に０．１　ｍｇ／ｍｌと
なるように保存した。ＩＬの酵母培養液から約１ｍｇの
ｒｅｇ蛋白質が得られた。

ヒトｒｅ　　蛋白質の特性・分子量得られた精製ｒｅｇ蛋白質の分子量は５ＤＳＰＡＧＥに
より決定し、約１６．０００であった。

・アミノ酸組成ｒｅｇ蛋白質をＨＰ　Ｌ　Ｃ（Ｂｒｏｗｎｌａｅ、　ａ
ｑｕａｐｏｒｅＲＰ−３００ｃｏｌｕｍｎ）で脱塩し、
４Ｍメタンスルホン酸（０，２Ｘ　３−（２−アミノエ
チル〉インドールを含む）を用いて１１０℃で２４時間
加水分解した。アミノ酸分析は、日立アミノ酸分析機（
Ｍｏｄｅｌ　８３５）を用いて行なった。結果を表１に
示す。

ｓｐｈｒｅｒ１ｕＰｒ。

Ｇｌｙｌａ１／２Ｃｙ　ａａ１ｅｔ１ｅｅｕｙｒｈｅｙｓｉｓｒｇｒｐ表１１８．４７．１１７　、４１４．４６．１１０　、１Ｂ、９４．８９．４１．２４．０９．１７．７７．４９．０２．５５．３６．２・Ｎ末端配列ｒｅｇ蛋白質のＮ末端配列を、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ　４７７Ａ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕ
ｅｎｃｅｒを用いて分析しようとしたあ（、Ｎ末端およ
びそれに続くアミノ酸は全く検出されなかった。そこで
、ピログルタメイトアミノペプチダーゼで処理した後、
上記と同様に分析した。酵素処理したｒｅｇ蛋白質のＮ
末端１４個のアミノ酸が、表２に示すように、決定され
、た。この酵素処理蛋白質のＮ末端はグリシンであり、
アミノ酸配列（Ｇｌｙ−２から５ｅｔ−１５）はｃＤＮ
Ａから推定される配列と一致した。

従って、ｒｅｇ蛋白質のＮ末端は、第１図に示すアミノ
酸配列の２０番目のＧｉｎであると決定された。

また、このＮ末端配列分析の結果、この精製ｒｅｇ蛋白
質には、２２番目のＧｉｎで始まるｒｅｇ蛋白質が約６
０％に対して、本発明の２０番目のＧｌｎで始まるｒｅ
ｇ蛋白質が約４０％存在していることがわかった。

表２（Ｇ　ｌ　ｎ　）” ｌ　ｙＧｉｎＧｌｎｌａＧｉｎｈｒＧｌｎｅｕＰｒ。

Ｇｉｎｌａｒｇ１ｅｅｒ（Ｃｙｓ）杓２２．５１７　、０２２　、８１０．６２１　、１１６　、４２６　、３３４．４３９　、３３４　、６２０　、９２９．０２９．８９６．１＊ｌ未同定残基；ピログルタメイトアミノペプテダーゼ
処理からＧｉｎと推定＊２未同定残基：ｃＤＮＡからＣｙｓと推定発明の効果ヒトｒｅｇ遺伝子はインスリン産生群Ｂ細胞の再生に密
接に関与すると考えられ、この遺伝子によりコードされ
る本発明のｒｅｇ蛋白質を投与可能な医薬として開発す
ることにより、糖尿病患者自身の膵Ｂ細胞の再生賦活と
いう、対症療法である従来のインスリン投与法に優る、
糖尿病の原因療法が可能になる。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒ）ｒｅｇ遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列および該
塩基配列から推定されるアミノ酸配列を示す。第２図は
ラットｒｅｇ遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列および該塩基配
列から推定されるアミノ酸配列を示す。第３図はヒトｒ
ｅｇの発現ベクターの構築の概略図である。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）第１図に示されるアミノ酸配列のＮ末端から２０
番目のＧｌｎから始まり１６５番目のＡｓｎで終わるア
ミノ酸配列、または該アミノ酸配列のＮ末端にさらにＭ
ｅｔを有するアミノ酸配列を有する新規ｒｅｇ蛋白質。
（２）請求項１に記載のｒｅｇ蛋白質をコードする遺伝
子。
（３）請求項１に記載のｒｅｇ蛋白質をコードする遺伝
子を有する発現ベクターを導入した宿主を培養し、該培
養物から該ｒｅｇ蛋白質を採取することを特徴とするｒ
ｅｇ蛋白質の製造法。
（４）該宿主が酵母である請求項３に記載の製造法。