JPH0220285A - ＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼの製造方法 - Google Patents
ＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼの製造方法Info
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- JPH0220285A JPH0220285A JP1125473A JP12547389A JPH0220285A JP H0220285 A JPH0220285 A JP H0220285A JP 1125473 A JP1125473 A JP 1125473A JP 12547389 A JP12547389 A JP 12547389A JP H0220285 A JPH0220285 A JP H0220285A
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
- C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、制限エンドヌクレアーゼＮ ｄｅ ｒおＪ：
びその修飾メチラーゼのクローンならびに該クロンから
これらの酵素を製造する方法に係る。
びその修飾メチラーゼのクローンならびに該クロンから
これらの酵素を製造する方法に係る。
制限エンドヌクレアーゼは天然の細菌中にみられる酵素
の一群である。制限エンドヌクレアーゼは、夾雑する伯
の細菌成分から精製すると、実験室でＤＮＡ分子を切断
して各々相応する正確な断片を形成するのに使用するこ
とが（・きる。この性質の故に、ＤＮＡ分子はひとつず
つ独自に同定することができ、また分画してその構成遺
伝子を単離することができる。制限エンドヌクレアーゼ
は現代の遺伝子研究にｄ３１］る不可欠の手段であるこ
とが立証されている。これらの酵素は生化学的４ｆ「ハ
サミ」であり、これによって遺伝子工学ｄ３よび遺伝子
解析が達成される。
の一群である。制限エンドヌクレアーゼは、夾雑する伯
の細菌成分から精製すると、実験室でＤＮＡ分子を切断
して各々相応する正確な断片を形成するのに使用するこ
とが（・きる。この性質の故に、ＤＮＡ分子はひとつず
つ独自に同定することができ、また分画してその構成遺
伝子を単離することができる。制限エンドヌクレアーゼ
は現代の遺伝子研究にｄ３１］る不可欠の手段であるこ
とが立証されている。これらの酵素は生化学的４ｆ「ハ
サミ」であり、これによって遺伝子工学ｄ３よび遺伝子
解析が達成される。
制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子上の特定のヌク
レオチド配列（いわゆる「認識配列」）を認識してこれ
に結合することによって作用する。
レオチド配列（いわゆる「認識配列」）を認識してこれ
に結合することによって作用する。
これらの酵素はＤＮＡ分子に結合すると、その配列の内
部または一端でその分子を開裂する。異なる制限エンド
ヌクレアーゼはそれぞれ異なる認識配列に対して親和性
を有１ノでいる。今日までに調べられた幾白株もの細菌
で百を越える数の異なる制限］ンドヌクレアーゼが同定
されている。
部または一端でその分子を開裂する。異なる制限エンド
ヌクレアーゼはそれぞれ異なる認識配列に対して親和性
を有１ノでいる。今日までに調べられた幾白株もの細菌
で百を越える数の異なる制限］ンドヌクレアーゼが同定
されている。
通常、細菌は、その株毎に、少数の制限エンドヌクレア
ーゼを持つに過ぎない。これらのＪンドヌクレアーゼは
それの由来となった細菌に因んで命名される。たどえば
、ｌｌａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ａｅｇｙｐｔｉｕｓ株
はＨａｅＪ、ｌ−１ａｅ［およびＨａｅｌｌと呼称され
る３つの異なる制限エンドヌクレアーゼを合成する。こ
れらの酵素は、それぞれ（ＡＴ）ＧＧＣＣ（ＡＴ）、Ｐ
ｕＧＣＧＣＰｙおよびＧＧＣＣという配列を認識【ノて
開裂する。一方、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ ＲＹ１３は１種類の酵素ＥＣ０ＲＩを合成するだ
けであり、この酵素はＧＡＡＴＴＣという配列を認識す
る。
ーゼを持つに過ぎない。これらのＪンドヌクレアーゼは
それの由来となった細菌に因んで命名される。たどえば
、ｌｌａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ａｅｇｙｐｔｉｕｓ株
はＨａｅＪ、ｌ−１ａｅ［およびＨａｅｌｌと呼称され
る３つの異なる制限エンドヌクレアーゼを合成する。こ
れらの酵素は、それぞれ（ＡＴ）ＧＧＣＣ（ＡＴ）、Ｐ
ｕＧＣＧＣＰｙおよびＧＧＣＣという配列を認識【ノて
開裂する。一方、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ ＲＹ１３は１種類の酵素ＥＣ０ＲＩを合成するだ
けであり、この酵素はＧＡＡＴＴＣという配列を認識す
る。
理論に縛られるつもりはないが、自然界で制限エンドヌ
クレアーゼは細菌細胞の増殖に関して保護的な役割を果
たしていると考えられる。これらの酵素のおかげで、細
菌は、放っておくとこれらの細菌を破壊したりまたはこ
れらに寄外したりするウィルスやプラスミドのような外
来ＤＮＡ分子による感染に対して抵抗することが可能に
なる。
クレアーゼは細菌細胞の増殖に関して保護的な役割を果
たしていると考えられる。これらの酵素のおかげで、細
菌は、放っておくとこれらの細菌を破壊したりまたはこ
れらに寄外したりするウィルスやプラスミドのような外
来ＤＮＡ分子による感染に対して抵抗することが可能に
なる。
制限エンドヌクレアーゼは、侵入して来るＤＮＡ分子に
結合し、認識配列に出会う度毎にそれらのＤＮＡ分子を
開裂することによって、細菌に抵抗性を付与する。こう
して生起する破壊の結果、侵入する遺伝子の多くは不活
性となり、そのＤ Ｎ Ａはエキソヌクレアーゼににつ
でさらに細かく分解されることになる。
結合し、認識配列に出会う度毎にそれらのＤＮＡ分子を
開裂することによって、細菌に抵抗性を付与する。こう
して生起する破壊の結果、侵入する遺伝子の多くは不活
性となり、そのＤ Ｎ Ａはエキソヌクレアーゼににつ
でさらに細かく分解されることになる。
細菌の防御系の第二の要素は修飾メチラーゼである。こ
れらの酵素は制限エンドヌクレアーゼと相補的であり、
これによって、細菌が外来の感染性ＤＮＡから自身のＤ
ＮＡを防御し区別できるようにする手段が提供される。
れらの酵素は制限エンドヌクレアーゼと相補的であり、
これによって、細菌が外来の感染性ＤＮＡから自身のＤ
ＮＡを防御し区別できるようにする手段が提供される。
修飾メチラーゼは対応する制限エンドヌクレアーゼと同
じヌクレオチド認識配列を認識してそれに結合するが、
このＤＮＡを破断する代わりに、メチル基を付加するこ
とによってその配列内のヌクレオチドのいずれかを化学
的に修飾する。このメチル化が起こると、その認識配列
に制限Ｔンドヌクレアーゼが結合することはなく、また
、その配列が制限１ンドヌクレアーゼによって開裂され
ることもない。細菌細胞のＤＮＡはその修飾メチラーゼ
の活性のおかげでいつも完全に修飾されており、したが
って自身の内因性制限エンドヌクレアーゼの存在に対し
て完全に非感受性となっている。制限エキソヌクレアー
ゼの認識と攻撃に対して感受性のあるのは未修飾のＤＮ
Ａ、したがって外来のものであることが確認できるＤＮ
Ａだけである。
じヌクレオチド認識配列を認識してそれに結合するが、
このＤＮＡを破断する代わりに、メチル基を付加するこ
とによってその配列内のヌクレオチドのいずれかを化学
的に修飾する。このメチル化が起こると、その認識配列
に制限Ｔンドヌクレアーゼが結合することはなく、また
、その配列が制限１ンドヌクレアーゼによって開裂され
ることもない。細菌細胞のＤＮＡはその修飾メチラーゼ
の活性のおかげでいつも完全に修飾されており、したが
って自身の内因性制限エンドヌクレアーゼの存在に対し
て完全に非感受性となっている。制限エキソヌクレアー
ゼの認識と攻撃に対して感受性のあるのは未修飾のＤＮ
Ａ、したがって外来のものであることが確認できるＤＮ
Ａだけである。
遺伝子工学技術の出現によって、今では、遺伝子をクロ
ーニングし、その遺伝子がコードしているタンパク質や
酵素を従来の精製技術で入手可能な聞より大量に生産す
ることが可能である。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の
クローンを単離する際の鍵は、そのようなりローンの出
現頻度が１０−３〜１０−４程度に低い場合、複雑な「
ライブラリー」、すなわち「ショットガン」法で得られ
るクローンの集団の中で目的とするり０−ンを同定する
ための簡単で信頼のおける方法を開発することである。
ーニングし、その遺伝子がコードしているタンパク質や
酵素を従来の精製技術で入手可能な聞より大量に生産す
ることが可能である。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の
クローンを単離する際の鍵は、そのようなりローンの出
現頻度が１０−３〜１０−４程度に低い場合、複雑な「
ライブラリー」、すなわち「ショットガン」法で得られ
るクローンの集団の中で目的とするり０−ンを同定する
ための簡単で信頼のおける方法を開発することである。
好ましくは、この方法は、目的どしない大多数のクロー
ンは破壊されるが珍にある望ましいクローンは生ぎ残れ
るように、選択的なものであるべきである。
ンは破壊されるが珍にある望ましいクローンは生ぎ残れ
るように、選択的なものであるべきである。
■型の制限−修飾系はクローニングされつつあり、その
数は次第に増加している。最初にクローニングされた系
は、制限エンドヌクレアーゼクローンを同定または選択
する手段としてバクアリオファージによる感染を使用し
た［ ＨｈａｌＩ ： Ｈａｎｎら。
数は次第に増加している。最初にクローニングされた系
は、制限エンドヌクレアーゼクローンを同定または選択
する手段としてバクアリオファージによる感染を使用し
た［ ＨｈａｌＩ ： Ｈａｎｎら。
Ｇｅｎｅ、 ３ ： ９７−１１２ （１９７
８） ； ＥｃｏＲＴｌ ： Ｋｏｓｙｋｈら。
８） ； ＥｃｏＲＴｌ ： Ｋｏｓｙｋｈら。
Ｍｏ１ｅｃ、 ｇｃｎ、 Ｇｃｎｅｔ、、 １７８
： ７１７−７１９ （１９８０）ＰｓｔＩ ：
Ｗａｌｄｅｒら、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、八ｃａｄ、
Ｓｃｉ、 ＵＳＡ７８、１５０３−１５０７ （
１９８１）］。細菌中に制限−修飾系が存在するど細菌
はバタテリオファージによる感染に対して抵抗できるの
で、クローニングされた制限−修飾遺伝子を保持する細
胞は、原理的に、ファージに暴露されたライブラリーか
らの生き残りとして選択的に単離することができる。し
かしこの方法は限られた価値しかないことが判明した。
： ７１７−７１９ （１９８０）ＰｓｔＩ ：
Ｗａｌｄｅｒら、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、八ｃａｄ、
Ｓｃｉ、 ＵＳＡ７８、１５０３−１５０７ （
１９８１）］。細菌中に制限−修飾系が存在するど細菌
はバタテリオファージによる感染に対して抵抗できるの
で、クローニングされた制限−修飾遺伝子を保持する細
胞は、原理的に、ファージに暴露されたライブラリーか
らの生き残りとして選択的に単離することができる。し
かしこの方法は限られた価値しかないことが判明した。
特定的にいうと、クローニングされた制限−修飾遺伝子
は、選択的な生き残りを可能にする程に充分なファージ
耐性を常に発現するとは限らないことが判明したのであ
る。
は、選択的な生き残りを可能にする程に充分なファージ
耐性を常に発現するとは限らないことが判明したのであ
る。
別のクローニング法では、最初プラスミド由来とされて
いた系をＥ、ｃｏＮクローニングプラスミド中に組み込
んでいる［ Ｅ ＣＯＲＶ ： Ｂｏｕｇｕｅｌｅｒｅ
ｔら、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、 １
２： ３６５９−３６７６（１９８４）；ｐ ａｅＲ７
：Ｇｉｎｏｅｒａｓと Ｂｒｏｏｋｓ Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 ＾ｃａｄＳｃｉ、 ｌｌ５Ａ、 ８０：
４０２−４０６（１９８３） ； Ｔｈｅｒｉａｕｌｔ
どＲｏｙｃｅｎｅ、 １９：３５５−３５９ （１９８
２）；ＰｖｕＩＩ ： Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌら。
いた系をＥ、ｃｏＮクローニングプラスミド中に組み込
んでいる［ Ｅ ＣＯＲＶ ： Ｂｏｕｇｕｅｌｅｒｅ
ｔら、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、 １
２： ３６５９−３６７６（１９８４）；ｐ ａｅＲ７
：Ｇｉｎｏｅｒａｓと Ｂｒｏｏｋｓ Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 ＾ｃａｄＳｃｉ、 ｌｌ５Ａ、 ８０：
４０２−４０６（１９８３） ； Ｔｈｅｒｉａｕｌｔ
どＲｏｙｃｅｎｅ、 １９：３５５−３５９ （１９８
２）；ＰｖｕＩＩ ： Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌら。
Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１６４： ５０１−５０
９ （１９８５）］。
９ （１９８５）］。
第三の方法として多くの系のクローニングに使用されて
いる方法では、本発明者らの特許出願第７０７０７９号
に関連する活性なメチラーゼ遺伝子にツイテ選択する［
ＢｓｕＲＩ：Ｋ１５ｓら、 Ｎｕｃｌｅｉｃ八ｃｉｄｓ
へＲｅｓ、 １３： ６４０３−６４２１ （１９
８５）］。制限遺伝子と修飾遺伝子とは近接して結合し
ている傾向があるので、両者の遺伝子を含有するクロー
ンは一方の遺伝子について選択するだけで単離できるこ
とが多い。しかし、メチル化活性による選択では常に完
全な制限−修飾系が得られるわけではなく、逆に、メチ
ラーゼ遺伝子のみが得られることあある［ Ｂ ５ｔ）
ＲＩ ： Ｓｚｏｍｏｌａｎｙｉら、 Ｇｅｎｅ、
１０：２１９−２２！１（１９８０） ； ３ ｃｎ■
： Ｊａｎｕｌａ＋ｔｉｓら、 Ｇｅｎｅ、 ２０
：１９７−２０４ （１９８２） ： Ｂ ｓｕＲＩ
： Ｋ１５ｓと Ｂａ１ｄａｕｆ、 Ｇｅｎｅ２１：
１１１−１１９（１９８３） ；およびＭ ｓｐＩ ：
Ｗａｌｄｅｒら、ＪＢｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、、
２５８ ： １２３５−１２４１（１９８３）］
。
いる方法では、本発明者らの特許出願第７０７０７９号
に関連する活性なメチラーゼ遺伝子にツイテ選択する［
ＢｓｕＲＩ：Ｋ１５ｓら、 Ｎｕｃｌｅｉｃ八ｃｉｄｓ
へＲｅｓ、 １３： ６４０３−６４２１ （１９
８５）］。制限遺伝子と修飾遺伝子とは近接して結合し
ている傾向があるので、両者の遺伝子を含有するクロー
ンは一方の遺伝子について選択するだけで単離できるこ
とが多い。しかし、メチル化活性による選択では常に完
全な制限−修飾系が得られるわけではなく、逆に、メチ
ラーゼ遺伝子のみが得られることあある［ Ｂ ５ｔ）
ＲＩ ： Ｓｚｏｍｏｌａｎｙｉら、 Ｇｅｎｅ、
１０：２１９−２２！１（１９８０） ； ３ ｃｎ■
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：１９７−２０４ （１９８２） ： Ｂ ｓｕＲＩ
： Ｋ１５ｓと Ｂａ１ｄａｕｆ、 Ｇｅｎｅ２１：
１１１−１１９（１９８３） ；およびＭ ｓｐＩ ：
Ｗａｌｄｅｒら、ＪＢｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、、
２５８ ： １２３５−１２４１（１９８３）］
。
制限−修飾遺伝子のクローニングに対する潜在的な障壁
は、修飾にＪ：っで保護されていない宿主中にエンドメ
クレアーじ遺伝子を導入しｊ、つとすることにある。メ
チラーゼ遺伝子どエンドヌクレアーゼ遺伝子どを一緒に
単一のクローンとして導入すると、エンドメクレアーぜ
が宿−ＩＥ Ｄ Ｎ Ａを開裂する機会を得る前にメチ
ラーゼがそのＤＮＡを修飾して保護するはずである。し
たがって、場合によっては、これらの遺伝子を順番にす
なわち、最初にメチラーゼ、次にエンドヌクレアーゼの
順にのみクローニングすることが可能となるがもしれな
い。制限−修飾系のクローニングに対する別の障壁は、
旦、ｃｏｌｉの株の中にはシトシンの修飾に対して逆の
反応を示すものがあるという発見の中に存する。すなわ
ち、そのような株は、メチル化シトシンを含有している
ＤＮＡを破壊する系を持っているのである［Ｒａｌｅｉ
ｇｈと一１ｌｓｏｎ ＰｒｏｃＮａｔｌ、＾ｃａｄ、
Ｓｃｉ、 ＩＩｓ＾、 ８３： ９０７０−９０７４
（１９１１６）１゜シトシ゛ンに対して特異的なメチ
ラーゼ遺伝子は、それ単独でも、あるいはその対応する
エンドメクレアーぜ遺伝子と一緒にでも、これらの株中
で容易にクローニングすることができない。この問題を
避けるためには、これらの系を欠損している旦 蝦変異
株（ＭＣｒＡ おＪζびＭＣｒＦ３ ）を使用する
必要がある。
は、修飾にＪ：っで保護されていない宿主中にエンドメ
クレアーじ遺伝子を導入しｊ、つとすることにある。メ
チラーゼ遺伝子どエンドヌクレアーゼ遺伝子どを一緒に
単一のクローンとして導入すると、エンドメクレアーぜ
が宿−ＩＥ Ｄ Ｎ Ａを開裂する機会を得る前にメチ
ラーゼがそのＤＮＡを修飾して保護するはずである。し
たがって、場合によっては、これらの遺伝子を順番にす
なわち、最初にメチラーゼ、次にエンドヌクレアーゼの
順にのみクローニングすることが可能となるがもしれな
い。制限−修飾系のクローニングに対する別の障壁は、
旦、ｃｏｌｉの株の中にはシトシンの修飾に対して逆の
反応を示すものがあるという発見の中に存する。すなわ
ち、そのような株は、メチル化シトシンを含有している
ＤＮＡを破壊する系を持っているのである［Ｒａｌｅｉ
ｇｈと一１ｌｓｏｎ ＰｒｏｃＮａｔｌ、＾ｃａｄ、
Ｓｃｉ、 ＩＩｓ＾、 ８３： ９０７０−９０７４
（１９１１６）１゜シトシ゛ンに対して特異的なメチ
ラーゼ遺伝子は、それ単独でも、あるいはその対応する
エンドメクレアーぜ遺伝子と一緒にでも、これらの株中
で容易にクローニングすることができない。この問題を
避けるためには、これらの系を欠損している旦 蝦変異
株（ＭＣｒＡ おＪζびＭＣｒＦ３ ）を使用する
必要がある。
精製した制限］ンドヌクレアーゼ、および重要性はそれ
より落ちるが修飾メチラーゼは、実験室でＤＮＡの特性
決定と再配列をするのに有用な道具であるために、これ
らの酵素を大量に合成する細菌株を組換えＤＮＡ技術に
よって得ることは商業的な魅ツノがある。そのような株
が得られれば、商業的に有用な都で生産するための手段
が提供されるばかりでなく精製の作業も簡単になると思
ゎれるので、これらの株は極めて有用なものとなるう。
より落ちるが修飾メチラーゼは、実験室でＤＮＡの特性
決定と再配列をするのに有用な道具であるために、これ
らの酵素を大量に合成する細菌株を組換えＤＮＡ技術に
よって得ることは商業的な魅ツノがある。そのような株
が得られれば、商業的に有用な都で生産するための手段
が提供されるばかりでなく精製の作業も簡単になると思
ゎれるので、これらの株は極めて有用なものとなるう。
発明の概要
本発明によって、Ｎ０ｉＳＳｅｒｉａ ｄｅｎｉｔｒ
ｉｆ＋ｃａｎｓに由来するＮｄｅＩ制限エンドヌクレア
ーゼおよび修飾メチラーゼの遺伝子を含有するクローン
、ならびにこれらの酵素の製造方法が提供される。より
特定すると、本発明は、ＣＡ↓ＴＡＴＧというＤＮＡ配
列を認識して矢印で示した最初の５°Ａと王の間を開裂
する酵素である制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩを発ｍ
−ｙるクローンに係る。ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１
５０１１４−１１６ （１９８２）参照。本文献の開示
は本明細書に参照として組み入れるものとする。
ｉｆ＋ｃａｎｓに由来するＮｄｅＩ制限エンドヌクレア
ーゼおよび修飾メチラーゼの遺伝子を含有するクローン
、ならびにこれらの酵素の製造方法が提供される。より
特定すると、本発明は、ＣＡ↓ＴＡＴＧというＤＮＡ配
列を認識して矢印で示した最初の５°Ａと王の間を開裂
する酵素である制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩを発ｍ
−ｙるクローンに係る。ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１
５０１１４−１１６ （１９８２）参照。本文献の開示
は本明細書に参照として組み入れるものとする。
この酵素をクローニングする好ましい方法は、Ｎｅ１Ｓ
Ｓｅｒｉａ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓに由来する
ＤＮＡを含有づ−るライブラリーを形成し、Ｎｄｅ工修
飾メチラーゼを］−ドしているＤＮＡを含有するクロー
ンを単離し、これらをスクリーニングして、ＮｄｅＩ制
限エンドヌクレアーゼ遺伝子も共に含有しているクロー
ンを同定することからなる。
Ｓｅｒｉａ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓに由来する
ＤＮＡを含有づ−るライブラリーを形成し、Ｎｄｅ工修
飾メチラーゼを］−ドしているＤＮＡを含有するクロー
ンを単離し、これらをスクリーニングして、ＮｄｅＩ制
限エンドヌクレアーゼ遺伝子も共に含有しているクロー
ンを同定することからなる。
詳細な説明
本発明は、ＮｄｅＩ制限および修飾遺伝子のり［１ニン
グ、ならびにこれによって生産されるクローンから制限
エンドヌクレアーゼ選択法工を製造する方法を提供する
。
グ、ならびにこれによって生産されるクローンから制限
エンドヌクレアーゼ選択法工を製造する方法を提供する
。
本方法は、発現されたＮｄｅＩ制限遺伝子おにびメチラ
ーゼ遺伝子を含有することに基づいて、エンドヌクレア
ーゼ選択法によりクローンを選択したという事実を利用
している。そのようなりローンはＮｅｄＩ制限エンドヌ
クレアーゼにょろりｖｉｔｒｏ消化に抵抗性である。
ーゼ遺伝子を含有することに基づいて、エンドヌクレア
ーゼ選択法によりクローンを選択したという事実を利用
している。そのようなりローンはＮｅｄＩ制限エンドヌ
クレアーゼにょろりｖｉｔｒｏ消化に抵抗性である。
ＮｄｅＩ制限遺伝子およびメチラーゼ遺伝子をクローニ
ングして発現させるための本発明の好ましい方法には以
下のステップが含まれる。
ングして発現させるための本発明の好ましい方法には以
下のステップが含まれる。
（１） Ｎｅ１ｓｓｃｒｉａ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉ
ｃａｎｓ株のゲノムＤＮＡを精製する。
ｃａｎｓ株のゲノムＤＮＡを精製する。
（２） このゲノムＤＮＡをＮＳｉ工制限エンドヌク
レアーゼのような制限エンドヌクレアーゼで完全に消化
する。
レアーゼのような制限エンドヌクレアーゼで完全に消化
する。
（３） その結果得られたＮ５ｉＩ断片を、ｐＵｃ１
９若しくはＩＩＢ Ｒ３２２のようなりローニングベク
ターのｐｓｔＩクローニング部位中又はｐＡｃＹｃ１７
７のＮ５ｉＩ部位中に結合し、この混合物を用いてＥ．
ｃｏｌｉ ＲＲ１細胞のにうな適当な宿主細胞を形質転
換する。
９若しくはＩＩＢ Ｒ３２２のようなりローニングベク
ターのｐｓｔＩクローニング部位中又はｐＡｃＹｃ１７
７のＮ５ｉＩ部位中に結合し、この混合物を用いてＥ．
ｃｏｌｉ ＲＲ１細胞のにうな適当な宿主細胞を形質転
換する。
（４） この形質転換された混合物を、形質転換細胞
を選択するためのアンピシリンのような抗生物質を含有
する培地に接種する。培養後、形質転換されたコロニー
をひとつに集めて細胞ライブラリーとする。
を選択するためのアンピシリンのような抗生物質を含有
する培地に接種する。培養後、形質転換されたコロニー
をひとつに集めて細胞ライブラリーとする。
（５） この細胞ライブラリーから組換えプラスミド
全部をそっくり精製してプラスミドライブラリーを作製
する。
全部をそっくり精製してプラスミドライブラリーを作製
する。
（６） このプラスミドライブラリーを、Ｗａｔｓｏ
ｎら。
ｎら。
５ｕｐｒａに記載されている方法と類似の方法によって
Ｎｅ１ｓｓｅｒｔａ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓか
ら製造したＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼで完全に消
化する。ＮｄｅＩ消化により、メチラーゼを含有しない
未修飾クローンが特異的に破壊され、ＮｄｅＩメチラー
ゼクローンの相対頻度が増大する。
Ｎｅ１ｓｓｅｒｔａ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓか
ら製造したＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼで完全に消
化する。ＮｄｅＩ消化により、メチラーゼを含有しない
未修飾クローンが特異的に破壊され、ＮｄｅＩメチラー
ゼクローンの相対頻度が増大する。
（７）消化したプラスミドライブラリーをアガロースゲ
ル電気泳動に掛け、未消化の超らせんプラスミドＤＮＡ
をゲルから切り出して溶離さＵる。
ル電気泳動に掛け、未消化の超らせんプラスミドＤＮＡ
をゲルから切り出して溶離さＵる。
（８） 切り出したプラスミドの超らぜんＤＮＡをＥ
、 ｃｏｌｉ Ｒ旧のような適当な宿主中に形質転換し
、形質転換体を選択培地上に接種して回収する。これら
のコロニーを採取し、そのＤＮＡをＮｄｅＩ修飾遺伝子
の存在について以下のように分析する。
、 ｃｏｌｉ Ｒ旧のような適当な宿主中に形質転換し
、形質転換体を選択培地上に接種して回収する。これら
のコロニーを採取し、そのＤＮＡをＮｄｅＩ修飾遺伝子
の存在について以下のように分析する。
すなわち、＝１０ニーが保持するプラスミドを精製し、
ＮｄｅＩｄｅ■ンドヌクレアーゼと共にインキュベート
シてプラスミドが消化に対して抵抗＋ｔ ７！＋１否か
を決定覆る。また、全細胞ＤＮ△（染色体およびプラス
ミド）も精製し、ＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼと共
にインキュベ−１−する。ＮｄｅＩ修飾遺伝子を保持す
るクローンのＤＮＡは充分に修飾されているはずであり
、プラスミドＤＮＡと全ＤＮＡは両方とも消化に対して
実質的に抵抗性であるはずである。
ＮｄｅＩｄｅ■ンドヌクレアーゼと共にインキュベート
シてプラスミドが消化に対して抵抗＋ｔ ７！＋１否か
を決定覆る。また、全細胞ＤＮ△（染色体およびプラス
ミド）も精製し、ＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼと共
にインキュベ−１−する。ＮｄｅＩ修飾遺伝子を保持す
るクローンのＤＮＡは充分に修飾されているはずであり
、プラスミドＤＮＡと全ＤＮＡは両方とも消化に対して
実質的に抵抗性であるはずである。
（９１ＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼを保持するクロ
ーンを、ＮｄｅＩメチラーゼ遺伝子を保持することが分
っているり［１−ンの粗製抽出物を調製し且つＮｄｅＩ
制限エ制限エンドアクレアーについて粗製抽出物を活性
測定することによって同定する。
ーンを、ＮｄｅＩメチラーゼ遺伝子を保持することが分
っているり［１−ンの粗製抽出物を調製し且つＮｄｅＩ
制限エ制限エンドアクレアーについて粗製抽出物を活性
測定することによって同定する。
粗製細胞抽出物中のＮｄＯ■活性のレベルは、測定の結
果、ｐＮｄｅｌＲＨ６，７−Ａ６を含むクローンの細胞
１ｑ当たり約４，５００，０００ ｕｎｉｔｓまたはｐ
ＮｄｅｌＲＨ６，７−Ｂ９を含むクローンの細胞１ｇ当
たり約５００．００ＯＬＩｎｌｔＳである。
果、ｐＮｄｅｌＲＨ６，７−Ａ６を含むクローンの細胞
１ｑ当たり約４，５００，０００ ｕｎｉｔｓまたはｐ
ＮｄｅｌＲＨ６，７−Ｂ９を含むクローンの細胞１ｇ当
たり約５００．００ＯＬＩｎｌｔＳである。
（１０）、 ＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼ活性が
陽ｆ１である組換えプラスミドｐＮｄｅＩＲＨ６，７−
八６Ｊ３よびｐＮｄｅＩＲＨ６，７−８６を含有するク
ローンは、ｐＵｃ１９のｐｓｔＩクローニング部位に挿
入された単一の４０ＫｂのＮ５ｉＩＤＮＡ断片を含む。
陽ｆ１である組換えプラスミドｐＮｄｅＩＲＨ６，７−
八６Ｊ３よびｐＮｄｅＩＲＨ６，７−８６を含有するク
ローンは、ｐＵｃ１９のｐｓｔＩクローニング部位に挿
入された単一の４０ＫｂのＮ５ｉＩＤＮＡ断片を含む。
（１１）種々の制限エンドヌクレアーげに対する多数の
制限エンドヌクレアーゼ部位を、このプラスミド上にマ
ツプ化し第３図に示した。遺伝子の位置は、欠失サブク
ローニングによって決定した。
制限エンドヌクレアーゼ部位を、このプラスミド上にマ
ツプ化し第３図に示した。遺伝子の位置は、欠失サブク
ローニングによって決定した。
（１２） ＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼを、プラ
スミドＤＮｄｅｌＲＨ６，７−Ａ６上にＮｄｅＩ制限遺
伝子ａ３よび修飾遺伝子を保持する細胞から製造覆る。
スミドＤＮｄｅｌＲＨ６，７−Ａ６上にＮｄｅＩ制限遺
伝子ａ３よび修飾遺伝子を保持する細胞から製造覆る。
この細胞を、発酵槽内のアンピシリン含有富栄養培地中
で増殖さぼる。
で増殖さぼる。
（１３）得られた細胞を遠心分離して採取する。
（１４）この細胞を超音波処理で破砕すると、ＮｄｅＩ
ｄｅ■ンドヌクレアーゼ活性を含有する粗製細胞抽出物
が生成する。
ｄｅ■ンドヌクレアーゼ活性を含有する粗製細胞抽出物
が生成する。
（１５） ＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を含
有する粗製細胞抽出物を、イオン交換クロマ１〜グラフ
イーヤ）アフィニティークロマトグラフィーにＪ：って
精製する、。
有する粗製細胞抽出物を、イオン交換クロマ１〜グラフ
イーヤ）アフィニティークロマトグラフィーにＪ：って
精製する、。
（１６） このようにして精製したエンドヌクレアー
げは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動上で均質
であること、並びに４３．０００ダルトンの分子社を有
し且つλＤＮＡ上で１２価測定されたそれの比活性が２
，０００，０００ ｕｎｉｔｓ／ｑタンパク質であるこ
とが判明した。
げは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動上で均質
であること、並びに４３．０００ダルトンの分子社を有
し且つλＤＮＡ上で１２価測定されたそれの比活性が２
，０００，０００ ｕｎｉｔｓ／ｑタンパク質であるこ
とが判明した。
上に概略を記載した手順は本発明の好ましい実施態様で
あるが、上記の手順を業界で公知の技術によって変える
ことができるということは当業者には明らかであろう。
あるが、上記の手順を業界で公知の技術によって変える
ことができるということは当業者には明らかであろう。
以下に現状で好ましい具体例を挙げて本発明を例示する
が、これらの実施例は単なる例示であって特許請求の範
囲で指摘されない限り本発明がこれらの実施例に限定さ
れることはないものと考えられたい。
が、これらの実施例は単なる例示であって特許請求の範
囲で指摘されない限り本発明がこれらの実施例に限定さ
れることはないものと考えられたい。
実施例
ＮｄｅＩｄｅ■ンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニング
（１）ゲノムＤＮＡの精製：
約５ｇのＮｅ１ｓｓｅｒｉａ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃ
ａｎｓ細胞（ＮＲＣＣ３１００９、ＮＥＢ １３２１株
）を解凍して、ｃｏｒｎ ： ｎｇ社製プラスチックチ
ューブ（５０ｄ ）内の０．ＩＨＴｒｉｓＨＣｌ、 ｐ
Ｈ７，１，０，１ＨＥＤＴＡ （２５ｍ）中に再懸濁さ
せた。３５ｍ１！の上記バッファーと６ｏＩＩｔｇのリ
ゾチームの溶液を２個の５０ｍｅ容プラスチックチュー
ブに分割し、各々に細胞懸濁液を当容量（１５ｍｌりず
つ加えた。この溶液を３７°Ｃで１５分間インキュベー
トした。
ａｎｓ細胞（ＮＲＣＣ３１００９、ＮＥＢ １３２１株
）を解凍して、ｃｏｒｎ ： ｎｇ社製プラスチックチ
ューブ（５０ｄ ）内の０．ＩＨＴｒｉｓＨＣｌ、 ｐ
Ｈ７，１，０，１ＨＥＤＴＡ （２５ｍ）中に再懸濁さ
せた。３５ｍ１！の上記バッファーと６ｏＩＩｔｇのリ
ゾチームの溶液を２個の５０ｍｅ容プラスチックチュー
ブに分割し、各々に細胞懸濁液を当容量（１５ｍｌりず
つ加えた。この溶液を３７°Ｃで１５分間インキュベー
トした。
２０％ＳＤＳ保存溶液を加えてＳＤＳの最終濃度を１％
に調整し、次いで、２００［のプロティプーゼＫ（２０
ｍｇ／−保存溶液）を添加して３７℃で１時間インキュ
ベー１〜した。この時、溶液は糸を引くように粘質とな
って拡散するが、不透明であった。
に調整し、次いで、２００［のプロティプーゼＫ（２０
ｍｇ／−保存溶液）を添加して３７℃で１時間インキュ
ベー１〜した。この時、溶液は糸を引くように粘質とな
って拡散するが、不透明であった。
デユープ（各１ｍ＞に２ｍｆｔの１０％ＳＤＳ／８％サ
ルコシル（５ａｒｃｏｓｙｌ ）を加えて５５℃で２時
間加熱した。サンプルは相変らず粘質状であったが全体
的に不透明であった。サンプルを一丁Ｅ （１０ｍＨＴ
ｒｉｓ１１ｃρ、 ｐＨ７，１，１ｍＨ［ＤＴＡ） （
２ρ）に対して全体で１６時間透析し、この間１回だり
Ｔ Ｅを交換した。
ルコシル（５ａｒｃｏｓｙｌ ）を加えて５５℃で２時
間加熱した。サンプルは相変らず粘質状であったが全体
的に不透明であった。サンプルを一丁Ｅ （１０ｍＨＴ
ｒｉｓ１１ｃρ、 ｐＨ７，１，１ｍＨ［ＤＴＡ） （
２ρ）に対して全体で１６時間透析し、この間１回だり
Ｔ Ｅを交換した。
透析後、溶液（９８ｍｅ ）を等容量のＴ Ｅ （ＤＩ
＋８．０）で希釈し°ＵＣ８Ｃρ勾配用に調製し、これ
を２つに分割し、各々に９８．０３のＣ５Ｃｊと１ｄの
５ＩＩｔｇ／ｄ臭化エヂジウムを添加した。２０個のチ
ューブを用イテＴ１７０ローター内で４８時間、４４，
０００ ｒｐｍで遠心した。生じたバンドを取り出し、
水を飽和させたイソブタノールで抽出した。溶液を上記
と同じバッファー（４りに対して透析した後、フェノー
ルおよびクロロホルムで１回ずつ抽出した。
＋８．０）で希釈し°ＵＣ８Ｃρ勾配用に調製し、これ
を２つに分割し、各々に９８．０３のＣ５Ｃｊと１ｄの
５ＩＩｔｇ／ｄ臭化エヂジウムを添加した。２０個のチ
ューブを用イテＴ１７０ローター内で４８時間、４４，
０００ ｒｐｍで遠心した。生じたバンドを取り出し、
水を飽和させたイソブタノールで抽出した。溶液を上記
と同じバッファー（４りに対して透析した後、フェノー
ルおよびクロロホルムで１回ずつ抽出した。
この溶液をもう一度透析してフェノールを除ぎ、さらに
電気泳動に掛けた。
電気泳動に掛けた。
（２）限定消化：
精製したＤＮＡをＮｓｉ工で切断し、以下のように完全
消化を達成した。１００ｉ／ｍの濃度で、１０ｍＨＴｒ
ｌｓ ｐＨ７，５，１０ｍＨＨｏＣ１！２．５０ｍＨＮ
ａＣ１！、 １０ｍＨ２−メルカプ１ヘエタノールバツ
フアーに溶解したＤＮＡ５０μを３個のチューブに分注
し、各チューブにｉｏ ｕｎｉｔｓのＮＳｉ■を添加し
た。チューブを３７℃で１時間インキュベートした後、
フェノール／り［１０ホルムで抽出し、エタノールで沈
澱させた。
消化を達成した。１００ｉ／ｍの濃度で、１０ｍＨＴｒ
ｌｓ ｐＨ７，５，１０ｍＨＨｏＣ１！２．５０ｍＨＮ
ａＣ１！、 １０ｍＨ２−メルカプ１ヘエタノールバツ
フアーに溶解したＤＮＡ５０μを３個のチューブに分注
し、各チューブにｉｏ ｕｎｉｔｓのＮＳｉ■を添加し
た。チューブを３７℃で１時間インキュベートした後、
フェノール／り［１０ホルムで抽出し、エタノールで沈
澱させた。
得られたペレットを１００ハの１０ｍＨＴｒｉｓ−ＩＩ
ｃρ、 １ｍＨＥＤＴＡ、 ｐＨ８，０中に再溶解し、
このうち各１０成を７ガロースグル電気泳動で分析した
。
ｃρ、 １ｍＨＥＤＴＡ、 ｐＨ８，０中に再溶解し、
このうち各１０成を７ガロースグル電気泳動で分析した
。
（３）結 合：
断片化したり、ＮＡを、以下に示すようにしてｐＵＣ１
９又はｐＡＣＹＣ１７７に結合した。Ｎ５ｉＩで消化し
たＮ（！１ｓｓｅｒｉａ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎ
ｓのＤＮＡ １．ＯＩＬｇ（１５Ａｅ ）を、Ｎｓｉ：
［で切断し１つ脱リン酸化したｐＡＣＹＣ１７７０，２
Ｎ（２，５ｐｉ）と混合した。これに２．５成の１０×
結合混合液（５００ｍＨＴｒｉｓ、 １１１１７．５
１００ｍＨＨＱＣｉ！２．１００ｍＨＤＴＴ、 ５ｍＨ
ＡＴＰ＞と２．５ρの滅菌蒸溜水を加えて最終容量を２
５堀と成した。１．θ〜のＴ４ＤＮＡリガーぜを添加し
、渥合物を１６℃で１６時間インキュベートした。この
うち２．５成および５．０成のアリコートを用いて、Ｅ
、 （Ｏｌｉ ＲＲＩ株を以下のように形質転換した。
９又はｐＡＣＹＣ１７７に結合した。Ｎ５ｉＩで消化し
たＮ（！１ｓｓｅｒｉａ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎ
ｓのＤＮＡ １．ＯＩＬｇ（１５Ａｅ ）を、Ｎｓｉ：
［で切断し１つ脱リン酸化したｐＡＣＹＣ１７７０，２
Ｎ（２，５ｐｉ）と混合した。これに２．５成の１０×
結合混合液（５００ｍＨＴｒｉｓ、 １１１１７．５
１００ｍＨＨＱＣｉ！２．１００ｍＨＤＴＴ、 ５ｍＨ
ＡＴＰ＞と２．５ρの滅菌蒸溜水を加えて最終容量を２
５堀と成した。１．θ〜のＴ４ＤＮＡリガーぜを添加し
、渥合物を１６℃で１６時間インキュベートした。この
うち２．５成および５．０成のアリコートを用いて、Ｅ
、 （Ｏｌｉ ＲＲＩ株を以下のように形質転換した。
各アリコートを２００パの氷冷Ｅ 、 ｃｏｌｉ ＲＲ
ＩＤンピテント（（ｏｍｐｅｔｅｎｔ）細胞と混合して
氷上に３０分間放置した。４２℃で２分間ヒートショッ
クした後、細胞を１ｄ（７）Ｌｕｒｉａブロス（ｃ−ｂ
ｒｏｔｈ）で希釈し、３７℃で１時間増殖させた。
ＩＤンピテント（（ｏｍｐｅｔｅｎｔ）細胞と混合して
氷上に３０分間放置した。４２℃で２分間ヒートショッ
クした後、細胞を１ｄ（７）Ｌｕｒｉａブロス（ｃ−ｂ
ｒｏｔｈ）で希釈し、３７℃で１時間増殖させた。
（４）１次細胞うイブラリー二
形質転換した細胞培養物を遠心分離し、Ｌ清の一部を捨
て残りの上清２５０ＩｉＩｌに再懸濁さゼ、１００１１
９／ｍｆｌアンピシリン又は２５埒／−テトラサイクリ
ンを含有するＬｕｒｉａ−寒天培地（＋−ａｇａｒ）プ
レー１へ上に接種した。３７℃で一部インキユベートし
た後、プレートを取り出し、２５ｓｔｅのｌ−Ｂ中、抗
生物質を用いて約５０００個のコロニーを破壊した。こ
れらの細胞からプラスミドＤＮＡを以下のように調整し
た。細胞を遠心分離によりペレット化し、３ｇの細胞ペ
ーストを１４ｔｄの２５ｍＨＴｒｉｓ−１１ｃρ １０
ｍＨＥＤＴ八ｐへ１８．０および５０１１１８グルコー
ス中に再懸濁させた。
て残りの上清２５０ＩｉＩｌに再懸濁さゼ、１００１１
９／ｍｆｌアンピシリン又は２５埒／−テトラサイクリ
ンを含有するＬｕｒｉａ−寒天培地（＋−ａｇａｒ）プ
レー１へ上に接種した。３７℃で一部インキユベートし
た後、プレートを取り出し、２５ｓｔｅのｌ−Ｂ中、抗
生物質を用いて約５０００個のコロニーを破壊した。こ
れらの細胞からプラスミドＤＮＡを以下のように調整し
た。細胞を遠心分離によりペレット化し、３ｇの細胞ペ
ーストを１４ｔｄの２５ｍＨＴｒｉｓ−１１ｃρ １０
ｍＨＥＤＴ八ｐへ１８．０および５０１１１８グルコー
ス中に再懸濁させた。
この懸濁液に１．０■／−リゾデームを添加し、２５℃
で５分間インキュベートした。１％ドデシル硫酸すｉ−
リウムおよび０．２Ｎ Ｈｏ叶から成るアリコート２７
ｄを加えて溶液を混合し、０℃で５分間インキュベート
した。ゲノムＤＮＡを、２０ｄの氷冷した３Ｍ酢酸カリ
ウム（ｐｌ＋ ４．８）を添加して沈澱させ、１０秒間
静かに攪拌し、氷上に５分間放置し、１２．０００ｘ
ｇで１０分間遠心分離した。上清取り出して等容量のフ
Ｊ−ノール／クロロボルム（１：１）で抽出した。これ
を１０，０００ｘ ｇで５分間遠心して複数の層に分離
し、旧制の層を取り出し、２倍容量のエタノールを添加
して核酸を沈澱さけた。沈澱物を１２，０００ｘ ｇで
１０分間遠心分離して採集し、ペレットを７０％エタノ
ールで１回洗浄し、上記のように再ペレット化した。ペ
レッ１−を真空乾燥し、２０鱈／−のＲＮ Ａ ａｓｅ
を含有する８−の１０ｍＨＴｒｉｓ−ＨＣρ １ｍｔ４
ＥＤＴＡ、 ｐｔ１８．０中に再懸濁させた。
で５分間インキュベートした。１％ドデシル硫酸すｉ−
リウムおよび０．２Ｎ Ｈｏ叶から成るアリコート２７
ｄを加えて溶液を混合し、０℃で５分間インキュベート
した。ゲノムＤＮＡを、２０ｄの氷冷した３Ｍ酢酸カリ
ウム（ｐｌ＋ ４．８）を添加して沈澱させ、１０秒間
静かに攪拌し、氷上に５分間放置し、１２．０００ｘ
ｇで１０分間遠心分離した。上清取り出して等容量のフ
Ｊ−ノール／クロロボルム（１：１）で抽出した。これ
を１０，０００ｘ ｇで５分間遠心して複数の層に分離
し、旧制の層を取り出し、２倍容量のエタノールを添加
して核酸を沈澱さけた。沈澱物を１２，０００ｘ ｇで
１０分間遠心分離して採集し、ペレットを７０％エタノ
ールで１回洗浄し、上記のように再ペレット化した。ペ
レッ１−を真空乾燥し、２０鱈／−のＲＮ Ａ ａｓｅ
を含有する８−の１０ｍＨＴｒｉｓ−ＨＣρ １ｍｔ４
ＥＤＴＡ、 ｐｔ１８．０中に再懸濁させた。
このＤＮＡ溶液を３７℃で１時間インキコベートした後
、塩化セシウム−臭化エチジウム平衡密度遠心用に調製
するために、８．８ｇの塩化セシウム、次いで０．４１
１１ｉ！の臭化エチジウム溶液（５Ｒｇ／ｍｅ）を加え
た。ＤＮＡ溶液を４４，０００ ｒｐＨｌで４８時間遠
心し、その結果得られたプラスミドのＤＮＡバンドを１
８ゲージの釘付注射器を用いて取り出した。
、塩化セシウム−臭化エチジウム平衡密度遠心用に調製
するために、８．８ｇの塩化セシウム、次いで０．４１
１１ｉ！の臭化エチジウム溶液（５Ｒｇ／ｍｅ）を加え
た。ＤＮＡ溶液を４４，０００ ｒｐＨｌで４８時間遠
心し、その結果得られたプラスミドのＤＮＡバンドを１
８ゲージの釘付注射器を用いて取り出した。
ＣｓＣＮ −水で飽和した等容量のイソプ［１パノルで
抽出して臭化エチジウムを除去した後、透析により塩化
セシウムを除去した。ＤＮＡを等容量のフェノール／ク
ロロホルム（１：１）で抽出し、さらに等容量のクロロ
ホルムで抽出し、透析し１Ｃ８（５）１次選択および選
択ライブラリー：１ ｔｎ （２，５ＩＪｉ）のプラス
ミドライブラリーを５０成の制限エンドヌクレアーゼ消
化用バッファー（１０ｍＨＴｒｉｓ ｐＨ７，５，１０
ｍＨＨｇＧ！２．１０ｍＨ２−メルカプトエタノール、
１５０ｍＨＮａａ！および１００ｐ９の牛血晴アルブ
ミン）中に希釈した。８ ｕｎｉｔｓ （Ｉ Ｎ）のＮ
ｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼを加え、デユープを３７
℃で２時間インキュベートした。この反応物を２００ρ
の氷冷Ｅ 、 ｃｏｌｉ ＲＲＩ：Ｔ］ンピテン１〜細
胞と混合し、接種し、１次ライブラリー用として一晩増
殖さけた。プラスミドＤＮＡを、１次ライブラリーに関
する前記の方法により調製した。
抽出して臭化エチジウムを除去した後、透析により塩化
セシウムを除去した。ＤＮＡを等容量のフェノール／ク
ロロホルム（１：１）で抽出し、さらに等容量のクロロ
ホルムで抽出し、透析し１Ｃ８（５）１次選択および選
択ライブラリー：１ ｔｎ （２，５ＩＪｉ）のプラス
ミドライブラリーを５０成の制限エンドヌクレアーゼ消
化用バッファー（１０ｍＨＴｒｉｓ ｐＨ７，５，１０
ｍＨＨｇＧ！２．１０ｍＨ２−メルカプトエタノール、
１５０ｍＨＮａａ！および１００ｐ９の牛血晴アルブ
ミン）中に希釈した。８ ｕｎｉｔｓ （Ｉ Ｎ）のＮ
ｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼを加え、デユープを３７
℃で２時間インキュベートした。この反応物を２００ρ
の氷冷Ｅ 、 ｃｏｌｉ ＲＲＩ：Ｔ］ンピテン１〜細
胞と混合し、接種し、１次ライブラリー用として一晩増
殖さけた。プラスミドＤＮＡを、１次ライブラリーに関
する前記の方法により調製した。
（６）２次選択：
１回選択の１次ライブラリーに由来するプラスミドＤＮ
Ａの２つの同一反応物を、上記のようにして２次選択に
掛けた。しかしながら、３７℃に１時間放置後、一方の
反応物に１ｕｎｉｔ（ｉ刈）のλの１キソヌクレアーゼ
を、また他方の反応物に１００ ｕｎｉｔｓ（１度）の
エキソヌクレアーゼ■を添加し、この２つの反応物をさ
らに１時間３７℃に維持た。
Ａの２つの同一反応物を、上記のようにして２次選択に
掛けた。しかしながら、３７℃に１時間放置後、一方の
反応物に１ｕｎｉｔ（ｉ刈）のλの１キソヌクレアーゼ
を、また他方の反応物に１００ ｕｎｉｔｓ（１度）の
エキソヌクレアーゼ■を添加し、この２つの反応物をさ
らに１時間３７℃に維持た。
（７）ゲル電気泳動および形質転換：
上記の各反応物を０．１％アガロースゲル上で２時間電
気泳動し、消化物の中から無傷のまま残っている超らせ
んプラスミドＤＮＡバンドを、長波長Ｕ■で視覚化しな
がらカミソリの刃で切り取って １．５ｒｎｆ！、のミ
クロツユ−（ｍｉｃｒｏｆｕｃ）チューブの中に入れた
。これに １００ｄのＴ Ｅ （１０ｍＨＴｒｉｓ−１
１ｃρ。
気泳動し、消化物の中から無傷のまま残っている超らせ
んプラスミドＤＮＡバンドを、長波長Ｕ■で視覚化しな
がらカミソリの刃で切り取って １．５ｒｎｆ！、のミ
クロツユ−（ｍｉｃｒｏｆｕｃ）チューブの中に入れた
。これに １００ｄのＴ Ｅ （１０ｍＨＴｒｉｓ−１
１ｃρ。
１ｍＨＥＤＴＡ、 ｐＨ８，０）を加えて攪拌した。ヂ
コーブをドライアイス−エタノール浴中で５分間凍結し
、次いで解凍した。火炎で先端を封じた２００ｐＩ！。
コーブをドライアイス−エタノール浴中で５分間凍結し
、次いで解凍した。火炎で先端を封じた２００ｐＩ！。
のピペットマンチップを用いて、ゲル断片を押しつぶし
た。上記の凍結−解凍一押しつぶしの各ステップをさら
に２回繰り返した後、チューブを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ
ミクロ遠心機中、１２，０００ｘ ｇで１０分間遠心し
、約１２５麿の−Ｖ清を取り出した。このうち２．５
ｌｊｌおよび５．０成のアリコートを用いて、以下のよ
うにＥ、 ｃｏｌｉ Ｒ８１株を形質転換した。各アリ
コートを２００ ＩＩＲの氷冷Ｅ、 ｃｏｌｉ ＲＲ１
コンピテント細胞と混合し、氷上に３０分間装いた。４
２℃で２分間ヒートショックした後、細胞を１ｍｌ！の
しｕｒｔａ−ブロス（Ｌ−ｂｒｏｔｈ）で希釈し、３７
℃で１時間増殖させ ｎ ＩＣ８次いで、この混合物を遠心分離に掛け、ペレット
化した細胞をアンピシリン含有ＩＢプレート上に振り撒
いた。
た。上記の凍結−解凍一押しつぶしの各ステップをさら
に２回繰り返した後、チューブを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ
ミクロ遠心機中、１２，０００ｘ ｇで１０分間遠心し
、約１２５麿の−Ｖ清を取り出した。このうち２．５
ｌｊｌおよび５．０成のアリコートを用いて、以下のよ
うにＥ、 ｃｏｌｉ Ｒ８１株を形質転換した。各アリ
コートを２００ ＩＩＲの氷冷Ｅ、 ｃｏｌｉ ＲＲ１
コンピテント細胞と混合し、氷上に３０分間装いた。４
２℃で２分間ヒートショックした後、細胞を１ｍｌ！の
しｕｒｔａ−ブロス（Ｌ−ｂｒｏｔｈ）で希釈し、３７
℃で１時間増殖させ ｎ ＩＣ８次いで、この混合物を遠心分離に掛け、ペレット
化した細胞をアンピシリン含有ＩＢプレート上に振り撒
いた。
（８）個体の分析：
上記の形質転換によって得られた３８個のコロ−を１０
ｄの培養液中で完全に増殖し、それらのコロニーが保持
するプラスミドを、ＢｉｒｎｂｏｉｍとＤｏｌｙ［Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 ７： １５１３（
１９７９）］の方法を適用した以下に示ずｍ１ｎｉｐｒ
ｅｐ （小調製物）精製法により調製した。
ｄの培養液中で完全に増殖し、それらのコロニーが保持
するプラスミドを、ＢｉｒｎｂｏｉｍとＤｏｌｙ［Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 ７： １５１３（
１９７９）］の方法を適用した以下に示ずｍ１ｎｉｐｒ
ｅｐ （小調製物）精製法により調製した。
ｍ１ｎｉｌｌｒｅｌ）法：
各々の培養を以下に示す手順により実施した。
−晩培養した１、５威の培養物を６．ＯＯＯｘｇで２分
間遠心してペレット化した。上清を取除き、細胞ペレッ
］〜を、ｌ１ｇ／ｄリゾチームを含有する１５０ρの２
５ｍＨＴｒｉｓ １０ＩＩＩＭ ＥＤＴＡ ５０ｍ
Ｈグルコース、ｐＨ８，０中に再懸濁さＶ−ｔ＝ ｏ室
温に５分間放置後、２００鱈の０．２ＨＮａ０１１．１
％ＳＤＳを加え、チコーブを振盪して細胞を溶解した後
、氷上に置いた。５分後、１５０庫の３Ｍ酢酸すｉ−リ
ウム（ｐｌ＋ ４．８）を加えて振盪し、さらに５分間
氷上に置いた。生じた沈澱を１２，０ＯＯｘ ｇ、４℃
で１０分間遠心して沈降させた。上清を取り出して等容
量のフェノール／クロロホルム（１：１）で抽出した。
間遠心してペレット化した。上清を取除き、細胞ペレッ
］〜を、ｌ１ｇ／ｄリゾチームを含有する１５０ρの２
５ｍＨＴｒｉｓ １０ＩＩＩＭ ＥＤＴＡ ５０ｍ
Ｈグルコース、ｐＨ８，０中に再懸濁さＶ−ｔ＝ ｏ室
温に５分間放置後、２００鱈の０．２ＨＮａ０１１．１
％ＳＤＳを加え、チコーブを振盪して細胞を溶解した後
、氷上に置いた。５分後、１５０庫の３Ｍ酢酸すｉ−リ
ウム（ｐｌ＋ ４．８）を加えて振盪し、さらに５分間
氷上に置いた。生じた沈澱を１２，０ＯＯｘ ｇ、４℃
で１０分間遠心して沈降させた。上清を取り出して等容
量のフェノール／クロロホルム（１：１）で抽出した。
１０，０００ｘ ｇで５分間遠心して複数の層を分離し
、上滑を８８０ｐｉのエタノールを含有する遠心チュー
ブに注入して混合した。室温に１０分間放置後、チュー
ブを１２，０００×９で１０分間遠心して沈澱した核酸
をペレット化した。上清を捨て、ペレットを１−の７０
％エタノール−水で再洗浄し、再びペレット化し、室温
で３０分間減圧乾燥した。乾燥後、ペレットを２０ｐ９
／ｄ ＲＮａｓｅを含有する５０成の１０ｍＨＴｒｉｓ
、 １ｍＨ［ＤＴＡｐＨ８，０中に再懸濁し、これを３
７℃で１時間インキュベートしてＲＮＡを消化した。
、上滑を８８０ｐｉのエタノールを含有する遠心チュー
ブに注入して混合した。室温に１０分間放置後、チュー
ブを１２，０００×９で１０分間遠心して沈澱した核酸
をペレット化した。上清を捨て、ペレットを１−の７０
％エタノール−水で再洗浄し、再びペレット化し、室温
で３０分間減圧乾燥した。乾燥後、ペレットを２０ｐ９
／ｄ ＲＮａｓｅを含有する５０成の１０ｍＨＴｒｉｓ
、 １ｍＨ［ＤＴＡｐＨ８，０中に再懸濁し、これを３
７℃で１時間インキュベートしてＲＮＡを消化した。
プラスミドｍ１ｎｉｐｒｅｐｓ （小調製物）を、引
き続ぎ、ＮｄｅＩおよびｌ−１ｉｎｄｌ［で消化するこ
とによって分析した。
き続ぎ、ＮｄｅＩおよびｌ−１ｉｎｄｌ［で消化するこ
とによって分析した。
（９）メチラーゼ遺伝子り［１−ン：
分析したプラスミドの多くは、ＤＮＡのランダムなＮＳ
ｉ■断片を保持すること、およびＮｄｅＩににる消化に
対して感受性であるか又はＤＵＣ１９の小欠失物（ｓｍ
ａｌｌ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）であることが判明した。
ｉ■断片を保持すること、およびＮｄｅＩににる消化に
対して感受性であるか又はＤＵＣ１９の小欠失物（ｓｍ
ａｌｌ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）であることが判明した。
これらのプラスミドはもはや興味のない偽の生残り個体
であったが、それ以外の残りのプラスミドは、ＮｄｅＩ
に抵抗、性であり且つ長さ約４．ＯｋｂのＮＳｉ工断片
を保持覆ることが共に判明した。さらに、これらのプラ
スミドはＮｄｅＩ修飾メヂラゼ遺伝子および制限エンド
ヌクレアーゼ遺伝子を共に保持することが分かった。
であったが、それ以外の残りのプラスミドは、ＮｄｅＩ
に抵抗、性であり且つ長さ約４．ＯｋｂのＮＳｉ工断片
を保持覆ることが共に判明した。さらに、これらのプラ
スミドはＮｄｅＩ修飾メヂラゼ遺伝子および制限エンド
ヌクレアーゼ遺伝子を共に保持することが分かった。
（１０）制限遺伝子クローン：
ＮｄｅＩ修飾メチラーゼ遺伝子を保持するものとして上
記（第（８）項）において同定されＩ（クローンを、Ｎ
ｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子についてもテスト
した。このテストは以下のＪ：うに実施した。−晩培養
した培養物の残留物を用いてエンドヌクレアーゼ活性を
チエツクした。このチ］ツク法を以下に示す。
記（第（８）項）において同定されＩ（クローンを、Ｎ
ｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子についてもテスト
した。このテストは以下のＪ：うに実施した。−晩培養
した培養物の残留物を用いてエンドヌクレアーゼ活性を
チエツクした。このチ］ツク法を以下に示す。
エンドヌクレアーゼ活性測定：
１０ｘ制限エンドヌクレアーゼバツフアー： １００ｍ
ＨＴｒｙｓ、 ｐＨ７，５，１００ｍＨＨｏＣ＋！２．
１．ＯＯｍＨ２−メルカプトエタノール、 ５００ｍＨ
ＮａＣＪ、。
ＨＴｒｙｓ、 ｐＨ７，５，１００ｍＨＨｏＣ＋！２．
１．ＯＯｍＨ２−メルカプトエタノール、 ５００ｍＨ
ＮａＣＪ、。
細胞抽出物の調製法を以下に示す。
培養物１ｒＲ１を４．００Ｏｒｐｍで５分間遠心分離し
て細胞をペレッ１〜化した。上清を捨て、ペレットを１
＋ｙ／ｄ、リゾデームを含有する１ｍの超音波処理用バ
ッフ−ｐ −（１（ｈ＋＋ＨＴｒｉｓ、 ｐｔ１７．５
．１０Ｏｎ＋ＨＮａＣ１！１０ｍＨ２−メルカプトエタ
ノール 再懸濁させた。この懸濁液を攪拌し、３０分間氷十に放
置した。このうち１Ｒｆ！、のザンプルをＥｌ）ｐｅｎ
ｄｏｒｆデユープに移し、連続して１０秒間ずつ２回静
かに超音波で処理して細胞を破壊した。デユープをミク
ロ遠心機中で５分間遠心し、この上清を細胞抽出物とし
て使用した。抽出物１１ｊ１および５／ｊｊ！を、５成
の１×制限Ｔンドヌクレアーゼバツフノ７−中のλＤＮ
ＡＩｎと一緒に３７℃で５分間インキュベー１〜した。
て細胞をペレッ１〜化した。上清を捨て、ペレットを１
＋ｙ／ｄ、リゾデームを含有する１ｍの超音波処理用バ
ッフ−ｐ −（１（ｈ＋＋ＨＴｒｉｓ、 ｐｔ１７．５
．１０Ｏｎ＋ＨＮａＣ１！１０ｍＨ２−メルカプトエタ
ノール 再懸濁させた。この懸濁液を攪拌し、３０分間氷十に放
置した。このうち１Ｒｆ！、のザンプルをＥｌ）ｐｅｎ
ｄｏｒｆデユープに移し、連続して１０秒間ずつ２回静
かに超音波で処理して細胞を破壊した。デユープをミク
ロ遠心機中で５分間遠心し、この上清を細胞抽出物とし
て使用した。抽出物１１ｊ１および５／ｊｊ！を、５成
の１×制限Ｔンドヌクレアーゼバツフノ７−中のλＤＮ
ＡＩｎと一緒に３７℃で５分間インキュベー１〜した。
１８個のコロニーはＮｄｅＩ制限系を安定に保持するこ
とが判明した。
とが判明した。
メチラーゼ陽性クローンの全てがエンドヌクレアーゼを
含有することが分った。これらのクローンは、また、配
向（ｏｒｅｉｎｔａｉｏｎ）Ａの湿潤細胞ペス１−１ｑ
当たり約４，５００，０００ ｕｎｉｔｓのＮｄｅＩ制
限エンドヌクレアーゼを、および配向（Ｏｒｅｉｎｔａ
ｉＯｎ）Ｂの湿潤細胞ペースト１Ｕ当たり約５００．０
ＯＯｕｎｉｔｓのＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼを合
成することが判明した。
含有することが分った。これらのクローンは、また、配
向（ｏｒｅｉｎｔａｉｏｎ）Ａの湿潤細胞ペス１−１ｑ
当たり約４，５００，０００ ｕｎｉｔｓのＮｄｅＩ制
限エンドヌクレアーゼを、および配向（Ｏｒｅｉｎｔａ
ｉＯｎ）Ｂの湿潤細胞ペースト１Ｕ当たり約５００．０
ＯＯｕｎｉｔｓのＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼを合
成することが判明した。
（１１） Ｎ ｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼおＪ：
びメチラーゼを］−ドする遺伝子を保持している組換え
プラスミドｐＮｄｅＩＲＨ６，７−＾６を形質転換によ
ってＦ。
びメチラーゼを］−ドする遺伝子を保持している組換え
プラスミドｐＮｄｅＩＲＨ６，７−＾６を形質転換によ
ってＦ。
ｃｏｌｉ ＲＲＩ株に移入した。
（１２） Ｅ、ｃｏｌｉ由来のＮｄｅＩエンドヌクレ
アーゼ：旦 ｃｏｌｔ ＩＩＲＩ／ｐＮｄｅＩＲＨ６
，７−Ａ６を、１０９／１カゼイン加水分解物、５ｆｉ
／１イーストエキストラクト、１０ｇ／ρ ＮａＣ１）
、 １ ｇ／ρ塩化塩化マグネシウム和水和物ｇ／ρ
グルコース、 １００＃Ｉ！Ｊ／ρアンピシリンから
成るＬ−ｂｒｏｔｈ培地を含む醗酵槽中、３７℃で増殖
させた。このとぎ、ｐＨをＮａ叶で７．２に調整ｊノだ
。遠心分離により細胞を集め、得られた細胞ペーストを
新鮮なうちに使用するか又は−７０℃に保存する。
アーゼ：旦 ｃｏｌｔ ＩＩＲＩ／ｐＮｄｅＩＲＨ６
，７−Ａ６を、１０９／１カゼイン加水分解物、５ｆｉ
／１イーストエキストラクト、１０ｇ／ρ ＮａＣ１）
、 １ ｇ／ρ塩化塩化マグネシウム和水和物ｇ／ρ
グルコース、 １００＃Ｉ！Ｊ／ρアンピシリンから
成るＬ−ｂｒｏｔｈ培地を含む醗酵槽中、３７℃で増殖
させた。このとぎ、ｐＨをＮａ叶で７．２に調整ｊノだ
。遠心分離により細胞を集め、得られた細胞ペーストを
新鮮なうちに使用するか又は−７０℃に保存する。
（１３）以下に続く全てのステップを４℃で実施する。
（１４）細胞ペースト（２４グ）を解凍し、１００ｄの
超音波処理用バッファ （２５ｍＭ Ｔｒ ｆ ５−
ＨＣｉ！ 、 ｐＨ８，０１００ｍＨＮａＣ１！１０ｍ
Ｈ２−メルカプ１〜エタノールおよび１０ｍＭ 、ＥＣ
Ｔ八）中に細胞を再懸濁させる。
超音波処理用バッファ （２５ｍＭ Ｔｒ ｆ ５−
ＨＣｉ！ 、 ｐＨ８，０１００ｍＨＮａＣ１！１０ｍ
Ｈ２−メルカプ１〜エタノールおよび１０ｍＭ 、ＥＣ
Ｔ八）中に細胞を再懸濁させる。
（１５）この細胞を超音波処理（すなわら、２５０ワツ
トで２分間処理し、５分間氷上で冷却する。この操作を
３回行う。）にＪ、って破壊し、懸濁した細胞１＃ｌｉ
！当たり約ｓｏｍｇの可溶性タンパク質を放出させる。
トで２分間処理し、５分間氷上で冷却する。この操作を
３回行う。）にＪ、って破壊し、懸濁した細胞１＃ｌｉ
！当たり約ｓｏｍｇの可溶性タンパク質を放出させる。
（１６）不溶性の細胞破片を２１，０００ｘ ｇで２０
分間遠心分離して除去する。
分間遠心分離して除去する。
（１７）上清を、２０ｍＭ にＩｆ ＰＯ、ｐｔｌ
６．９．１０ｍＭＨａａ！および１０ｍＭ ２−メル
カプ１〜エタノールで平衡化したホスホセルロースカラ
ム（５Ｘ３５ｃｍ）（Ｗｈａｔｎ＋ａｎ Ｐ−１１）に
流し込む。このカラムをカラム容積の２倍容量のト記バ
ッファーで洗浄し、カラムから素通りする流体を１個の
フラスコ中に集める。カラムに滞留しているＮｄｅＩエ
ンドヌクレフ アーゼを０．３〜０．５ＨＮａＣｆ１で溶出させる。最
大活性の両分をプールし、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈα、
ｐＨ７，／ｌ。
６．９．１０ｍＭＨａａ！および１０ｍＭ ２−メル
カプ１〜エタノールで平衡化したホスホセルロースカラ
ム（５Ｘ３５ｃｍ）（Ｗｈａｔｎ＋ａｎ Ｐ−１１）に
流し込む。このカラムをカラム容積の２倍容量のト記バ
ッファーで洗浄し、カラムから素通りする流体を１個の
フラスコ中に集める。カラムに滞留しているＮｄｅＩエ
ンドヌクレフ アーゼを０．３〜０．５ＨＮａＣｆ１で溶出させる。最
大活性の両分をプールし、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈα、
ｐＨ７，／ｌ。
５０ｍＭ ＮａＣρおよび１０＋ｎＨ２−メルカプトエ
タノールに対して透析する。
タノールに対して透析する。
（１８）ホスホセルロースカラムから得たプールを、２
０１１１８ ＴｒｌＳ−１１ｃｊ！ 、 ｐＨ７，４５
０ｍＭ ＮａＣ１！おにび１０ｍＭ２−メルカプトエタ
ノールで平衡化したヘパリン５ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ
−６Ｂカラムに流し込み、カラム容積の２倍容量の同一
バッファーで洗浄するａｏ、ＩＭ−１、ＯＨＮａＣ１（
総容Ｉｔ７００ａｉりの直線的濃度勾配を形成させなが
らカラムに流し込む。このとき１０ｄずつ分画する。各
々の両分を、λＤＮＡ基質に対するＮｄｅＩ制限エンド
ヌクレアーゼ活性の存在について測定する。活性画分を
プールし、１００倍容量のバッフ ７ （５０ｎ＋Ｍ
ＫＱ！ 、 ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ） ｐＨ
７，４，１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール）に対し
て透析する。
０１１１８ ＴｒｌＳ−１１ｃｊ！ 、 ｐＨ７，４５
０ｍＭ ＮａＣ１！おにび１０ｍＭ２−メルカプトエタ
ノールで平衡化したヘパリン５ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ
−６Ｂカラムに流し込み、カラム容積の２倍容量の同一
バッファーで洗浄するａｏ、ＩＭ−１、ＯＨＮａＣ１（
総容Ｉｔ７００ａｉりの直線的濃度勾配を形成させなが
らカラムに流し込む。このとき１０ｄずつ分画する。各
々の両分を、λＤＮＡ基質に対するＮｄｅＩ制限エンド
ヌクレアーゼ活性の存在について測定する。活性画分を
プールし、１００倍容量のバッフ ７ （５０ｎ＋Ｍ
ＫＱ！ 、 ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ） ｐＨ
７，４，１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール）に対し
て透析する。
（１９）透析したＮｄｅＩ活性プール（５０＃ｌｉりを
１ ｍｅのＨｏｎｏ−Ｑ ｒＰｌ−Ｃカラム（ｐｈａｒ
ｍａｃ ｉａ）に流し込み、バ”Ｊ ７ ？ Ｑ （
０，０２ＱＨＴｒｙｓ−ＨＯ２） 、 １）ｔ１７．４
．５０ｍＨＫＣｊ＋ 、 １０ｍＭ ２−メルカプト
エタノール）で洗浄し、５０ｍＭ 〜０．６８ ＫＣＩ
（総室１４０ｒｎｆ！、）の直線的濃度勾配をバッフ
ァーＱ中で形成させながらカラムに流し込む。１ｄずつ
分画し、各々の両分をＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼ
活性の存在について測定する。
１ ｍｅのＨｏｎｏ−Ｑ ｒＰｌ−Ｃカラム（ｐｈａｒ
ｍａｃ ｉａ）に流し込み、バ”Ｊ ７ ？ Ｑ （
０，０２ＱＨＴｒｙｓ−ＨＯ２） 、 １）ｔ１７．４
．５０ｍＨＫＣｊ＋ 、 １０ｍＭ ２−メルカプト
エタノール）で洗浄し、５０ｍＭ 〜０．６８ ＫＣＩ
（総室１４０ｒｎｆ！、）の直線的濃度勾配をバッフ
ァーＱ中で形成させながらカラムに流し込む。１ｄずつ
分画し、各々の両分をＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼ
活性の存在について測定する。
２つの最大活性の均質な両分を得る。
第１図は、ＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼをクローニ
ングする方法の概略を示す。 第２図は、ＮｄｅＩ制限エンドヌク、レアーピを製造す
る方法の概略を示す。 第３図は１）ＬＪＣ１９内にＮｄｅ、Ｉ制限エンドヌク
レアーゼおよび修飾メチラーゼをコードしているＮｅ１
ＳＳＯｒｉａ ｄ［１ｉｔｒｌｆｉｃａｎｓ由来の
４．ＯｋｂのＮＳｉ■断片の制限地図であり、この断片
をＤＵＣ１９（ＡＴＣＣ３７２５４）のＰＳｔＩ部位中
にクローニングしてｐＮｄｅｌＲＨ６，７−八６および
ｐＮｄｅＩｌｌＨ６，７−Ｂ９を作製する。 第４図は、制限地図中の制限部位を実証するアガロース
ゲルの写真である。 第５図は、ＤＮｄｅＩＲＨ６，７−Ａ６およびｐＮｄｅ
ｌＲＨ６，７−８９を保持している旦、製且ＲＲＩ （
ＡＴＣＣ３１３４３）の細胞抽出物中のＮｄｅＩ制限エ
ンドヌクレアーゼ活性を実証するアガロースゲルの写真
である。 ３つ 手続補正書 平成元り １、事件の表示 平成１年特許願第１２５４７３号 ２゜ 発明の名称 ＮｄｅＩ制限エンドヌクレア メチラーゼの製造方法 ゼおｊ ３゜ 補正をする者 事件との関係
ングする方法の概略を示す。 第２図は、ＮｄｅＩ制限エンドヌク、レアーピを製造す
る方法の概略を示す。 第３図は１）ＬＪＣ１９内にＮｄｅ、Ｉ制限エンドヌク
レアーゼおよび修飾メチラーゼをコードしているＮｅ１
ＳＳＯｒｉａ ｄ［１ｉｔｒｌｆｉｃａｎｓ由来の
４．ＯｋｂのＮＳｉ■断片の制限地図であり、この断片
をＤＵＣ１９（ＡＴＣＣ３７２５４）のＰＳｔＩ部位中
にクローニングしてｐＮｄｅｌＲＨ６，７−八６および
ｐＮｄｅＩｌｌＨ６，７−Ｂ９を作製する。 第４図は、制限地図中の制限部位を実証するアガロース
ゲルの写真である。 第５図は、ＤＮｄｅＩＲＨ６，７−Ａ６およびｐＮｄｅ
ｌＲＨ６，７−８９を保持している旦、製且ＲＲＩ （
ＡＴＣＣ３１３４３）の細胞抽出物中のＮｄｅＩ制限エ
ンドヌクレアーゼ活性を実証するアガロースゲルの写真
である。 ３つ 手続補正書 平成元り １、事件の表示 平成１年特許願第１２５４７３号 ２゜ 発明の名称 ＮｄｅＩ制限エンドヌクレア メチラーゼの製造方法 ゼおｊ ３゜ 補正をする者 事件との関係
Claims (14)
- （１）ＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含むク
ローニングベクター。 - （２）請求項１に記載のクローニングベクターを含有す
る形質転換された宿主。 - （３）ＮｄｅＩ遺伝子が、￥Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｄｅｎ
ｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ￥のゲノムＤＮＡから切り出され
たものである、請求項１に記載のクローニングベクター
。 - （４）ＮｄｅＩ修飾遺伝子を含むクローニングベクター
。 - （５）請求項４に記載のクローニングベクターを含有す
る形質転換された宿主。 - （６）（ａ）￥Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｄｅｎｉｔｒｉｆｉ
ｃａｎｓ￥に由来するＤＮＡからライブラリーを形成し
、 （ｂ）ＮｄｅＩ制限−修飾系プラスミドを含有するクロ
ーンを単離し、 （ｃ）修飾遺伝子を含有するクローンをスクリーニング
し、 （ｄ）ＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を同時に
含有しているクローンを単離する ことからなる、ＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
のクローニング方法。 - （７）前記ライブラリーを、 （ａ）￥Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎ
ｓ￥に由来するＤＮＡを精製するステップ、 （ｂ）精製したＤＮＡを消化してＤＮＡ断片を形成する
ステップ、 （ｃ）この断片をクローニングベクター内に結合するス
テップ、 （ｄ）ステップ（ｃ）のクローニングベクターで宿主細
胞を形質転換して細胞ライブラリーを形成するステップ
、 （ｅ）この細胞ライブラリーから組換えベクターを精製
してプラスミドライブラリーを形成するステップ によって形成する、請求項６に記載の方法。 - （８）クローニングベクターがｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹ
Ｃ１７７又はｐＵＣ１９である、請求項７に記載の方法
。 - （９）宿主細胞が￥Ｅ￥．￥ｃｏｌｉ￥のｈｓｄＲ＾−
株である、請求項７に記載の方法。 - （１０）プラスミドライブラリーをＮｄｅＩで消化して
消化物プールを形成し、この消化物プールを宿主細胞中
に形質転換し、修飾遺伝子を含有するクローンを選択す
ることによって、ＮｄｅＩ修飾遺伝子を含有するクロー
ンを単離する、請求項７に記載の方法。 - （１１）（ａ）￥Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｄｅｎｉｔｒｉｆ
ｉｃａｎｓ￥に由来するＤＮＡを精製し、 （ｂ）精製したＤＮＡを適当な制限エンドヌクレアーゼ
で消化してＤＮＡ断片を形成し、 （ｃ）この断片をクローニングベクター内に結合してＤ
ＮＡ混合物を形成し、 （ｄ）ステップ（ｃ）のＤＮΛ混合物で宿主細胞を形質
転換してライブラリーを形成し、 （ｅ）ＮｄｅＩ修飾メチラーゼ遺伝子を含有するクロー
ンを単離し、 （ｆ）ＮｄｅＩ修飾メチラーゼ遺伝子を含有するクロー
ンをスクリーニングし、ＮｄｅＩ制限エンドヌクレアー
ゼ遺伝子を同時に含有しているクローンを単離し、 （ｇ）ステップ（ｆ）のクローンを含有する宿主細胞を
培養し、 （ｈ）この培養物からＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼ
を回収する ことからなる、ＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼの製造
方法。 - （１２）クローニングベクターがプラスミドまたはウィ
ルスのＤＮＡ分子である、請求項１１に記載の方法。 - （１３）プラスミドがｐＢＲ３２２である、請求項１２
に記載の方法。 - （１４）プラスミドがｐＵＣ１９である、請求項１２に
記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/196,028 US5139942A (en) | 1988-05-19 | 1988-05-19 | Method for producing the nde i restriction endonuclease and methylase |
| US196028 | 1988-05-19 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0220285A true JPH0220285A (ja) | 1990-01-23 |
| JP3162059B2 JP3162059B2 (ja) | 2001-04-25 |
Family
ID=22723846
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12547389A Expired - Lifetime JP3162059B2 (ja) | 1988-05-19 | 1989-05-18 | ＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼの製造方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5139942A (ja) |
| EP (1) | EP0343009B1 (ja) |
| JP (1) | JP3162059B2 (ja) |
| DE (1) | DE68917372T2 (ja) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5288696A (en) * | 1990-09-07 | 1994-02-22 | New England Biolabs, Inc. | Method for producing and cloning SacII restriction endonuclease and methylase |
| EP2119788A1 (en) | 1999-03-02 | 2009-11-18 | Life Technologies Corporation | Compositions and methods for use in recombinational cloning of nucleic acids |
| EP2210948A3 (en) | 1999-12-10 | 2010-10-06 | Life Technologies Corporation | Use of multiple recombination sites with unique specificity in recombinational cloning |
| US7198924B2 (en) | 2000-12-11 | 2007-04-03 | Invitrogen Corporation | Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites |
| JP4210769B2 (ja) * | 2001-11-22 | 2009-01-21 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | Ｇａｔｅｗａｙエントリークローンの作製方法 |
| US8304189B2 (en) | 2003-12-01 | 2012-11-06 | Life Technologies Corporation | Nucleic acid molecules containing recombination sites and methods of using the same |
| US20090098611A1 (en) * | 2004-02-27 | 2009-04-16 | Wood David W | Self-cleaving affinity tags and methods of use |
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