JPH0220286A - メチロトローフ酵母におけるＨＩＶ ２４ｋＤＡ ｇａｇ蛋白質の発現 - Google Patents
メチロトローフ酵母におけるＨＩＶ ２４ｋＤＡ ｇａｇ蛋白質の発現Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は組み換えＤＮＡバイオテクノロジーの分野に関
するものである。一つの態様において、本発明はメチロ
トローフ酵母類におけるＨ Ｉ Ｖ２４ｋＤａ ｇａ
ｇタンパク質の発現のための方法に関するものである。
するものである。一つの態様において、本発明はメチロ
トローフ酵母類におけるＨ Ｉ Ｖ２４ｋＤａ ｇａ
ｇタンパク質の発現のための方法に関するものである。
もう一つの態様において、本発明は新しいＤＮＡ分子と
、該分子で形質転換した新しい酵母に関するものである
。
、該分子で形質転換した新しい酵母に関するものである
。
従来の技術
レトロウィルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ） ｉ（Ｉ Ｖ
（以前はＨＴＬＶ−ｍまたはＬＡＶと呼ばれていた）
は後天性免疫不完症候群（ａｃｑｕｉｒｅｄ ｉｍｍｕ
ｎｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｓｙｎｄｒｏｍｅ）（Ａ
Ｉ Ｄ Ｓ ）の病原体であることか明らかにされた。
（以前はＨＴＬＶ−ｍまたはＬＡＶと呼ばれていた）
は後天性免疫不完症候群（ａｃｑｕｉｒｅｄ ｉｍｍｕ
ｎｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｓｙｎｄｒｏｍｅ）（Ａ
Ｉ Ｄ Ｓ ）の病原体であることか明らかにされた。
ＨＩＶのウィルスゲノム軸ｅｎｏｍｅ）はｇａｇ、 ｐ
ｏｌ、ｅｎｖ遺伝子に相当する６つの大きなオーブンリ
ーディングフレーム（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａ
ｍｅｓ）を含んでいる。ｇａｇ遺伝子はウィルスのコア
タンパク質をコードしており、ｐｏｌはウィルスの逆転
写酵素、タンパク質分解酵素、エンドヌクレアーゼをコ
ードしており、ｅｎｖはウィルスの糖タンパク質をコー
ドしている。
ｏｌ、ｅｎｖ遺伝子に相当する６つの大きなオーブンリ
ーディングフレーム（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａ
ｍｅｓ）を含んでいる。ｇａｇ遺伝子はウィルスのコア
タンパク質をコードしており、ｐｏｌはウィルスの逆転
写酵素、タンパク質分解酵素、エンドヌクレアーゼをコ
ードしており、ｅｎｖはウィルスの糖タンパク質をコー
ドしている。
ｇａｇ遺伝子はウィルス粒子成熟の間にプロセスされて
コアタンパク質になる前駆体をコードしている。ｇａｇ
前駆体は約５６ｋＤａであり、タンパク質分解的にプロ
セスされて約２４．１６．１４ｋＤａの６つのタンパク
質になる。ＨＩｖレトロウィルスのｇａｇコアタンパク
質の２４ｋＤａ型は、以前このウィルスに暴露されたこ
とのある個体の大きな割合で抗体産生な誘導することが
見出されてきた。
コアタンパク質になる前駆体をコードしている。ｇａｇ
前駆体は約５６ｋＤａであり、タンパク質分解的にプロ
セスされて約２４．１６．１４ｋＤａの６つのタンパク
質になる。ＨＩｖレトロウィルスのｇａｇコアタンパク
質の２４ｋＤａ型は、以前このウィルスに暴露されたこ
とのある個体の大きな割合で抗体産生な誘導することが
見出されてきた。
この観察に基ついてＨＩＶ ２４ｋＤａ ｇａｇタン
パク質に対する抗体の有無を測定し、個人が１４１ｖに
暴露されたことがあるか否か、ＡＩＤＳを発病する候補
者であるかも知れないか否かを評価する一つの方法とな
るアッセイ法が開発された。このアッセイ法を実行する
ため、精製したＨ’ＩＶ２４ｋＤａ ｇａｇタンパク
質が診断薬として必要である。
パク質に対する抗体の有無を測定し、個人が１４１ｖに
暴露されたことがあるか否か、ＡＩＤＳを発病する候補
者であるかも知れないか否かを評価する一つの方法とな
るアッセイ法が開発された。このアッセイ法を実行する
ため、精製したＨ’ＩＶ２４ｋＤａ ｇａｇタンパク
質が診断薬として必要である。
現在、このタンパク質製剤の要求に応じるｉ−Ｉ Ｉ
Ｖ２４ ｋ Ｄ ａ ｇ ａ ｇの簡単に入手できる
供給はない。
Ｖ２４ ｋ Ｄ ａ ｇ ａ ｇの簡単に入手できる
供給はない。
同様にこのタンパク質は、もしこのタンパク質が安全で
経済的な方法で生産できれば、単独で、あるいは他のＨ
ＩＶウィルスタンパク質と組み合わせてワクチンとして
も利用できる可能イがある。
経済的な方法で生産できれば、単独で、あるいは他のＨ
ＩＶウィルスタンパク質と組み合わせてワクチンとして
も利用できる可能イがある。
従って、ＨＩＶ ２４ｋＤａ ｇａｇ タ：ｙバク質
の生産のための効率的な方法を開発することは本分野に
重要な貢献となるだろう。
の生産のための効率的な方法を開発することは本分野に
重要な貢献となるだろう。
従って、ＨＩＶ ２４ｋＤａ ｇａｇ タンパク質の
生産のための方法を提供することが本発明の１つの対象
である。
生産のための方法を提供することが本発明の１つの対象
である。
さらに、本発明のもう１つの対象は、ＨＩＶ ２４ｋＤ
ａ ｇａｇタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含ん
だ新しいベクターを提供することである。
ａ ｇａｇタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含ん
だ新しいベクターを提供することである。
本発明の対象はさらに、ＨＩＶ ２４ｋＤａ ｇａｇ
タンパク質の増強された生産が可能な、一つあるいは複
数のベクターで形質転換された新しいメチロトロフィッ
ク酵母類を提供することである。
タンパク質の増強された生産が可能な、一つあるいは複
数のベクターで形質転換された新しいメチロトロフィッ
ク酵母類を提供することである。
本発明のこれらならびに他の対象は、本明細書に含まれ
る説明と特許請求の範囲から明らかになるだろう。
る説明と特許請求の範囲から明らかになるだろう。
発明の構成
本発明に従って、我々ばＨＩＶ ２４ｋＤａ ｇａｇ
タンパク質の構造遺伝子を含む酵母発現カセットと適合
するベクター少なくとも一つでメチロトローフ酵母を形
質転換することと、結果としてできた形質転換体を、Ｈ
Ｉ Ｖ ２４ ｋ Ｄ ａ ｇ ａ ｇタンパク質の
生産を得るのに適切な条件下で培養することから成るＨ
ＩＶ ２４ｋＤａ ｇａｇ タンパク質の生産のため
の方法を発見した。
タンパク質の構造遺伝子を含む酵母発現カセットと適合
するベクター少なくとも一つでメチロトローフ酵母を形
質転換することと、結果としてできた形質転換体を、Ｈ
Ｉ Ｖ ２４ ｋ Ｄ ａ ｇ ａ ｇタンパク質の
生産を得るのに適切な条件下で培養することから成るＨ
ＩＶ ２４ｋＤａ ｇａｇ タンパク質の生産のため
の方法を発見した。
第１図は、ＨＩＶの２４ｋｌ）ａ ｇａｇ遺伝子を含
む、Ｉ−ＩＩＶのＥｃｏＲＩ／Ｃ１ａＩ断片の制限酵素
地図を示している。
む、Ｉ−ＩＩＶのＥｃｏＲＩ／Ｃ１ａＩ断片の制限酵素
地図を示している。
第２図は、プラスミドｐｓＬ４４Ａの作製の流れ図を示
している。
している。
第３図は、プラスミドｐｓＬ４４Ａの説明を示している
。ｐＳＬ４４は、Ｆ ｌ−ｏ ｒ ｉの挿入と唯一のＥ
ｃｏＲＩ部位にＨＩＶ ２４ｋＤａ構造遺伝子の挿入に
より修飾されたｐＡｏ ８０４の誘導体である。
。ｐＳＬ４４は、Ｆ ｌ−ｏ ｒ ｉの挿入と唯一のＥ
ｃｏＲＩ部位にＨＩＶ ２４ｋＤａ構造遺伝子の挿入に
より修飾されたｐＡｏ ８０４の誘導体である。
ｐＡＯ８０４はＮＲＲ，Ｌ Ｂ−１８１１４で入手でき
、７．５Ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片としてプラスミドＤＮＡ
から回収することができる。
、７．５Ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片としてプラスミドＤＮＡ
から回収することができる。
ＨＩＶゲノムはこの分野ではよ（知られており、ラトナ
ー（Ｒａｔｎｅｒ）らにより塩基配列を決定された。Ａ
ＩＤＳウィルス、ＨＴＬＶ−ＩＩＩの全塩基配列、Ｎａ
ｔｕｒｅ３１３：２７７（１９８５）。ＨＩＶ ２４ｋ
Ｄａｇａｇタンパク質塩基配列はヌクレオチド７２９番
から始まり、ヌクレオチド部位１４２１で終わる。
ー（Ｒａｔｎｅｒ）らにより塩基配列を決定された。Ａ
ＩＤＳウィルス、ＨＴＬＶ−ＩＩＩの全塩基配列、Ｎａ
ｔｕｒｅ３１３：２７７（１９８５）。ＨＩＶ ２４ｋ
Ｄａｇａｇタンパク質塩基配列はヌクレオチド７２９番
から始まり、ヌクレオチド部位１４２１で終わる。
２４ｋＤａ ｇａｇタンパク質・をコードする用いた
ヌクレオチド配列は表１に示されている。（しかし、約
１０１０−１１１５の間のヌクレオチドは、発表された
配列との一致を確認するために塩基配列は決定していな
い。）従って、２４ｋＤａ ｇａｇタンパク質の塩基
配列は、ＨＩＶから構造遺伝子な再単離することにより
、またはインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）ＤＮＡ合成、
あるいはこれらの技術の組み合わせにより入手すること
ができる。
ヌクレオチド配列は表１に示されている。（しかし、約
１０１０−１１１５の間のヌクレオチドは、発表された
配列との一致を確認するために塩基配列は決定していな
い。）従って、２４ｋＤａ ｇａｇタンパク質の塩基
配列は、ＨＩＶから構造遺伝子な再単離することにより
、またはインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）ＤＮＡ合成、
あるいはこれらの技術の組み合わせにより入手すること
ができる。
ＨＩＶ ２４ｋＤａ ｇａｇタンパク質の構造遺伝子
は、増殖、維持または組み換え操作のためにいずれの適
当な宿主ベクター系でも維持することができる。本発明
の実施に適した宿主／ベクター系は、ｐＢ Ｒ３２２プ
ラスミドと組み合わせた大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）宿主ま
たはｐＡＯ８０４かｐＡＯ８０７と組み合わせたピキア
・バストリスＧＳ１１５宿主を含むが、これに限定され
るものではない。
は、増殖、維持または組み換え操作のためにいずれの適
当な宿主ベクター系でも維持することができる。本発明
の実施に適した宿主／ベクター系は、ｐＢ Ｒ３２２プ
ラスミドと組み合わせた大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）宿主ま
たはｐＡＯ８０４かｐＡＯ８０７と組み合わせたピキア
・バストリスＧＳ１１５宿主を含むが、これに限定され
るものではない。
上記宿主株の培養は、いずれの適当な方法によっても達
することができる。宿主を培養する一般的な技術はこの
分野で概によく知られており、これらの方法をここで用
いた株の特異的な要求に適用することはいずれも十分に
当業者の能力の範囲内にある。
することができる。宿主を培養する一般的な技術はこの
分野で概によく知られており、これらの方法をここで用
いた株の特異的な要求に適用することはいずれも十分に
当業者の能力の範囲内にある。
宿主からのプラスミドＤＮＡの回収は、該プラスミドＤ
ＮＡの小型のサイズと閉環状の超らせん構造に基づいて
い（つかの技術により成し遂げることができる。例えば
集菌の後、宿主細胞は遠心でペレットにし、次に再懸濁
して溶菌することができる。溶菌液は細胞の破砕物を除
（ために遠心をし、ＤＮＡを含むその上清を集める。次
に、ＤＮＡを濃縮するためにＰＥＧ沈殿を行うことがで
きろ。次に沈殿したＤＮＡをさらに密度勾配遠心か、ゲ
ルろ過技術を用いて、プラスミドＤＮＡを細菌ＤＮＡか
ら分離することができる。上で述べた分離を成し遂げる
ための技術はこの分野でよ（知られており、これらの技
術を実行する数多（の方法が知られている。
ＮＡの小型のサイズと閉環状の超らせん構造に基づいて
い（つかの技術により成し遂げることができる。例えば
集菌の後、宿主細胞は遠心でペレットにし、次に再懸濁
して溶菌することができる。溶菌液は細胞の破砕物を除
（ために遠心をし、ＤＮＡを含むその上清を集める。次
に、ＤＮＡを濃縮するためにＰＥＧ沈殿を行うことがで
きろ。次に沈殿したＤＮＡをさらに密度勾配遠心か、ゲ
ルろ過技術を用いて、プラスミドＤＮＡを細菌ＤＮＡか
ら分離することができる。上で述べた分離を成し遂げる
ための技術はこの分野でよ（知られており、これらの技
術を実行する数多（の方法が知られている。
プラスミドのヌクレアーゼ消化は、ＨＩＶｇａｇ構造遺
伝子の回収を容易にするような方法で、選んだプラスミ
ドを切るような適当なエンドヌクレアーゼを選ぶことに
より行った。用いるエンドヌクレア−ゼは、ＨＩＶ ２
４ｋＤａ ｇａｇ遺伝子を切り出すプラスミドに依る
である。
伝子の回収を容易にするような方法で、選んだプラスミ
ドを切るような適当なエンドヌクレアーゼを選ぶことに
より行った。用いるエンドヌクレア−ゼは、ＨＩＶ ２
４ｋＤａ ｇａｇ遺伝子を切り出すプラスミドに依る
である。
ＤＮＡのゲル電気泳動は多数の技術を用いて行うことが
できる。Ｐ、Ｇ、シーリー（Ｓｅａｌｙ）とＥ、Ｍ。
できる。Ｐ、Ｇ、シーリー（Ｓｅａｌｙ）とＥ、Ｍ。
サザン（Ｓ ｏｕｔｈｅｒｎ）の、核酸のゲル電気泳動
−実際的アプローチ（Ｄ、リックウッド（Ｒｉ ｃｋｗ
ｏｏｄ ）とＢ、Ｄ。
−実際的アプローチ（Ｄ、リックウッド（Ｒｉ ｃｋｗ
ｏｏｄ ）とＢ、Ｄ。
ヘイムズ（Ｈａｍｅｓ）編） ｐ、３９ （１９８２）
参照。溶出も用いたゲルに適した、電気溶出、拡散、ゲ
ル溶解（アガロース・ゲル）、または物理的抽出（アガ
ロース・ゲル）のような多（の技術を用いて行うことが
できる。それに加え、高品質、低融点アガロースのよう
ない（つかのゲルでは溶出は不要であることも知られて
いる。
参照。溶出も用いたゲルに適した、電気溶出、拡散、ゲ
ル溶解（アガロース・ゲル）、または物理的抽出（アガ
ロース・ゲル）のような多（の技術を用いて行うことが
できる。それに加え、高品質、低融点アガロースのよう
ない（つかのゲルでは溶出は不要であることも知られて
いる。
いったんＨＩＶ２４ｋＤａ ｇ’ａｇ構造遺伝子を含
む断片、またはその断片群が単離されたら、それがベク
ターに挿入される前に追加的な操作が必要となるだろう
。これらの操作には、リンカ−の付加、または断片の末
端平滑化が含まれるが、これに限定されるものではない
。
む断片、またはその断片群が単離されたら、それがベク
ターに挿入される前に追加的な操作が必要となるだろう
。これらの操作には、リンカ−の付加、または断片の末
端平滑化が含まれるが、これに限定されるものではない
。
ＨＩＶ ｇａｇ 構造遺伝子の単離に続いて、該遺伝子
をプラスミドのような適当なメチロトローフ酵母ベクタ
ーに挿入する。本発明の実施に望ましいベクターはピキ
ア属、最も望ましいのはピキア・パストリスに適合した
ベクターである。
をプラスミドのような適当なメチロトローフ酵母ベクタ
ーに挿入する。本発明の実施に望ましいベクターはピキ
ア属、最も望ましいのはピキア・パストリスに適合した
ベクターである。
プラスミドは長い間組み換えＤＮＡ技術で用いられる基
本的な要素の１つであった。プラスミドは微生物中に見
出される環状の染色体外２本鎖ＤＮＡである。プラスミ
ドは細胞あたり単一あるいは複数σフコピーで存在する
ことが見出されている。プラスミドＤＮＡには、プラス
ミドの複製のために必要な情報が含まれている。ｊなわ
ち細菌での複製のための複製起点は含まれている。形質
転換した細胞中でプラスミドを表現型で選択する単一ま
たは複数の手段も、プラスミドにコードされる情報に含
まれている。抗生物質耐性遺伝子や、宿主の生化学的糸
路の欠損を相補する遺伝子のような表現型の、あるいは
選択的マーカーは、形質転換された宿主細胞のクローン
を識別し、選択し、維持することを可能にする。
本的な要素の１つであった。プラスミドは微生物中に見
出される環状の染色体外２本鎖ＤＮＡである。プラスミ
ドは細胞あたり単一あるいは複数σフコピーで存在する
ことが見出されている。プラスミドＤＮＡには、プラス
ミドの複製のために必要な情報が含まれている。ｊなわ
ち細菌での複製のための複製起点は含まれている。形質
転換した細胞中でプラスミドを表現型で選択する単一ま
たは複数の手段も、プラスミドにコードされる情報に含
まれている。抗生物質耐性遺伝子や、宿主の生化学的糸
路の欠損を相補する遺伝子のような表現型の、あるいは
選択的マーカーは、形質転換された宿主細胞のクローン
を識別し、選択し、維持することを可能にする。
ＨＩＶ ２４ｋＤａ ｇａｇ構造遺伝子をメチロトロ
ーフ酵母中で発現させるために、該遺伝子は機能可能で
あるよ５に５’制御領域と、３′終結配列に連結しなげ
ればならす、それはベクターにより宿主中に挿入される
発現カセットとなる。
ーフ酵母中で発現させるために、該遺伝子は機能可能で
あるよ５に５’制御領域と、３′終結配列に連結しなげ
ればならす、それはベクターにより宿主中に挿入される
発現カセットとなる。
次の用語は明確にするためにここで定義する。
機能可能であるように連結した・・・・・・構成物がそ
の機能を果たすように配置される並置のことを言う。
の機能を果たすように配置される並置のことを言う。
制御領域・・・・・・種々の刺激に応答し、ｍ Ｊ（、
Ｎ Ａ転写の速度に影響を与えるＤＮＡ配列。
Ｎ Ａ転写の速度に影響を与えるＤＮＡ配列。
、３′終結配列・・・・・・ポリアデニル化を引き起こ
す配列のようなｍＲＮＡを安定化する機能をする終止コ
ドンの、３′側の配列。
す配列のようなｍＲＮＡを安定化する機能をする終止コ
ドンの、３′側の配列。
゛ピキアに適合した″とはピキア由来の制御領域や３′
終終結列のような、ピキア中で正常な機能を果たすＤＮ
Ａ配列のことを言う。現在ヨーロッパ公示済特許第２２
６７５２号明細書として公示された、ヨーロッパ特許出
願筒８ｉ１４７００．７号明細書に述べられているよう
に、フレラダ（ｃｒｅｇｇ）の線状の部位特異的組込み
（インテグレイティブ）ベクターのような組込みベクタ
ーが、本発明の実施には望ましい。そのようなベクター
は、少なくとも１）第１の挿入可能なＤＮＡ断片；２）
選択マーカー遺伝子；６）第２の挿入可能なＤＮＡ断片
を順に配置した配列より成る。
終終結列のような、ピキア中で正常な機能を果たすＤＮ
Ａ配列のことを言う。現在ヨーロッパ公示済特許第２２
６７５２号明細書として公示された、ヨーロッパ特許出
願筒８ｉ１４７００．７号明細書に述べられているよう
に、フレラダ（ｃｒｅｇｇ）の線状の部位特異的組込み
（インテグレイティブ）ベクターのような組込みベクタ
ーが、本発明の実施には望ましい。そのようなベクター
は、少なくとも１）第１の挿入可能なＤＮＡ断片；２）
選択マーカー遺伝子；６）第２の挿入可能なＤＮＡ断片
を順に配置した配列より成る。
第１と第２の挿入可能な１〕Ｎ Ａ断片は各々少なくと
も長さ約２００ヌクレオチドあり、ピキア属の種のゲノ
ムＤＮＡの部分と相同である塩基配列を持っている。挿
入型ベクターの種々の構成物は、発現カセットと選択マ
ーカー遺伝子が、第１の挿入可能なＤＮＡ断片の、３′
端と、第２の挿入可能なＤＮＡ断片の５′端の間に位置
するように線状のＤ Ｎ Ａ断片となるように順に配置
されている。
も長さ約２００ヌクレオチドあり、ピキア属の種のゲノ
ムＤＮＡの部分と相同である塩基配列を持っている。挿
入型ベクターの種々の構成物は、発現カセットと選択マ
ーカー遺伝子が、第１の挿入可能なＤＮＡ断片の、３′
端と、第２の挿入可能なＤＮＡ断片の５′端の間に位置
するように線状のＤ Ｎ Ａ断片となるように順に配置
されている。
第１と第２の挿入可能なＤＮＡ断片は、順に配置された
線状断片中で、該断片が親株のゲノムの中で配置してい
るように、お互いに対して配置している。
線状断片中で、該断片が親株のゲノムの中で配置してい
るように、お互いに対して配置している。
第１と第２の挿入可能なＤＮＡ断片として便利な塩基配
列はゲノムの修飾を起こそうとする、元のゲノムの部位
のお互いに離れた部分と相同な塩基配列である。従って
、例えばもし、アルコール・オキシダーゼ遺伝子の座位
にゲノムの修飾を起こそうとするなら、用いる第１と第
２の挿入可能すＤ Ｎ Ａ断片は、アルコール・オキシ
ダーゼ遺伝子座位のお互いに離れた部分と相同な配列で
ある。
列はゲノムの修飾を起こそうとする、元のゲノムの部位
のお互いに離れた部分と相同な塩基配列である。従って
、例えばもし、アルコール・オキシダーゼ遺伝子の座位
にゲノムの修飾を起こそうとするなら、用いる第１と第
２の挿入可能すＤ Ｎ Ａ断片は、アルコール・オキシ
ダーゼ遺伝子座位のお互いに離れた部分と相同な配列で
ある。
本発明に一致して起こそうとするゲノムの修飾のために
は、２つの挿入可能なＤＮＡ断片は、線状の断片中で、
親株のゲノムの中で存在している時と同じ相対的な配置
で、お互いに対して配置していなくてはならない。第１
と第２の挿入可能なＤＮＡ断片として用いることのでき
る塩基配列の例は、アルコール・オキシダーゼ（ＡＯＸ
ｌ ） 遺伝子、ジヒドロアセトン・シンターゼ（１）
ＨＡＳＩ）遺伝子、ｐ４０遺伝子、ＨＩＳ４遺伝子から
成るグループから選択した塩基配列である。ＡＯＸ１遺
伝子、ＤＨＡＳＩ遺伝子、ｐ４０遺伝子、ＨＩＳ４遺伝
子は参考文献として本明細書に含まれている本出願と同
時に係属中の特許出願第７８０．１０２号明細書に含ま
れている。
は、２つの挿入可能なＤＮＡ断片は、線状の断片中で、
親株のゲノムの中で存在している時と同じ相対的な配置
で、お互いに対して配置していなくてはならない。第１
と第２の挿入可能なＤＮＡ断片として用いることのでき
る塩基配列の例は、アルコール・オキシダーゼ（ＡＯＸ
ｌ ） 遺伝子、ジヒドロアセトン・シンターゼ（１）
ＨＡＳＩ）遺伝子、ｐ４０遺伝子、ＨＩＳ４遺伝子から
成るグループから選択した塩基配列である。ＡＯＸ１遺
伝子、ＤＨＡＳＩ遺伝子、ｐ４０遺伝子、ＨＩＳ４遺伝
子は参考文献として本明細書に含まれている本出願と同
時に係属中の特許出願第７８０．１０２号明細書に含ま
れている。
第１の挿入可能なＤＮＡ断片は発現カセット中で使われ
る制御領域を構成する機能可能である制御領域を含むこ
とができる。第１の挿入可能なＤＮＡ断片を発現カセッ
トの制御領域として用いることは本発明の望ましい態様
の一つである。第３図は第１の挿入可能なＤＮＡ断片を
カセットのための制御領域として用いるベクターの図を
示したものである。
る制御領域を構成する機能可能である制御領域を含むこ
とができる。第１の挿入可能なＤＮＡ断片を発現カセッ
トの制御領域として用いることは本発明の望ましい態様
の一つである。第３図は第１の挿入可能なＤＮＡ断片を
カセットのための制御領域として用いるベクターの図を
示したものである。
第３図に付加的に示されているように、単一あるいは複
数の挿入部位と、３′終結配列は、第１の挿入可能なＤ
ＮＡ断片のすぐ、３′側に置（ことができる。この線状
の部位特異的挿入型ベクターの構造は適合した３′終終
結列の付加の必要なしに、構造遺伝子の便利な挿入部位
を提供するという付加的な利点もある。
数の挿入部位と、３′終結配列は、第１の挿入可能なＤ
ＮＡ断片のすぐ、３′側に置（ことができる。この線状
の部位特異的挿入型ベクターの構造は適合した３′終終
結列の付加の必要なしに、構造遺伝子の便利な挿入部位
を提供するという付加的な利点もある。
宿主を形質転換するのに用いるＬ）ＮＡ中には選択マー
カー遺伝子が少なくとも１つ含まれることも必要である
。これは形質転換するＤＮＡを取り込んだ生物を選択し
、単離′１−るのを容易にする。
カー遺伝子が少なくとも１つ含まれることも必要である
。これは形質転換するＤＮＡを取り込んだ生物を選択し
、単離′１−るのを容易にする。
マーカー遺伝子は、宿主が持っていなかった表現型の特
徴、たとえば形質転換されていない宿主株が特定のアミ
ノ酸生合成系路に欠損を持っている場合には特定のアミ
ノ酸を生産する能力の回復、または抗生物質に対する耐
性などを形質転換された生物に与える。
徴、たとえば形質転換されていない宿主株が特定のアミ
ノ酸生合成系路に欠損を持っている場合には特定のアミ
ノ酸を生産する能力の回復、または抗生物質に対する耐
性などを形質転換された生物に与える。
例となる選択マーカー遺伝子は、ピキア・パストリスと
サッカロミセス・セレビシエ由来のＨＩＳ４遺伝子とＡ
ＲＧ４遺伝子、サッカロミセス・セレビシエ由来のイン
ベルターゼ遺伝子（ＳｕＣ２）、または大腸菌転移要素
Ｔ ｎ ６０１かＴｎ９０３のＧ４１８ホスホトランス
フエラーゼ遺伝子から成るグループから選ぶことができ
る。
サッカロミセス・セレビシエ由来のＨＩＳ４遺伝子とＡ
ＲＧ４遺伝子、サッカロミセス・セレビシエ由来のイン
ベルターゼ遺伝子（ＳｕＣ２）、または大腸菌転移要素
Ｔ ｎ ６０１かＴｎ９０３のＧ４１８ホスホトランス
フエラーゼ遺伝子から成るグループから選ぶことができ
る。
当業者は、本発明の実施に用いたベクターに、付加的な
Ｌ）ＮＡ配列、たとえば細菌のグラスミドＤＮＡ、バク
テリオファージのＤＮＡなどを組み込むことが可能であ
ることを知っている。そのような配列はこれらのベクタ
ーを細菌宿主中で増幅したり維持したりすることを可能
にする。
Ｌ）ＮＡ配列、たとえば細菌のグラスミドＤＮＡ、バク
テリオファージのＤＮＡなどを組み込むことが可能であ
ることを知っている。そのような配列はこれらのベクタ
ーを細菌宿主中で増幅したり維持したりすることを可能
にする。
もし第１の挿入可能なＤＮＡ断片が制御領域を持ってい
ないなら機能可能であるような発現カセットを提供する
ために、構造遺伝子と機能可能であるように連結した適
当な制御領域を挿入する必要がある。同様にもし発現カ
セットを完成するために挿入部位に、３′終結配列か与
えられていなければ、、３′終結配列は挿入される構造
遺伝子に機能可能であるように連結されなくてはならな
い。
ないなら機能可能であるような発現カセットを提供する
ために、構造遺伝子と機能可能であるように連結した適
当な制御領域を挿入する必要がある。同様にもし発現カ
セットを完成するために挿入部位に、３′終結配列か与
えられていなければ、、３′終結配列は挿入される構造
遺伝子に機能可能であるように連結されなくてはならな
い。
当業者は解析されメチロトローフ酵母類と組み合わせて
用いることのできる多（の制御領域を知っている。例と
なる制御領域は、サッカロミセス・セレビシエから単離
された酸性ホスファターゼガラクトキナーゼ、アルコー
ル・デヒドロゲナーゼ、シトクロムＣ、アルファー接合
因子、ダリセルアルデヒドろリン酸・デヒドロゲナーゼ
の制御領域と、ピキア・パストリス由来の主要なアルコ
ール・オキシダーゼ（ＡＯＸＩ）、ジヒドロキシアセト
ン・シンターゼ、（］）ＡＳＩ）、ｐ４０の制御領域と
ＨＩ Ｓ ４の制御領域など、から成るグループから選
んだ酵母の制御領域が含まれるが、これに限定されるも
のではない。本発明の実施において用いられている現在
望ましい制御領域は、本出願と同時に係属中の特許出願
第７８Ｕ、１０２号明細書で開示されているＡＯＸ ｌ
、ＤＨＡＳｌ、ｐ４０から成るグループから選んだ制御
領域のような、メタノールを含む培地に対する応答能に
より特徴付けられる上記制御領域である。
用いることのできる多（の制御領域を知っている。例と
なる制御領域は、サッカロミセス・セレビシエから単離
された酸性ホスファターゼガラクトキナーゼ、アルコー
ル・デヒドロゲナーゼ、シトクロムＣ、アルファー接合
因子、ダリセルアルデヒドろリン酸・デヒドロゲナーゼ
の制御領域と、ピキア・パストリス由来の主要なアルコ
ール・オキシダーゼ（ＡＯＸＩ）、ジヒドロキシアセト
ン・シンターゼ、（］）ＡＳＩ）、ｐ４０の制御領域と
ＨＩ Ｓ ４の制御領域など、から成るグループから選
んだ酵母の制御領域が含まれるが、これに限定されるも
のではない。本発明の実施において用いられている現在
望ましい制御領域は、本出願と同時に係属中の特許出願
第７８Ｕ、１０２号明細書で開示されているＡＯＸ ｌ
、ＤＨＡＳｌ、ｐ４０から成るグループから選んだ制御
領域のような、メタノールを含む培地に対する応答能に
より特徴付けられる上記制御領域である。
本発明の実施において最も望ましい制御領域はＡＯＸ１
制御領域である。
制御領域である。
、３′終結配列は発現カセット中で、または上で論じた
ようにベクターの一部として用いることができる。、３
′終結配列は遺伝子に機能可能であるように連結すると
、構造遺伝子によりコードされているメツセンジャーＲ
ＮＡを終結させ、ポリアデニル化し、そして／また安定
化する働きをする。本発明の実施のための、３′終結配
列のための説明となる由来のいくつかの例はサッカロミ
セス・セレビシエ ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎ
ｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ３，１．ピキアの３
′終結配列を含んでいるが、これに限定されるものでは
ない。ＡＯＸ１遺伝子Ｄ ＨＡ Ｓ遺伝子、ｐ４［］遺
伝子、ＨＩＳ４遺伝子、０、３′終結配列から成るグル
ープから選んだもののようなピキア・パストリス由来の
ものが望ましい。
ようにベクターの一部として用いることができる。、３
′終結配列は遺伝子に機能可能であるように連結すると
、構造遺伝子によりコードされているメツセンジャーＲ
ＮＡを終結させ、ポリアデニル化し、そして／また安定
化する働きをする。本発明の実施のための、３′終結配
列のための説明となる由来のいくつかの例はサッカロミ
セス・セレビシエ ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎ
ｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ３，１．ピキアの３
′終結配列を含んでいるが、これに限定されるものでは
ない。ＡＯＸ１遺伝子Ｄ ＨＡ Ｓ遺伝子、ｐ４［］遺
伝子、ＨＩＳ４遺伝子、０、３′終結配列から成るグル
ープから選んだもののようなピキア・パストリス由来の
ものが望ましい。
そして特に望ましいものはＡＯＸ１遺伝子の、３′終結
配列である。
配列である。
本発明の実施のためには、第３図に示されたように時計
回りのＢｇｌＩ［断片のような線状形質転換ベクターを
用いることが現在のところ望ましい。
回りのＢｇｌＩ［断片のような線状形質転換ベクターを
用いることが現在のところ望ましい。
ＨＩＶ ２４ｋＤａ ｇａｇ構造遺伝子ｗｍ当なベク
ター中に挿入することは、選んだベクターを適切な単一
あるいは複数の部位で切断し、構造遺伝子を含んだ機能
可能である発現カセットを少なくとも一つベクター中に
入れるようにするあらゆる適切な技術を用いて行なうこ
とができる。
ター中に挿入することは、選んだベクターを適切な単一
あるいは複数の部位で切断し、構造遺伝子を含んだ機能
可能である発現カセットを少なくとも一つベクター中に
入れるようにするあらゆる適切な技術を用いて行なうこ
とができる。
ＨＩＶ ２４ｋｌ）ａ ｇａｇ構造遺伝子の結合は′
１゛４Ｄ Ｎ Ａ ！Ｊガーゼを用いるような、あらゆ
る適切なライゲーション技術を用いて行なうことができ
る。
１゛４Ｄ Ｎ Ａ ！Ｊガーゼを用いるような、あらゆ
る適切なライゲーション技術を用いて行なうことができ
る。
ＨＩＶ ２４ｋＤａ ｇａｇ構造遺伝子とヘクターノ
ライゲーション混合物の最初の選択、増殖、伺加的な増
幅は、混合物を（ライゲーション混合物は酵母宿主に直
接形質転換することも可能であるが）むしろ大腸菌のよ
うな細菌の宿主に形質転換することにより行われる。大
腸菌のための適切な形質転換の技術はこの分野でよ（知
られている。それに加え、ベクターの細菌宿主中での維
持に必要な選択マーカーと、細菌の複製起点もこの分野
ではよ（知られている。
ライゲーション混合物の最初の選択、増殖、伺加的な増
幅は、混合物を（ライゲーション混合物は酵母宿主に直
接形質転換することも可能であるが）むしろ大腸菌のよ
うな細菌の宿主に形質転換することにより行われる。大
腸菌のための適切な形質転換の技術はこの分野でよ（知
られている。それに加え、ベクターの細菌宿主中での維
持に必要な選択マーカーと、細菌の複製起点もこの分野
ではよ（知られている。
１（ＩＶ ２４ｋｌ）ａ ｇａｇ構造遺伝子を発現系
に含んでいる、希望のプラスミドの単離ならひに／もし
くは精製は、宿主ＤＮＡからプラスミドＤ Ｎ Ａを分
離するためのあらゆる手段を用いて行うことができる。
に含んでいる、希望のプラスミドの単離ならひに／もし
くは精製は、宿主ＤＮＡからプラスミドＤ Ｎ Ａを分
離するためのあらゆる手段を用いて行うことができる。
同様に、ライゲーションにより作製したベクターは、Ｈ
Ｉ Ｖ ２４ ｋ Ｄ ａ ｇ ａ ｇ遺伝子の存在
とその制御領域と、３′終結配列との機能可能な結合を
確認するために、むしろ増殖させた後に調べることがで
きる。これは、エンドヌクレアーゼ消化、ゲル電気泳動
またはエンドヌクレアーゼ消化、サザン＋ハイブリダイ
ゼーション（５ｏｕｔｈｅｒｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔ
ｉｏｎ）を含む種々の技術により行うことができるが、
これに限定されるものではない。
Ｉ Ｖ ２４ ｋ Ｄ ａ ｇ ａ ｇ遺伝子の存在
とその制御領域と、３′終結配列との機能可能な結合を
確認するために、むしろ増殖させた後に調べることがで
きる。これは、エンドヌクレアーゼ消化、ゲル電気泳動
またはエンドヌクレアーゼ消化、サザン＋ハイブリダイ
ゼーション（５ｏｕｔｈｅｒｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔ
ｉｏｎ）を含む種々の技術により行うことができるが、
これに限定されるものではない。
プラスミドあるいは線状のベクターを酵母宿主に形質転
換することは、ヒネン（Ｈｉｎｎｅｎ）らＰ ｒｏｃ。
換することは、ヒネン（Ｈｉｎｎｅｎ）らＰ ｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃ１、 ７５． （１９７８
） １９２９； イトウ（Ｉｔｏ）ら、 Ｊ 、Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ １５３． （１９８ろ）１６３；
ブレツク（ｃｒｅｇｇ）らＭｏｌ、Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ
、 ５（１９８５）ｐｇ、３３６；またはスリークリシ
ュナ（５ｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ）ら、Ｇｅｎｅ、５９（
１９８７）ｐｇ、１１５によって述べられたものを含む
かこれに限定されるものではない適切な形質転換技術に
より行うことができる。本発明の実施のためにはフレラ
グの形質転換技術が望ましい。
） １９２９； イトウ（Ｉｔｏ）ら、 Ｊ 、Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ １５３． （１９８ろ）１６３；
ブレツク（ｃｒｅｇｇ）らＭｏｌ、Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ
、 ５（１９８５）ｐｇ、３３６；またはスリークリシ
ュナ（５ｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ）ら、Ｇｅｎｅ、５９（
１９８７）ｐｇ、１１５によって述べられたものを含む
かこれに限定されるものではない適切な形質転換技術に
より行うことができる。本発明の実施のためにはフレラ
グの形質転換技術が望ましい。
形質転換のための宿主は、すべての適切なメチロトロフ
ィ、り酵母がなることができる。メチロトロフィック酵
母はハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、 カンディ
ダ（ｃａｎｄｉｄａ）、りｏエヶラ（］ぐ１ｏｅｃｋｅ
ｒａ）、 ピキア、サツカロミセス、トルロプシス（
Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）。
ィ、り酵母がなることができる。メチロトロフィック酵
母はハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、 カンディ
ダ（ｃａｎｄｉｄａ）、りｏエヶラ（］ぐ１ｏｅｃｋｅ
ｒａ）、 ピキア、サツカロミセス、トルロプシス（
Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）。
ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）から成る属の中
から選んだメタノール上で生育できる酵母を含むが、こ
れに限定するものではない。このクラスの酵母の例とな
る特定の種のリストはＣ，アンンニ（Ａｎｔｈｏｎｙ）
、 ’、［”ｈｅ Ｈｉｏｄｅｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｍ
ｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｂｓ。
から選んだメタノール上で生育できる酵母を含むが、こ
れに限定するものではない。このクラスの酵母の例とな
る特定の種のリストはＣ，アンンニ（Ａｎｔｈｏｎｙ）
、 ’、［”ｈｅ Ｈｉｏｄｅｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｍ
ｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｂｓ。
２６９（１９８２）に見出すことができる。栄養要求性
のピキア・パストリスＧＳ １１５ （ＮＲＲＬＹ−１
５８５１）のようなピキア属のメチロトロフィック酵母
が現在のところ望ましい。栄養要求性メチロトロフィッ
ク酵母は本発明の実施においても、選択が容易なことか
ら利点がある。もしピキア・パストリスを形質転換して
ショ糖の上で生育できる株にする５ＩＪＣ２の使用のよ
うな適切な形質転換マーカー遺伝子を選べば、または０
４１８のような抗生物質耐性マーカーを用いれは、野生
株のメチロトロフィック酵母も用いて同様に成功するこ
とができることが知られている。
のピキア・パストリスＧＳ １１５ （ＮＲＲＬＹ−１
５８５１）のようなピキア属のメチロトロフィック酵母
が現在のところ望ましい。栄養要求性メチロトロフィッ
ク酵母は本発明の実施においても、選択が容易なことか
ら利点がある。もしピキア・パストリスを形質転換して
ショ糖の上で生育できる株にする５ＩＪＣ２の使用のよ
うな適切な形質転換マーカー遺伝子を選べば、または０
４１８のような抗生物質耐性マーカーを用いれは、野生
株のメチロトロフィック酵母も用いて同様に成功するこ
とができることが知られている。
形質転換されたメチロ）ｏフィック酵母細胞は、以前栄
養要求性であった細胞を形質転換後（細胞の栄養要求性
に応じ）必要とされる生化学的産物の非存在下で培養す
る、新しい表現型（゛′メタノ＋／− 一ル利用能十／ −、Ｍｕｔ ” ）を検出する
ことによるスクリーニング、または形質転換体に含まれ
る耐性遺伝子がない場合は酵母に廟毒である抗生物質の
存在下で培養する、ということを含むが、これに限定さ
れない適切な技術を用いて選択することができる。
養要求性であった細胞を形質転換後（細胞の栄養要求性
に応じ）必要とされる生化学的産物の非存在下で培養す
る、新しい表現型（゛′メタノ＋／− 一ル利用能十／ −、Ｍｕｔ ” ）を検出する
ことによるスクリーニング、または形質転換体に含まれ
る耐性遺伝子がない場合は酵母に廟毒である抗生物質の
存在下で培養する、ということを含むが、これに限定さ
れない適切な技術を用いて選択することができる。
単離した形質転換されたメチロトロフィック酵母は、フ
ラスコ振盪発酵法、高密度発酵法、また４７９（１９８
７）で開示された技術のような、適切な発酵技術により
培養される。
ラスコ振盪発酵法、高密度発酵法、また４７９（１９８
７）で開示された技術のような、適切な発酵技術により
培養される。
発現は用いた制御領域に適切な方法により行うことがで
きろ。もしメタノール応答性制御領域を用いたら、発現
の誘導は栄養培地中の形質転換された細胞を、用いた制
御領域に適したアルコールに露すことにより行うことが
できる。
きろ。もしメタノール応答性制御領域を用いたら、発現
の誘導は栄養培地中の形質転換された細胞を、用いた制
御領域に適したアルコールに露すことにより行うことが
できる。
ＨＩＶ ２４ｋＤａ ｇａｇ タンパク質は、十分な
時間誘導させた形質転換細胞を、ビーズ粉砕に続けて細
胞破砕物を除（のに十分な遠心を行うような標準的な技
術を用いて溶菌することにより粗製物の形で回収するこ
とができる。望ましい回収法は実施例■に含まれている
。
時間誘導させた形質転換細胞を、ビーズ粉砕に続けて細
胞破砕物を除（のに十分な遠心を行うような標準的な技
術を用いて溶菌することにより粗製物の形で回収するこ
とができる。望ましい回収法は実施例■に含まれている
。
以下の限定するものではない実施例は、本発明の実施を
さらに説明するために挙げた。
さらに説明するために挙げた。
実施例
実施例に関する一般的な情報。
菌株
ピキア・パストリス（Ｐ１、ｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉ
ｓ）ＧＳ１１５（ＨＩＳ４）［ＮＲＲＬ Ｙ−１５８
５１）はこれらの実施例で用いた宿主酵母株である。
ｓ）ＧＳ１１５（ＨＩＳ４）［ＮＲＲＬ Ｙ−１５８
５１）はこれらの実施例で用いた宿主酵母株である。
緩衝液、溶液、培地
以下の実施例で用いた緩衝液と溶液は以下のような組成
を持っている。
を持っている。
ｄＨ２０ミリＱ （ｍｉ ｌ ｌ ｉ−Ｑ）（Ｍｉｌｌ
ｉｐｏｒｅ）試薬用水システム（ｒｅａｇｅｎｔ ｗａｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍ）で処理した脱１Ｍトリス緩
衝液 ＴＥ緩衝液 ＥＤ ＣＥ ａＳ イオンしたＨ２Ｏ。
ｉｐｏｒｅ）試薬用水システム（ｒｅａｇｅｎｔ ｗａｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍ）で処理した脱１Ｍトリス緩
衝液 ＴＥ緩衝液 ＥＤ ＣＥ ａＳ イオンしたＨ２Ｏ。
８００ｍＬのＨ２Ｏに１２１．１ｇのトリス塩基：濃（
６５％）塩酸を加え ることによりｐＨを希望の価に 合わせる；最終的ｐＨ調整の前 に溶液を室温に冷やし、終容積 が１Ｌになるよう希釈。
６５％）塩酸を加え ることによりｐＨを希望の価に 合わせる；最終的ｐＨ調整の前 に溶液を室温に冷やし、終容積 が１Ｌになるよう希釈。
１．０ｍＭ ＥＩＤＴＡ
０．０１ Ｍ （ｐＨ８，０） ）リス緩衝液中。
１Ｍ ツルピトー／ｌ／（ｓｏｒｂｉｔｏｌ）２５ｍＭ
Ｅｌ）ＴＡ ５０ｍＭ １）ＴＴ ｐＨ８に調整 ９、１ ｇ ソルビトール １．４７．９ クエン酸ナトリウム ０．１６８ｇ ＥＤＴＡ ｐｌ−１をＨＣｌで５．８に調整、 ５０ ｍ１ｄＨｚｏ中 オートクレーフ １Ｍソルビトール ＰＥＧ溶液 溶液Ａ 溶液Ｂ １ＱｍＭ ＣａＣＪｈ ・・・・・・３過滅菌 ２０％ ホリエチレン・グリコール−３３５０１Ｑ ｍ
Ｍ’ ＣａＣａＣ ４２１Ｑ ）リス４−（ｃｌ（ｐＨ７，４）・・・・
・・ろ過滅菌 ０．２Ｍ ）リス−ＨＣ１（ｐＨ７，５）０．１Ｍ
ｆＬ９ Ｃ４２ ０，５Ｍ ＮａＣ７ ０，０１Ｍ ジチオスレイトール （ｄｉ ｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）（ＤＴＴ）０．２
Ｍ ）リス−ＨＣＡ（ｐＨ７，５）０．１Ｍ Ｍｇ
ＣＡ２ ０、ＩＭ ＤＴＴ ４μｌ １０ｍＭ ４μノ １ＱｍＭ ４μＡ１０ｍＭ ４μＡ１０ｍＭ ＴＴＰ ＧＴＰ ＣＴＰ ＴＰ ２０ＸＳＳＰＥ ４μｌＴ４ リガーゼ（２Ｕ／μ１） １２μ７ Ｈ２Ｏ 溶液Ｃの処決はシラー（Ｚｏｌ Ｉｅｒ）とスミス（Ｓ
ｍｉｔｈ）を改変した。
Ｅｌ）ＴＡ ５０ｍＭ １）ＴＴ ｐＨ８に調整 ９、１ ｇ ソルビトール １．４７．９ クエン酸ナトリウム ０．１６８ｇ ＥＤＴＡ ｐｌ−１をＨＣｌで５．８に調整、 ５０ ｍ１ｄＨｚｏ中 オートクレーフ １Ｍソルビトール ＰＥＧ溶液 溶液Ａ 溶液Ｂ １ＱｍＭ ＣａＣＪｈ ・・・・・・３過滅菌 ２０％ ホリエチレン・グリコール−３３５０１Ｑ ｍ
Ｍ’ ＣａＣａＣ ４２１Ｑ ）リス４−（ｃｌ（ｐＨ７，４）・・・・
・・ろ過滅菌 ０．２Ｍ ）リス−ＨＣ１（ｐＨ７，５）０．１Ｍ
ｆＬ９ Ｃ４２ ０，５Ｍ ＮａＣ７ ０，０１Ｍ ジチオスレイトール （ｄｉ ｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）（ＤＴＴ）０．２
Ｍ ）リス−ＨＣＡ（ｐＨ７，５）０．１Ｍ Ｍｇ
ＣＡ２ ０、ＩＭ ＤＴＴ ４μｌ １０ｍＭ ４μノ １ＱｍＭ ４μＡ１０ｍＭ ４μＡ１０ｍＭ ＴＴＰ ＧＴＰ ＣＴＰ ＴＰ ２０ＸＳＳＰＥ ４μｌＴ４ リガーゼ（２Ｕ／μ１） １２μ７ Ｈ２Ｏ 溶液Ｃの処決はシラー（Ｚｏｌ Ｉｅｒ）とスミス（Ｓ
ｍｉｔｈ）を改変した。
４．４ｇ ＮａＯＨ
７，４ｇ Ｎａ２ＢＤＴＡ
２７、６ ｇＮａｆ４２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ２１０，９Ｎａ
Ｃ１ −−−−−・ｐＨをＮａＯＨで７．５−８．０に調整・
・・・Ｈ２Ｏで１リツトルに、 ０ＸＳＳＣ （Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｏｌ １ｄｉｎｅ）５９
ＢＳＡ フラクションＶ １（２０で５ Ｑ ［］ ｍｌ！に １７５．３ 、！９’ ＮａＣ１１ ８８，２ｇ クエン酸ナトリウム ・・・・・・ｐＨをＮａＯＨで７．０に調整・・・・・
・Ｈ２Ｏで１リツトルに、 （３す ４０〃ｌ ビオチン １３４＋＋＋１Ｈ３Ｐ’０４（８５％）５．８，９
ＣａＳＯ４・２２Ｈ２ Ｏ９２Ｋ２ＳＯ４ ７５，９ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０ ２１，９ＫＯ１（ ０，３０ｇ 硫酸マグネシウム・Ｈ２Ｏ０，２０，９
モリブデン酸ナトリウム ０．０２ｇ ホウ酸 ２．００ ｇ 硫酸亜鉛・Ｈ２Ｏ ４，８Ｉ 塩化第２鉄・Ｈ２Ｏ ３，００ｍ１／リツトル硫酸 水で１リツトルに、 ３５００ ｍｌ水 ウェスタン緩衝液 １リツトルに ２．５ｇ ゼラチンをマイクロウェー ブ溶液に入れる。
Ｃ１ −−−−−・ｐＨをＮａＯＨで７．５−８．０に調整・
・・・Ｈ２Ｏで１リツトルに、 ０ＸＳＳＣ （Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｏｌ １ｄｉｎｅ）５９
ＢＳＡ フラクションＶ １（２０で５ Ｑ ［］ ｍｌ！に １７５．３ 、！９’ ＮａＣ１１ ８８，２ｇ クエン酸ナトリウム ・・・・・・ｐＨをＮａＯＨで７．０に調整・・・・・
・Ｈ２Ｏで１リツトルに、 （３す ４０〃ｌ ビオチン １３４＋＋＋１Ｈ３Ｐ’０４（８５％）５．８，９
ＣａＳＯ４・２２Ｈ２ Ｏ９２Ｋ２ＳＯ４ ７５，９ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０ ２１，９ＫＯ１（ ０，３０ｇ 硫酸マグネシウム・Ｈ２Ｏ０，２０，９
モリブデン酸ナトリウム ０．０２ｇ ホウ酸 ２．００ ｇ 硫酸亜鉛・Ｈ２Ｏ ４，８Ｉ 塩化第２鉄・Ｈ２Ｏ ３，００ｍ１／リツトル硫酸 水で１リツトルに、 ３５００ ｍｌ水 ウェスタン緩衝液 １リツトルに ２．５ｇ ゼラチンをマイクロウェー ブ溶液に入れる。
最初’ｌｏｏｍｌの水に
１００ｍ１１０ＸＰ］３５
１ｍ１５０％ トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０４ｍｌ
５％ アジ化ナトリウム ｄＨ２０で１リツトルに、 再生寒天 ［＋、６ Ｋｃｚ ２％寒天実施例
１ ｐＡＯ８０７０作製 ｐＡ０８０４プラスミドは大腸菌の宿主に入って、合衆
国農業省（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｅｕ
ｌｔｎｒｅ）、ペオリア（Ｐｅｏｒ ｉ ａ） 、イリ
ノイ州（Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）の北部地域研究センター（
Ｎｏｒｔｈｅｒｒ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈＣｅｎｔｅｒ）寄託番号Ｂ−１８１１４から入手する
ことができる。ｐＡＯ８０４はフリスミドＤＮＡを単離
し、ＥｃｏＲＩで消化し、ゲル電気泳動して唯一のｇｃ
ｏＲＩ部位で切断された線状のｐＡＯ８０４である〜７
．５ Ｋ ｂ断片を回収することにより、回収される。
５％ アジ化ナトリウム ｄＨ２０で１リツトルに、 再生寒天 ［＋、６ Ｋｃｚ ２％寒天実施例
１ ｐＡＯ８０７０作製 ｐＡ０８０４プラスミドは大腸菌の宿主に入って、合衆
国農業省（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｅｕ
ｌｔｎｒｅ）、ペオリア（Ｐｅｏｒ ｉ ａ） 、イリ
ノイ州（Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）の北部地域研究センター（
Ｎｏｒｔｈｅｒｒ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈＣｅｎｔｅｒ）寄託番号Ｂ−１８１１４から入手する
ことができる。ｐＡＯ８０４はフリスミドＤＮＡを単離
し、ＥｃｏＲＩで消化し、ゲル電気泳動して唯一のｇｃ
ｏＲＩ部位で切断された線状のｐＡＯ８０４である〜７
．５ Ｋ ｂ断片を回収することにより、回収される。
１、 ｆｌ−ｏｒｉＤＮＡの調整
ｆｌバクテリオファージＤＮＡ（５０ｇｇ）を５０ユニ
ツトのＲｓａ ＩとＤｒａ Ｉで（製造者の指示に従っ
て）消化し、ｆｌの複製起点（Ｏｒｌ）を含む〜４５８
ｂｐのＤＮＡ断片を遊離させた。消化物の混合物は等容
のフェノール：クロロホルム（Ｖ／Ｖ ）で抽出した後
、水層な等容のクロロホルムで抽出し、最後にＮａＣ７
１濃度を０．２Ｍに合わせて２．５容のエタノールを加
えて水層のＤＮＡを沈殿した。混合物を氷上（４℃）に
１０分間放置した後、微量遠心機で４°Ｇで１０．００
０Ｘ、９．６０分間遠心することによりＤＮＡ沈殿を集
めた。
ツトのＲｓａ ＩとＤｒａ Ｉで（製造者の指示に従っ
て）消化し、ｆｌの複製起点（Ｏｒｌ）を含む〜４５８
ｂｐのＤＮＡ断片を遊離させた。消化物の混合物は等容
のフェノール：クロロホルム（Ｖ／Ｖ ）で抽出した後
、水層な等容のクロロホルムで抽出し、最後にＮａＣ７
１濃度を０．２Ｍに合わせて２．５容のエタノールを加
えて水層のＤＮＡを沈殿した。混合物を氷上（４℃）に
１０分間放置した後、微量遠心機で４°Ｇで１０．００
０Ｘ、９．６０分間遠心することによりＤＮＡ沈殿を集
めた。
ＤＮＡベレットは７０％エタノール水溶液で２度洗浄し
た。洗浄したペレットは真空乾燥し、２５μｌのＴＥ緩
衝液に溶解した。このＤＮＡを１．５％アガロースゲル
で電気泳動し、〜４５８ｂｐｆ１−ρｒ１１断片を含む
ゲルの部分を切り出して、ゲル中ノＤ ＮＡヲＤ Ｅ
８１ （Ｗ２１ｊｌＴＬａｎ）ペーパー上に電気溶出し
、ペーパーから１ＭＮａ（Ｊ！に溶出した。
た。洗浄したペレットは真空乾燥し、２５μｌのＴＥ緩
衝液に溶解した。このＤＮＡを１．５％アガロースゲル
で電気泳動し、〜４５８ｂｐｆ１−ρｒ１１断片を含む
ゲルの部分を切り出して、ゲル中ノＤ ＮＡヲＤ Ｅ
８１ （Ｗ２１ｊｌＴＬａｎ）ペーパー上に電気溶出し
、ペーパーから１ＭＮａ（Ｊ！に溶出した。
ＤＮＡ溶液は上で詳しく述べたように沈殿し、ＤＮＡ沈
殿は２５μｌＴＥ緩衝液に溶解した。
殿は２５μｌＴＥ緩衝液に溶解した。
（ｆｌ−ｏｒｉ断片）
２、ｆｌ−ｏｒｉのｐＢＲ３２２のＤｒａ Ｉ部位への
クローニング： ｐＢＲ３２２（２μｇ）を２ユニツトのＤｒａ■テ（製
造者の指示に従って）部分消化した。反応はフェノール
：クロロホルム抽出に続けて、上のステップ１で詳しく
述べたようにＤＮＡ沈殿することにより停止させた。Ｄ
ＮＡペレットを２０μｌＴＥ緩衝液に溶解した。２０μ
ｌのライゲーション緩衝液中で、１ユニツトのＴ０ｎ）
ＮＡＩＪガーゼと１４℃で一夜保温することにより、こ
のＤＮＡの約１ｏｏｎｇをＩＤＯｎｇのｆｌ−ｏｒｉ断
片（ステップ１）とライゲーションした。ライゲーショ
ンは７０°Ｃで１０分間加熱することにより停止させ、
その後大腸菌ＪＭ１０３株を形質転換するのに用い、ｐ
ＢＲ３２２のＤｒａ Ｉ部位（ヌクレオチド番号６２６
２と３２５１）にクローニングされたｆｌｏｒｉを含ん
だｐ、Ｂ Ｒｆ １−ｏｒｉを得た。
クローニング： ｐＢＲ３２２（２μｇ）を２ユニツトのＤｒａ■テ（製
造者の指示に従って）部分消化した。反応はフェノール
：クロロホルム抽出に続けて、上のステップ１で詳しく
述べたようにＤＮＡ沈殿することにより停止させた。Ｄ
ＮＡペレットを２０μｌＴＥ緩衝液に溶解した。２０μ
ｌのライゲーション緩衝液中で、１ユニツトのＴ０ｎ）
ＮＡＩＪガーゼと１４℃で一夜保温することにより、こ
のＤＮＡの約１ｏｏｎｇをＩＤＯｎｇのｆｌ−ｏｒｉ断
片（ステップ１）とライゲーションした。ライゲーショ
ンは７０°Ｃで１０分間加熱することにより停止させ、
その後大腸菌ＪＭ１０３株を形質転換するのに用い、ｐ
ＢＲ３２２のＤｒａ Ｉ部位（ヌクレオチド番号６２６
２と３２５１）にクローニングされたｆｌｏｒｉを含ん
だｐ、Ｂ Ｒｆ １−ｏｒｉを得た。
３、 ｐＡＯ８０７０作製
ｐＢＲｆ ｌ −ｏｒｉ（１０μＩ）をそれぞれ１０ユ
＝ツトＰｓｔＩとＮｄｅＩで６７°Ｃで４時間消化した
。消化したＤＮＡは、上のステップ１で詳しく述べたよ
うにフェノール：クロロホルムで抽出し、沈殿し、２５
μｌＴＥ緩衝液に溶解した。この物質を１．２％アガロ
ース・ゲルで電気泳動し、上のステップ１で詳しく述べ
たようにｆｌ−ｏｒｉを含むＮｄｅ ｆＰｓｔ Ｉ断片
（約３８ｋｂ）を単離し、２０μｌのＴＥ緩衝液に溶解
した。このＤＮＡ約１１００ｎを、あらかじめ均士１と
ＮｄｅＩで消化し、ホスファターゼ処理をしたｐＡＯ８
０４１１００ｎと混合した。この混合物は２０μｌのラ
イゲーション緩衝液中で、１ユニツトのＴ４ＤＮＡ！Ｊ
ガーゼと１４℃で一夜保温することによりライゲーショ
ンした。ライゲーションの反応は７Ｄ’Ｃで１０分間加
熱することにより停止させた。このＤＮＡを大腸菌Ｊ
Ｍ １０３株を形質転換するのに用い、ｐＡＯ８０７を
得た。
＝ツトＰｓｔＩとＮｄｅＩで６７°Ｃで４時間消化した
。消化したＤＮＡは、上のステップ１で詳しく述べたよ
うにフェノール：クロロホルムで抽出し、沈殿し、２５
μｌＴＥ緩衝液に溶解した。この物質を１．２％アガロ
ース・ゲルで電気泳動し、上のステップ１で詳しく述べ
たようにｆｌ−ｏｒｉを含むＮｄｅ ｆＰｓｔ Ｉ断片
（約３８ｋｂ）を単離し、２０μｌのＴＥ緩衝液に溶解
した。このＤＮＡ約１１００ｎを、あらかじめ均士１と
ＮｄｅＩで消化し、ホスファターゼ処理をしたｐＡＯ８
０４１１００ｎと混合した。この混合物は２０μｌのラ
イゲーション緩衝液中で、１ユニツトのＴ４ＤＮＡ！Ｊ
ガーゼと１４℃で一夜保温することによりライゲーショ
ンした。ライゲーションの反応は７Ｄ’Ｃで１０分間加
熱することにより停止させた。このＤＮＡを大腸菌Ｊ
Ｍ １０３株を形質転換するのに用い、ｐＡＯ８０７を
得た。
実施例２
ベクターｐｓＬ３４Ａの作製
２４ｋＤａ ｇａｇ配列と、他のＨＩＶ配列を含む、
３．８５ｋｂから成るＨ Ｉ Ｖウィルス由来の二部Ｒ
Ｉ／Ｃ］ａＩ 断片を単離した。（第１図参照）この断
片２５ｎｇば１ユニツトのＪ” ４リガーゼ（イーリン
ガ−０マンノ＼イム（Ｂｏｃｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ
ｂｅｉｍ） ）を用いて、あらかじめ４：１過剰量のＪ
”２ｃｏ １％ ＩとＣＩａＩエンドヌクレアーゼで製
造者の指示（全てのエンドヌクレアーゼはニュー・イン
グランド・バイオラプズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂ
ｉｏｌａｂｓ）またはベーリンガー・マンハイムから入
手した）に従って消化し、仔牛腸アルカリ・ホスファタ
ーゼで処理したｐＢＲ３２２ＤＮＡ、１０ｎｇと、２０
μｌのリガーゼ緩衝液（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ）ら１９８２）中で、１４°Ｃで一夜ライゲーション
した。
３．８５ｋｂから成るＨ Ｉ Ｖウィルス由来の二部Ｒ
Ｉ／Ｃ］ａＩ 断片を単離した。（第１図参照）この断
片２５ｎｇば１ユニツトのＪ” ４リガーゼ（イーリン
ガ−０マンノ＼イム（Ｂｏｃｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ
ｂｅｉｍ） ）を用いて、あらかじめ４：１過剰量のＪ
”２ｃｏ １％ ＩとＣＩａＩエンドヌクレアーゼで製
造者の指示（全てのエンドヌクレアーゼはニュー・イン
グランド・バイオラプズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂ
ｉｏｌａｂｓ）またはベーリンガー・マンハイムから入
手した）に従って消化し、仔牛腸アルカリ・ホスファタ
ーゼで処理したｐＢＲ３２２ＤＮＡ、１０ｎｇと、２０
μｌのリガーゼ緩衝液（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ）ら１９８２）中で、１４°Ｃで一夜ライゲーション
した。
コンピテント細胞はＬＢ培地での細菌ＭＣ１０６１の１
００ ｍｌの培養物を初期対数増殖期まで生育させるこ
とにより調製した。次に細胞をＩＥＣＩ）ＰＲ６０００
遠心機で、３０００ｒｐｍ５分間、４°Ｃで遠心するこ
とによりペレットにした。次に細胞は４０ｍ１のｃａ浴
溶液 ５ ＱｍＭＣａＣＡ２と１０％グリセロール）に
再懸濁し、水中に１５−２０分間装いた。細胞を先と同
様に遠心によりペレットにし５ｍｌのＣＧに再懸濁した
。４５ｍ７！／チユーブの分注物を１．５１１１ｘツペ
ンドル７ （Ｅｐｐｅｎｄｏｒ ｆ ）チュブに入れ、
液体窒素で急速凍結し、−７０℃で保存した。２００μ
ｌの細胞を、６ ８Ａ６００ユニツトに相当する最終濃
度で、各形質転換に用いた。
００ ｍｌの培養物を初期対数増殖期まで生育させるこ
とにより調製した。次に細胞をＩＥＣＩ）ＰＲ６０００
遠心機で、３０００ｒｐｍ５分間、４°Ｃで遠心するこ
とによりペレットにした。次に細胞は４０ｍ１のｃａ浴
溶液 ５ ＱｍＭＣａＣＡ２と１０％グリセロール）に
再懸濁し、水中に１５−２０分間装いた。細胞を先と同
様に遠心によりペレットにし５ｍｌのＣＧに再懸濁した
。４５ｍ７！／チユーブの分注物を１．５１１１ｘツペ
ンドル７ （Ｅｐｐｅｎｄｏｒ ｆ ）チュブに入れ、
液体窒素で急速凍結し、−７０℃で保存した。２００μ
ｌの細胞を、６ ８Ａ６００ユニツトに相当する最終濃
度で、各形質転換に用いた。
ｐＢＲ３２２とＨＩＶＥｃｏＲ，Ｉ／Ｃ１ａ 、ｒ：ノ
ライゲーション混合物を２００μｌのコンピテントなＭ
Ｃ１０６１細胞を形質転換するのに用いた。細胞とライ
ゲーション混合物を混合し、氷上に２０分間装いた後、
６７℃で２分間保温した。次に混合物を室温に１０分間
放置した。次に形質転換混合物を選択培地（ＬＢ培地に
５０μｊｉ ／ ｍｌ！アンピシリンを添加）上にブレ
ーティングした。プレートは６７℃で一夜保温した。
ライゲーション混合物を２００μｌのコンピテントなＭ
Ｃ１０６１細胞を形質転換するのに用いた。細胞とライ
ゲーション混合物を混合し、氷上に２０分間装いた後、
６７℃で２分間保温した。次に混合物を室温に１０分間
放置した。次に形質転換混合物を選択培地（ＬＢ培地に
５０μｊｉ ／ ｍｌ！アンピシリンを添加）上にブレ
ーティングした。プレートは６７℃で一夜保温した。
アンピシリン耐性コロニーを同定し、アルカリ溶菌な用
いたマニアティスの技術に従い各耐性コロニーについて
微量調製を行った。回収したプラスミドＤＮＡを４；１
過剰量のＥＣＯＲ，ＩとＣ１ａ Ｉで消化した。次に断
片をＧＳ％アガロース・ゲルでＴＨＥ緩衝液中で泳動し
た。ゲル上で３．８５ｋｂＣ１ａＩ／ＥｃｏＲ，Ｉ断片
が見えるコロニーをｐｓＬ３２と呼び集めた。
いたマニアティスの技術に従い各耐性コロニーについて
微量調製を行った。回収したプラスミドＤＮＡを４；１
過剰量のＥＣＯＲ，ＩとＣ１ａ Ｉで消化した。次に断
片をＧＳ％アガロース・ゲルでＴＨＥ緩衝液中で泳動し
た。ゲル上で３．８５ｋｂＣ１ａＩ／ＥｃｏＲ，Ｉ断片
が見えるコロニーをｐｓＬ３２と呼び集めた。
シアンエチルホスホルアミダイド法を利用したアプライ
ド・バイオシステムズ社（Ａｐｐ ｌ１ｅｄＢ ｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ ）モデル３８０ジーン・マシンによりオ
リゴヌクレオチド・アダプターを合成した。アダプター
は３．８５ｋｂＣＩａＩ／Ｅｃｏｌ（、Ｉ断片を発現ベ
クターｐＡＯ８０７の唯一のＥｃｏＲＩ部位への挿入を
容易にするようにＥＣ０Ｉ（Ｉ部位を与えるように設計
された。合成されたオリゴヌクレオチド・アダプターは
次の塩基配列を持っていた：５’ ＣＧＡＴＧＡＡＴＴ
ＣＡＴＧＧＧ’ｌ”ＧＣＧＡＧＡＧＣＧ３／ ＴＡ
ＣＴＴＡＡＧ’ｒＡＣＣＣＡＣＧＣＴＣＴＣＧＣＴＣＡ
ＧＴＡＴＴＡＡＧＣＧＧＧＧＧＡＧＡＡＴＴＡＧＡ ３
’Ａ（３’ｌ”ＣＡＴＡＡＴＴＣＧＣＣＣＣＣＴＣＴ’
、ｌｌ”ＡＡＴＣＴＡＧＣ５’各鎖は別々に合成され、
５μｇの両オリゴヌクレオチドを合わせてマニアティス
の方法を用いてキナーゼ反応を行（・、６７°Ｃで１時
間保温した。保温後、混合物は水溶中で６５℃で５分間
加熱し、次に水溶のスイッチを切って放置し、室温まで
ゆっ（り冷やした。１０μＩのプラスミドｐｓＬ３２を
Ｃｌａ Ｉで消化し、その末端をマニアティスの方法で
ホスファターゼ処理した。１１０−２５ｎの脱リン酸化
したベクターを、約１ユニツトのＴ４’Ｊガーゼを用い
て、１：４から１＝１０モル過剰量存在するリン酸化し
、アニールした１１５−１５０ｎのオリゴヌクレオチド
・アダプターとライゲーションした。次にこの反応混合
物をコンピテントなＭＣ１０６１細胞を形質転換するの
に用い、その細胞を選択培地上にプレートした。（これ
らの技術は上で以前に述べたように行った。）アンピシ
リン耐性コロニーについて微量調製を行い、各コロニー
をＥｃｏ ＲＩで消化した；アダプターを持つコロー一
ば〜３．８５ｋｂ断片を遊離する。挿入を持った１つの
コロニーをｐｓＬ３３と呼んだ。
ド・バイオシステムズ社（Ａｐｐ ｌ１ｅｄＢ ｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ ）モデル３８０ジーン・マシンによりオ
リゴヌクレオチド・アダプターを合成した。アダプター
は３．８５ｋｂＣＩａＩ／Ｅｃｏｌ（、Ｉ断片を発現ベ
クターｐＡＯ８０７の唯一のＥｃｏＲＩ部位への挿入を
容易にするようにＥＣ０Ｉ（Ｉ部位を与えるように設計
された。合成されたオリゴヌクレオチド・アダプターは
次の塩基配列を持っていた：５’ ＣＧＡＴＧＡＡＴＴ
ＣＡＴＧＧＧ’ｌ”ＧＣＧＡＧＡＧＣＧ３／ ＴＡ
ＣＴＴＡＡＧ’ｒＡＣＣＣＡＣＧＣＴＣＴＣＧＣＴＣＡ
ＧＴＡＴＴＡＡＧＣＧＧＧＧＧＡＧＡＡＴＴＡＧＡ ３
’Ａ（３’ｌ”ＣＡＴＡＡＴＴＣＧＣＣＣＣＣＴＣＴ’
、ｌｌ”ＡＡＴＣＴＡＧＣ５’各鎖は別々に合成され、
５μｇの両オリゴヌクレオチドを合わせてマニアティス
の方法を用いてキナーゼ反応を行（・、６７°Ｃで１時
間保温した。保温後、混合物は水溶中で６５℃で５分間
加熱し、次に水溶のスイッチを切って放置し、室温まで
ゆっ（り冷やした。１０μＩのプラスミドｐｓＬ３２を
Ｃｌａ Ｉで消化し、その末端をマニアティスの方法で
ホスファターゼ処理した。１１０−２５ｎの脱リン酸化
したベクターを、約１ユニツトのＴ４’Ｊガーゼを用い
て、１：４から１＝１０モル過剰量存在するリン酸化し
、アニールした１１５−１５０ｎのオリゴヌクレオチド
・アダプターとライゲーションした。次にこの反応混合
物をコンピテントなＭＣ１０６１細胞を形質転換するの
に用い、その細胞を選択培地上にプレートした。（これ
らの技術は上で以前に述べたように行った。）アンピシ
リン耐性コロニーについて微量調製を行い、各コロニー
をＥｃｏ ＲＩで消化した；アダプターを持つコロー一
ば〜３．８５ｋｂ断片を遊離する。挿入を持った１つの
コロニーをｐｓＬ３３と呼んだ。
プラスミドｐｓＬ３３０犬量調製は、ｐｓＬ３３で形質
転換されたＭＣ１０６１細胞を１００ ｍｌの選択培地
（ＬＢ＋５０μｉ ／ ｍｌアンピシリン）中で定常期
まで生育させることにより行った。
転換されたＭＣ１０６１細胞を１００ ｍｌの選択培地
（ＬＢ＋５０μｉ ／ ｍｌアンピシリン）中で定常期
まで生育させることにより行った。
次にこれらの細胞をＧＳＡローターを用いて、５ｏｒｖ
ａｌｌ ＲＣ−５Ｂ遠心機で、１０，０００ ｒｐｍｓ
で１０分間遠心した。ペレットを２５ｍ１のＧＥＴ
溶液（５ＱｍＭグルコース、１０ｍＭＥＤＴＡ、２５ｍ
Ｍトリス・Ｃ４，ｐＨ８を含む）に ５ｍｌの１０係り
ゾチームを加えたものに再懸濁し、室温に１〜５分保温
した。５０ｍ１の１ ％ Ｓ Ｄ Ｓ溶液と０．２ Ｎ
ＮａＯＨを加え、ペレットを再懸濁するために逆に向
けることにより混合した。これに続けて３８ＴＬｌの６
Ｍ酢酸カリウム（ｐｆ（４，５）を加え、逆に向けるこ
とにより中に混合した。この混合物を氷水中で１５分間
冷却した。次に冷却した混合物をＧＳＡローターを用い
て、５ｏｒｖａｌｌ ＲＣ−５８遠心機で、１０．００
０ ｒｐｍｓで１０分間再び遠心した。次に上清をガー
ゼのパッドを通して新しい遠心管に注ぎ入れた。１２グ
ラムのＰＥＧ３０００（ポリエチレン・グリコール）を
上清に加え、こうしてできた混合物を氷水中で６０分間
冷却した。次に冷却した混合物を先に述べたように（１
０，０００ｒｐｍｓ。
ａｌｌ ＲＣ−５Ｂ遠心機で、１０，０００ ｒｐｍｓ
で１０分間遠心した。ペレットを２５ｍ１のＧＥＴ
溶液（５ＱｍＭグルコース、１０ｍＭＥＤＴＡ、２５ｍ
Ｍトリス・Ｃ４，ｐＨ８を含む）に ５ｍｌの１０係り
ゾチームを加えたものに再懸濁し、室温に１〜５分保温
した。５０ｍ１の１ ％ Ｓ Ｄ Ｓ溶液と０．２ Ｎ
ＮａＯＨを加え、ペレットを再懸濁するために逆に向
けることにより混合した。これに続けて３８ＴＬｌの６
Ｍ酢酸カリウム（ｐｆ（４，５）を加え、逆に向けるこ
とにより中に混合した。この混合物を氷水中で１５分間
冷却した。次に冷却した混合物をＧＳＡローターを用い
て、５ｏｒｖａｌｌ ＲＣ−５８遠心機で、１０．００
０ ｒｐｍｓで１０分間再び遠心した。次に上清をガー
ゼのパッドを通して新しい遠心管に注ぎ入れた。１２グ
ラムのＰＥＧ３０００（ポリエチレン・グリコール）を
上清に加え、こうしてできた混合物を氷水中で６０分間
冷却した。次に冷却した混合物を先に述べたように（１
０，０００ｒｐｍｓ。
１０分間、ＧＳＡｏ−ター１．Ｓ、ｏ、ｒ、Ｖａ ｌ
ＩＲＣ−５８）遠心した。次に遠心管は上清を徹底的に
除き、ペレットヲ９ｍ１ＳのＴＥ、緩衝液（１０ｍＭ）
リス（ｐｉ−Ｉ８．０）と１ｍＭＥ］）ＴＡ）に溶解し
た。溶解したペレットに９グラムのＣ８Ｃｌと３．４５
ｍ１ｓの１％エチジウム・ブロマイドを加えた。次にこ
の混合物をチューブにつめ、Ｔｌ７５０−ターに入れて
、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ） Ｌ ８−７０超遠
心で、５５０００ ｒｐｍｓ、１６時間、１８℃で遠心
した。ＤＮＡのバンドをＣ５Ｃｌから抜きとり、ＮａＣ
１で飽和した第２−ブタノールで３または４回抽出した
。最初の容積の２倍の水を加えた。この混合物に最初の
容積の６倍のイングロパノールを加えた。混合物を一２
０℃で数時間または一夜冷却するか、凍結するまでドラ
イ・アイス上で冷却した。次にＤＮＡをＨＢ−４０−タ
ーで５ｏｒｖａｌｌ ＲＣ−５８遠心機を用いて、２０
分間、１１．０００ ｒｐｍｓ で遠心することによ
りペレットにした。上清を注ぎ出し、ペレットをＱ、４
５ｍ１ＴＥ緩衝液に再懸濁し、次にエッペンドルフ・チ
ューブに移した。再懸濁したペレットに、Ｑ５ｍｌの６
Ｍ酢酸ナトリウム１ｍ１のエタノールを加え、ドライ・
アイス上で凍結するまで冷却した。次にペレットを融解
し、低温室（４℃）中で微小遠心機で遠心した。次に融
解したペレットは２００μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。
ＩＲＣ−５８）遠心した。次に遠心管は上清を徹底的に
除き、ペレットヲ９ｍ１ＳのＴＥ、緩衝液（１０ｍＭ）
リス（ｐｉ−Ｉ８．０）と１ｍＭＥ］）ＴＡ）に溶解し
た。溶解したペレットに９グラムのＣ８Ｃｌと３．４５
ｍ１ｓの１％エチジウム・ブロマイドを加えた。次にこ
の混合物をチューブにつめ、Ｔｌ７５０−ターに入れて
、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ） Ｌ ８−７０超遠
心で、５５０００ ｒｐｍｓ、１６時間、１８℃で遠心
した。ＤＮＡのバンドをＣ５Ｃｌから抜きとり、ＮａＣ
１で飽和した第２−ブタノールで３または４回抽出した
。最初の容積の２倍の水を加えた。この混合物に最初の
容積の６倍のイングロパノールを加えた。混合物を一２
０℃で数時間または一夜冷却するか、凍結するまでドラ
イ・アイス上で冷却した。次にＤＮＡをＨＢ−４０−タ
ーで５ｏｒｖａｌｌ ＲＣ−５８遠心機を用いて、２０
分間、１１．０００ ｒｐｍｓ で遠心することによ
りペレットにした。上清を注ぎ出し、ペレットをＱ、４
５ｍ１ＴＥ緩衝液に再懸濁し、次にエッペンドルフ・チ
ューブに移した。再懸濁したペレットに、Ｑ５ｍｌの６
Ｍ酢酸ナトリウム１ｍ１のエタノールを加え、ドライ・
アイス上で凍結するまで冷却した。次にペレットを融解
し、低温室（４℃）中で微小遠心機で遠心した。次に融
解したペレットは２００μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。
こうして得られたＤ 、Ｎ Ａの濃度は２６０ｎｍにお
ける吸光度の実測値をとり、濃度を見積る（１が５０μ
ｉ／ｍｌに相当）ことにより決定した。
ける吸光度の実測値をとり、濃度を見積る（１が５０μ
ｉ／ｍｌに相当）ことにより決定した。
２５μｇのｐｓＬ３３を上で述べたように４＝１過剰量
のＥｃｏ ＲＩで消化した。消化混合物を、７％アガロ
ース・ゲルでＴＢＥ緩衝液（１０ＸＴＢＥは１０８ｇｒ
）リス塩基、５５ ｇｒホウ酸、６．７２ｇＥＤＴＡ２
・ナトリウムから成っている（結果としてｐＨ８，１−
８，２） ）中で電気泳動した。この消化により生成す
る３、８５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片をゲルから切り出し、
透析チューブ中に置いてＴＢＥ緩衝液中に電気溶出した
。次に電気溶出した断片は、２容のエタノールで沈殿し
、フェノール・クロロホルムで抽出された。次に１２．
５５−１２５ｎのこの３．８５ ｋｂ Ｅｃｏ Ｒ，Ｉ
断片は１０ｎｇのＥｃｏＲ，Ｉで切断し、ホスファター
ゼ処理されたプラスミドｐＡＯ８０７にライゲーション
された。ライゲーションはマーアティスのりガーゼ緩衝
液を用いて行った。
のＥｃｏ ＲＩで消化した。消化混合物を、７％アガロ
ース・ゲルでＴＢＥ緩衝液（１０ＸＴＢＥは１０８ｇｒ
）リス塩基、５５ ｇｒホウ酸、６．７２ｇＥＤＴＡ２
・ナトリウムから成っている（結果としてｐＨ８，１−
８，２） ）中で電気泳動した。この消化により生成す
る３、８５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片をゲルから切り出し、
透析チューブ中に置いてＴＢＥ緩衝液中に電気溶出した
。次に電気溶出した断片は、２容のエタノールで沈殿し
、フェノール・クロロホルムで抽出された。次に１２．
５５−１２５ｎのこの３．８５ ｋｂ Ｅｃｏ Ｒ，Ｉ
断片は１０ｎｇのＥｃｏＲ，Ｉで切断し、ホスファター
ゼ処理されたプラスミドｐＡＯ８０７にライゲーション
された。ライゲーションはマーアティスのりガーゼ緩衝
液を用いて行った。
次にライゲーション混合物は２００μｌのコンピテント
なＪＭ１０３細胞に形質転換された。
なＪＭ１０３細胞に形質転換された。
コンピテントなＪＭ１０１１Ｂ胞は添加物を補ったＭ９
培地、シラーとスミス、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙ
ｍｄｏｇｙ Ｉ ＤＯ： ４６８ 、４９０ （１９８
３）にＪＭ１０３を植え、細胞が定常期に達するまで３
７℃で振盪しながら培養することにより調製した。５０
μｌの定常期ＪＭ１０３を５０ｍ１のＬＢ培地に加え。
培地、シラーとスミス、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙ
ｍｄｏｇｙ Ｉ ＤＯ： ４６８ 、４９０ （１９８
３）にＪＭ１０３を植え、細胞が定常期に達するまで３
７℃で振盪しながら培養することにより調製した。５０
μｌの定常期ＪＭ１０３を５０ｍ１のＬＢ培地に加え。
６７℃で２時間または０Ｄ６００が、乙になるまで培養
した。細胞を集め、Ｉ Ｅ ＣＤ Ｐ Ｒ６０００中で
３０００ ｒｐｍｓで５分間、４℃で遠心した。次に細
胞を２５ｒｎｌの５０Ｉ］ｌｌＬ、ＭＣａＣ１２に再懸
濁し、氷上に１５５分間置た。１５分間の後、再び細胞
をＩＥＣＤＰＲ６０００中で３０００ｒｐｍｓで５分間
、４℃で遠心した。次に細胞は２．５ｍ１ｓの５０ ｍ
Ｍ Ｃａｃｔ ２に再懸濁し、使用まで氷上に保存し
た。（細胞は使用までに２−６時間だけ保存してもよい
。） ＪＭ１０３のための形質転換プロトコールは先にＭＣ１
０６１に用いたものと同じである。細胞はアンピシリン
を含むＬＢ培地上に（ＭＣ１０６１のために先に述べた
ように）プレートし、アンピシリン耐性コロニーを選択
した。アルカリ溶菌のためのマニアティスのプロトコー
ルを用いて微量調製を行った。微量調製により得られた
ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、。７％アガロース・ゲル
で泳動した。〜３．８５ｋｂ断片を生じるコロニーを選
択し、ｐｓＬ３４Ａと名付けたが、これは第２図に示さ
れている。このプラスミドの方向もＣ１ａ Ｉ消化によ
って決定された。
した。細胞を集め、Ｉ Ｅ ＣＤ Ｐ Ｒ６０００中で
３０００ ｒｐｍｓで５分間、４℃で遠心した。次に細
胞を２５ｒｎｌの５０Ｉ］ｌｌＬ、ＭＣａＣ１２に再懸
濁し、氷上に１５５分間置た。１５分間の後、再び細胞
をＩＥＣＤＰＲ６０００中で３０００ｒｐｍｓで５分間
、４℃で遠心した。次に細胞は２．５ｍ１ｓの５０ ｍ
Ｍ Ｃａｃｔ ２に再懸濁し、使用まで氷上に保存し
た。（細胞は使用までに２−６時間だけ保存してもよい
。） ＪＭ１０３のための形質転換プロトコールは先にＭＣ１
０６１に用いたものと同じである。細胞はアンピシリン
を含むＬＢ培地上に（ＭＣ１０６１のために先に述べた
ように）プレートし、アンピシリン耐性コロニーを選択
した。アルカリ溶菌のためのマニアティスのプロトコー
ルを用いて微量調製を行った。微量調製により得られた
ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、。７％アガロース・ゲル
で泳動した。〜３．８５ｋｂ断片を生じるコロニーを選
択し、ｐｓＬ３４Ａと名付けたが、これは第２図に示さ
れている。このプラスミドの方向もＣ１ａ Ｉ消化によ
って決定された。
実施例６２
ｐｓＬ４４Ａの作製
■、オリゴヌクレオチド・ブイレフテッド変異遺伝子（
Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＤｉｒｅｃｔｅｄＭ
ｕｔａｇｅｎｅｓ） プラスミドｐＳＬ３４Ａに、１） ｇａｇ遺伝子の５′
端にＥｃｏＲＩ部位と開始メチオニンを加えるためと、
２） ｇａｇ遺伝子の、３′端に終止コドンと＆ｏＲ，
Ｉ部位を加えるために、２つの誘導体ｐｓＬ３４Ａプラ
スミド（ｐｓＬ４２とｐｓＬ４３、第２図参照）を作る
ことになる別々の変異作製（ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）
を行った。鋳型ＤＮＡは、（ｐＳＬ３４Ａプラスミドに
より）アンピシリン耐性に形質転換されたＪＭ１０６Ｍ
Ｂ胞のコロニーを、２ｍｌのＬＢに１００μｇ／ｍｌア
ンピシリンを加えたものに再懸濁し、３７℃で４−５時
間生育させることにより、ｐｓＬ３４Ａの形質転換体か
ら調製した。この飽和培養液０．５ｍｌを５ｒ：Ｊｍｌ
のＬ Ｂ −１−ａｍｐに植菌し、０Ｄ６ｏｏ＝０．３
まで生育させた。次にこれは、ヘルパー・ファージの多
重感染をするばかりになった。ヘルパー・ファージの調
製は以下に述べる。ヘルパー・ファージＲ４０８からの
ファージ・ストックは、添加物を補ったＭ９培地でのＪ
Ｍ１０３０オーバーナイト・カルチャー０．２１ｎｌと
、７ Ｘ １０８ Ｒ４０８と、１００μｌのＬＢ培地
を小さな滅菌済チューブに入れることにより調製した。
Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＤｉｒｅｃｔｅｄＭ
ｕｔａｇｅｎｅｓ） プラスミドｐＳＬ３４Ａに、１） ｇａｇ遺伝子の５′
端にＥｃｏＲＩ部位と開始メチオニンを加えるためと、
２） ｇａｇ遺伝子の、３′端に終止コドンと＆ｏＲ，
Ｉ部位を加えるために、２つの誘導体ｐｓＬ３４Ａプラ
スミド（ｐｓＬ４２とｐｓＬ４３、第２図参照）を作る
ことになる別々の変異作製（ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）
を行った。鋳型ＤＮＡは、（ｐＳＬ３４Ａプラスミドに
より）アンピシリン耐性に形質転換されたＪＭ１０６Ｍ
Ｂ胞のコロニーを、２ｍｌのＬＢに１００μｇ／ｍｌア
ンピシリンを加えたものに再懸濁し、３７℃で４−５時
間生育させることにより、ｐｓＬ３４Ａの形質転換体か
ら調製した。この飽和培養液０．５ｍｌを５ｒ：Ｊｍｌ
のＬ Ｂ −１−ａｍｐに植菌し、０Ｄ６ｏｏ＝０．３
まで生育させた。次にこれは、ヘルパー・ファージの多
重感染をするばかりになった。ヘルパー・ファージの調
製は以下に述べる。ヘルパー・ファージＲ４０８からの
ファージ・ストックは、添加物を補ったＭ９培地でのＪ
Ｍ１０３０オーバーナイト・カルチャー０．２１ｎｌと
、７ Ｘ １０８ Ｒ４０８と、１００μｌのＬＢ培地
を小さな滅菌済チューブに入れることにより調製した。
チューブは振盪なしで、６７℃に１５分間保温し、それ
からＬＢに０．７％寒天を加えたもの２．５ｍ７を加え
て、混合物を前日に作ったＬＢプレートの表面に流し込
んだ。プレートは６７℃で６時間生育させ、次に５ｒｎ
ｌのＬＢを重層し、低温室で一夜か、室温で、回転振盪
機の上で、ゆっ（すした振盪で４５５分間置てお（。
からＬＢに０．７％寒天を加えたもの２．５ｍ７を加え
て、混合物を前日に作ったＬＢプレートの表面に流し込
んだ。プレートは６７℃で６時間生育させ、次に５ｒｎ
ｌのＬＢを重層し、低温室で一夜か、室温で、回転振盪
機の上で、ゆっ（すした振盪で４５５分間置てお（。
上清を吸引し、５ｏｒｖａｌｌ遠心機と、ＨＢ ４か５
Ｓ３４ヘツドを用いて８．００ Ｏｒｐｍで２０分間遠
心し、この遠心の上清を吸引し新しい滅菌した５０ｍ１
Ｊの円錐状のチーーブに入れた。チューブを６５℃で６
０分間加熱した。ストックは４℃で保存するべきである
。
Ｓ３４ヘツドを用いて８．００ Ｏｒｐｍで２０分間遠
心し、この遠心の上清を吸引し新しい滅菌した５０ｍ１
Ｊの円錐状のチーーブに入れた。チューブを６５℃で６
０分間加熱した。ストックは４℃で保存するべきである
。
ファージの力価測定は、１ｒｎｌのＬＨに１０−２１０
．１０ ．１０ ．１０ の濃度でファージ・スト
ックの一連の希釈液を作ることにより行う。力価測定の
ための細菌のローン（ｌａｗｎｓ）は、ＬＢプレートの
上にＱ、 ２ ｍｌのＪＭ１０３０オーバーナイト・カ
ルチャーと２．５ ｍｌの０７％寒天をブレーティング
し、プレートをフタをずらしてベンチの上に５分間置く
ことによって調製する。２０μｌの各希釈液をガラスの
マイクロピペットを用いてプレート上にスポットし、プ
レートを６７℃で一夜保温する。−夜の生育の後、２０
μｌの１０−９希釈液の１０のプラークの存在は、５Ｘ
１０１１の力価を示している。これはストックを作るの
に使うファージ数のための望ましい値であり、−水銀生
産のためのプラスミド培養液の多重感染のために便利な
力価である。
．１０ ．１０ ．１０ の濃度でファージ・スト
ックの一連の希釈液を作ることにより行う。力価測定の
ための細菌のローン（ｌａｗｎｓ）は、ＬＢプレートの
上にＱ、 ２ ｍｌのＪＭ１０３０オーバーナイト・カ
ルチャーと２．５ ｍｌの０７％寒天をブレーティング
し、プレートをフタをずらしてベンチの上に５分間置く
ことによって調製する。２０μｌの各希釈液をガラスの
マイクロピペットを用いてプレート上にスポットし、プ
レートを６７℃で一夜保温する。−夜の生育の後、２０
μｌの１０−９希釈液の１０のプラークの存在は、５Ｘ
１０１１の力価を示している。これはストックを作るの
に使うファージ数のための望ましい値であり、−水銀生
産のためのプラスミド培養液の多重感染のために便利な
力価である。
０Ｄ６００−０．３の培養液をヘルパー・ファージＲ，
４０８〔う、 セル（Ｒｕｓｓｅｌ）ら（１９８６）Ｇ
ｅｎｅ４５：３３３−３３８，１ で、感染多重度１０
−２０で多重感染させた。次に多重感染した培養液を、
５ｏｒｖａｌｌ ＲＣ−５Ｂ遠心機を用いて３Ｑｍｌコ
ーレックス、（ｃｏｒｅｘ） ’チューブ中で１０，０
００ ｒｐｍｓで、１０分間、２回遠心した。上清は新
しいコーレックス・チューブに移し、７ ｍｌの２．５
Ｍ ＮａＣ７１を含む２０％ＰＥ０６０００をそれに
加えた。混合物は４℃で一夜保温した。次に混合物を５
ｏｒｖａｌｌＲＣ５Ｂ遠心機を用いて、１０，０００
ｒｐｍｓで１０分間遠心し、上清は捨てた。ペレットを
２ｍ１ｌのＴＥに再懸濁し、フェノール；フェノール：
クロロホルム次にエーテルで抽出した。１／１ｏ容の８
Ｍ塩化リチウムと、２容のエタノールをこの混合物に加
えた。混合物を一２０℃で一夜保温した。−夜の保温の
後、混合物を５ｏｒｖａｌｌＲＣ−５Ｂ遠心機で１０．
０００ ｒｐｍ で１０分間遠心した。上清を捨てベレ
ットをエタノールでリンスした。ベレットヲＱ、 ５
ｍｌの１０ｍＭ）リス・ＨＣｌに再懸濁した。
４０８〔う、 セル（Ｒｕｓｓｅｌ）ら（１９８６）Ｇ
ｅｎｅ４５：３３３−３３８，１ で、感染多重度１０
−２０で多重感染させた。次に多重感染した培養液を、
５ｏｒｖａｌｌ ＲＣ−５Ｂ遠心機を用いて３Ｑｍｌコ
ーレックス、（ｃｏｒｅｘ） ’チューブ中で１０，０
００ ｒｐｍｓで、１０分間、２回遠心した。上清は新
しいコーレックス・チューブに移し、７ ｍｌの２．５
Ｍ ＮａＣ７１を含む２０％ＰＥ０６０００をそれに
加えた。混合物は４℃で一夜保温した。次に混合物を５
ｏｒｖａｌｌＲＣ５Ｂ遠心機を用いて、１０，０００
ｒｐｍｓで１０分間遠心し、上清は捨てた。ペレットを
２ｍ１ｌのＴＥに再懸濁し、フェノール；フェノール：
クロロホルム次にエーテルで抽出した。１／１ｏ容の８
Ｍ塩化リチウムと、２容のエタノールをこの混合物に加
えた。混合物を一２０℃で一夜保温した。−夜の保温の
後、混合物を５ｏｒｖａｌｌＲＣ−５Ｂ遠心機で１０．
０００ ｒｐｍ で１０分間遠心した。上清を捨てベレ
ットをエタノールでリンスした。ベレットヲＱ、 ５
ｍｌの１０ｍＭ）リス・ＨＣｌに再懸濁した。
プライミングに用いた５′オリゴヌクレオチドは次の配
列のものだった： ５’ −ＡＧＣＡＧ’ｌｌ’ ＣＡＧ ＧＴＣＡＧＣ
ＧＡＡ ＴＴＣＡＴＧ ｃｃＴＡ’ｒＡＧＴＧ ＣＡＧ
ＡＡＣ−３’プライミングに用いた、３′オリゴヌク
レオチドは次の配列のものだった： ５’ −ＡＡＧ ＧＣＡ ＡＧＡ ＧＴＴ ＴＴＧ
ＴＡＡ ＧＡＡＴＴＣＡＴＧ ＡＧＣＣＡＡ ＧＴＡ
ＡＣＡ−３’合成ヌクレオチドはこれも、上で述べたよ
うにアプライド・バイオシステム社ＤＮＡ合成機、モデ
ル６８０Ａとシアノエチルホスホルアミダイド法を用い
て作った。５′端の変異作製は、次のプロトコールに従
ってプラスミドｐｓＬ３４Ａ由来の鋳型ＤＮＡを用いて
行い、プラスミドｐｓＬ４２を得た。
列のものだった： ５’ −ＡＧＣＡＧ’ｌｌ’ ＣＡＧ ＧＴＣＡＧＣ
ＧＡＡ ＴＴＣＡＴＧ ｃｃＴＡ’ｒＡＧＴＧ ＣＡＧ
ＡＡＣ−３’プライミングに用いた、３′オリゴヌク
レオチドは次の配列のものだった： ５’ −ＡＡＧ ＧＣＡ ＡＧＡ ＧＴＴ ＴＴＧ
ＴＡＡ ＧＡＡＴＴＣＡＴＧ ＡＧＣＣＡＡ ＧＴＡ
ＡＣＡ−３’合成ヌクレオチドはこれも、上で述べたよ
うにアプライド・バイオシステム社ＤＮＡ合成機、モデ
ル６８０Ａとシアノエチルホスホルアミダイド法を用い
て作った。５′端の変異作製は、次のプロトコールに従
ってプラスミドｐｓＬ３４Ａ由来の鋳型ＤＮＡを用いて
行い、プラスミドｐｓＬ４２を得た。
、３′端の変異作製は、次のプロトコールに従ってプラ
スミドｐｓＬ３４Ａ由来の鋳型ＤＮＡを用いて行い、プ
ラスミドｐｓＬ４３を得た。
スミドｐｓＬ３４Ａ由来の鋳型ＤＮＡを用いて行い、プ
ラスミドｐｓＬ４３を得た。
１ｎｍｏｌの変異作製用オリゴヌクレオチドは従来のプ
ロトコール（マニアティスら、１９８２）により、非放
射性ＡＴＰでリン酸化した。これらのオリゴヌクレオチ
ドの配列は上に挙げた。４゜ｐｍｏｌｅｓの各々のリン
酸化されたオリゴヌクレオチドは、それぞれ別々に２ｇ
ｍｄｌｅｓのｐｓＬ３４Ａ由来の鋳型ＤＮＡと、溶液Ａ
（０，２Ｍト’）、＜−ｎｃｌ！（ｐＨ７，５）、０．
５Ｍ ＮａＣｌ、０．１ ＭＭｇＣＡ’２，０．０１
Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ））中で、反応混合物を
２分間煮沸し、混合物を６５℃で５分間保温し、水浴の
スイッチを切ることにより反応物を室温までゆっくりと
冷やすことによりアニールした。
ロトコール（マニアティスら、１９８２）により、非放
射性ＡＴＰでリン酸化した。これらのオリゴヌクレオチ
ドの配列は上に挙げた。４゜ｐｍｏｌｅｓの各々のリン
酸化されたオリゴヌクレオチドは、それぞれ別々に２ｇ
ｍｄｌｅｓのｐｓＬ３４Ａ由来の鋳型ＤＮＡと、溶液Ａ
（０，２Ｍト’）、＜−ｎｃｌ！（ｐＨ７，５）、０．
５Ｍ ＮａＣｌ、０．１ ＭＭｇＣＡ’２，０．０１
Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ））中で、反応混合物を
２分間煮沸し、混合物を６５℃で５分間保温し、水浴の
スイッチを切ることにより反応物を室温までゆっくりと
冷やすことによりアニールした。
２．５μｌの大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー・
フラグメントにュー・イングランド・バイオラブズ）と
２５μｌの溶液Ｃを各々のチューブに加えた。
フラグメントにュー・イングランド・バイオラブズ）と
２５μｌの溶液Ｃを各々のチューブに加えた。
次にチューブをベンチ上で５分装置いて、１６°Ｃ−夜
に移した。
に移した。
、３′端の変異作製は、ｐ８Ｌ３４Ａ由来の別のＤＮＡ
鋳型で同じプロトコールを用いて独立に行った。
鋳型で同じプロトコールを用いて独立に行った。
■、細菌への形質転換とコロニーのスクリーニング
次の朝、雌の細菌株ＭＣ１０６１のコンピテント細胞を
、伸長反応液の１＝４０希釈液の０．５゜２．５μｌで
、上に挙げた形質転換法とコンピテント細胞の調製法を
用いて、形質転換した。各希釈液に５枚ずつのプレート
にプレートした。６７°Ｃで一夜保温した後、グルンス
タイン（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ）とホグネス（Ｈｏｇｎｅ
ｓ ｓ ）に基づ（方法を用いて、細菌ノコロニー由
来のＤＮＡをニトロセルロース・フィルターの上へ移し
た；そしてコロニーにスクリーン用オリゴヌクレオチド
でハイブリダイズしたが、そのオリゴヌクレオチドは（
シラーとスミス、前出４９２）の方法で放射性ガンマ−
ＡＴＰの存在下でキナーゼ標識で、放射性にされた。Ｎ
端変異作製のスクリーニングに用いたオリゴヌクレオチ
ドの配列は： ５’ −ＧＴＣＡＧＣＧＡＡ ＴＴＣＡＴＧ ＣＣＴ
ＡＴＡ＝ ３’ であり、Ｃ端変異作製のスクリーニングに用いたオリゴ
ヌクレオチドの配列は： ５’ −ＧＴＴ ＴＴＧ ＴＡＡ ＧＡＡ Ｔ’ｌ”
ＣＡＴＧＡＧＣ−３’ である。
、伸長反応液の１＝４０希釈液の０．５゜２．５μｌで
、上に挙げた形質転換法とコンピテント細胞の調製法を
用いて、形質転換した。各希釈液に５枚ずつのプレート
にプレートした。６７°Ｃで一夜保温した後、グルンス
タイン（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ）とホグネス（Ｈｏｇｎｅ
ｓ ｓ ）に基づ（方法を用いて、細菌ノコロニー由
来のＤＮＡをニトロセルロース・フィルターの上へ移し
た；そしてコロニーにスクリーン用オリゴヌクレオチド
でハイブリダイズしたが、そのオリゴヌクレオチドは（
シラーとスミス、前出４９２）の方法で放射性ガンマ−
ＡＴＰの存在下でキナーゼ標識で、放射性にされた。Ｎ
端変異作製のスクリーニングに用いたオリゴヌクレオチ
ドの配列は： ５’ −ＧＴＣＡＧＣＧＡＡ ＴＴＣＡＴＧ ＣＣＴ
ＡＴＡ＝ ３’ であり、Ｃ端変異作製のスクリーニングに用いたオリゴ
ヌクレオチドの配列は： ５’ −ＧＴＴ ＴＴＧ ＴＡＡ ＧＡＡ Ｔ’ｌ”
ＣＡＴＧＡＧＣ−３’ である。
両オリゴヌクレオチドは、機構によりＮ端のオリゴから
トリチル基が除かれ、試料が（ＨＰＬＣではなく）セフ
ァデク、ｚ （５ｅｐｈａｄｅｘ） Ｇ 〜４０の中程
度のカラムを用いて脱塩されている以外は先に述べたよ
うに合成された。
トリチル基が除かれ、試料が（ＨＰＬＣではなく）セフ
ァデク、ｚ （５ｅｐｈａｄｅｘ） Ｇ 〜４０の中程
度のカラムを用いて脱塩されている以外は先に述べたよ
うに合成された。
放射性オリゴヌクレオチドのノ・イブリダイゼーション
は、４２℃で５ＸＳＳＰＥ、１０Ｘデンノ・ルト溶液、
Ｑ、５％ＳＤＳ中で行われた。フィルターはハイブリダ
イゼーションに先立ち、同じ溶液中で６５℃で６０分間
、プレノ・イブリダイゼーンヨンし、ハイブリダイゼー
ションのためＫｍ液を交換した。標識したオリゴヌクレ
オチドはノ・イブリダイゼーションに１０６ｃｐｍ ／
ｍｌで用いた。フィルターは室温で、６×ＳＳＣ中１
５分間洗浄６回４２°Ｃで６×ＳＳＣ中１５分間洗浄１
回で洗浄した。Ｘ線フィルム（コダック（Ｋｏｄａｋ）
、Ｘ −ＯｍａｔＡＲ）に露出した後、各変異作製か
ら８個の仮の単一陽性コロニーを拾った；コロニーから
のＤＮＡは標準の細菌微量調製プロトコール（マニアテ
ィス）を用いて調製し、ＤＮＡばＥｃｏＲＩで消化し、
消化物をポリアクリルアミド・ゲルで泳動することによ
り、新しいＥｃｏＲＩ部位の存在でＣｈｅｃｋした。Ｎ
とＣ端、各々に４個と２個の細菌の微量調製物は、新し
いＥｃｏＪ％Ｉ部位の存在を確認した。これらの陽性の
ものの各々１個、マニアティスの方法を用いてプラスミ
ドＤＮＡの大量調製のために生育させ、これらの同じ陽
性のもの各々からの微量調製した］） Ｎ Ａの１：４
０の希釈液１．５，１０，２０μｌを、細菌株ＪｆＶ１
１０３をアンピシリン耐性に形質転換するのに用いた。
は、４２℃で５ＸＳＳＰＥ、１０Ｘデンノ・ルト溶液、
Ｑ、５％ＳＤＳ中で行われた。フィルターはハイブリダ
イゼーションに先立ち、同じ溶液中で６５℃で６０分間
、プレノ・イブリダイゼーンヨンし、ハイブリダイゼー
ションのためＫｍ液を交換した。標識したオリゴヌクレ
オチドはノ・イブリダイゼーションに１０６ｃｐｍ ／
ｍｌで用いた。フィルターは室温で、６×ＳＳＣ中１
５分間洗浄６回４２°Ｃで６×ＳＳＣ中１５分間洗浄１
回で洗浄した。Ｘ線フィルム（コダック（Ｋｏｄａｋ）
、Ｘ −ＯｍａｔＡＲ）に露出した後、各変異作製か
ら８個の仮の単一陽性コロニーを拾った；コロニーから
のＤＮＡは標準の細菌微量調製プロトコール（マニアテ
ィス）を用いて調製し、ＤＮＡばＥｃｏＲＩで消化し、
消化物をポリアクリルアミド・ゲルで泳動することによ
り、新しいＥｃｏＲＩ部位の存在でＣｈｅｃｋした。Ｎ
とＣ端、各々に４個と２個の細菌の微量調製物は、新し
いＥｃｏＪ％Ｉ部位の存在を確認した。これらの陽性の
ものの各々１個、マニアティスの方法を用いてプラスミ
ドＤＮＡの大量調製のために生育させ、これらの同じ陽
性のもの各々からの微量調製した］） Ｎ Ａの１：４
０の希釈液１．５，１０，２０μｌを、細菌株ＪｆＶ１
１０３をアンピシリン耐性に形質転換するのに用いた。
■、鋳型ＤＮＡの調製と、塩基配列決定による確認者々
の２０μｌ希釈プレートから６コロニーずつを、上記の
方法（多重感染したＪＭ１０３細胞の上清のポリエチレ
ン・グリコール沈殿と、それに続けたフェノールとクロ
ロホルムによる脱タンパク質と、ＤＮＡのエタノール沈
殿を含む）により一本鎖鋳型ＤＮＡを調製するのに用い
た。Ｎ端変異作製の配列は、次の配列のオリゴヌクレオ
チドを用いて： ５’ −ＣＡＣＣＡＡ ＧＧＡ ＡＧＣＴＴＴ ＡＧ
Ａ Ｃ−３’またＣ端変異作製の配列は次の配列のオリ
ゴヌクレオチドを用いて： ５’ −ＣＧＡ ＡＣＣＣＡＧ ＡＴＴ ＧＴＡ Ａ
ＧＡ ＣＴＡ−３’サンガ（Ｓａｎｇｅｒ（１９７７）
）の鎖停止法（ｃｈａｉｎｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｍ
ｅｔｈｏｄ）を用いて確認した。ｐＳＬ４２とｐｓＬ４
３由来のＥｃｏ ＲＩ −Ｐｓｉ Ｉ ＨＩ Ｖ断片を
、ｐＡＯ８［１７０ＥｃｏＲ，Ｉ部位にライゲーション
することによりｐＳＬ４４が作製された後、ｐＳＬ４４
から鋳型を調製した。この鋳型のＰｓｔＩ部位を通る配
列は、オリゴヌクレオチド： ５’ −ＣＡＡ ＧＣＡ ＧＣＣＡＴＧ ＣＡＡ ＡＴ
Ｇ ＴＴ−３’を用いて確認した。
の２０μｌ希釈プレートから６コロニーずつを、上記の
方法（多重感染したＪＭ１０３細胞の上清のポリエチレ
ン・グリコール沈殿と、それに続けたフェノールとクロ
ロホルムによる脱タンパク質と、ＤＮＡのエタノール沈
殿を含む）により一本鎖鋳型ＤＮＡを調製するのに用い
た。Ｎ端変異作製の配列は、次の配列のオリゴヌクレオ
チドを用いて： ５’ −ＣＡＣＣＡＡ ＧＧＡ ＡＧＣＴＴＴ ＡＧ
Ａ Ｃ−３’またＣ端変異作製の配列は次の配列のオリ
ゴヌクレオチドを用いて： ５’ −ＣＧＡ ＡＣＣＣＡＧ ＡＴＴ ＧＴＡ Ａ
ＧＡ ＣＴＡ−３’サンガ（Ｓａｎｇｅｒ（１９７７）
）の鎖停止法（ｃｈａｉｎｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｍ
ｅｔｈｏｄ）を用いて確認した。ｐＳＬ４２とｐｓＬ４
３由来のＥｃｏ ＲＩ −Ｐｓｉ Ｉ ＨＩ Ｖ断片を
、ｐＡＯ８［１７０ＥｃｏＲ，Ｉ部位にライゲーション
することによりｐＳＬ４４が作製された後、ｐＳＬ４４
から鋳型を調製した。この鋳型のＰｓｔＩ部位を通る配
列は、オリゴヌクレオチド： ５’ −ＣＡＡ ＧＣＡ ＧＣＣＡＴＧ ＣＡＡ ＡＴ
Ｇ ＴＴ−３’を用いて確認した。
ｐｓＬ４４Ａを作製するために、ｐＳＬ４２とｐＳＬ４
３の１０μｇのプラスミドＤＮＡをＥｃｏ ＲＩとＰｓ
ｔＩで４＝１過剰量で消化した。５’ｐ２４断片は〜２
４０ ｂｐ Ｅｃｏ ＲＩ−Ｐｓｔ Ｉ断片； ３’ｐ
３４断片は〜４６ Ｑ ｂｐ Ｐｓｔ Ｉ−ＥｃｏＲ
，Ｉ断片であった。断片は５％ポリアクリルアミド・ゲ
ルから、ＤＮＡＱ含むゲル小片からの拡散により回収し
た。１０μｌのプラスミドｐＡＯ８０７をＥｃｏＲＩで
消化し、末端をホスファターゼ処理し、ベクターと２つ
のｐ２４をコードしている断片を６種ライゲーションに
より連結した。ライゲーション混合物はＭＣ１０６１細
胞に形質転換し、ａｍｐ ｒ細胞を同定した。形質転換
体に対し、プラスミド微量調製を行い、消化と、８％ア
ガロースでの電気泳動により正しいプラスミドを同定し
た；これをｐｓＬ４４Ａと呼んだ。
３の１０μｇのプラスミドＤＮＡをＥｃｏ ＲＩとＰｓ
ｔＩで４＝１過剰量で消化した。５’ｐ２４断片は〜２
４０ ｂｐ Ｅｃｏ ＲＩ−Ｐｓｔ Ｉ断片； ３’ｐ
３４断片は〜４６ Ｑ ｂｐ Ｐｓｔ Ｉ−ＥｃｏＲ
，Ｉ断片であった。断片は５％ポリアクリルアミド・ゲ
ルから、ＤＮＡＱ含むゲル小片からの拡散により回収し
た。１０μｌのプラスミドｐＡＯ８０７をＥｃｏＲＩで
消化し、末端をホスファターゼ処理し、ベクターと２つ
のｐ２４をコードしている断片を６種ライゲーションに
より連結した。ライゲーション混合物はＭＣ１０６１細
胞に形質転換し、ａｍｐ ｒ細胞を同定した。形質転換
体に対し、プラスミド微量調製を行い、消化と、８％ア
ガロースでの電気泳動により正しいプラスミドを同定し
た；これをｐｓＬ４４Ａと呼んだ。
（第３図参照）
実施例■
ピキア・パストリスの形質転換
■、ベクター調製
２０μｇのプラスミドｐＳＬ４４をＢｇｌＩＩで完全に
消化した。
消化した。
プラスミドの完全消化は。８％アガロース・ゲル電気泳
動により決定した。消化混合物は、合衆国農業省（Ｄｅ
ｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）の
北部地域研究センター（Ｎｏｒｔｈｅｎｎ Ｒｅｇｉｏ
ｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ）に寄託番号Ｎ
ＲＩ’（Ｌ Ｙ−１５８５１で寄託されているピキア
・パストリスＧＳ１１５株（ｈｉｓ４”−）を形質転換
するのに用いた。ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝
子を含むベクターによる形質転換はヒスチジン系路にお
けるこの欠損を相補し、ＧＳ１１５形質転換細胞な出Ｓ
＋に変える。従って形質転換体のスクリーニングは、形
質転換後細胞をヒスチジンを欠（生育環境で培養し、こ
の条件下で生育可能な細胞を回収することにより容易に
行うことができる。
動により決定した。消化混合物は、合衆国農業省（Ｄｅ
ｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）の
北部地域研究センター（Ｎｏｒｔｈｅｎｎ Ｒｅｇｉｏ
ｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ）に寄託番号Ｎ
ＲＩ’（Ｌ Ｙ−１５８５１で寄託されているピキア
・パストリスＧＳ１１５株（ｈｉｓ４”−）を形質転換
するのに用いた。ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝
子を含むベクターによる形質転換はヒスチジン系路にお
けるこの欠損を相補し、ＧＳ１１５形質転換細胞な出Ｓ
＋に変える。従って形質転換体のスクリーニングは、形
質転換後細胞をヒスチジンを欠（生育環境で培養し、こ
の条件下で生育可能な細胞を回収することにより容易に
行うことができる。
Ｉｌ、 細胞の生育
ピキア・バストリスＧＳ １１５ （ＮＲＲＬＹ−１５
８５１） を約１０ｍ１のＹＰＤ培地に植菌し、６０
℃で１２−２０時間振盪培養した。１ＱＱｍｌのＹＰＤ
培地に種培養を０Ｄ６ｏｏが約ｏ、ｏｏｉになるよう植
菌した。培地は６０℃で振盪フラスコ中で約１２．−２
０時間培養した。培養は０Ｄ６ｏ。
８５１） を約１０ｍ１のＹＰＤ培地に植菌し、６０
℃で１２−２０時間振盪培養した。１ＱＱｍｌのＹＰＤ
培地に種培養を０Ｄ６ｏｏが約ｏ、ｏｏｉになるよう植
菌した。培地は６０℃で振盪フラスコ中で約１２．−２
０時間培養した。培養は０Ｄ６ｏ。
が約０．２’−０，３になった時（約１６−２０時間後
）、ＩＥＣＤＰＲ６０００遠心機を用いて、３０００ｒ
ｐｍｓで５分間遠心することにより集菌した。
）、ＩＥＣＤＰＲ６０００遠心機を用いて、３０００ｒ
ｐｍｓで５分間遠心することにより集菌した。
ＩＪｌ、 スフェロプラストの調製
細胞を１回１０１ｎｌの滅菌水で洗い、次に３００Ｏｒ
ｐｍで５分間遠心した。（特に記していない場合は、遠
心は各細胞洗浄の１ＩＥｃＤＰＲ６０００を用いて３０
０Ｄｒｐｍｓで５分間行った。）次に細胞を１０ｍ１の
新しく調製したＳＥＤで１回洗い、１０ｍ１の滅菌１Ｍ
ンルビトールで洗い、最後に１Ｑ ｍｌのＳＣＥ緩衝液
に再懸濁した。１０μｌのザイモリアーゼ（ＺＹｍＯｌ
ｙａＳｅＸｌｏｏ、０００ ！＝ット／ｇをマイルス・
ラボラトリーズ（ＭｉｌｅｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
）から人手）の４ ｍｇ ／ ｍｌ溶液を加えた。
ｐｍで５分間遠心した。（特に記していない場合は、遠
心は各細胞洗浄の１ＩＥｃＤＰＲ６０００を用いて３０
０Ｄｒｐｍｓで５分間行った。）次に細胞を１０ｍ１の
新しく調製したＳＥＤで１回洗い、１０ｍ１の滅菌１Ｍ
ンルビトールで洗い、最後に１Ｑ ｍｌのＳＣＥ緩衝液
に再懸濁した。１０μｌのザイモリアーゼ（ＺＹｍＯｌ
ｙａＳｅＸｌｏｏ、０００ ！＝ット／ｇをマイルス・
ラボラトリーズ（ＭｉｌｅｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
）から人手）の４ ｍｇ ／ ｍｌ溶液を加えた。
次に細胞を６０℃で約６０分保温した。スフェロプラス
トを１５００ｒｐｍｓで１０分間遠心することにより、
１０〃＋ｌの滅菌１Ｍソルビトール中で２回洗った。１
Ｑ＋＋＋ｌの滅菌ＣａＳを最後の細胞洗浄液として用い
、再び細胞を１５００ｒｐｍｓで１０分間遠心し、Ｑ、
６ｍｌのＣａＳに再懸濁した。
トを１５００ｒｐｍｓで１０分間遠心することにより、
１０〃＋ｌの滅菌１Ｍソルビトール中で２回洗った。１
Ｑ＋＋＋ｌの滅菌ＣａＳを最後の細胞洗浄液として用い
、再び細胞を１５００ｒｐｍｓで１０分間遠心し、Ｑ、
６ｍｌのＣａＳに再懸濁した。
■、形質転換
ＧＳ１１５細胞を０．５，１．５．１０Ｌｇのプラスミ
ドＤＮＡ消化物で形質転換した。ＤＮＡ試料を１００μ
ｌのスフェロプラストに加え、室温に約２０分間保温し
た。１ＴＬｌのＰＥＧ溶液を各試料に加え、室温に約１
５分間保温した。
ドＤＮＡ消化物で形質転換した。ＤＮＡ試料を１００μ
ｌのスフェロプラストに加え、室温に約２０分間保温し
た。１ＴＬｌのＰＥＧ溶液を各試料に加え、室温に約１
５分間保温した。
■、スフェロプラストの再生
プレートあたり１０ｍ１の再生寒天の下部寒天層を、形
質転換の試料が用意される少なくとも６０分前に流し込
んだ。これに加え、１０ｍ１Ｊの再生寒天を５５°Ｃの
水浴に入れた５０ｍ１の円錐型の底のコーニングチュー
ブに分注した。１０または９９０μｌの形質転換試料を
５５℃に保った溶けた再生寒天１０ｍ１に加え、固化し
た下部寒天層を含むプレートの上に流し込んだ。プレー
トは３０°Ｃで６−５日間保温した。
質転換の試料が用意される少なくとも６０分前に流し込
んだ。これに加え、１０ｍ１Ｊの再生寒天を５５°Ｃの
水浴に入れた５０ｍ１の円錐型の底のコーニングチュー
ブに分注した。１０または９９０μｌの形質転換試料を
５５℃に保った溶けた再生寒天１０ｍ１に加え、固化し
た下部寒天層を含むプレートの上に流し込んだ。プレー
トは３０°Ｃで６−５日間保温した。
■、形質転換体の選択
形質転換体はヒスチジンを欠（培地である再生寒天上で
培養することにより選択された。Ｈｉｓ＋のコロニーを
同定し、さらに以下の方法で適当なＭｕｔ−の表現型に
関してスクリーニングした。滅菌蒸留水の存在下でプレ
ートの表面をかきとることにより、形質転換体をプール
し、低出力で１５秒間超音波処理した。次にそれらをＡ
６００ ”’ ０−１まで希釈し、０．２％クルコース
を炭素源として含む最少プレートの上に１０−３と１０
−４の希釈で重複してプレートし、３０℃で１．５ ＝
２日間保温した。
培養することにより選択された。Ｈｉｓ＋のコロニーを
同定し、さらに以下の方法で適当なＭｕｔ−の表現型に
関してスクリーニングした。滅菌蒸留水の存在下でプレ
ートの表面をかきとることにより、形質転換体をプール
し、低出力で１５秒間超音波処理した。次にそれらをＡ
６００ ”’ ０−１まで希釈し、０．２％クルコース
を炭素源として含む最少プレートの上に１０−３と１０
−４の希釈で重複してプレートし、３０℃で１．５ ＝
２日間保温した。
次にそれらを０．５％メタノールを炭素源として含む最
少プレートの上にレプリカした。６０℃で一夜保温した
後、１８／７５（２４％）の形質転換体はメタノール上
で残りの形質転換体より遅く生育することが明らかであ
った。ｐｓＬ４４由来のＢｇｌｌ（断片でＡＯＸ１遺伝
子が置換されることにより予想されるゲノムのサザン・
プロット上の断片のパターンはこれらの株のうちのい（
つかで示された。
少プレートの上にレプリカした。６０℃で一夜保温した
後、１８／７５（２４％）の形質転換体はメタノール上
で残りの形質転換体より遅く生育することが明らかであ
った。ｐｓＬ４４由来のＢｇｌｌ（断片でＡＯＸ１遺伝
子が置換されることにより予想されるゲノムのサザン・
プロット上の断片のパターンはこれらの株のうちのい（
つかで示された。
これらの株の１つはＧ−ＧＡＧ４４と名付げられた。
実施例■
（３−ＧＡＵ４４の発酵
１０Ｌの発酵几ｕｎ＃３５８は次のように行われた。フ
ァーンパックーフラ、ｚ、 コ（Ｆｅｒｎｂａｃｋ Ｆ
ｌｏｓｋ）中の５００ｍ１の緩衝されたナイトロジェン
ベース（Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａ５ｅ）（ＹＮＢ ）
−２％グリセロールに、種培養または最少グルコースプ
レートの培養から植菌した。２００ｒｐｍで６０°Ｃで
１日間振盪した後、植菌液を７リツトルの４８０ｇのグ
リセロール、４０ｍ９のビオチン、４０ｍ１の微量゛類
類溶液を含む最少培地に植えた。培養がバッチ・モード
でグリセロールが枯渇するまで（約２４時間）生育する
間、発酵液は６０℃、ｐＨ５，５に維持された。
ァーンパックーフラ、ｚ、 コ（Ｆｅｒｎｂａｃｋ Ｆ
ｌｏｓｋ）中の５００ｍ１の緩衝されたナイトロジェン
ベース（Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａ５ｅ）（ＹＮＢ ）
−２％グリセロールに、種培養または最少グルコースプ
レートの培養から植菌した。２００ｒｐｍで６０°Ｃで
１日間振盪した後、植菌液を７リツトルの４８０ｇのグ
リセロール、４０ｍ９のビオチン、４０ｍ１の微量゛類
類溶液を含む最少培地に植えた。培養がバッチ・モード
でグリセロールが枯渇するまで（約２４時間）生育する
間、発酵液は６０℃、ｐＨ５，５に維持された。
ｐＨはＮＨ３ガスを加えることにより調節された。
グリセロールの枯渇は、ＣＯ２放出の急激な減少と、溶
解酸素の急激な上昇（または酸素吸収速度の低下）によ
り知る。メタノール供給は発酵液のレベルが〜Ｑ、５％
ＭｅＯＨまでにするように９ｍｌ／ｈで開始し、実際の
ＭｅＯＨ消費速度に基づいて、このレベルを維持するよ
うに調節した。４０ｍ１の微量塩類を、メタノール消費
速度を維持するために約２日間融で加えた。
解酸素の急激な上昇（または酸素吸収速度の低下）によ
り知る。メタノール供給は発酵液のレベルが〜Ｑ、５％
ＭｅＯＨまでにするように９ｍｌ／ｈで開始し、実際の
ＭｅＯＨ消費速度に基づいて、このレベルを維持するよ
うに調節した。４０ｍ１の微量塩類を、メタノール消費
速度を維持するために約２日間融で加えた。
実施例■
細胞をアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）ろ過装置を用いて、発
酵培地から取り出し、破砕緩衝液（１０ｍＭＮａＰＯ４
，ｐＨ７，５，１５０ｍＭＮａＣ４５ｍＭ Ｅｌ）ＴＡ
、 １ｍＭＰＭｓＦ）で洗った。約１６００．９の細胞
を、全容量６．４リツトルの緩衝液中で定流ビーズミル
（ｃｏｎｔ １ｎｕｏｕｓ−ｆ ｌｏｗ ｂｅａｄｍｉ
ｌ ｌ ）（Ｄｙｎｏｍｉ Ｉ Ｉ）で破砕した。こ
うしてできた細胞溶菌液は７７００Ｘｇで遠心し、この
遠心の上清をｐＨ５に調整し、さらに１７．０ＯＯＸ、
９で遠心した。この遠心の上清をｐＨ７に調整し、２つ
の０．４５μｍフィルターを通して滅菌したポリスチレ
ンのコンテナ中にろ過した。
酵培地から取り出し、破砕緩衝液（１０ｍＭＮａＰＯ４
，ｐＨ７，５，１５０ｍＭＮａＣ４５ｍＭ Ｅｌ）ＴＡ
、 １ｍＭＰＭｓＦ）で洗った。約１６００．９の細胞
を、全容量６．４リツトルの緩衝液中で定流ビーズミル
（ｃｏｎｔ １ｎｕｏｕｓ−ｆ ｌｏｗ ｂｅａｄｍｉ
ｌ ｌ ）（Ｄｙｎｏｍｉ Ｉ Ｉ）で破砕した。こ
うしてできた細胞溶菌液は７７００Ｘｇで遠心し、この
遠心の上清をｐＨ５に調整し、さらに１７．０ＯＯＸ、
９で遠心した。この遠心の上清をｐＨ７に調整し、２つ
の０．４５μｍフィルターを通して滅菌したポリスチレ
ンのコンテナ中にろ過した。
最終試料中のｐ ２４ ｇａｇの量はウェスタン・プロ
ッティングで約２０２０−３Ｏ，＃であると見積られた
。全タンパク濃度はＴＣＡローＩＪ −（Ｌｏｗｒｙ）
法で６．８５ｆｌ／ｌであると決定された。従って、試
料中のｐ２４ｇａｇの最終濃度は全細胞タンパク質の約
０．５−０．７５％であった。我々はこの操作の収率は
、最終細胞試料の１０［］ＯＤ分の手作業の破砕からの
量に比べ約３３−５０％であると見積った。
ッティングで約２０２０−３Ｏ，＃であると見積られた
。全タンパク濃度はＴＣＡローＩＪ −（Ｌｏｗｒｙ）
法で６．８５ｆｌ／ｌであると決定された。従って、試
料中のｐ２４ｇａｇの最終濃度は全細胞タンパク質の約
０．５−０．７５％であった。我々はこの操作の収率は
、最終細胞試料の１０［］ＯＤ分の手作業の破砕からの
量に比べ約３３−５０％であると見積った。
実施例■
生産物の分析
最終滅菌ろ液中ｐ２４ ｇａｇの量はＣｅｎｔｏｃｏｒ
の３５−ｋｄ融合タンパク質、ＰＯ２を標準に用いて［
Ｇｈｒａｙｅｂら（１９８６）ＤＮＡ５：９３−９９）
ウェスタン・プロットで見積った；バイオネティッグヌ
・・リサーチ（Ｂｉｏｎｅｔｉｃｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
）、Ｉｎｃ。
の３５−ｋｄ融合タンパク質、ＰＯ２を標準に用いて［
Ｇｈｒａｙｅｂら（１９８６）ＤＮＡ５：９３−９９）
ウェスタン・プロットで見積った；バイオネティッグヌ
・・リサーチ（Ｂｉｏｎｅｔｉｃｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
）、Ｉｎｃ。
（Ｒｏｃｋｖ ｉ ｌ ｌ ｅ 、Ｍ Ｄ ）のウィル
ス抽出物に対するウサギ抗血清の１ ：１２５０希釈液
と、１２５■−プロティンＡにニュー・イングランド・
ニュークリアー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕ４Ｊ：
ｅａゆを検出に用いた。
ス抽出物に対するウサギ抗血清の１ ：１２５０希釈液
と、１２５■−プロティンＡにニュー・イングランド・
ニュークリアー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕ４Ｊ：
ｅａゆを検出に用いた。
前の実施例の６液はレムリ（Ｌａｅｒｒｒｎｌ １）（
ＩＪＫ）Ｎａｔｕｒｅ ２２７：６８０−６８５（１９
７０）のプロトコールに従ったポリアクリルアミド・レ
ムリ・ゲルにかけた。次にトウビニｙ （Ｔｏｗｂｉｎ
）ら、Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃａｄ８ｃｉＵＳＡ、７６
：４３５０−４３５４（１９７９）のプロトコールに従
って、３ Ｑ Ｑ ｍＡｍｐ ｓ定電流での１１／２−
２時間の電気泳動によって、ゲルから４５ ／−１ｍ
ノニトロセルロース・フィルターの上にエレクトロ・プ
ロッティングした。次にフィルターを、エレクトロ・プ
ロットから外し、ウェスタン緩衝液中で１時間保温した
。次にウェスタン緩衝液で希釈した抗体を加え、振盪機
の上で低温室に一装置いた。フィルターをウェスタン緩
衝液中で、各洗浄１５分間ずつ、４回洗浄した。次にフ
ィルターを ■プロティンＡと１．５μＣ１１２５Ｉ
−プロティンＡ／レーンで４５分間保温した。フィルタ
ーを再びウェスタン緩衝液中で、各洗浄１５分間ずつ、
４回洗浄し、コダックＸ −ＯＭＡＴＡＩＦｔフィルム
に露光した。
ＩＪＫ）Ｎａｔｕｒｅ ２２７：６８０−６８５（１９
７０）のプロトコールに従ったポリアクリルアミド・レ
ムリ・ゲルにかけた。次にトウビニｙ （Ｔｏｗｂｉｎ
）ら、Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃａｄ８ｃｉＵＳＡ、７６
：４３５０−４３５４（１９７９）のプロトコールに従
って、３ Ｑ Ｑ ｍＡｍｐ ｓ定電流での１１／２−
２時間の電気泳動によって、ゲルから４５ ／−１ｍ
ノニトロセルロース・フィルターの上にエレクトロ・プ
ロッティングした。次にフィルターを、エレクトロ・プ
ロットから外し、ウェスタン緩衝液中で１時間保温した
。次にウェスタン緩衝液で希釈した抗体を加え、振盪機
の上で低温室に一装置いた。フィルターをウェスタン緩
衝液中で、各洗浄１５分間ずつ、４回洗浄した。次にフ
ィルターを ■プロティンＡと１．５μＣ１１２５Ｉ
−プロティンＡ／レーンで４５分間保温した。フィルタ
ーを再びウェスタン緩衝液中で、各洗浄１５分間ずつ、
４回洗浄し、コダックＸ −ＯＭＡＴＡＩＦｔフィルム
に露光した。
Ｐ、パストリス株Ｇ−ＧＡＧ４４に対するウェスタン・
プロットで約８０−９０ ｋｄ、３９ｋｄ、２７ｋｄ。
プロットで約８０−９０ ｋｄ、３９ｋｄ、２７ｋｄ。
２４ｋｄに泳動される免疫反応するバンドが検出された
。６つの大きい分子種は形質転換されていない細胞の抽
出液にも存在し、従って明らかにＨ工■ｇａｇ ｐ２４
以外の抗原に対する交差反応を表している。我々はｐ
２４． ｇａｇの濃度を全細胞タンパク質の０．５から
０．７５％の間であると見積った。
。６つの大きい分子種は形質転換されていない細胞の抽
出液にも存在し、従って明らかにＨ工■ｇａｇ ｐ２４
以外の抗原に対する交差反応を表している。我々はｐ
２４． ｇａｇの濃度を全細胞タンパク質の０．５から
０．７５％の間であると見積った。
本実施例は単に本発明の詳細な説明するために挙げたも
のであり、いかなる意味においても本発明、または添付
の特許請求の範囲を制限するものとして読まれるべきで
はない。本発明の本質や精神を外れない合理的な変更や
修飾は、希望し、請求している特許の範囲内であること
を意図している。
のであり、いかなる意味においても本発明、または添付
の特許請求の範囲を制限するものとして読まれるべきで
はない。本発明の本質や精神を外れない合理的な変更や
修飾は、希望し、請求している特許の範囲内であること
を意図している。
第１図は、ＨＩＶの２４ｋＤａ ｇａｇ遺伝子を含む
、ＨｉＶのＢｃｏＲＩ ／ Ｃ１ａ Ｉ断片の制限酵素
地図を示している。 第２図は、プラスミドｐｓＬ４４Ａの作製の流れ図を示
している。 第３図は、プラスミドｐｓＬ４４Ａの説明を示している
。ｐｓＬ４４は、Ｆｌ−ｏｒｉの挿入と唯一のＢｃｏＲ
Ｉ部位にＨＩ Ｖ ２４ｋＤａ構造遺伝子の挿入により
修飾されたｐＡＯ８０４の誘導体である。
、ＨｉＶのＢｃｏＲＩ ／ Ｃ１ａ Ｉ断片の制限酵素
地図を示している。 第２図は、プラスミドｐｓＬ４４Ａの作製の流れ図を示
している。 第３図は、プラスミドｐｓＬ４４Ａの説明を示している
。ｐｓＬ４４は、Ｆｌ−ｏｒｉの挿入と唯一のＢｃｏＲ
Ｉ部位にＨＩ Ｖ ２４ｋＤａ構造遺伝子の挿入により
修飾されたｐＡＯ８０４の誘導体である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ＨＩＶ２４ｋＤａ ￥ｇａｇ￥タンパク質を生産す
る方法であって、 ａ）ＨＩＶ２４ｋＤａ ￥ｇａｇ￥タンパク質の構造遺
伝子に、機能可能であるように連結した制御領域と、３
′終結配列を含んだ発現カセットを少なくとも一つ持っ
たベクター少なくとも一つで、メチロトローフ酵母を形
質転換し、その後 ｂ）結果としてできた形質転換された酵母株を、該ＨＩ
Ｖ２４ｋＤａタンパク質の生産を得るのに適切な条件下
で培養する、ことからなる上記方法。 ２、該ベクターがプラスミド、もしくは線状の組込み部
位特異的ベクターから成る群から選択される、特許請求
の範囲第１項記載の方法。 ３、ベクターが線状の組込み、部位特異的ベクターであ
る、特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４、該線状の組込み部位特異的ベクターが次に挙げる一
連の配列、 ａ）第１の挿入可能なＤＮＡ断片 ｂ）マーカー遺伝子を少なくとも一つ、及びＨＩＶ２４
ｋＤａｇａｇタンパク質の構造遺伝子に機能可能である
ように連結した制御領域と３′終結配列を含んだ発現カ
セット少なくとも一つ、そして ｃ）第２の挿入可能なＤＮＡ断片 を含み、構成物（ｂ）のマーカー遺伝子とカセットの順
序が交換可能な特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５、第１の挿入可能なＤＮＡ断片と第２の挿入可能なＤ
ＮＡ断片がピキア・パストリス（￥Ｐｉｃｈｉａ￥ ￥
ｐｏｓｔｏｒｉｓ￥）から単離されたＤＮＡ配列由来で
、￥ＡＯＸ１￥、ｐ４０、￥ＤＨＡＳ￥と￥ＨＩＳ４￥
から成るグループから選択される、特許請求の範囲第４
項記載の方法。 ６、該発現カセットが ａ）機能可能であるように下記（ｂ）と連結した、ピキ
ア・パストリスから単離された￥ＡＯＸ１￥、ｐ４０、
￥ＤＨＡＳ￥とサッカロミセス・セレビシエ（￥Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ￥ ￥ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ￥）
から単離された酸性ホスファターゼ、ガラクトキナーゼ
、アルコールデヒドロゲナーゼ、シトクロムＣ、アルフ
ァー接合因子、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲ
ナーゼから成るグループから選択された制御領域 ｂ）機能可能であるように下記（ｃ）と連結したＨＩＶ
２４ｋＤａ￥ｇａｇ￥タンパク質の構造遺伝子、 ｃ）￥ＡＯＸ１￥遺伝子、ｐ４０遺伝子、￥ＤＨＡＳ￥
遺伝子、￥ＨＩＳ４￥遺伝子から単離された３′終結配
列より成るグループから選択した、ピキア・パストリス
由来の３′終結配列 から成る、特許請求の範囲第４項記載の方法。 ７、該マーカー遺伝子が、ピキア・パストリスから単離
された￥ＨＩＳ４￥と￥ＡＲＧ４￥、サッカロミセス・
セレビシエから単離されたＳＵＣ＿２、￥Ｔｎ９０３￥
と￥Ｔｎ６０１￥のＧ４１８＾Ｒ遺伝子から成るグルー
プから選択される、特許請求の範囲第４項記載の方法。 ８、該ベクターが ａ）機能可能であるように下記（ｂ）と連結した、ピキ
ア・パストリスから単離された５′￥ＡＯＸ１￥制御領
域の約１キロベースの第１の挿入可能なＤＮＡ断片、 ｂ）機能可能であるように下記（ｃ）と連結した、ＨＩ
Ｖ２４ｋＤａ ￥ｇａｇ￥タンパク質の構造遺伝子、 ｃ）下記ｄ）と結合した、ピキア・パストリスから単離
した￥ＡＯＸ１￥の３′終結配列、 ｄ）下記ｅ）と結合した、ピキア・パストリスから単離
した￥ＨＩＳ４￥のマーカー遺伝子少なくとも１つ、お
よび ｅ）３′￥ＡＯＸ１￥結配列の約０．８５キロベースの
第２の挿入可能なＤＮＡ断片、 より成る、特許請求の範囲第４項記載の方法。 ９、次に挙げる一連の配列、 ａ）第１の挿入可能なＤＮＡ断片 ｂ）マーカー遺伝子を少なくとも１つ、及びＨＩＶ２４
ｋＤａ ￥ｇａｇ￥タンパク質の構造遺伝子に機能可能
であるように連結した制御領域と３′終結配列を含んだ
発現カセットを少なくとも１つ、そして ｃ）第２の挿入可能なＤＮＡ断片 から成る、線状の挿入型部位特異的ベクターで、構成物
（ｂ）のマーカー遺伝子とカセットの順序が交換可能な
上記ベクター。 １０、該第１の挿入可能なＤＮＡ断片と同第２の断片が
、￥ＡＯＸ１￥、ｐ４０、￥ＤＨＡＳ￥、￥ＨＩＳ４￥
から成るグループから選択されるピキア・パストリスか
ら単離された遺伝子のＤＮＡ配列由来である、特許請求
の範囲第９項記載のベクター。 １１、該発現カセットが、 ａ）機能可能であるように下記ｂ）と連結した、ピキア
・パストリスから単離された￥ＡＯＸ１￥、ｐ４０、￥
ＤＨＡＳ￥、￥ＨＩＳ４￥と、サッカロミセス・セレビ
シエから単離された酸性ホスファターゼ、ガラクトキナ
ーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、シトクロムＣ、ア
ルファー接合因子、グリセルアルデヒド３リン酸デヒド
ロゲナーゼから成るグループから選択された制御領域、 ｂ）機能可能であるように下記ｃ）と連結した、ＨＩＶ
２４ｋＤａ￥ｇａｇ￥タンパク質の構造遺伝子、 ｃ）ピキア・パストリスから単離された、 ￥ＡＯＸ１￥遺伝子、ｐ４０遺伝子、￥ＤＨＡＳ￥遺伝
子、ＨＩＳ４遺伝子から単離した、３′終結配列より成
るグループから選択された３′終結配列から成る、特許
請求の範囲第９項記載のベクター。 １２、該マーカー遺伝子が、ピキア・パストリウスから
単離された￥ＨＩＳ４￥、￥ＡＲＧ４￥、サッカロミセ
ス・セレビシエから単離した￥ＳＵＣ２￥、細菌のＴｎ
９０３とＴｎ６０１のＧ４１８＾Ｒから成るグループか
ら選択される、特許請求の範囲第９項記載のベクター。 １３、該ベクターが、 ａ）機能可能であるように下記ｂ）と連結した、ピキア
・パストリスから単離された、長さ約１キロベースの、
５′￥ＡＯＸ１￥遺伝子の機能可能な制御領域である第
１の挿入可能なＤＮＡ断片、 ｂ）機能可能であるようにｃ）と連結したＨＩＶ２４ｋ
Ｄａ￥ｇａｇ￥タンパク質の構造遺伝子、 ｃ）下記ｄ）と結合した、ピキア・パストリスから単離
した￥ＡＯＸ１￥の３′終結配列、 ｄ）下記ｅ）と結合した、ピキア・パストリスから単離
した￥ＨＩＳ４￥のマーカー遺伝子少なくとも１つ ｅ）３′￥ＡＯＸ１￥終結配列の約０．８５キロベース
の第２の挿入可能なＤＮＡ断片、 より成る、特許請求の範囲第９項記載のベクター。 １４、３′終結配列に機能可能であるように連結したＨ
ＩＶ２４ｋＤａ ￥ｇａｇ￥タンパク質の構造遺伝子に
、機能可能であるように連結した制御領域より成る発現
カセットを少なくとも１つ含んだベクター少なくとも一
つで形質転換したメチロトローフ酵母。 １５、酵母がピキア・パストリスである、特許請求の範
囲第１４項記載のメチロトローフ酵母。 １６、酵母がピキア・パストリスＧＳ１１５株である、
特許請求の範囲第１４項記載のメチロトロフィック酵母
。 １７、該ＧＳ１１５が、 ａ）第１の挿入可能なＤＮＡ断片 ｂ）機能可能であるように下記ｃ）と連結した、マーカ
ー遺伝子を少なくとも１つ及びＨＩＶ２４ｋＤａ ￥ｇ
ａｇ￥タンパク質の構造遺伝子を含むピキアに適合した
発現カセットを少なくとも１つ、 ｃ）ピキア・パストリスから単離した￥ＡＯＸ１￥遺伝
子、ｐ４０遺伝子、￥ＤＨＡＳ￥遺伝子、￥ＨＩＳ４￥
遺伝子から単離した３′終結配列から成るグループから
選択した３′終結配列、 ｄ）第２の挿入可能なＤＮＡ断片、 の一連の配列である線状の挿入型、部位特異的ベクター
で、構成物（ｂ）のマーカー遺伝子とカセットの順序が
交換可能な上記ベクター少なくとも一つで形質転換され
た、特許請求の範囲第１６項記載のピキア・パストリス
ＧＳ１１５。 １８、該ベクターが ａ）機能可能であるように下記ｂ）と連結した、ピキア
・パストリスから単離した５′￥ＡＯＸ１￥制御領域の
約１キロベースである第１の挿入可能なＤＮＡ断片 ｂ）機能可能であるように下記ｃ）と連結した、ＨＩＶ
２４ｋＤａ￥ｇａｇ￥タンパク質の構造遺伝子、 ｃ）下記ｄ）と結合したピキア・パストリスから単離し
た￥ＡＯＸ１￥の３′終結配列、 ｄ）下記ｅ）と結合した、ピキア・パストリスから単離
した￥ＨＩＳ４￥であるマーカー遺伝子少なくとも１つ
、および ｅ）３′￥ＡＯＸ１￥終結配列の約６５キロベースであ
る第２の挿入可能なＤＮＡ断片、 から成る、特許請求の範囲第１７項記載の線状の部位特
異的組込みベクター。 １９、ピキア・パストリスＧ−ＧＡＧ４４。 ２０、該ＧＳ１１５株が前記線状組込み部位特異性ベク
ターのコピー一つ以上で形質転換されている、請求項１
７のように形質転換されたピキア・パストリスＧＳ１１
５。
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|---|---|---|---|
| US18640988A | 1988-04-25 | 1988-04-25 | |
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|---|---|
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| JP (1) | JPH0220286A (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| JP2023134312A (ja) * | 2022-03-14 | 2023-09-27 | Ｋｔｅｎ Ｂｉｏ株式会社 | 生体中や環境あるいは食品中に存在する微小物質の濃縮法 |
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- 1989-04-25 EP EP19890107462 patent/EP0339569A3/en not_active Withdrawn
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|---|---|---|---|---|
| JP2023134312A (ja) * | 2022-03-14 | 2023-09-27 | Ｋｔｅｎ Ｂｉｏ株式会社 | 生体中や環境あるいは食品中に存在する微小物質の濃縮法 |
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