JPH0220290A - トランス−４−シアノシクロヘキサンカルボン酸アミドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、トランス−４−シアノシクロヘキサンカルボ
ン酸アミドの新規な製造方法に関する。本発明の目的は
、抗潰瘍作用を有するトランス−４−アミノメチルシク
ロヘキサンカルボン酸アミドの製造原料として有用な次
式（ＩＩ） Ｎ ０ＮＨ２ で示されるトランス−４−シアノシクロヘキサンカルボ
ン酸アミドを工業的に、かつ、高収率で製造することに
ある。

（従来の技術） ４−シアノシクロヘキサン類については、特公昭５１−
１４５０６号公報に、次式（ビ）ＣＮ で示される１、４−ジシアノシクロヘキサンをアンモニ
ア水で加水分解して、次式（Ｉｌｌ）ＣＮ ＯＲ （式中、Ｒは水酸基またはアミノ基を表す。）で示され
る４−シアノシクロヘキサンカルボン酸、４−シアノシ
クロヘキサンカルボン酸アミドを含有する混合溶液を製
造する方法に関する記載がある。

また、本発明者らは、次式（ＩＶ） で示されるトランス−４−シアノシクロヘキサンカルボ
ン酸アミドを適当な溶媒中でアンモニアと反応させるこ
とにより、式（ＩＩ）の化合物を得ている。

（特願昭６１−１８００３５号） （発明が解決しようとする課題） 従来の製造方法は、すべて合成技術を用いる手法である
ため、高温高圧な反応条件を必要とする。また、副生物
が多く生成するので、目的物の単離生成工程が極めて煩
雑である。さらに、従来の製造法においては、トランス
体の原料からトランス−４−シアノシクロヘキサンカル
ボン酸アミドを立体配置を保持させて製造することば困
難である。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは、上記の課題を解決するため鋭意検討を重
ねた結果、常温常圧で、かつ、立体配置を保持させるこ
とができ、しかも、極めて効率の良い、微生物の生化学
的作用を利用する新規な製造方法を見出した。すなわち
、次式（１） で示されるトランス−１，４−ジシアノシクロヘキサン
から微生物の作用により、次式（１）で示されるトラン
ス−４−シアノシクロヘキサンカルボン酸アミドを製造
する方法である。

一般に、ニトリル基をカルボキシアミド基に変換する生
化学的作用、すなわち、酵素はニトリルヒＩ゛ラターゼ
として知られている。〔発酵と工業、第４１巻、３８２
〜３８８頁（１９８３年）〕しかし、シクロヘキサン環
を含むニトリル化合物を基質として対応するカルボン酸
アミドへ変換する反応は、全く知られていない。さらに
、式（１）の化合物の二つのニトリル基のうちの一方の
ニトリル基のみをカルボキシアミド基に立体配置を保持
したまま変換することも、全く知られていない。

そこで、本発明者らは、式（１）の化合物を弐（ＩＩ）
の化合物に変換する能力を持つ微生物を、土壌分離株お
よび公的保存株より探索し、該変換能力を持つ微生物を
発見し、本発明を完成するに至った。

次に、本発明の実施方法について説明する。

■使用菌株 本発明で使用される微生物を挙げれば、コリネバクテリ
ウム属、ロドコッカス属、シュードモナス属およびロド
シュードモナス属に属するものであり、これらの属に属
する具体的な菌株としては、京都市内の土壌より分離し
たコリネバクテリウム　エスピＣ５（微工研菌寄第８９
３１号）、および公的保存株としてロドコッカス　エス
ピー　ＡＴＣＣＩ９０７０、シュードモナスマルギナリ
ス　Ｉ　ＦＯ３９２５、ロドシュードモナス　スファエ
ロイデスＡＴＣＣ１１１６７である。土壌分譲株０５株
は、上記の番号で微工研に寄託されており、菌学的性質
は以下に示すとおりである。

（ａ）形態 １、細胞の形および大きさ；桿菌、０゜４〜０゜６Ｘ２
．５〜６．０μｍ０ ２、細胞の多形成の有無；長稈状（１日日）を呈し、ス
ナツピングを伴った発育をし、後（３日日）には短稈状
（０，４〜０．６Ｘ０．６〜１２　μｍ）に断裂する。

３、運動性の有無；無 ４、胞子の有無；無 ５、ダラム染色性；＋ ６、抗酸性； （ｂ）各培地における生育状態 １、肉汁寒天平板培養；直径１．０〜２．２ｍｍ円形、
平滑で乾き気味、半球状、白ないし淡ピンク色。

２、肉汁寒天斜面培養；生育中程度、平滑、乾き気味、
白ないし淡ピンク色。

３、肉汁液体培養；生育旺盛、中程度の濁り、生育に伴
い沈澱生成。

４、肉汁ゼラチン穿刺培養：表面によ 刺部にそって生育、液化無。

５、リドマス・ミルク；変化無 （ｃ）生理的性質 ■、硝酸塩の還元；− ２、脱窒反応； ３、ＭＲテスト； ４、ＶＰテスト； ５、インドールの生成； ６、硝化水素の生成； ７、デンプンの加水分解；− ８、クエン酸の利用 （イ）コーサーの培地； （ロ）クリステンセンの培地−十 ９、無機窒素源の利用 （イ）硝酸塩；＋ （ロ）アンモニウム塩；＋ １０、色素の生成 （イ）キングＡ培地： （ロ）キングＢ培地； く生育、 １１、ウレアーゼ；＋ １２、オキシダーゼ； １３、カタラーゼ；＋ １４、生育の範囲 （イ）ｐＨ；６〜１０ （口〕温度；工Ｏ〜３７℃ １５、酸素に対する態度；好気性 １６．０−Ｆテスト；〜 １７、Ｗ類から酸およびガスの生成七資化性１８．１０
％スキムミルク中、７２°Ｃ１１５分間の耐熱性；無 １９、オルニチン脱炭酸；＋ ２０、リジン脱炭酸； 以上の菌学的性質をバージ−の細菌分類書（ＢＥＲＧＹ
’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖ
ｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ第８版）および「マニュ
アル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー（Ｍａ
ｎｕａｌ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ旧ｃ’ｒ　。

ｂｉｏｌｏｇＶ　）第４版（１９８５年）」に基づいて
分類した。

０５株は、好気性、ダラム陽性、カタラーゼ陽性の内性
胞子を生じない桿菌であり、鞭毛を着生せず、発育の初
期は長稈状でスナツピングを伴って発育し、後に短稈状
に断裂することより、コリネ型細菌に属することは明ら
かである。また、セルロース分離能を持たないこと、ダ
ラム染色がバリアプルでないこと、１０％スキムミルク
、７２°Ｃ１１５分間の耐熱性がないこと、さらに、絶
対好気性でないこと、ＯＦテストが−であることより、
Ｃ５株はコリネバクテリウム属に属することは明らかで
ある。

０５株の種については、３７°Ｃで生育、酸素に対する
態度として好気性ではあるが、通性嫌気ともいえ、Ｏ−
Ｆテストが−、グルコースの資化性弱く、Ｄ−フラクト
ース、ショ糖、Ｄ−マンニントおよびエタノールを資化
し、硝酸還元能がなく、硫化水素を生成せず、コーサー
培地でクエン酸を資化せず、ウレアーゼ活性およびカタ
ラーゼ活性を持つことより、先に述べた分類書類から判
断すると、該当する種がない。よって、０５株はコリネ
バクテリウム属の新種と考えられる。

■反応方法 本発明における式（１）の化合物を式（ＩＩ）の化合物
に変換する反応方法としては、具体的には前記微生物を
式（１）の化合物の存在下に培養する方法と、微生物培
養物、さらにそこから集めた菌体または菌体処理物（例
えば、菌体の破砕物、菌体の有機溶媒処理物、または菌
体より分離抽出した酵素）と式（１）の化合物とを接触
させる方法の二つの方法がある。また、菌体、菌体処理
物または菌体から抽出された酵素を公知の方法、例えば
、セライト、アルギン酸カルシウム、カラギーナン等に
より固定化した後、式（Ｉ）の化合物と反応させてもよ
い。

■培養方法 本発明で使用される微生物の培養は、公知の方法に準じ
て行うことができる。使用する培地は、一般微生物の栄
養源として公知のものが利用でき、廃糖蜜、グルコース
、グリセリン、エタノール、シュークロース等の炭素源
、硫酸アンモニウムまたは尿素、塩化アンモニウム等の
窒素源、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン
等の有機栄養源、リン酸、マグネシウム、カリウム、鉄
、コバルト等の無機栄養源、ビタミン類を適宜組み合わ
せて使用できる。

また、微生物の式（１）の化合物から式（ＩＴ）の化合
物への変換活性を促進する物質として、アセトニトリル
、トランス−１，４−ジシアノシクロヘキサン等のシア
ノ化合物を添加してもよい。培地のｐＨは５〜１０の範
囲で選べばよく、培養温度は１８〜３８°Ｃ８好ましく
は２５〜３２°Ｃの温度がよい。培養日数は１〜８日の
範囲で活性が最大になるまで培養すればよい。

■反応条件 ■２ 反応媒体としては、水、緩衝液などの水性媒体、あるい
はメタノール、クロロホルム、塩化メチレン等の有ａ溶
媒と水との混合物が使用できる。反応媒体中へは、式（
１）の化合物を粉末のままで、あるいは適当な溶媒に溶
かして添加する。式（１）の化合物の添加濃度は０．０
１〜６０重量％程度、好ましくは１．０〜２０重量％で
ある。反応に菌体を使用する場合の菌体の濃度は、通常
０．１〜８重量％の範囲でよい。反応温度は４〜５０°
Ｃ１望ましくは１５〜３２°Ｃ１反応ｐ　Ｈは４〜１１
、好ましくは６゜５〜９．０である。反応時間は通常、
０．５〜１００時間の範囲で適当な時間選べばよい。消
費される式日）の化合物は、連続的にまたは間歇的に補
充して、反応液中の濃度が上記の範囲内に維持されるよ
うに添加してもよい。

■分離精製 生成された式（ＩＩ）の化合物は、反応終了液より菌体
等の不溶物を除去した後、公知の方法、例えば、溶媒抽
出あるいは晶析等により容易に高純度の結晶を得ること
ができる。

（発明の効果） 本発明を利用することにより、トランス−４−シアノシ
クロヘキサンカルボン酸アミドを常温常圧の反応条件下
で高濃度に生成させることができる。さらに、立体配置
を保持させて製造することができるので、経済上極めて
有用である。

（実施例） 次に、本発明を実施例をもって説明するが、この実施例
によって本発明が何ら限定されるものでＬｌない。

実施例１ 肉エキス１．０ｇ、ペプトン１．Ｏｇ、グルコース１．
０ｇ、トランス−１，４−ジシアノシクロヘキサン０．
５ｇ、リン酸二カリウム０．２ｇ、塩化すトリウム０．
１ｇ、硫酸マグネシウム０．０２ｇ、ビオチン塩酸塩１
μｇを含み、ｐ　Ｈを７．５とした殺菌培地１００　ｍ
ｇ、に、あらかじめ同培地で培養したロドコッカス　エ
スピー　ＡＴＣＣ１９０７０を植菌し、３０°Ｃで３日
間振盪培養した。培養液から遠心分離で菌体を除去した
後、その上清液に苛性ソーダを加えｐＨ１２，５に調整
し、次いで、クロロホルム１００ｍｆを加えて抽出を行
う。次いで、クロロボルム層を濃縮してトランス−４−
シアノシクロヘキサンカルボン酸アミドの結晶０．１２
ｇを得た。

本島は、高速液体クロマト分析で単一ピークを示した。

融点、ＴＲ，ＮＭＲ１元素分析を以下に示すが、これは
目的物の構造を支持する。

融点　１８９〜１９１°Ｃ ＩＲ（ＫＢｒ） ３３５５ｃｍ−’　（７＝ＮＩ−１） ３２００ｃｍ−’　（７−ＮＨ） ２２２０ｃｎｒ’　Ｃｒ　＝ＣＨ） １６６５印−’　（ｒ＝ｃｏ） ＮＭＲ（ＭｅＯＨ−ｄ’　、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ；　１
．２〜３．０　（ＩＯＨｌｍ）元素分析 理論値　　　　　分析値 Ｃ６３，１６％　　　６３．００％ Ｔ−１７，８９％　　　　７．９５％ Ｎ１８．４２％　　　１８．５０％ ０１０．５３％　　　１０．５５％ なお、高速液体クロマト分析は以下のようにして行った
。分析装置；ウォーターズ社製６０００Ａ型ポンプ、東
ソー製Ｒ１−８型示差屈折計、カラム；ツババックＣ−
１８（ウォーターズ社製）、溶媒；水／アセトニトリル
＝９５１５（容量比）　−１−Ｐ　Ｉ　Ｃ８４（ウォー
ターズ社製）１．５容量％。

実施例２ 肉エキス０．１ｇ、ペプトン０．１ｇ、グルコース０．
１ｇ、リン酸−カリウム０．０１ｇ、塩化すトリウム０
．０１ｇ、硫酸マグネシウム０．００５ｇ、硫酸第一鉄
０．００１ｇ、硫酸アンモニウム０゜０１ｇを含む、ｐ
Ｈを７，０とした殺菌培地１０ｍρに、あらかじめ同培
地で培養したコリネバクテリウム　エスピー　０５株を
植菌し、３０°Ｃで４０時間培養した。培養終了後、遠
心分離にて菌体を集め、これを水１０（１＋ｆｆｉの入
った三角フラスコ中に懸濁した後、トランス−１，４−
ジシアノシクロヘキサン２０ｇを加え、３０°Ｃで振盪
しながら反応させた。

８時間後に反応を終了し、高速液体クロマト分析を行っ
たところ、トランス−４−シアノシクロヘキサンカルボ
ン酸アミドが１６．４ｇ生成していた。

（転換率７２．４％） 以下、実施例１と同様の操作を行い、トランス４〜シア
ノシクロヘキサンカルボン酸アミドの結晶１４．０ｇを
得た。（収率６１．９％）木製品の物性データーは、実
施例１と同じく目的物の構造を支持した。

実施例３ 実施例１と同じ培地にシュードモナス　マルギナリス　
ＩＦ０３９２５を植菌し、３０°Ｃで３日間培養した後
、実施例１と同様の後処理を行い、トランス−４−シア
ノシクロヘキサンカルボン酸アミド０゜０８ｇを得た。

実施例４ 実施例１と同じ培地にロドシュードモナス　スファエロ
イデス　ＡＴＣＣ１１１６７を植菌し、３２°Ｃで３日
間培養した後、同様の後処理を行い、トランス−４−シ
アノシクロヘキサンカルボン酸アミド０．１５ｇを得た
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 次式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） で示されるトランス−１，４−ジシアノシクロヘキサン
   を次式（II） ▲数式、化学式、表等があります▼（II） で示されるトランス−４−シアノシクロヘキサンカルボ
   ン酸アミドに変換させる能力を有する微生物の作用によ
   り、トランス−１，４−ジシアノシクロヘキサンからト
   ランス−４−シアノシクロヘキサンカルボン酸アミドを
   生成させることを特徴とするトランス−４−シアノシク
   ロヘキサンカルボン酸アミドの製造方法。