JPH02124096A - トランス−４−シアノシクロヘキサンカルボン酸アミドの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、トランス−４−シアノシクロヘキサンカルボ
ン酸アミドの新規な製造法に関する。本発明の目的は、
抗潰瘍作用を有するトランス−４−アミノメチルシクロ
ヘキサンカルボン酸アミドの製造原料として有用な次式
（ｎ） ０ＮＨ２ で示されるトランス−４−シアノシクロヘキサンカルボ
ン酸アミドを工業的に高収率で、かつ、安定して製造す
ることにある。

（従来の技術） シアノシクロヘキサン類については、 次式 で示される１、４−ジシアノシクロヘキサンをアンモニ
ア水で加水分解して、次式（ＩＩＩ）Ｃ式中、Ｒは水酸
基またはアミノ基を表す。）で示される４−シアノシク
ロヘキサンカルボン酸、４−シアノシクロヘキサンカル
ボン酸アミドを含有する混合溶液を製造する方法に関す
る記載がある。

（特公昭５１−１４５０６号公報） さらに、微生物の生化学的作用により、次式（１）で示
されるトランス−１，４−ジシアノシクロヘキサンより
式゛（■）の化合物を製造する方法を本発明者らは、提
案した。（特願昭６３−１６７８２８号） （発明が解決しようとする課題） 従来の製造方法のうち、合成技術を用いる製造法におい
ては、高温高圧な反応条件を必要とする。また、副生成
物が多く生成するので、目的物の単離生成工程が極めて
煩雑である。さらに、トランス体の原料からトランス−
４〜シアノシクロヘキサンカルボン酸アミドを立体配置
を保持させて製造することは困難である。

一方、微生物の生化学的作用を用いる製造法は、常温常
圧の反応条件下でトランス体の原料からトランス−４−
シアノシクロヘキサンカルボン酸アミドを立体配置を保
持させて製造することができ、合成法に比べて有利であ
る。しかし、微生物を作用させる時間により、副生成物
である次式（Ｖ）Ｎ で示されるトランス−４−シアノシクロヘキサンカルボ
ン酸が混在し、これを取り除く精製工程が必要となり、
式（ＩＩ）の化合物を高収率に安定して製造するには、
いまだ十分なものではない。

（ＩＩＩを解決するための手段） 本発明者らは、上記の問題点を解決するため鋭意検討を
重ねた結果、常温常圧で、かつ、立体配置を保持させる
ことができ、しかも、極めて効率の良い、微生物の生化
学的作用を利用した製造法を確立した。

すなわち、式（Ｉ）で示される化合物から微生物の生化
学的作用を用いて、式（ＩＩ）で示されるトランス−４
−シアノシクロヘキサンカルボン酸アミドを製造する方
法である。

一般に、ニトリル基をカルボキシアミド基に変換する生
化学的作用、すなわち、酵素はニトリルヒドラターゼと
して知られている［発酵と工業、第４１巻、３８２〜３
８８頁（１９８３年）］。また、カルボキシアミド基を
カルボキシル基に変換する酵素はアミダーゼとして知ら
れている。

特願昭６３−１６７８２８号にて報告された微生物の生
化学的作用を用いる製造法では、微生物にアミダーゼが
含まれるため、式（Ｖ）で示される副生成物が生じる。

そこで、本発明者らは、式（１）の化合物を弐（ｎ）の
化合物に変換する能力を有する微生物に、突然変異誘発
剤であるＮ−メチル−Ｎ“−ニトロ−Ｎ−ニトロソグア
ニジンを用いて突然変異を起こさせ、副生物生成に関与
するアミダーゼを欠損させ、弐（Ｉ）の化合物より弐（
ｎ）の化合物のみを選択的に生成する能力を有する微生
物を作成し、本発明を完成するに至った。

次に、本発明の実施方法について説明する。

■使用菌株 本発明で使用する微生物は、京都市内の土壌より分離し
たコリネバクテリウム　エスピー　０５株（微工研菌寄
第８９３１号）を親株として、ｐＨ７゜０の０．１Ｍリ
ン酸カリウム緩衝液中で、３００μｇ／１ｒｄｌの濃度
のＮ−メチル−Ｎ″−ニトロ−Ｎ＝ニトロソグアニジン
で約１時間処理することにより得られたコリネバクテリ
ウム　エスピー　Ａ６８株（微工研菌寄第１０２２４号
）である。上記の２株は、微工研に寄託されている。コ
リネバクテリウムエスピー０５株の菌学的性質は、特開
昭６３−１２９９８８号公報に示すとおりである。この
２株の差異は、コリネバクテリウム　エスピー　Ａ６８
株が弐（ＩＩ）の化合物を式（Ｖ）の化合物に変換させ
る酵素であるアミダーゼを保有しないところにある。

なお、コリネバクテリウム　エスピー　Ａ６８株の菌学
的性質は以下に示すとおりである。

（ａ）形態 ■、細胞の形および大きさ：桿菌、０．４〜０゜６Ｘ２
．５〜６．０ｕｍ。

２、細胞の多形成の有無；長稈状（１日日）を呈し、ス
ナンピングを伴った発育をし、後（３８目）には短稈状
（０，４〜０．６Ｘ０．６〜１２　７／ｍ）に断裂する
。

３、運動性の有無；無 ４、胞子の有無；無 ５、ダラム染色性；＋ ６、抗酸性；− （ｂ）各培地における生育状態 １、肉汁寒天平板培養；直径１．０〜２．２ｍ＋ｎ円形
、平滑で乾き気味、半球状、白ないし淡ピンク色。

２、肉汁寒天斜面培養；生育中程度、平滑、乾き気味、
白ないし淡ピンク色。

３、肉汁液体培養；生育旺盛、中程度の濁り、生育に伴
い沈澱生成。

４、肉汁ゼラチン穿刺培養；表面によく生育、穿刺部に
そって生育、液化無。

５、リドマス・ミルク；変化無 （Ｃ）生理的性質 ■、硝酸塩の還元； ２、脱窒反応；− ３、ＭＲテスト； ４、ｖｐテスト；− ５、インドールの生成； ６、硫化水素の生成； ７、デンプンの加水分解； ８、クエン酸の利用 （イ）コーサーの培地； （ロ）クリステンセンの培地； ９、無機窒素源の利用 （イ）硝酸塩；十 （ロ）アンモニウム塩；＋ １０、色素の生成 （イ）キングＡ培地；− （ロ）キングＢ培地；− １１、ウレアーゼ；＋ １２、オキシダーゼ； １３、カタラーゼ；＋ １４、生育の範囲 （イ）ｐＨ；６〜１０ （ロ）温度；１０〜３７°Ｃ ＋ １５、酸素に対する態度；好気性 １６．０−Ｆテスト；− １７、ｔＪ７［から酸およびガスの生成と資化性１８．
１０％スキムミルク中、７２°Ｃ１１５分間の耐熱性；
無 １９、オルニチン脱炭酸；十 ２０、リジン脱炭酸；− 以上の菌学的性質をバージ−の細菌分類書（ＢＥＲＧＹ
’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖ
ｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ第８版）および「マニュ
アル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー（Ｍａ
ｎｕａｌ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒ。

ｂｉｏｌｏｇｙ　）第４版（１９８５年）」に基づいて
分類した。

Ａ２Ｂ株は、好気性、ダラム陽性、カタラーゼ陽性の内
性胞子を生じない桿菌であり、子便毛を着生せず、発育
の初期は長稈状でスナツピングを伴って発育し、後に短
稈状に断裂することより、コリ皐型細菌に属することは
明らかである。また、セルロース分解能を持たないこと
、１０％スキムミルク、７２“Ｃ１１５分間の耐熱性が
ないこと、さらに、絶対好気性でないこと、０−Ｆテス
トが−であることより、０５株はコリネバクテリウム属
に属することが明らかである。

Ａ２Ｂ株の種については、３７°Ｃで生育、酸素に対す
る態度として好気性ではあるが、通性嫌気ともいえ、Ｏ
−Ｆテストか−、グルコースの資化性弱く、Ｄ−フラク
トース、ショ峯唐、Ｄ−マンニントおよびエタノールを
資化し、硝酸還元能がなく、硫化水素を生成せず、コー
サー培地でクエン酸を資化せず、ウレアーゼ活性および
カタラーゼ活性を持つことより、先に述べた分類書から
判断すると、該当する種がない。よって、Ａ２Ｂ株はコ
リネバクテリウム属の新種と考えられる。

■反応方法 本発明における式（１）の化合物を式（Ｉ［）の化合物
に変換する反応方法としては、具体的には前記微生物を
式（１）の化合物の存在下に培養する方法と、微生物培
養物、さらに、そこから集めた菌体または菌体処理物（
例えば、菌体の破砕物、菌体の有機溶媒処理物、または
菌体より分離抽出した酵素）と式（１）の化合物とを接
触させる方法の二つの方法がある。また、菌体、菌体処
理物または菌体から抽出された酵素を公知の方法、例え
ば、セライト、アルギン酸カルシウム、カラギーナン等
により固定化した後、弐（Ｉ）の化合物と反応させても
よい。

■培養方法 本発明で使用される微生物の培養は、公知の方法に準じ
て行うことができる。使用する培地は、一般微生物の栄
養源として公知のものが利用でき、廃糖蜜、グルコース
、グリセリン、エタノール、シュークロース等の炭素源
、硫酸アンモニウムまたは尿素、塩化アンモニウム等の
窒素源、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン
等の有機栄養源、リン酸、マグネシウム、カリウム、鉄
、コバルト等の無機栄養源、ビタミン類を適宜組み合わ
せて使用できる。

また、微生物の弐（１）の化合物から弐（ｎ）の化合物
への変換活性を促進する物質として、アセトニトリル、
トランス−１，４−ジシアノシクロヘキサン等のシアン
化合物を添加してもよい。培地中のｐＨは５〜１０の範
囲で選べばよく、培養温度は１８〜３８”Ｃ，好ましく
は２３〜３０°Ｃの温度がよい。

培養日数は１〜８日の範囲で活性が最大になるまで培養
すればよい。

■反応条件 反応媒体としては、水、緩衝液などの水性媒体、あるい
はメタノール、クロロホルム、塩化メチレン等の有機溶
媒と水との混合物が使用できる。反応媒体中へは、弐（
Ｉ）の化合物を粉末のままで、あるいは適当な溶媒に溶
かして添加する。式（１）の化合物の添加濃度は０．０
１〜６０重量％程度、好ましくは１．０〜２０重量％で
ある。反応に菌体を使用する場合の菌体の濃度は、通常
０．１〜８重計％の範囲でよい。反応温度は４〜５０°
Ｃ１望ましくは１５〜３２°Ｃ１反応ｐＨは４〜１１、
好ましくは７゜５〜９．５である。反応時間は通常、０
．１〜１２０時間の範囲で適当な時間を選べばよい。消
費されろ弐（１）の化合物は、連続的にまたは間歇的し
こ補充して、反応液中の濃度が上記の範囲内に維持され
るように添加してもよい。

■分離精製 生成された弐（ＩＩ）の化合物は、反応終了液より菌体
等の不溶物を除去した後、公知の方法、例えば、溶媒抽
出あるいは晶析等により容易に畜純度の結晶を得ること
ができる。

（発明の効果） 本発明を利用することにより、トランス−４−シアノシ
クロヘキサンカルボン酸アミドを常温常圧の反応条件下
で高収率に、しかも、副生物の生成なしに安定して生成
させることができる。さらに、立体配置を保持させて製
造することができるので、経済上極めて有用である。

（実施例） 次に、本発明を実施例をもって説明するが、これらの実
施例によって本発明が何ら限定されるものではない。

実施例１ 酵母エキス１．０ｇ、シュークロース１．０ｇ、塩化ナ
トリウム０．１ｇ、リン酸二カリウム０．２ｇ、硫酸鉄
３　ｍｇを含み、ｐＨを７．２とした殺菌培地１００　
ｍｌに、あらかじめ同培地にて培養したコリネバクテリ
ウム　エスピー　Ｃ５株をを植菌し、２８°Ｃで６時間
培養した。培養終了後、遠心分離にて、菌体を集め、ｐ
Ｈ７，ＯのＯ，１Ｍリン酸カリウム緩衝液で洗浄後、再
び同暖衝液１００　ｍｌに懸濁した。

この懸濁ン夜に、３０ｍｇのＮ−メチル＝Ｎ°　−二ト
ロＮ−ニトロソグアニジンを加え、２８°Ｃで約１時間
振盪しく致死率約９９％）、変異を行った。次いで、遠
心分離にて菌体を集め、ｐＨ７，０の０．　１〜１リン
酸カリウム緩衝液に懸濁した後、肉汁寒天平板培地に広
げて生育したコロニーについて、ニトリルヒドラターゼ
およびアミダーゼ活性を調べた。ニトリルヒドラターゼ
については、トランス−１４ジシアノシクロヘキサンを
基質とし、アミダーゼについては、トランス−４−シア
ノシクロヘキサンカルボン酸アミドを基質として、ｐＨ
８，０の０゜１Ｍリン酸カリウム緩衝液に０．０３〜Ｏ
，ＬｍｇＤＣＩｄ７ｍｌ濃度に懸濁した菌体を３０　’
Ｃで反応させ、生成物の量を測定して活性を求めた。（
ＤＣＷは乾菌体重量） 結果は泡入のとおりで、アミダーゼを欠損するＡ２Ｂ株
が得られた。

人工変異によるアミダーゼ欠１１株の取得実施例２ 酵母エキス１．０ｇ、シュークロース１．０ｇ、塩化ナ
トリウム０．１Ｅ、リン酸二カリウム０．２ｇ、硫酸鉄
３ｍｇを含み、ｐ　］（を７．２とした殺菌培Ｉｔ！！
　１００　ｍｌに、あらかじめ同培地にて培養したコリ
ネバクテリウム　エスピー　Ａ６ｆ３株を植菌し、２８
°Ｃで２日間培養した。培養終了後、遠心分４１１にて
、菌体を集め、このうち０．３ｇＤ＋Ｊｌ（乾菌体重量
）を、ｐ＋＋１３．５の０、ＩＭリン酸カリウム緩衝液
１００ｍ１が入った三角フラスコ中に懸濁した後、トラ
ンス−１，４−ジシアノシクロヘキサン４０ｇを加え、
３０°Ｃで攪拌しながら反応させた。３時間半後に反応
を終了し、メタノールを加えて生成物を溶解させた後に
遠心分離にて菌体を除いた。次いで、濃縮、晶析の操作
によりトランス−４−シアノシクロヘキサンカルボン酸
アミドの結晶３７．１ｇを得た。

本製品は、高速液体クロマト分析で単一ピークを示した
。

融点、ＩＲ，ＮＭＲ１元素分析の結果を以下に示すが、
これは目的物の構造を支持する。

融点　１８９〜１９１　’Ｃ ＩＲ（ＫＢｒ法） ３３５０ｃｍ−’　　（シーＮＨ） ３２００ｃｎｒ’　　（シーＮＨ） ２２４０ｃｍ−’　　（ｖ　＝ＣＨ） １６７０ｃｍ−’　　（シーＣ○） ＮＭＲ（Ｍ　ｅ　ＯＨｄ４　、ＤＭＳ　Ｏδ　；　　ｌ
、　　２〜３．　　Ｏ（ＩＯＨ，ｍ）元素分析 理論値　　　　　分析値 Ｃ６３，１６％　　　６３．０５％ Ｈ’７．８９％　　　　８．００％ Ｎ１８．４２％　　　１８．３５％ ０１０．５３％　　　１０．６０％ なお、高速液体クロマト分析は以下のようにして行った
。分析装置；東ソー社製ＣＣＰＤ型デュアルポンプ、東
ソー社製Ｒｒ−８型示差屈折計、カラム；ユニシルパッ
クＣ−１８（ガスクロエＷ社ｇ）、）容媒；メタノール
ＩＯ容量％の０，１Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ３，０ 実施例３ 実施例２と同様に培養して得られたコリぶバクテリウム
　エスピー　Ａ６８株９ｍｇＤＣ−を、ｐＨ８゜５のＯ
０ＬＭリン酸カリウム暖街液５雁が入った容器に懸濁し
た。次に、トランス−１，４−ジシアノシクロヘキサン
５０ｍｇを加え、３０　’Ｃで撹拌しながら反応させた
。１０分後、反応液の一部を取り出し高速液体クロマト
分析を行ったところ、５６．ＩＩＩｇのトランス−４−
シアノシクロヘキサンカルボン酸アミドが生成していた
。１０時間後、反応液の一部を取り出し再び高速液体ク
ロマト分析を行ったところ、生成したトランス−４−シ
アノシクロヘキサンカルボン酸アミド濃度は変化なかっ
た。（転換率１００モル％） 実施例４ 酵母エキス１．０ｇ、シュークロース１．０ｇ。

塩化ナトリウム０．１ｇ、リン酸二カリウム０．２ｇ、
硫酸鉄３■、トランス−１，４−ジシアノシクロヘキサ
ン１．０ｇを含み、ｐＨを７．２とした殺菌培地１００
ｄに、あらかじめ実施例１に記載の培地で培養したコリ
ネバクテリウム　エスピー　Ａ２Ｂ株を植菌し、２８°
Ｃにて２４時間振盪培養した。

培養液から遠心分離にて菌体を除去した後、その上清液
に苛性ソーダを加えｐＨを１２．５に調製した。

次いで、クロロホルム１００　ｍｌを加えて抽出を行っ
た。そのクロロホルム層を濃縮して、トランス−４−シ
アノシクロヘキサンカルボン酸アミドの結晶０゜５６ｇ
を得た。本製品は、高速液体クロマト分析で単一ピーク
を示した。

実施例５ 実施例２と同様に培養して得られたコリネバクテリウム
　エスピー　Ａ６８株０．１ｇＤＣ讐を、ｐＨ８，５の
Ｏ，１Ｍリン酸カリウム緩衝液５燻に、懸濁した。この
懸ビ蜀；夜に５減の２重量％のアルギン酸ソーダをよく
混合し、シリンジを用いて０．１Ｍ塩化カルシウム水溶
液中に滴下することにより、固定化菌体を得た。こうし
て得られた固定化菌体（ビーズ）０．２ｇを、トランス
−１，４−ジシアノシクロヘキサン５０ｍｇと共に、ｐ
Ｈ８，５の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液５雁中に入れ
、３０　’Ｃで攪拌しながら反応させた。１時間後に反
応液の一部を取り出し、高速液体クロマト分析したとこ
ろ、５６．５ｍｇのトランス−４−シアノシクロヘキサ
ンカルボン酸アミドが生成していた。（転換率１００モ
ル％）実施例６ 実施例２と同様に培養して得られたコリネバクテリウム
　エスピー　Ａ２Ｂ株、および同様に培養して得られた
親株であるコリネバクテリウム　ニス５０５株を比較す
るため、当量の菌体（１，５ｍｇＤＣ臀）をｐＨ８，５
の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液５成に懸濁した。次に
、トランス−１，４−ジシアノシクロヘキサン５０ｍｇ
をそれぞれ加えて、３０°Ｃで攪拌しながら反応させた
。その経時変化は図面に示すとおりで、Ｃ５株では、実
線で示したように反応が進むにつれてトランス−４−シ
アノシクロヘキサンカルボン酸が生成するが、Ａ６８株
では、破線で示したように短時間でトランス−１，４−
ジシアノシクロヘキサンが消失し、その後、トランス４
−シアノシクロヘキサンカルボン酸は生成しなかった。

【図面の簡単な説明】

図面は、コリネバクテリウム　エスピー　Ａ６８株、コ
リネバクテリウム　エスピー　０５株それぞれの反応に
おける経時変化を示すグラフである。 ばか１名 トランス−７，４−ジシアノシクロへキサントランス−
４−シアノシクロヘキサンカルシボン酸アミド゛トラン
ス−４−シアノシクロヘキサンカルボン酸実線＋　　Ｃ
５株使用 ３腺　Ａ６８抹使用

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ニトリルヒドラターゼを保有し、アミダーゼを欠
   損させた微生物の作用により、次式（ I ）▲数式、化
   学式、表等があります▼（ I ） で示されるトランス−１，４−ジシアノシクロヘキサン
   を次式（II） ▲数式、化学式、表等があります▼（II） で示されるトランス−４−シアノシクロヘキサンカルボ
   ン酸アミドに変換させることを特徴とするトランス−４
   −シアノシクロヘキサンカルボン酸アミドの製造法。
2. （２）ニトリルヒドラターゼを保有し、かつ、アミダー
   ゼを欠損させたコリネバクテリウム属に属する微生物。