JPH0220294A - Ｂ型肝炎表面抗原の回収 - Google Patents
Ｂ型肝炎表面抗原の回収Info
- Publication number
- JPH0220294A JPH0220294A JP9653189A JP9653189A JPH0220294A JP H0220294 A JPH0220294 A JP H0220294A JP 9653189 A JP9653189 A JP 9653189A JP 9653189 A JP9653189 A JP 9653189A JP H0220294 A JPH0220294 A JP H0220294A
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- Japan
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- peg
- slurry
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- supernatant
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- Pending
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
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- Peptides Or Proteins (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
Ｂ型肝炎表面抗原遺伝子（ＨＢｓＡｇ）は、トランスホ
ームされた宿主細胞中より発現されてくる。この発現し
たタンパク質は、Ｂ型肝炎ウィルスによって引き起こさ
れる病気及び／あるいは感染に対する治療及び予防とし
てのワクチン、またインビトロにおける診断システムと
して有効利用されるものである。
ームされた宿主細胞中より発現されてくる。この発現し
たタンパク質は、Ｂ型肝炎ウィルスによって引き起こさ
れる病気及び／あるいは感染に対する治療及び予防とし
てのワクチン、またインビトロにおける診断システムと
して有効利用されるものである。
しかし、細胞破壊スラリーあるいは細胞培養上清液いず
れにしても、これらから発現したタンパク質を精製する
には抗原の破壊に伴ない、その回収の面で多大な損失が
今まで経験されてきている。
れにしても、これらから発現したタンパク質を精製する
には抗原の破壊に伴ない、その回収の面で多大な損失が
今まで経験されてきている。
よって、本発明の一つの目的は高かい回収率をもつＨＢ
ｓ Ａ ｇの回収方法を提供するものである。他の目
的は、ＨＢ ｓ Ａ ｇの精製を促進する方法を提供す
るものである。本発明のこれら及び他の目的は以下の説
明により明白である。
ｓ Ａ ｇの回収方法を提供するものである。他の目
的は、ＨＢ ｓ Ａ ｇの精製を促進する方法を提供す
るものである。本発明のこれら及び他の目的は以下の説
明により明白である。
回収成分の有無には関係なく、ＨＢ ｓ Ａ ｇを含む
液相は２つの液相部分に分離され、ＨＢ ｓ Ａ ｇ含
有相のみが取り出され、生理学的許容溶液で希釈し、滅
菌濾過、濃縮、及びダイアフィルトレージョンを行ない
、より収率の良い、精製産物を産出する。
液相は２つの液相部分に分離され、ＨＢ ｓ Ａ ｇ含
有相のみが取り出され、生理学的許容溶液で希釈し、滅
菌濾過、濃縮、及びダイアフィルトレージョンを行ない
、より収率の良い、精製産物を産出する。
本発明は細胞破壊スラリーあるいは細胞培養上清液から
のＨＢ ｓ Ａ ｇの回収及び精製に関するものである
。
のＨＢ ｓ Ａ ｇの回収及び精製に関するものである
。
本発明によれば、ポリエチレングリコール（Ｐ Ｅ Ｇ
）溶液及びデキストランを加える事により、細胞破壊ス
ラリーあるいは細胞培養上清液を二相に分離し、先の目
的を達成するものである。約５％から約７％濃度になる
様にＰＥＧを充分量加える、好ましくは約６％である。
）溶液及びデキストランを加える事により、細胞破壊ス
ラリーあるいは細胞培養上清液を二相に分離し、先の目
的を達成するものである。約５％から約７％濃度になる
様にＰＥＧを充分量加える、好ましくは約６％である。
またデキストランはその濃度が約３％から約５％までで
あり、好ましくは約４％である。これら２種の成分を必
要量加える事により、ＨＢ ｓ Ａ ｇが多く上層疎水
性ＰＥＧ含有層に移動している２相の溶媒層を形成させ
る。抗原の溶解度を高めるには、非イオン性の界面活性
剤の存在が望ましい。
あり、好ましくは約４％である。これら２種の成分を必
要量加える事により、ＨＢ ｓ Ａ ｇが多く上層疎水
性ＰＥＧ含有層に移動している２相の溶媒層を形成させ
る。抗原の溶解度を高めるには、非イオン性の界面活性
剤の存在が望ましい。
ＰＥＧの分子量は約１，５００から約
５．０００ と種々の範囲にわたっているが。
好ましくは約３３５０の分子量を有するＰＥＧである。
また適切なデキストランとしては、デキストランＴ５０
０’（５００，ＯＯＯｍｗ）である。非イオン性界面活
性剤の一例をあげるとすると、それは約０．３％ぐらい
までの量で使用しうるポリオキシエチレン（９）オクタ
フェノール（トリトンＸ−１００）であり、かつ好まし
くは約０．２％である。
０’（５００，ＯＯＯｍｗ）である。非イオン性界面活
性剤の一例をあげるとすると、それは約０．３％ぐらい
までの量で使用しうるポリオキシエチレン（９）オクタ
フェノール（トリトンＸ−１００）であり、かつ好まし
くは約０．２％である。
細胞破壊スラリーあるいは細胞培養上清液に先の成分を
添加したらＪそれを約５分から約３０分間、約１１００
０×ｇから約４０００×ｇ、約２℃から約８℃における
条件下で遠心にかける。上清液を取り出し、それを約１
から３容量の生理学的許容溶液で希釈する。
添加したらＪそれを約５分から約３０分間、約１１００
０×ｇから約４０００×ｇ、約２℃から約８℃における
条件下で遠心にかける。上清液を取り出し、それを約１
から３容量の生理学的許容溶液で希釈する。
例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ’）、生理的食
塩水あるいは水であり、希釈後、それらを滅菌も濾過す
る。
塩水あるいは水であり、希釈後、それらを滅菌も濾過す
る。
ｐ液を濃縮及びダイアフィルトレージョンにかけ、ＰＥ
Ｇの除去を行ない、更に残存界面活性剤を樹脂処理によ
り取り除く。
Ｇの除去を行ない、更に残存界面活性剤を樹脂処理によ
り取り除く。
以下の実施例は本発明を説明するものであるが、それら
を限定するものではない。
を限定するものではない。
実施例 Ｉ
ＨＢ ｓ Ａ ｇの発現の為に構築されたベクターによ
りトランスホームされた酵母細胞をＹＥＨＤ培地で定常
期に至るまで培養し、その後、酵母細胞を破壊する。こ
れはヨーロッパ特許出願第０ ０２０ ２５１号におい
て記載されている通りである（本明細書中において参考
文献として取り入れである。）。
りトランスホームされた酵母細胞をＹＥＨＤ培地で定常
期に至るまで培養し、その後、酵母細胞を破壊する。こ
れはヨーロッパ特許出願第０ ０２０ ２５１号におい
て記載されている通りである（本明細書中において参考
文献として取り入れである。）。
０．２％のトリトン ｘ−１００を含む酵母細胞破壊ス
ラリー７９０ ｍ Ｑに対して２０％のＰＥＧ３３５０
溶液４８０ ｍ Ｑを加える。
ラリー７９０ ｍ Ｑに対して２０％のＰＥＧ３３５０
溶液４８０ ｍ Ｑを加える。
撹拌混合後、更に２０％のデキストラン下５００溶液３
２０ｍＲを加え、よく混合する。
２０ｍＲを加え、よく混合する。
この混合液を、２５００ Ｘ ｇ ＋ ４°Ｃ２１５分
間の遠心にかけ、ＨＢ ｓ Ａ ｇを含む、疎水性ＰＥ
Ｇ３３５０上清溶液を分離抽出し、２容量の ＰＢＳで
希釈後、０．２μフイルターの滅菌濾過にかける。七戸
液を濃縮し、アミコン１０’分子量カットオフメンプラ
ンを用いた。
間の遠心にかけ、ＨＢ ｓ Ａ ｇを含む、疎水性ＰＥ
Ｇ３３５０上清溶液を分離抽出し、２容量の ＰＢＳで
希釈後、０．２μフイルターの滅菌濾過にかける。七戸
液を濃縮し、アミコン１０’分子量カットオフメンプラ
ンを用いた。
ダイアフィルトレージョンに１０容量のＰＢＳで処理し
、ＰＥＧ３３５０を除去する。残留トリトンＸ−１００
に関しては、ポリスチレンジビニルベンゼン樹脂（ＸＡ
Ｄ−２）で処理し、その樹脂粒子をｔｐ過により除去す
るという方法で取り除く。シリカゲルの吸着を用いた産
生過程における回収率は ７．８％にすぎなかったが、
本発明におけるＨ Ｂ ｓ Ａ ｇの回収率は総タンパ
ク量の２３．６％に相当するものであった。
、ＰＥＧ３３５０を除去する。残留トリトンＸ−１００
に関しては、ポリスチレンジビニルベンゼン樹脂（ＸＡ
Ｄ−２）で処理し、その樹脂粒子をｔｐ過により除去す
るという方法で取り除く。シリカゲルの吸着を用いた産
生過程における回収率は ７．８％にすぎなかったが、
本発明におけるＨ Ｂ ｓ Ａ ｇの回収率は総タンパ
ク量の２３．６％に相当するものであった。
スＪＪＬ−１
ＨＢ ｓ Ａ ｇの発現の為に楕築されたベクターによ
りトランスホームされた酵母細胞をＹＥＨＤ培地で定常
期に至るまで培養し、その後、酵母細胞を破壊する。こ
れはヨーロッパ特許出願第０ ０２０ ２５１号におい
て記載されている通りである（本明細書中において参考
文献として取り入れである。）。
りトランスホームされた酵母細胞をＹＥＨＤ培地で定常
期に至るまで培養し、その後、酵母細胞を破壊する。こ
れはヨーロッパ特許出願第０ ０２０ ２５１号におい
て記載されている通りである（本明細書中において参考
文献として取り入れである。）。
０．２％のトリトン Ｘ−１００を含む酵母細胞破壊ス
ラリー７９０ｍＱに対して２０％のＰＥＧ３３５０溶液
４８０ ｍ Ｑを加える。
ラリー７９０ｍＱに対して２０％のＰＥＧ３３５０溶液
４８０ ｍ Ｑを加える。
撹拌混合後、更に２０％のデキストラン下５００溶液３
２０ｍＱを加え、よく混合する。
２０ｍＱを加え、よく混合する。
この混合液を、２５００ｘｇ、４℃、１５分間の遠心に
かけ、ＨＢ ｓ Ａ ｇを含む、疎水性ＰＥＧ３３５０
上清溶液を分離抽出し、２容量のＰＢＳで希釈後、０．
２μフイルターの滅菌を濾過にかける。炉液を濃縮し、
アミコン１０”分子量カットオフメンプランを用いた、
ダイアフィルトレージョンに１０容量のＰＢ８で処理し
、ＰＥＧ３３５０を除去する。残留トリトンＸ−１００
に関しては、ポリスチレンジビニルベンゼン樹脂（ＸＡ
Ｄ−２）で処理し、その樹脂粒子を濾過により除去する
という方法で取り除く。シリカゲルの吸着を用いた産生
過程における回収率は ７．８％にすぎなかったが、本
発明におけるＨＢｓＡｇの回収率は総タンパク量の２８
％に相当するものであった・ 手続補正書
かけ、ＨＢ ｓ Ａ ｇを含む、疎水性ＰＥＧ３３５０
上清溶液を分離抽出し、２容量のＰＢＳで希釈後、０．
２μフイルターの滅菌を濾過にかける。炉液を濃縮し、
アミコン１０”分子量カットオフメンプランを用いた、
ダイアフィルトレージョンに１０容量のＰＢ８で処理し
、ＰＥＧ３３５０を除去する。残留トリトンＸ−１００
に関しては、ポリスチレンジビニルベンゼン樹脂（ＸＡ
Ｄ−２）で処理し、その樹脂粒子を濾過により除去する
という方法で取り除く。シリカゲルの吸着を用いた産生
過程における回収率は ７．８％にすぎなかったが、本
発明におけるＨＢｓＡｇの回収率は総タンパク量の２８
％に相当するものであった・ 手続補正書
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、細胞破壊スラリーあるいは細胞培養 上清液より酵母−産生のＨＢｓＡｇを単離する方法にお
いて細胞破壊スラリーあるいは細胞培養上清液に上層疎
水性相及び下層親水 性相を形成するに十分な量のＰＥＧ及びデキストランを
加え、この二層混合液を遠心にかけ、上清を生理学的許
容溶液で希釈し、この希釈上清液を濃縮及びろ過するこ
とよりなる方法。 ２、総細胞破壊スラリーあるいは細胞培 養上清液量に対してのＰＥＧの量が約５％から約７％で
あるところの請求項１記載の方法。 ３、ＰＥＧの量が約６％であるところの 請求項２記載の方法。 ４、総細胞破壊スラリーあるいは細胞培 養上清液量に対してのデキストランの量が約３％から約
５％であるところの請求項１記載の方法。 ５、デキストランの存在量が約４％であ るところの請求項４記載の方法。 ６、ＰＥＧの分子量が約３３５０からな る請求項１記載の方法。 ７、デキストランの分子量が約４５０，０００から約５
５０，０００であるところの請求項１記載の方法。 ８、遠心操作を約５分から約３０分、約 １０００×ｇから約４０００×ｇ、約２℃から約８℃に
おいて行なう請求項１記載の方法。 ９、遠心操作が約１５分間、２５００ ×ｇ、４℃において行なわれる請求項８記載の方法。 １０、生理学的許容溶液がＰＢＳ、生理食 塩水あるいは水であるところの請求項１記載の方法。 １１、上清液量に対する生理学的許容溶液 の量が約１から約３容量であるところの請求項１０記載
の方法。 １２、細胞破壊スラリーあるいは細胞培養 上清液に添加する非イオン性界面活性剤の量が約０．１
％から約０．３％であるところの請求項１記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US18255688A | 1988-04-18 | 1988-04-18 | |
| US182,556 | 1988-04-18 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0220294A true JPH0220294A (ja) | 1990-01-23 |
Family
ID=22668982
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9653189A Pending JPH0220294A (ja) | 1988-04-18 | 1989-04-18 | Ｂ型肝炎表面抗原の回収 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0338620A1 (ja) |
| JP (1) | JPH0220294A (ja) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IE52036B1 (en) * | 1979-05-24 | 1987-05-27 | Univ California | Non-passageable viruses |
-
1989
- 1989-04-13 EP EP89200934A patent/EP0338620A1/en not_active Withdrawn
- 1989-04-18 JP JP9653189A patent/JPH0220294A/ja active Pending
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| NUCLEIC ACIDS RESEARCH=1983 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0338620A1 (en) | 1989-10-25 |
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