JPH0450294B2

JPH0450294B2 -

Info

Publication number: JPH0450294B2
Application number: JP61125590A
Authority: JP
Inventors: Biinendeere Furansu Fuan; Gyui Shimoonetsuto
Original assignee: SUMISUKURAIN BAIOROJIKARUSU SA
Current assignee: SUMISUKURAIN BAIOROJIKARUSU SA
Priority date: 1985-05-30
Filing date: 1986-05-29
Publication date: 1992-08-13
Also published as: ATE42679T1; EP0204680A3; DK247586A; DK247586D0; JPS61280438A; EP0204680A2; DE3663108D1; ES555442A0; ZA863935B; GR861357B; EP0204680B1; ES8706444A1; AU589331B2; CA1259922A; PT82644B; AU5790686A; PT82644A; US4649192A

Description

【発明の詳細な説明】

発明の分野本発明は、ワクチンとして有用なＢ型肝炎表面
抗原（HBsAg）の改良単離精製およびその調製
方法に関する。本発明の方法により得られるHBsAg抗原は、
17〜20nmのHBsAg粒子の形態である。これは、
ワクチンの調製に有用である。発明の背景Ｂ型肝炎は、広範囲に広まり、潜在的に到命性
のウイルス性疾病である。その病原体、即ち、Ｂ
型肝炎ウイルスは、何年も前に、この病気にかか
つている患者の血液から単離されているが、商業
的Ｂ型肝炎ワクチンの開発は、大きな問題に直面
している。即ち、Ｂ型肝炎ウイルスは、(a)コアプ
ロテイン結合したウイルス性ゲノム、および免疫
原性でないコア抗原（HBcAg）を含有するコ
ア、および(b)免疫原性表面抗原（HBsAg）を含
有するエンベロープからなるデーン粒子（Dane
particle）と称する42nm粒子である。HBsAgは、
形態学的に不均質な複合巨大分子構造群である。
即ち、これは、タンパク質、炭水化物、糖タンパ
ク質および脂質を含有し、その主成分は、ホスフ
アチジルコリン、コレステリルエステル、コレス
テロールおよびトリグリセリドである。Ｂ型肝炎
ウイルス（HBV）での感染は、デーン粒子の産
生ばかりでなく、22nm粒子および表面エンベロ
ープの成分を含有するフイラメントの過剰産生を
きたす。これらの22nm粒子は、モノマーHBsAg
タンパク質よりも、約1000倍免疫原性が大きいこ
とが知られているが、HBVの複製および発現は、
in vitroで該ウイルスを増殖させるのに適当な細
胞培養系がないため、長い間防げられてきた。ウ
イルスを効率よく増殖させることができるin
vitroの培養系がないため、組換DNA技術を用い
ることによりHBsAg様分子の合成または別の宿
主系におけるHBsAgの発現のいずれかに対する
研究開発がなされた。例えば、HBsAgに関する
遺伝子を担うDNAベクターで形質転換された酵
母セルからのHBsAgの発現が報告されており、
また、酵母中で合成されたHBsAgが直径17〜
20nmで、ヒト細胞から分泌される22nm粒子と類
似した性質を有する粒子になることが知られてい
る（ピー・バレンツエラら、ネイチヤー（P.
VALENZUELAS et al.，Nature）、298；347〜
350（1982）およびアール・エイ・ヒツツエマン
ら、ニユークレイツク・アシツズ・リサーチ
（R.A.HITZEMANN et al.Nucl.Ac.Res.）11；
2745〜2763（1983）参照）。操作処理セル培養物、
例えば、処理酵母培養物における、組換え技術に
よるHBsAgの産生は公知である（例えば、ヨー
ロツパ特許出願公開第0106828号；ダブリユー・
ジエイ・マツカリーら、ネイチヤー（W.J.
McALEER et al.，Nature）307；178〜180
（1984）およびシー・イー・カーテイーら、アブ
ストラクト030・オブ・ジ・アニユアル・ミーテ
イング・オブ・ジ・アメリカン・ソサイエテイ
ー・フオア・マイクロバイオロジー（C.E.
CARTY et al.，Abstract030 of the annual
meeting of the American Society for
Microbiology）（1984）（第84回会議、1984年３
月４日〜９日）参照）。 HBsAgの血漿、血清または他の血液製品また
は生物学的液体または処理セル培養物からの抽出
および精製方法を記載した記事および特許も多く
ある。本発明の方法は、HBsAgを産生する処理酵母
セルら適用し得る。十分な細胞濃度まで増殖させた処理酵母セル培
養物からのHBsAgの抽出および精製は、一般に
以下の様な３つの連続した段階を要する。： (1) セル内部からのHBsAgの除去； (2) 培地のHBsAgでの濃化； (3) 培地からの実質的に全ての汚染物質の除去。たいていの方法において、工程(1)は、機械的
力、例えば剪断力（例えば、Ｘ−プレスまたはフ
レンチプレス）によるか、またはガラスビーズと
ともに振とうし、最後に界面活性剤を添加するこ
とにより行なう。非イオン性界面活性剤（トリト
ンＸ−100）の使用が、ケイ・ムレイら、ヨーロ
ピアン・モレキユラ・バイオロジー・オーガニゼ
イシヨン・ジヤーナル（K.MURRAY et al.，
TheEMBO J.）３；（1984）および前記アール・
エイ・ヒツツエマンら（R.A.HITZEMAN et
al.）により報告されている。 HBsAgを界面活性剤を用いてインキユベート
することにより、粒子が破壊されることも報告さ
れている。この点に関して、英国特許第2093039
号は、HBsAgを非イオン性界面活性剤（トリト
ンＸ−100）で処理してポリペプチド混合物を形
成し、これをスクロースグラジエントを有する水
性緩衝溶液の上部に導入し、実質的に界面活性剤
を含まず、ポリペプチド混合物のミセルを含有す
るフラクシヨンを回収することを開示している。ヨーロツパ特許第0005864号は、粒子径が少な
くとも20nmのＢ型肝炎表面抗原（HBsAg）およ
びコア抗原（HBcAg）を含有する抗原性物質を
界面活性剤（例えば、ツイーン20または80）と接
触させ、次いで、抗原性組成物を含有する界面活
性剤を水性アルデヒド溶液で処理することを開示
している。得られた生成物は、粒子径20nm以下、
特に5nm以下の粒子である。日本国特開昭53−104724号（ダーウエント・ア
ブストラクト第75324A号）は、HBsAg粒子を(1)
非イオン性界面活性剤（即ち、７〜10のオキシエ
チレン鎖を有するポリオキシエチレンアルキルフ
エニル）、(2)タンパク質変性剤（即ち、尿素また
はグアニジン）、および(3)所望により還元剤の存
在下に加熱する方法を開示している。得られた生
成物は、10〜20nmの粒子径を有する。日本国特
開昭50−160420号（ダーウエント・アブストラク
ト第27420A号）は、HBsAgを異なつた界面活性
剤で処理して、サブユニツト生成物を産生する方
法を開示している。西ドイツ国特許出願第2611723号は、抗原を脱
脂界面活性剤の存在下で加温することにより、
HBsAg球状粒子を得る方法を開示している。米国特許第4113712号は、HBsAgを、ほぼ中性
のPHの脱脂質可能な界面活性剤を含有する塩化ナ
トリウム等張溶液中で加熱することにより調製さ
れる一種のポリペプチドサブユニツトからなる
HBsAg粒子を開示している。米国特許第4481189号は、界面活性剤（例えば、
非イオン性界面活性剤）と接触させることによ
り、血漿および血清誘導体を滅菌化する方法を開
示している。工程(2)および(3)は、種々の技術、とりわけ、コ
ロイド状シリカ、更に詳しくは、「アエロシル
（“AEROSIL”）」（デグツサ社（西独）
（DEGUSSA，Francfort，FRG）より市販の製
品）を用いた吸着／脱着を取り入れたものであ
る。かかる技術は、以下に示す文献に記載されてい
る：ダブリユー・ジエイ・エム・デユイメルら、フ
オクス・サンギニス（W.J.M.DUIMEL et al.，
Vox Sang.）23；249〜255（1972）ジエイ・ピロツトら、ジヤーナル・オブ・クリ
ニカル・マイクロバイオロジー（J.PILLOT et
al.，J.Clin.Microdiol.）４；205〜207（1976）お
よびモレキユラ・イムノロジー（Molec.
Immunol.）21；53〜60（1984）エフ・バリンら、
アニユマル・マイクロバイオロジー（パスツール
研究所）（F.BARIN et al.，Ann.Microbiol.）
（Inst.Pasteur）129B；87〜100（1978）前記文献では、せいぜい、吸着されたHBsAg
のフラクシヨン（即ち、約60％）を、溶出液にデ
オキシコレートを添加せずに回収する（低イオン
強度の緩衝液で溶出する場合に、最も良い結果が
得られる）ことを示唆しているのみである。他の研究（シーブケら、アクタ・パソロジカ・
マイクロバイオロジカ・エト・イムノロジカ・ス
カンジナビカ、セクシヨンＢ（SIEBKE et al.，
Acta Path.Microbiol.Scand.Section Ｂ80；935
〜936（1972）においては、オーストラリア抗原
は、２％ツイーン80により、アエロシルから一部
溶出され、同様に、界面活性剤の存在下で、吸着
されにくいことが指摘されている。発明の開示シリカゲルへの吸着およびデオキシコリン酸緩
衝液を用いた脱着を取り入れた公知の技術を、非
イオン性界面活性剤を添加することにより得られ
る後培養HBsAg産生セルの溶解物から得られる
上清に適用する場合、破裂されたセルの透明な上
清が得られないだけでなく、コロイド状シリカか
らの脱着にデオキシコリン酸を用いても、
HBSAgが部分的にしか脱着されず、一方、セフ
アロース4B−Cl上クロマトグラフイーにより示
される如く、通常の位置（Kd；0.25）に肝炎抗
原が検出されないことから、酵母粒子が破壊され
ていることが判明した。スクロース中匂配遠心分離によつて、0.5％
（ｗ／ｖ）トリトンＸ−100の存在下で酵母セルの
破壊を行なつた場合、HBsAg粒子の構造は無傷
でなくなるが、一方、0.5％（ｖ／ｖ）ポリソル
ベート（例えば、ポリソルベート20）をトリトン
Ｘ−100にかえた場合、無傷のHBsAgの収率が、
実質的に向上することも判明した。さらに、ポリソルベート非イオン性界面活性剤
（例えば、ポリソルベート20または80）で破裂さ
せた酵母セルの上清を、尿素（最終濃度２〜6M
まで）で補足した場合、（例えば、室温にて30分
間攪拌することにより）部分的に清澄化された溶
液が得られることが判明した。さらに、該清澄化溶液をアエロシルで処理する
ことにより、尿素／非イオン性界面活性剤添加剤
を前に用いたデスオキシコレート添加剤にかえた
場合、低いイオン強度の緩衝液系で、HBsAgが
完全に脱着され得ることが判明した。この様にして行なわれるHBsAg脱着の完全性
は、脱着されたコロイド状シリカにおいて、22K
のバンドが存在しないことにより示され、単離さ
れたHBsAgが、約22nmの粒子となり、これを被
験動物に非径口投与すると、高いレベルの
HBsAg抗体が惹起されることが判明した。従つて、本発明の第１の目的は、ワクチンの目
的に有用なＢ型肝炎表面抗原を、発現された
HBsAgを有する処理酵母セルの培養物から調製
する改良された方法であつて、非イオン性界面活
性剤、更に詳しくは、ポリソルベート（例えば、
0.3％ｖ／ｖポリソルベート20または80）の存在
下にセルを破裂させ、これに尿素を添加して最終
濃度を２〜6Mにして清澄化HBsAg溶液を得（例
えば、室温にて30分間攪拌することによる）、
HBsAgをコロイド状シリカ（アエロシルなど）
上に吸着させ（例えば、４℃にて一夜攪拌するこ
とによる）、HBsAgを、最終濃度8Mの尿素、お
よび非イオン性界面活性剤、更に詳しくは、ポリ
ソルベート（例えば、最終濃度0.1〜１％のポリ
ソルベート20または80）で補足した低イオン強度
の緩衝液（例えば、10mM）でPH８〜9.5，37℃
にてHBsAgを脱着することを特徴とする方法を
提供することである。脱着物は、精製HBsAg粒子を含有し、これは、
公知の技術、例えば、限外過、アガロース上ク
ロマトグラフイー、硫酸デキストラン／塩化カル
シウムを様いた沈降および透析などに従つて、さ
らに処理することができる。本発明を、以下の実施例により説明する。実施例１培養物１につき乾燥セル重量30ｇまで増殖さ
せたHBsAgを発現する処理酵母セル培養菌のペ
レツト化セル80ｇ（湿潤セル重量）をNa₂HPO₄
水性溶液（7.098ｇ／）150ml中に懸濁させる。
この懸濁液を４％（ｗ／ｖ）EDTA溶液3ml、ポ
リソルベート20 ０，9mlおよびフツ化フエニル
メチルスルホニル（PMSF）60mgを含有するイ
ソプロパノール90mlで補足する。NaOH（10％
ｗ／ｖ水中溶液）でPHを8.1に調節する。懸濁液
を氷溶中で冷却し、冷ガラスビーズホモジナイザ
ーに２度通して破裂させる。ホモジネートを次い
で13000ｇにて30分間遠心操作に付す。粗抽出上清160mlを、尿素の最終濃度を4Mと
し、室温にて30分間攪拌して、HBsAg粒子を汚
染酵母細胞膜から分離し、これに、0.3％（ｖ／
ｖ）ポリソルベート20および4M尿素を含有する
50mMリン酸緩衝液（NaH₂PO₄／NaOH）（PH
7.2）中予備洗浄したアエロシル 380（2.5％ｗ／
ｖ）を添加する。溶液を室温にて一夜攪拌し、
HBsAg粒子をシリカ粒子上に最大量吸着させる。コロイド状シリカを次いで6500ｇにて15分間遠
心操作に付し、250mlの10％（ｗ／ｖ）NaClで
２回洗浄する。洗浄したシリカを、0.5％（ｖ／ｖ）ポリソル
ベート20および尿素（最終濃度8M）で補足した
10mMホウ酸緩衝液PH9.0（Na₂B₄O₇／HCl）中に
懸濁させ、懸濁液を37℃にて４時間攪拌する。脱着したコロイド状シリカを、次いで、27000
ｇにて30分間遠心操作に付し、最大量のコロイド
状シリカ粒子を沈降させる。スクロースグラジエント中の勾配遠心分離およ
び電子顕微鏡により、直径約22nmの粒子形態で
抗原が存在することがわかる。脱着物を、100000ダルトンのカツトオフを有す
るカートリツジを備えたAMICON DC（アミコ
ン・コーポレイシヨン（AMICON CORP.
DANVERS，MA，USA）より市販の装置）で
15mlに濃縮し、0.3％（ｖ／ｖ）ポリソルベート
20を含有する10mMトロメタモール／HCl緩衝液
（PH8.0）中平衡化されたセフアロース
（SEPHAROSE）4B−Cl（フアーマシア・フアイ
ン・ケミカルズ（PHARMACIA FINE
CHEMICALS，Uppsala，Sweden）より製造・
販売されているアガロースゲル）上カラム（φ2.5
cm×100cm）に付す。抗原含有ピーク（Kd＝0.25）を、最終濃度0.1
％（ｗ／ｖ）の硫酸デキストラン（MW50000）
および最終濃度40mMのCaCl₂で処理する。過剰の硫酸デキストランは、10mMトロメタモ
ール／HCl緩衝液（PH8.0）中40mMBaCl₂溶液に
対して透析することにより沈殿する。透析物
30mlをCsCl勾配遠心操作に付し、HBsAg含有ピ
ーク9mlを集める。前記工程の異なる段階でのHBsAgの精製を第
表にまとめる。 SDS−PAGEゲルによる走査分析により、最終
生成物は、HBsAgに関し、少なくとも98％純粋
であることがわかる。

【表】実施例２培養物１あたり乾燥セル重量30ｇまで増殖さ
せたHBsAgを発現する処理酵母培養菌のペレツ
ト化セル（湿潤セル重量80ｇ）をNa₂HPO₄水性
溶液（7.098ｇ／）150ml中に懸濁させる。この
懸濁液を４％（ｗ／ｖ）EDTA溶液3ml、ポリソ
ルベート20 0.9mlおよびフツ化フエニルメチルス
ルフオニル（PMSF）60mgを含有するイソプロパ
ノール9mlで補足する。NaOH（10％ｗ／ｖ水中
溶液）でPH8.1に調整する。懸濁液を氷浴中で冷
却し、冷ガラスビーズホモジナイザーに２回通す
ことにより破裂させる。ホモジネートを次いで
13000ｇにて30分間遠心操作に付す。粗抽出物上清160mlを、尿素の最終濃度を4M
になるようにし、室温にて、30分間攪拌して、汚
染酵母細胞膜からHBsAgを除去し、これに0.3％
（ｖ／ｖ）ポリソルベート20および4M尿素を含有
する50mMリン酸緩衝液（NaH₂PO₄／NaOH）
（PH7.2）中予備洗浄したアエロシル 380（2.5％
ｗ／ｖ）を添加する。溶液を４℃にて一夜攪拌
し、シリカ粒子上に最大量のHBsAg粒子を吸着
させる。コロイド状シリカを次いで6500ｇにて15分間遠
心操作に付し、10％（ｗ／ｖ）NaCl250mlずつ
で２回洗浄する。洗浄したシリカを0.5％（ｖ／ｖ）ポリソルベ
ート20および尿素（最終濃度8M）で補足した
10mM硼酸緩衝液（Na₂B₄O₇／HCl）（PH9.0）
80ml中に懸濁させ、該懸濁液を37℃にて４時間
攪拌する。脱着したコロイド状シリカを、次いで27000ｇ
にて30分間遠心分離し、最大量のコロイド状シリ
カ粒子を沈降させる。尿素を透析により除去するために、脱着物を
100000ダルトンのカツトオフを有するカートリツ
ジを備えたAMICON DC中、10mMトロメタモ
ール／HCl緩衝液（PH7.5）に対して透析し、流
速10ml／時にて、10mMトロメタモール／HCl緩
衝液（PH7.5）で平衡化したヘキシルアガロース
（フアーマシア・フアイン・ケミカルズ
（PHARMACIA FINE CHEMICALS，
Uppsala，Sweden）より製造・販売されている
製品）25mlのカラムに付す。カラムを10mMトロメタモール／HCl緩衝液
（PH7.5）で洗浄し、エチレングリコールおよび最
終濃度1MのNaClで補足した10mMトロメタモー
ル／HCl緩衝液（PH7.5）の50／50（ｖ／ｖ）混合
物で溶出し、その後、最終濃度4Mの尿素で補足
した10mMトロメタモール／HCl緩衝液（PH7.5）
で溶出する。前記工程の異なる段階でのHBsAgの精製を第
表にまとめる。

【表】 SDS−PAGEゲルによる走査分析により、最終
生成物は、HBsAgに関して少なくとも97％純粋
であることが示される。実施例３実施例２と同じ方法で、ただし、ヘキシルアガ
ロースをフエニルアガロース（フアーマシア・フ
アイン・ケミカルズ（PHARMACIA FINE
CHEMICALS，Uppsala，Sweden）により製造
されている製品）25mlにかえる。一連のHBsAg精製工程および最終生成物中の
HBsAg含量は、実施例２で得られたものと類似
している。実施例４ NaCl、リン酸緩衝液（Na₂HPO₄／NaH₂PO₄）
およびアルヒドロゲル（ALHYDROGEL）
（スペルホス・エキスポート・カンパニー
（SUPERPHOS EXPORT Co.，Copenhagen，
Demmark）より製造販売されている水酸化アル
ミニウムゲル）（最終濃度は各々、0.9％（ｗ／
ｖ）、20mMおよびAl（OH）₃0.15％（ｗ／ｖ）ま
で、最終PH6.9）を添加することにより、タンパ
ク質含量を10μｇ／mlに調節する。調製物を滅菌し、各々1ml投与単位のワクチン
を入れた2mlガラスバイアル中に分散させる。実施例５種々の希釈度の実施例４のワクチン調製物の投
与単位を、５群の５週令のスイス・マウスに、腹
腔内経路で投与する。投与の28日後、被験動物から血液を採取し、
AUSAB法（AUSABは、アボツト・ダイアグ
ノステイツク・プロダクツ社（ABBOTT
Diagnostic Products GmbH，Wiesbaden，
FRG）により製造販売されているテストキツト
の登録商標）により、各サンプルについて血清抗
HBs滴定量を測定する。同時に、同じワクチン・スケジユールに従つ
て、実施例４の技術（ただし、コロイド状シリカ
の工程なしに実施例１の技術により調製した抗原
を用いる）により得られたワクチン調製物の同じ
希釈度の投与単位を、５群の５週令スイスマウス
に投与する。この比較試験の結果を、第表に示す。表中、
(A)は、尿素を用いた本発明の技術により得られた
ワクチンに関するものであり、一方、(B)は、コロ
イド状シリカの段階のない方法により得られるワ
クチンに関するものである。

【表】

Claims

【特許請求の範囲】１Ｂ型肝炎表面抗原を産生し、非イオン性界面
活性剤の存在下に破裂させた処理酵母セルの上
清をコロイド状シリカで処理することによるＢ型
肝炎表面抗原の単離精製法であつて、尿素を添加
することにより該上清を清澄化し、抗原をコロイ
ド状シリカ上に吸着させ、尿素および非イオン性
界面活性剤で補足した低イオン性緩衝液（PH８〜
9.5）を用いて抗原を脱着させることを特徴とす
るＢ型肝炎表面抗原の単離精製法。２尿素を、最終濃度が２〜6Mになるまで添加
することにより、上清の清澄化を行なう前記第１
項の方法。３清澄化工程を４℃にて行なう前記第１項また
は第２項の方法。４低イオン強度緩衝液が10mMである前記第１
項〜第３項いずれか１つの方法。５低イオン強度緩衝液に、最終濃度8Mまで尿
素を補足する前記第１項〜第４項いずれか１つの
方法。６脱着を37℃にて行なう前記第１項〜第５項い
ずれか１つの方法。７低イオン強度緩衝液に補足する非イオン性界
面活性剤がポリソルベートである前記第１項〜第
６項いずれか１つの方法。８ポリソルベートがポリソルベート20また80で
ある前記第７項の方法。９ポリソルベートの最終濃度が0.1〜１％
（ｖ／ｖ）である前記第７項または第８項の方法。