JPH02219573A - 新規化合物、その製法及びそれを含む医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、プラスミノーゲンの５つのクリングルドメイ
ｙ　（Ｋｒｉｎｇｌｅ　ｄｏｍａｉｎ）を含むプラスミ
ノーゲンおよびプラスミノーゲン活性化因子、それらの
製法、それらを含有する薬剤組成物、および血栓症（特
に急性心筋梗塞）の治療におけるそれらの使用に関する
。

〔従来の技術〕

プラスミンは単鎖前駆体であるプラスミノーゲンの特定
の内部ペプチド結合を切断することによシ得られる２本
鎖セリンプロテアーゼである。ヒトプラスミノーゲンの
アミノ酸配列は知られている（Ｗｉｍａｎ　ａｎｄ　Ｗ
ａｉｔｅｒｓ　（１９７５）　Ｅｕｒ、　Ｊ。

１３ｉｏｃｈｅｍ、　５０．４８９−４９４および５８
．５３９−５４７：Ｗｉｒｎａｎ（１９７７）Ｅｕｒ、
Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、７６゜１２９−１３７：　　５ｏ
ｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ　　ａｔ　　ａｌ。

（１９７８）Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｓｉａ　　ａｎｄ　
ＴｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓＶｏｌ、３．　１９１−２０
９．Ｒａｖｅｎ　　ｐｒｅｓｓｓ、Ｎｅｗ７ｏｒｋ：お
よび５ｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ　ｅｔ　ｍｌ。

（１９７８ン　Ａｔ１ａｓ　　ｏｆ　　ｐｒｏｔｅｉｎ
　　５ｅｑｕｅｎｅｅａｎｄ　　３ｔｒｕｅｔｕｒｅ　
　Ｍｏｌ、５，５ｕｐｐｌ、３．ｐ９１゜Ｎａｔｉｏｎ
ａｌ　　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＦ
ｏｕｎｄａｔｉｏｎ、５ｉｌｖｅｒ　ＳｐｒｌｎｇｅＭ
Ｄ）ｏヒトプラスミノーゲンのアミノ酸残基２７２−７
９０　をコドする部分ヌクレオチド配列もまたすでに開
示されている（Ｍａｌ　ｉｎｏｗａｋｉ、　Ｄ、Ｐ、　
ａｔ　ａｌ、　、　１９８４　。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２３．４２４３−４２５０
）。ヒトプラスミノーゲンの切断部位はｌｒｇ−５６０
とｖａｌ−５６１（Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｓｎ　ｅ
ｔ　ａｌ、　（１９７８）Ａｔｌａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅ（前掲）に記載の配列ナンバ
リングに従う）の間に存在する。２種のプラスミノーゲ
ンが同定された（Ｆ、Ｊ。

Ｃａ５ｔｅｌｌｉｎｏ、　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅｖｉ
ｅｗｓ　ｖｏｌ、８１ｐ４３１（１９８１）：すなわち
１位にＮ末端グルタミン酸残基を有するｇｌｕｌおよび
７７位にＮ末端リシン残基を有する１ｙａｌｙ。ｇｌｕ
−プラスミノーゲンはまた制限てれたプラスミン消化に
よ）Ｎ末端バリン（ｖａｌｙｓ）　　またはメチオニン
（ｍｅ　ｔＢ　）を有する他の修飾形態に容易に転化さ
れる（　Ｃ。

Ｍｉｙａｓｈｉｔａ、　Ｅ、　Ｗｓｎｚｅｌ　ａｎｄ　
Ｍ、　Ｈｅ１ｄｅｎ。

）ｉａｅｍｏｓｔａａｉｓ　１８　　ａｕｐｐ、　１　
ｐｐ７−１３（１９８８））。

本明細曹におけるプラスミノーゲンへの言及はこれらの
Ｓ類をすべて含むものである。

最近、完全なヌクレオチド配列が発表された（Ｆｏｒｓ
ｇｒｅｎ、　Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ｆ
ＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ２１３２５４−２６０）。この
ヌクレオチド配列はＡ鎖のＮ末端近傍に追加の、以前に
報告されていなめ。

イソロイシン残基が存在することを予告した。この発見
は独立して確認された（ＭｃＬｅａｎ、　Ｊ、　Ｎ、　
。

ｅｔ　ｍｌ、、　１９８７．　Ｎａｔｕｒｅ　３３０．
１３２−１３７）。従って、以下のすべての配列ナンバ
リング（アミノ酸およびヌクレオチド）はＦｏｒｓｇｒ
ｅｎ　ｅｔ　ａｌ。

（１９８７）に従うものとする。仁のナンバリング配列
にお−て、プラスミノーゲンの切断部位は残基ａｒｇ−
５６１とｖａｌ−５６２の間に存在し、モしてＮ末端修
飾形態はｍｅｔＨ，１Ｆ１１７８およびｖａｌｙ＠と呼
ばれる。

プラスミノーゲンは５つのクリングル構造を有する。そ
れぞれのクリングル構造：すなわち残基８４−１６２，
１６６−２４３．２５６−３３３．３５８−４３５お！
び４６２−５４１の最初から最後のシスティン残基まで
の領域は、本明細書中では、それぞれＫｔ　Ｐ、　Ｋｇ
　Ｐ、　ＫｊＰ、　Ｋ４　ＦおよびＫｓＰ　　ドメイン
と呼ばれるであろう。

ヒトプラスミノーゲンは２つのグリコジル化部位を有す
る：すなわちクリングル３中の２８９位のアスパラギン
およびクリングル３と４の間の８７６８．８７７２　　
ａｎｄ　８７７７．１９７９）。ＨａｙｅｓおよびＣａ
５ｔｅｌｌｉｎｏは２つの１ラスミノーゲン変異型を開
示している。変異型１はａ　ｓ　ｎ　２＠＠にＮ結合炭
水化物構造およびｔ　ｈ　ｒ３４ｇ　　に０結合炭水化
物を含んでいる。変異型２はｔｈｒ３４．に０結合炭水
化物を含むがｓ　＆Ｉｎｘ５＊　ＫＮ結合炭水化物を含
んでいない。

Ｎ結合部位でのグリコジル化はトリペプチド藺識配列： ａ　ｓ　ｎ　−Ｘ−ａ　ｅ　ｒ／ｌ　ｈ　ｒ（ここでＸ
はプロリン以外のアミノ酸残基である）の存在に依存し
ている〇 〔発明の構成〕 本発明によれば、炭水化物構造がアミノ酸１Ｈに結合し
得ないプラスミノーゲンの５つのクリングルドメインを
含むプラスミノーゲンまたはプラスミノーゲン活性化因
子が提供される。

好適な面において、プラスミノーゲンまたはプラスミノ
ーゲン活性化因子は２８９位にアスパラギン以外のアミ
ノ酸残基を含む。

置換用アミノ酸は合成後修飾に関与しうる側鎖を避ける
ように１例えばジスルブイド結合を形成し得る残基また
はグロテアーゼ感受性切断部位を導入する残基を避ける
ように選択される。

ａｓｎＢ）を置換するのに適した残基の例にはグルタミ
ンおよびアスパラギン酸が含まれる。

好適な面におい七、プラスミノーゲンまたはプラスミノ
ーゲン活性化因子はまた３４６位にトレオニン以外のア
ミノ酸残基（例えばアラニンまたはグリジン）を含むの
が好ましい。従って、両方の潜在的なプラスミノーゲン
グリコジル化部位は遮断されることが理解されるであろ
う。

本発明によって修飾されたプラスミノーゲンの例には Ｐｉｇ　　ａｓｎＨｇ−＋　ｇｉｎ：　ｔｈｒ３４ｇ″
ａ１ｍおよびＰｌｇ　ａｓｎＨｇ−＋　ａｓｐが含まれ
る。これらの修飾プラスミノーゲンはプラスミノーゲン
含有プラスミノーゲン活性化因子において用いられ、こ
れもまた本発明の一部を構成する。

プラスミノーゲン活性化因子の適当な例にはスト亭しプ
トキナーゼープラスミノーゲン活性化因子複合体ニアシ
ル化ストレプトキナーゼ−プラスミノーゲン活性化因子
（ＥＰ−０００９８７９，ＥＰ−００２８４８９およヒ
ＥＰ−００９１２４０に記載されるもの、＠に内部ペプ
チド結合切断を実質的に含まないｐ−アニソイルストレ
プトキナーゼ−プラスミノーゲン活性化因子複合体を含
む）；およびプラスミノーゲンの５つのクリングルドメ
インを含むハイブリッドプラスミノーゲン活性化因子（
ハイブリッドＰＡ）（例えば、ＥＰ−０１５５３８７，
ＥＰ−０２９０１１８（ＵＳＳＮ　１６３９５９　）ｅ
　ＥＰ−０２９２３２６（ＵＳＳＮ　１９５２０７）お
よびＥＰ−０２９７８８２（ＵＳＳＮ　２１２９１０）
に記載されるもの）が含まれる（すべての文献は参照て
いる。この誘導体は酵素の活性触媒部位が加水分解（そ
の擬−次反応速度定数が１０−６〜１０−Ｊ／秒の範囲
にある）によシ除去しうる基で遮断されていることに特
徴がある。

ＥＰ−００２８４８９は、と９わけ、内部ベフチド粘合
切断を実質的に含１ないｐ−アニソイルストレフトキナ
−モー１フｓフラスミノーゲン活性化因子複合体を開示
している。本発明は、特に、内部ペプチド結合切断を実
質的に含まないｐ−アニソイルストレプトキナーゼ−１
ｙｓプラスミノーゲン（ａａｎｌＢ−＋ｇｌｎ　：　ｔ
ｈｒ３Ｂ−＋ａｌｔ）　　活性化因子複合体；および内
部ペプチド結合切断を実質的に含まないｐ−７ニソイル
ストレプトキナ一ゼーｇｌｕプラスミノーゲ／（ａｓｎ
＊ｓｅ−ｇｉｎ：　ｔｈｒ！４藝−＋ａ１ｍ）活性化因
子複合体を提供する。これらの化合物はＥＰ−００２８
４８９に一般的に記載される方法によシ、シかしｌｙｓ
またはｇｌｕプラスミノーゲン（ａｓｎ鵞＄、→ｇｉｎ
：　ｔｈｒ３Ｂ−＋ａｌｔ）を用いることによシ製造で
きる。

詳細には、この方法はストレプトキナーゼと本発明によ
るプラスミノーゲンとを過剰の弐ＥＦの遮断剤（ここで
Ｅはこの遮断剤を触媒部位へ位置づける位置探索基であ
シ、そしてＦはこの探索基から触媒部位へ転移しうる基
、例えばｐ−アミジノフェニルｐ′−７ニセートである
）の存在下で混合することから成っている。

ＥＰ−０１５５３８７は２本鎖プロテアーゼの一方の鎖
を別の２本鎖プロテアーゼの一方の鎖に、または同一プ
ロテアーゼの同−鎖に結合させて成る線維素溶解活性ハ
イブリッドタンパク質を開示しており、このハイブリッ
ドタンパク質の少なくとも１本の鎖は、ハイブリッドタ
ンパク質が除去しうる遮断基によって随意に遮断される
線維素溶解活性にとって必要な触媒部位を有するように
、線維素溶解活性プロテアーゼから誘導されるものであ
る。

ハイブリッドタンパク質の例は組織型プラスミノーゲン
活性化因子（ｔ−ｐＡ）　Ｂ鎖またはウロキナーゼＢ鎖
に結合したプラスミンＡ鎖である。

ハイブリッドタンパク質はあるプロテアーゼの１本鎖と
別のプロテアーゼの１本鎖とを、場合により酸化条件下
で透析しながら、混合することによシ製造できる。

別法として、ハイブリッドタンパク質はそれぞれのタン
パク質の遺伝情報（ＤＮＡ配列）を取り出し、これを切
断および連結してハイブリッドタンパク質をコードする
新しいＤＮＡ配列を構築し、そしてこのＤＮＡを原核ま
たは真核宿主内で発現させることによシ作製できる。

酵素組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ｐＡ）を
構成するアミノ酸配列およびｔ−ＰＡをコードするｃ　
ＤＮＡのヌクレオチド配列は知られている（ｐｅｎｎｉ
ｃａ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８３：　Ｎａｔｕｒｅ、　
３０１゜２１４を参照）。ｔ−ＰＡ　　は線維未溶解作
用を有することが分かつている。

本明細書中で用いる組織型プラスミノーゲン活性化因子
（ｔ−ＰＡ）なる用語は、１９８２年７月２７日にイタ
リー国ペルガモで開催嘔れた「血栓症およびうつ血症に
関する国際会蟻」の第ｘｘｖｍミーティングでｔ−ＰＡ
Ｋついて定義された免疫学的性質を有するグループのプ
ラスミノーゲン活性化因子を意味する。

いろいろな形態のｔ−ＰＡ　　のアミノ酸配列は知られ
ている。上記文献Ｎａｔｕｒｅ　１９８３−はｔ−ＰＡ
のＬ鎖および成熟゛Ｓ鎖形態の配列を開示しておシ、ま
たＶｅｈａｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１３ｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ、　１９８４゜２、１０５１−７　　も論じて
おり、ζζでは最初に形成されたｔ−ＰＡのプロ配列を
除去することによシプロセッシングするとＳ鎖形態が得
られると報告している。ｐｏｈｌ　ｅｔ　ａｌ　、　Ｆ
ＥＢＳ　１ｅｔｔｅｒｓ。

１９８４、　Ｖｏｌ、　１６８　Ｊｉｌ、　２９−３２
はｔ−ＰＡのＮ末端多様性について言及しておシ、Ｕ鎖
形態を開示している。本明細書中で用いるｔ−ＰＡのア
ミノ酸配列のナンバリングシステムは成熟（Ｓ鎖）ｔ−
ＰＡについて文献Ｎａｔｕｒｅ　１９８３に記載される
ものであシ、Ｎ末端セリンが番号１となる。このシステ
ムによれば、Ｌ鎖ｔ−ＰＡは一３位にＮ末端グリシ／残
基を有し、そしてＵ鎖ｔ−ＰＡは４位にＮ末端バリンを
有する。ここでｔ−ＰＡについて言及するときは、この
種の変異形態をすべて含むものとする。

天然ｔ−ＰＡはＢまたは軽（Ｉ、）鎖とＡｔたは重（Ｈ
）鎖とから成っている。Ｂ鎖はこの酵素の活性部位を含
む。単鎖から２本鎖形態へｔ−ＰＡを変換するための切
断部位は残基ａｒｇ−２７５とｔｉｅ−２７６の間に存
在する。２本鎖形態において、これらの鎖はＡ鎖中の残
基４ｙｓ−２６４とＢ鎖中のｅ７！ｌ−３９５との間に
形成されるジスルフィド結合で結ばれている。

Ａ鎖は他の血漿タンパク質に見られる構造と類似した多
くの構造および機能的ドメイン：すなわち２つのトリプ
ルジスルフィド結合構造またはクリングル、成長因子様
ドメインおよびフィブロネクチン−フィンガー様ドメイ
ン、を有することが判明した（Ｎｙ、　Ｔ、ｅｔ　４１
９８４　：ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　３ｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、、　８１．５
３５５）。

アミノ酸残基４４−９１の領域は”成長因子ドメイン”
と名づけられた（Ｂａｎｙａｉ、　Ｌ、、ヱ１すＦＥＢ
Ｓ　Ｌｅｔｔ、　１６．ｊ−、３７，１９８３）。　こ
のドメインの大部分（残基５ｌ−８６）をコードし且つ
残基５０および８７を部分的にコードする遺伝情報は単
一のエクソン上に存在する。この領域内の最初から最後
のシスティン残基壇での領域（残基５ｌ−８４）はトリ
プルジスルフィド結合構造を有し、ここではｔ−ＰＡ成
長因子ドメインと呼ばれるであろう。

フィブロネクチンはフィブリン親和性に関与するフィン
ガードメインを単量体当シ１２有する（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、１５４．１５−２９（１９８６））。

これらのフィンガードメインのアミノ酸配列は知られて
いる（ＥＭＢＯＪ、　４．１７５５−１７５９（１９８
５）：Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１２８．６
０５−６２３（１９８２）：ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　
Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　８０．１３７−１４１
（１９８３））。ファクターｘＩＮ　　の一部はフィブ
ロネクチンのフィンガードメインどの構造相同性を示す
コトカ分かりた（Ｊ、　１３ｉｏ１．　（：ｈｅｍ、　
２６０　、５３２８−５３４１　ａｎｄ　１３６６６−
１３６７６（１９８５））。また、ｔ−ＰＡ酵素の一部
もフィブロネクチンのフィンガ３７）。アミノ酸残基６
−４３のこの領域はｔ−ＰＡフィンガードメインと名づ
けられた。このドメイ８１　、５３５５）。　　フィン
ガードメイン”なる用語は以後フィブロネクチンのフィ
ンガードメインと構造相同性を示すアミノ酸配列、また
はフィブロネクチンフィンガードメインそれ自体の配列
を表すために用いられる。

単鎖および２本鎖形態の酵素ウロキナーゼ型プラスミノ
ーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）を構成するアミノ酸配列
（Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅ、　Ｍ、　ａｎｄ　Ｃｏ１１ｅ
ｎ。

Ｄ、、　１９８６：　Ｂｌｏｏｄ、虹、　１５２９）お
よびヒトｕ−ＰＡをコードするｅＤＮＡのヌクレオチド
配列（）（ｏｌｍｅｓ、　Ｗ、　Ｅ、　ｅｔ　ａｌ　、
　１９８５：Ｂｉｏ／ｌｅｃｈｎｏｌｏｇｙａ、　９２
３−９２９）は知られている。ウロキナーゼ型プラスミ
ノーゲン活性化因子は線維素溶解作用を有することが分
かつている。２本領ｕ−ＰＡはＡ鎖とＢ鎖から成る。Ｂ
鎖がこの酵素の活性部位を含む。単鎖から２本鎖形態へ
ｕ−ＰＡを変換するための切断部位は残基１ｙｓ−１５
８とｔｉｅ−１５９の間にある。２本鎖形態において、
これらの鎖はＡ鎖中の残基ａｙｓ−１４８とＢ鎖中のａ
ｙｓ−２７９との間に形成されるジスルフィド結合で一
緒に結ばれている。

ここで用いるウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因
子（ｕ−ＰＡ）なる用語は、１９８２年７月２７日にイ
タリー国ベルガモで開催された「面枠症およびうつ血症
に関する国際会犠」の第ｘｘｖｍミーティングでｕ−Ｐ
Ａについて定義された免疫学的性質を有するグループの
プラスミノーゲン活性化因子を意味する。

ここで用いるｕ−ＰＡのアミノ酸およびヌクレオチド配
列のナンバリングシステムは）ｊｏｌｍｅｓ、ＷＥ、ｅ
ｔ　ａｌ、　１９８５（前掲）に記載されるものであシ
、Ｎ末端セリン残基を番号１とする。

上記の天然型のｔ−ＰＡおよびｕ−ＰＡのほかに、種々
の変異型タンパク質も知られておシ、例えばＥＰ−Ａ−
０２０１１５３，ＥＰ−Ａ−０２３３０１３゜ＥＰ−Ａ
−０１９９５７４，ＷＯ８６１０１５３８，ＥＰ−Ａ−
０２２７４６２゜ＥＰ−Ａ−０２５３５８２，ＷＯ８６
１０４３５１，ＥＰ−Ａ−０２３６０４０゜ＢＰ−Ａ−
０２００４５１，ＩＰ−Ａ−０２３８３０４，ＥＰ−０
２２５２８６゜ＤＥ−３５３７１７６、ＷＯ８７１０４
７２２およびＥＰ−Ａ−０２３６２８９を参照されたい
。ｔ−ＰＡおよびｕ−ＰＡについてここで言及するとき
は、天然型と変異型の両方を含むものである。

ＢＰ−０２９７８８２（ＵＳＳＮ２１２９１０）は、プ
ラスミノーゲンの５つのクリングルドメインをｔ−ＰＡ
　ｔたはｕ−ＰＡのＢ鎖に、それぞれｔ−ＰＡの残基２
７５と２７６の間のｔ−ＰＡ切断部位およびシスティン
残基２６４、またはｕ−ＰＡの残基１５８と１５９の間
のｕ−ＰＡ切断部位およびシスティン残基１４８　を含
むアミノ酸配列を介して結合して成るハイブリッドプラ
スミノーゲン活性化因子（）１を含む少なくとも七〇Ｂ
鎖部分を意味し、好ましくはそれぞれ残基２７６−５２
７または１５９−４１１から成っている。

アミノ酸の結合配列はノ・イブリッドプラスミノーゲン
活性化因子（ＰＡ）の製造の際に合成的に導入され、そ
して／ｌた天然配列から誘導される。

天然プラスミノーゲンは２本鎖プラスミンの鎖間ジスル
フィド結合に関与するシスティン残基をプラスミノーゲ
ンクリ／グル５のＣ末端側の５４８位と５５８位に含ん
でいる。好適な態様において、これらの残基は結合配列
中に存在しない。

ｔ−ＰＡまたはｕ−ＰＡＢ鎖からのプラスミノーゲンク
リングルのｉｎ　ｖＬｖｏ切゛断を防ぐために、結合配
列はｔ−ＰＡ　ｆ）ｃｙｓ−２６４またはｕ−ＰＡのａ
ｙｓ−１４８ＯＮ末端側でトリプシン様加水分解を受け
やすい部位が存在するのを避けるように選択すべきであ
ることが理解されるであろう。

ｔ−ＰＡのＢ鎖を用いる場合、アミノ酸の結合配列は好
ましくはｔ−ＰＡ残基２６４−２７５から成シ、よシ好
ましくは残基２６２−２７５から成る。

ｕ−ＰＡのＢ鎖を用いる場合、アミノ酸の結合配列は好
ましくはｕ−ＰＡ残基１４−８−１５８、より好ましく
は残基１３７−１５８から成っている。

１つの好適な面忙おいて、ハイブリッドＰＡは次式： ％式％） で表すことができ、ここでＢｔはｔ−ＰＡの残基２７６
−５２７　から成り、ｍはＯｌたは１（好ましくは１）
であシ、５個のＫｌ）はそれぞれプラスミノーゲンから
順次誘導されるクリングルドメインを表し、セしてＹお
よび５個の２１のそれぞれは独立してハイブリッドＰＡ
の製造に際して合成的に導入され、かつ／まだ天然プラ
スミノーゲンおよび／またはｔ−ＰＡ配列から誘導され
るアミノ酸の結合配列もしくは直接結合を表し、配列２
−は少なくともｔ−ＰＡの残基ａｙｓ−２６４およびａ
ｒｇ−２７５を含み、そして（Ｋｐ−Ｚｔ）ｓは本発明
に従って修飾されている１、 第２の好適な面において、ハイブリッドＰＡは次式： ％式％） で表すことができ、ここでＢｕはｕ−ＰＡの残基１５９
−４１１から成り、Ｙおよび５個のＺＵ　　のそれぞれ
は独立してハイブリッドＰＡの製造に際して合成的に導
入きれ、かつ／また天然プラスミノーゲンおよび／また
はｕ−ＰＡ配列から誘導されるアミノ酸の結合配列もし
くは直接結合を表し、配列ＺｓＵは少なくともｕ−ＰＡ
残基ａｙｓ−１４８および１ｙｓ−１５８を含み、ｍお
よび５個のＫｐのそれぞれは先に定義した通シであシ、
そして（Ｋｌ’−Ｚｕ）５は本発明に従って修飾されて
いる。

ｍが１である場合、配列Ｙはいろいろな形態の天然プラ
スミノーゲン（例えばｓＦｌ”１または１７ｓ７−形態
）に存在する配列の１つ（それぞれ、プラスミノーゲ／
残基１−８３または７８−８３）であシ得る。

場合によシ、ＩＰ−Ａ−０２４１２１０Ｋ一般的に教示
されるように、配列Ｙはフィブロネクチンのフィンガー
ドメインとの構造相同性を示すアミノ酸配列としてここ
で定義される１つ以上のフィンガードメイン（例えば、
フィブロネクチンフィンガードメインそれ自体またはｔ
−ＰＡフィンガードメイン、好ましくはｔ−ＰＡフィン
ガードメイン）から開始される。

フィンガードメインがｔ−ＰＡから誘導される場合、フ
ィンガードメイン配列は天然ｔ−ＰＡの残基６に先行す
る残基、例えばＵ、ＳまたはＬ鎖形態の天然ｔ−ＰＡの
それぞれ残基４と５、残基１から５まで、または残基−
３から５まで、を含むようにそのＮ末端で伸長していて
もよい。フィンガードメイン配列は好ましくは天然ｔ−
ＰＡの残基１−５を含むようそのＮ末端で伸長している
。

それぞれのフィンガードメイン配列は場合によシ天然ｔ
−ＰＡの成長因子ドメインに相当する第二のアミノ酸配
列に結合させることができる。従って、フィンガードメ
イン配列（例えばｔ−ＰＡの残基６−４３）をＦとして
表し、成長因子ドメイン配列（ｔ−ＰＡの残基５ｌ−８
４）をＧとして表すと、Ｙは式：　Ａ　−Ｆ　−Ｘ　ｔ
−および／またはＡ−Ｆ−Ｘ鵞−Ｇ−Ｘｓ−のＮ末端単
位（ここでＸｔ、Ｘ冨およびＸ３はハイブリッドＰＡの
製造に際して合成的に導入され、かつ／またＦおよびＧ
ドメインに隣接する天然ｔ−ＰＡ配列から誘導源れるア
ミノ酸の結合配列もしくは直接結合を表し、そしてＡは
Ｆドメインの任意のＮ末端伸長を表す）を１以上含む。

好適な面において、結合配列Ｘ、は、−ｐｒｏ−ｇｔｙ
−のようなアミノ酸配列のＣ末端に場合によシ結合され
た、天然ｔ−ＦＡの残基４４−５０および８５−９１か
ら選ばれるアミノ酸残基を含み、よシ好ましくは残基４
４−５０および残基８８−９１から成る。結合配列Ｘｔ
は好ましくは天然ｔ−ＰＡの残基４４−５０から選ばれ
る残基を含み、より好ましくは残基４４−５０から成る
。結合配列Ｘ、は好ましくは天然ｔ−ＰＡの残基８５−
９１から選ばれる残基を含み、よシ好ましくは、場合に
よシーｐｒｏ−ｇｌｙ−のようなアミノ酸配列のＣ末端
に結合された、残基８５−９１から成る。

追加ドメインの相互からのまたはノ＼イブリッドプラス
ミノーゲン活性化因子の残部からの１ｎｖｉｖｏ切断を
防止するために、ドメイン間結合配列および追加ドメイ
ンと１ラスミノーゲン活性化因子との間の結合配列は、
加水分解を受けやすい部位の存在を避けるように選択す
べきである仁とが理解されるであろう。従って、特に、
結合配列Ｘ１またはＸ、はアルギニンまたはりシン以外
の残基で終わるのが好ましいだろう。

Ｙは好ましくは６個までの追加のフィンガードメインを
含み、よシ好ましくは２個まで、最も好ましくは１個を
含み、それぞれのドメインは場合によシ成長因子ドメイ
ンに結合していてもよい。

Ｚｌ、　Ｚ宜、　Ｚ３およびｚ４は好ましくはそれぞれ
プラスミノーグ／クリｙグルドメイン１および２．２お
よび３．３および４、並びに４および５間の天然プラス
ミノーゲンドメイン間配列を表し、ｚ３は場合によシ本
発明に従ってｔｈｒ１４＠　で蓚飾されている。

Ｃ末端プラスミノーゲンクリングルドメインをｔ−ＰＡ
１７）Ｂ鎖に結合きせる適邑な配列（ｚｓ’）には次の
ものが含まする： １、　　（ＡＡＰＳＴＣＧＬＲＱＹＳＱＰＱＦＲ）２、
　（ＡＡＰＳＴＣＧＬＲＱＹＳＱＰＱＦＱ　）３、　　
　　（ＳＴＣＧＬＲＱＹＳＱＰＱＦＲ）（−文字アミノ
酸表記法）。これより、配列１および２はセリン残基に
よって結合されたプラスミノーゲンの残基５４２−５４
４およびｔ−ＰＡの残基２６３−２７５　　から成るこ
とが分かる。介在するセリン残基はプラスミノーゲンの
ｍａｒ−５４５またはｔ−ＰＡの５ｅｒ−２６２であり
うる。配列２では、ｔ−ＰＡの残基２７５がＥＰ−Ａ−
０２３３０１３に従ってグルタミンに置換されている。

配列３はｔ−ＰＡの残基２６２−２７５　　から成る。

Ｃ末端プラスミノーゲンクリングルドメインをｕ−ＰＡ
のＢ鎖に結合重せる好適な配列（２−）は次のものであ
る： （ＡＡＰＳＦＰＳＳＰＰＥＥＬＫＦＱＣＧＱＫＴＬＲＰ
ＲＦＫ）（−文字アミノ酸表記法）。この配列はプラス
ミノーゲンの残基５４２−５４６　　およびｕ−ＰＡの
残基１３７−１５８　　から成る。

本発明の好適なハイブリッドＰＡは次の構造を有する： １、　　Ｐｉｇ　１−５４１（ａｓｎ＊ａｓ→ｇｌｎ）
（ＡＡＰＳＴＣＧＬＲＱＹＳＱＰＱＦＲ：ｌ　ｔ−ＰＡ
２μｍｊλＺ２、　　Ｐｉｇ　１−５４１（ａｓｎ＊ｓ
＠−＋ｇｌｎ：　ｔｈｒｓｎｓ＋ａｌａ）（ＡＡＰＳＴ
ＣＧＬＲＱＹＳＱＰＱＦＲ）ｔ−ＰＡ　２７６−３、　
　Ｐｉｇ　１−５４１（ａｓｎ＊ｓｓ−＋ｇｌｎ：ｔｈ
ｒ３４ｇ−ｅａｌａ）（ＡＡＰＳＴＣＧＬＲＱＹＳＱＰ
ＱＦＲ）ｔ−ＰＡ　２７６−５２７　（ａｓｎ４４＠−
Ｉｇｉｎ） ４、　　Ｐｉｇ　１−５４１（ａｓｎＢ＠−＋ｇｌｎ；
　ｔｈｒ３４ｇ−ｅａｌａ）（ＳＴＣＧＬＲＱＹＳＱＰ
ＱＦＲ）ｔ−ＰＡ　２７６−５２７（ａｓｎ４４＠→ｇ
ｌｎ） ５、脱グリコＰｉｇ　１−５４１（ＡＡＰＳＴＣＧＬＲ
ＱＹＳＱＰＱＦＲ）ｔ−ＰＡ　２７６−５２７　（グリ
コジル化化合物をペプチド：Ｎ−グリコシダーゼＦで処
理した生成物） ６、脱グリコｐｉｇ　１−５４１［５ＴＣＧＬＲＱＹＳ
ＱＰＱＦＲ）ｔ−ＰＡ　２７６−５２７　（グリコジル
化化合物をペプチド：Ｎ−グリコシダーゼＦで処理した
生成物） ７、脱グリコｐｉｇ　１−５４１（ＡＡＰＳＦＰＳＳＰ
ＰＥＥＬＫＦＱＣＧＱＫＴＬＲＰＲＦＫ）ｕ−ＰＡ　１
５９−４１１（グリコジル化化合物をペプチド：Ｎ−グ
リコシダーゼＦで処理した生成物）。

ここでＰｉｇ　１−５４１はプラスミノーゲンの残基１
−５４１（すなわち、クリングル１−５を含む）を表し
、そしてかっこ内の記号は一文字アミノ酸表記法で示し
たアミノ酸残基であシ、１本鎖および２本鎖変異型、１
ｙａｙｓおよびｇｌｕｌ変異型、およびこれらの混合物
を含む。

本発明のフ゛ラスミノーゲン活性化因子（ＰＡ）は以下
の（１ｋ）〜（ｄ）に示すような既知のＰＡ含有複合体
に類似した薬学的に有用な複合体をもたらすように銹導
することができる： （ＩＬ）　　ＢＰ−Ａ−０１５５３８８に記載されるよ
うな酵素−タンパク質複合体であって、線維未溶解作用
に関与する酵素の触媒部位が可逆的結合基によってそれ
に結合あれたヒトタンパク質で遮断されているもの； （ｂ）　　ＢＰ−Ａ−０１５２７３６に記載される酵素
−タンパク質複合体であって、腸紐累溶解作用に関与す
る触媒部位以外の部位が少々くとも１種のヒトタンパク
質に結合された、少なくとも１種の随意に遮断された線
維素溶解酵素から成るもの； （ｅ）　　ＥＰ−Ａ−０１８３５０３に記載されるよう
なタンパク質−ポリマー複合体であって、可逆的結合基
によって少なくとも１種の水溶性ポリマーに結合された
薬学的に有用なタンパク質から成るもの；または （ｄ）　　ＥＰ−Ａ−０１８４３６３に記載されるよう
な酵素複合体であって、除去しうる遮断基で活性中心を
介して一緒に結合された複数のＩｆ＆維累連累溶解酵素
成るもの。

本発明のＰＡは、適宜に、上記複合体のいずれかの酵素
または（ヒト）タンパク質成分としてＰＡの代わシに用
いられる。

上記のＰＡ誘導体はＰＡそれ自体について以下で述べる
方法および組成物において用いることができる。

別の面において、本発明は、　ａ　ｓ　ｎ　ａｓｓの位
置に炭水化物構造を有する対応タンパク質をペプチド：
Ｎ−グリコシダーゼＦで処理することから成る、本発明
のプラスミノーゲンまたはプラスミノーゲン活性化因子
の製造方法を提供する。

ペプチド：Ｎ−グリコシダーゼＦ　（Ｔ、　Ｈ。

Ｐｌｕｍｍｅｒ、　Ｊ、　Ｈ，Ｅｌｄｅｒ、　Ｓ、　Ａ
ｌｅｘａｎｄｅｒ、　Ａ、Ｗ。

Ｐｈｅｌａｎ　ａｎｄ　Ａ、　Ｌ、　Ｔａｒｅｎｔｔｎ
ｏ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　（１９８４）２５９（１７）１０７００−
１０７０４）はグリコペプチダーゼＦという商標名でＢ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅ　ｉｍ　ｄｓら市販さ
れているフラポバクテリであって、グリコジルアミン接
合部で糖タンパク質を加水分解し、炭水化物成分を放出
して切断点のアスパラギンをアスパラギン酸に転化する
と考えられている＠ 第二の別の面において、本発明は、上記タンパク質をコ
ードするＤＮＡを組換え宿主細胞内で発現させ、そのタ
ンパク質産物を回収することから成る、本発明のプラス
ミノーゲンまたはプラスミノーゲン活性化因子の製造方
法を提供する。

上記タンパク質をコードするヌクレオチド配列から成る
ＤＮＡポリマーもまた本発明の一部を構成する。

本発明方法は、Ｍａｎｉａｔｉａ　ｅｔ、　ａｌ、。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　−Ａ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ：　Ｃｏ１ｄ　ｓｐｒｔｎｇ
　Ｈａｒｂｏｒ、１９８２およびＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ　ｖａｌｅ　１．　ｕ　ａｎｄｌ（Ｄ、　Ｍ。

Ｇｌｏｖｅｒ　ｅｄ、、　ＩＲＬ　　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｔ
ｄ）　　に記載されるような慣例的な組換え技術によっ
て行うことができる。

詳細には、本方法は次の工程から成っている：ｉ）　　
上記タンパク質をコードするヌクレオチド配列から成る
ＤＮＡポリマーを、宿主細胞内で、発現しつる複製可能
な発現ベクターを作製する工程： １１）宿主細胞を上記ベクターで形質転換する工程： １１１）上記の形質転換宿主細胞を上記ＤＮＡポリマー
の発現条件下で培養して、上記タンパク質を生産させる
工程；および ｉｖ）上記タンパク質を回収する工程。

本発明はまた適当なモノ、ジ、またはオリゴマーヌクレ
オチド単位を縮合させることによるＤＮＡポリマーの製
造方法を提供する。

この製法は化学的に、または酵素を用いて、もしくは２
つの方法の併用により、適宜にｉｎ　ｖｉｔｒ。

でまたはｉＨｖｉｖｏで行われる。従って、ＤＮＡポリ
マーはり、　Ｍ、　Ｒｏｂｅｒｔｓ　ａｔ　ａｌ　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９８５、２４．５０９０−５０
９８　に記載きれるような慣用方法を用いて、適描なり
ＮＡ断片を酵素で連結することにより作製できる。

ＤＮＡ断片は、必要なヌクレオチド配列を含むることに
よシ得られる。

制限酵素による消化は適当な緩衝液中２０〜７００の温
度で、一般には０．１〜１０μｆｆ）ＤＮＡを含む５０
μｔまたはそれ以下の容量にて行われる。

ＤＮＡの酵素による重合は、必１２に応じてヌクレオチ
ド三リン酸ｄＡＴＰ％ｄｃＴＰ％ｄＧＴＰおよびｄＴＴ
Ｐを含む緩衝液中１０〜３７℃の温度で、一般に５０μ
Ｌ以下の容量にて、ＤＮＡポリメラーゼ■（［１ｅｎｏ
ｗ断片）のようなりＮＡポリメラーゼを用いてｉｎ　ｖ
ｉｔｒｏで実施される。

ＤＮＡ断片の酵素による連結は適当な緩衝液中４℃ない
し室温で、一般に５０μを以下の容量にて、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼのようなりＮＡリガーゼを用いて実施される。

ＤＮＡポリマーまたは断片の化学合成は’Ｃｈ＊ｍ１ｃ
ａｌ　ａｎｄ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉ
ａ　ｏｆＧｏｎ＠Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　−Ａ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ’（ｅｄ、Ｈ，Ｇ、Ｇａ５
５ｅｎ　　ａｎｄ　　Ａ、Ｌａｎｇ）、ＶｅｒｌａｇＣ
ｈｅｍｉｅ、　Ｗｅｉｎｈｅｉｍ（１９８２）、ｔたけ
その他の科学文献、例えばＭ、　Ｊ、　Ｇａ１ｔ、　Ｈ
，Ｗ、　Ｄ、　Ｍａｔｔｈｅｓ。

Ｍ、Ｓｉｎｇｈ、Ｂ、Ｓ、５ｐｒｏａｔ、ａｎｄ　　Ｒ
，Ｃ，Ｔｔｔｍａｓ。

Ｎｕｃｌｅｉｅ　　Ａｅｉｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、
１９８２．ユ旦。

６２４３：Ｂ、Ｓ、５ｐｒｏａｔ　　ａｎｄ　　Ｗ、Ｂ
ａｎｎｗａｒｔｈ。

’ｌ’ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　Ｌｅｔｔｅｒ＋ｓ、１
９８３，２４，５７７１：Ｍ、Ｄ、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ
　　ａｎｄ　　Ｍ、ＨＣａｒｕｔｈｅｒ＋ｓ。

’ｐｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９８
０，２１，７１９：Ｍ、Ｄ、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ　　ａ
ｎｄ　　Ｍ、Ｈ，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ。

Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　、ｓｋｍｅｒｉ
ｃａｎ　　（：：ｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ、１９
８１，１０３，３１８５：　　Ｓ、Ｐ、Ａｄａｍｓｅｔ
　　ａｌ、、Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ（：：ｈｅｍｉｃａｌ　　５ｏｃｉｅｔ
ｙ、１９８３，１０５，６６１：　Ｎ、Ｄ。

５ｉｎｈａ、Ｊ、Ｂｉｅｒｎａｔ、ＪｏＭｃＭａｎｎｕ
ｓ、ａｎｄ　　Ｈ。

Ｋｏｅｓｔｅｒ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ、１９８４゜１２、４５３９：およびＨ
，Ｗ、　Ｄ、　Ｍａｔｔｈｅｓ　ｅｔ　ａｌ、　。

ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ、１９８４，３，８０１゜に記
載されるような同相法を用いて慣例的なホスホトリエス
テル、ホスファイ）ｔたはホスホルアミダイト化学によ
り実施できる。好ましくは、自動ＤＮＡ合成機が用いら
れる。

ＤＮＡ断片の正確な構造およびそれらを得る方法は目的
とするタンパク質の構造に依存している。

タンパク質をコードするＤＮＡ分子の構築のための適当
な戦略計画は尚業者にとって日常的な仕享である。

タンパク質をコードするＤＮＡポリマーの組換え宿主細
胞内での発現は、そのＤＮＡポリマーを宿主細胞内で発
現しうる複製可能な発現ベクターを用いて実施される。

この発現ベクターは新規であって、本発明の一部を構成
する。

複製可能な発現ベクターは、本発明に従って、宿主細胞
と適合しうるベクターを開裂させて完全なレプリコンを
有する線状ＤＮＡセグメントを得、この線状セグメント
を１以上のＤＮＡ分子（この線状セグメントと一緒にな
ってタンパク質をコードする）と連結条件下で連結する
ことにより作製できる。ＩｖＩ！状セグメントと２以上
のＤＮＡ分子との連結反応は、所望によシ同時に、また
は段階的に行われる。従って、ＤＮＡポリマーは予備形
成されても、ベクターの構築中に形成されてもよい。。

ベクターの選択は宿主細胞によって幾分かは決定される
であろう。宿主細胞はＥ、ｃｏｌｔのような原核生物、
またはマウスＣ１２７、マウスミニａ　−マ、チャイニ
ーズハムスター卵巣、真菌（例えば糸状確や単細胞”酵
母”）もしくは昆虫細胞（例えばショウジヨウバエ）の
ような真核細胞であ夛うる。宿主細胞はまたトランスジ
ェニック動物内に存在しうる。適当なベクターはプラス
ミド、バクテリオファージ、コスミド、および例えばバ
キュロウィルスやワクンニアから誘導される組換えウィ
ルスである。

ｙｒｍ可能な発現ベクターの作製はＤＮＡの制限、重合
および連結用の適当な酵素を用いて、例えばＭａｎｉａ
ｔｉｓらの上記文献に記載の方法によシ慣例的に実施さ
れる。重合および連結はＤＮＡポリマーの製造について
先に説明したとおシに行うことができる。制限酵素によ
る消化は適当な緩衝液中２０〜７０℃の温度で、一般に
は０．１〜１０１１１を本発明の複製可能な発現ベクタ
ーで形質転換条件下に形質転換することによシつくられ
る。適当な形質転換条件は′慣例的であシ、例えばＭａ
ｎｉａｔｉｓらの上記文献または”　ＤＮＡ　（’ｌｏ
ｎｉｎｇ’Ｖｏ１．　ｎ、　Ｄ、　Ｍ、　Ｇｌｏｖｅｒ
　ｅｄ、、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｔｄ。

１９８５　Ｋ記載されている。

形質転換条件の選択は宿主細胞によって決定される。こ
うして、ｇ、　ｃｏｌｉのような細菌宿主はＣａ（、ｔ
＊　　の溶液で処理される（（：：ｏｈｅｎ　ｅｔ　ａ
ｌ。

ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、Ａｅａｄ、　Ｓｃ：１．．１９７
３，６９．２１１０）か、１またはＲｂＣ／＝％ＭｎＣ
２２，酢酸カリウムおよびグリセロールの混合物から成
る溶液で処理し、その後３−（Ｎ−モルホリノツーフロ
パン−スルホン酸、ＲｂＣ１およびグリセロールで処理
することができる。哺乳動物細胞の培養物は細胞上への
ベクターＤＮＡのカルシウム共沈により形質転換される
。

宿主細胞がトランスジェニック動物内にある場合、形質
転換は顕微壮大により行われる（例えばＱｏｒｄｏｎ、
に、　　ｅｔ　　ａユ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　
　１９８７５１１８３−を参照）。糸状菌の形質転換も
論評されている（Ｔｉｍｂｅｒｌａｋｅ、　Ｗ、　Ｅ、
　ａｎｄ　Ｍａｒｓｈａｌｌ。

Ｍ、　Ａ、　、　５ｃｉｅｎｃｅ　１９８９２４４１３
１３）。

本発明はまた本発明の複製可能な発現ベクターで形質転
換された宿主細胞にも及んでいる。形質転換宿主細胞を
ＤＮＡポリマーの発現条件下で培養することは、例えば
Ｍａｎｉａｔｉｌらの上記文献および′″ＤＮＡ　　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ”　Ｋ記載される！５Ｋ。

慣例的に行われる。従って、好ましくは細胞は栄養素と
共に供給され、４５℃以下で培養される。

タンパク質発現産物は宿主細胞に応じて慣用法により回
収される。こうして、宿主細胞がＥ。

ｃｏｌｔのような細菌である場合は、それを物理的にま
たは化学的にもしくは酵素により溶菌して、この溶鉋液
からタンパク質を単離するか、あるいは分泌ベクターを
用いて細胞周辺腔または栄養培地から生産物を単離する
。宿主細胞が哺乳類である場合は、一般に栄養培地から
生産物を単離する。

宿主細胞がトランスジェニック動物内にある場合は、生
産物をミルクから分離する。

ＤＮＡポリマーはタンパク質を発現する安定した形質転
換哺乳動物細胞系列の選別のために作製されたベクター
（例えば、チャイニーズノ・ムスター卵巣細胞内の増幅
ベクターまたはウシノ（ビローマウイルスベクター）に
挿入される（ＤＮＡｃｌｏｎｉｎｇ　Ｍｏ１．　ＩＩ　
Ｄ、　Ｍ、　Ｇｌｏｖｅｒ　ｅｄ、　ＩＲＬｐｒｅｓｓ
　　１９８５　：　Ｋａｕｆｍａｎ、　Ｒ，Ｊ、　ｅｔ
　　ａｌ、　ｌＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ
ｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　５゜１７５０−１７５９．
１９８５　：　Ｐａｖｌａｋｉｓ　Ｇ、　Ｎ、　ａｎｄ
Ｈａｍｅｒ、　Ｄ、　Ｈ，、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　
　ｏｆ　　ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　
ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ（ＵＳＡ）８０、３９７−４０
１．１９８３　：　Ｇｏｅｄｄｅｌ、　Ｄ、　Ｖ。

ｅｔ　ａｌ、、　　欧州特許公開第００９３６１９号、
１９８３を参照）。

宿主細胞に応じて、本発明によシ得られたタンパク質は
いろいろな程度にグリコジル化されることが理解される
であろう９さらに、　ｐｏｈｌ　　ｅｔ、ａｌ、。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１９８４．２３　、３７
０１−３７０７およびＲａｓｍｕ８ｓｅｎ、Ｊ、Ｒｌａ
ｔ　ａｌ、、　Ｂｌｏｔｅｅｈ　８８゜ｐ、９７，０ｎ
ｌｉｎｅ　　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｎｅｒ
。

ＵＫ、１９８８．によって観察されたように１修飾され
ていない、自然界に存在するｔ−ＰＡにもいろいろな程
度のグリコジル化が見られる。プラスミノーゲンも様々
なグリコジル化度を示すＱ（ａｙｅｓＭ、　Ｌ、　Ｊ、
　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５４：８７６８．１９７
９およびＭａｒｔｉ　、　Ｊ、　ａｔ　ｍｌ、　、　Ｅ
ｕｒ、　Ｊ、１３ｉｏｅｈｅｍ。

１７３．５７．１９８８）。残存するグリコジル化部位
がＥＰ−Ａ−０２３８３０４，ＥＰ−Ａ−０２２５２８
６゜ＤＥ−３５３７１７６またはＷＯ３７１０４７２２
ＶＣ開示されるような遺伝子工学的手法により除かれる
（例えば、ｔ−ＰＡ鎖中のａｓｎ４４＠をグルタミンに
変える）変異型のタンパｌり質産物も包含される。

本発明のタンパク質はこの種のグリコジル化変異を含む
ことが理解されるであろう。

また、発現条件に応じて、本発明に従って作られたタン
パク質は単鎖または２本鎖もしくはこれらの混合物とし
て存在することが認められるであろう。本発明はこの種
の形態のすべてに及んでいる。

本発明の１つの面において、タンパク質はプラスミノー
ゲンから誘導された５つのクリングルドメインを含むＡ
鎖およびｔ−ＰＡの残基２６４および２７５ｔたはｕ−
ＰＡの残基１５８および１４８から成るアミノ酸の結合
配列に連結された、天然ｔ−ＰＡｉたはｕ−ＰＡｆ）Ｂ
鎖から成る本発明のノ・イブリッドＰＡである。

このハイブリッドＰＡのＡ鎖はＥＰ−０−１・５５３８
７に記載されるような線維素溶解作用を有するハイブリ
ッドタンパク質の一方の鎖として用いることができる。

ハイブリッドＡ釦、ノ１イブリッド人鎖をコードするＤ
ＮＡ、および線維素溶解活性プロテアーゼのＢ鎖に結合
されたノ１イブリッドＡ鎖から成るハイブリッドタンパ
ク質（その触媒部位は除去しうる遮断基で遮断されてい
てもよ―）はすべて本発明の一部を構成するものである
。

ハイブリッドＡ鎖は穏やかな還元によってそのＢ鎖から
分離することによシ得られる。別法として、ハイブリッ
ド人鎖はそれをコードするＤＮＡを組換え宿主細胞内で
発現させ、その後ノ・イブリッドＡ鎖産物を回収するこ
とによシつくることもできる。線維素溶解活性プロテア
ーゼのＢ鎖に結合されたハイブリッドＡ鎖から成るハイ
ブリッドタンパク質は、（ａ）上記のＡ鎖とＢ鎖を酸化
条件下で混合するか、または（ｂ）　Ａ鎖をコードする
ＤＮＡとＢ鎖をコードするＤＮＡとを連結して、その連
結ＤＮＡを原核または真核細胞宿主内で発現させ：その
後場合によりハイブリッドタンパク質の触媒部位を除去
しうる遮断基で遮断する；ことによシ得られる。酸化お
よび還元条件は一般的にＥＰ−Ａ−０１５５３８７に記
載されている。

得られたハイブリッドタンパク質はハイブリッドＰＡそ
れ自体について以後で説明する方法および組成物におい
て用いることができる。

本発明のタンパク質またはその複合体は、紳維素溶解活
性に必要な触媒部位が除去しうる遮断基で遮断されるよ
うに、さらに誘導体化することができる。

本明細書中で用いる“除去しうる遮断基”なる表現は、
加水分解の擬−次速度定数、がｐ　Ｈ７，４０等張水性
媒体中３７℃で１０−’／秒〜１０４／秒、よシ好まし
くは１０−’／秒〜１０−”７秒、最も好ましくは１０
−１秒〜１０１　秒の範囲であるような速度で加水分解
によシ除去できる基を含む。

この種の遮断基は欧州特許第０００９８７９号に記載さ
れておシ、置換または無置換のベンゾイルまたはアクリ
ロイルのようなアシル基を含む。ベンゾイル遮断基のた
めの適当な置換基はノ１０ゲン、Ｃｌ−６アルキル５ｃ
１−６アルコキシ、Ｃｔ　−アルカノイルオキシ、Ｃｌ
−６アルカノイルアミノ、アミノまたはｐ−グアニジノ
などである。アクリロイル遮断基のための適当な置換基
はＣ＋−ｓアルキル、フリル、フェニルマタはＣｔ−Ｓ
アルキルフェニルである。

好適す面におφて、プラスミノーゲン活性化因子がｔ−
ＰＡｔたはｕ−ＰＡのセリンプロテアーゼドメインを含
む場合、除去しうる遮断基は３位または４位においてハ
ロゲン原子で置換きれ且つ場合によ９１個以上の弱い電
子吸引基または電子供与基でさらに置換された２−アミ
ノベンゾイル基であシ、その場合この誘導体の加水分解
の擬−次速度定数は、０．０５Ｍリン酸ナトリウム・、
０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．０１％”／’６界面活性
剤（分子量約１３００のポリオキシエチレンソルビタン
モノオレエート）を含む緩衝系ｐ　Ｈ７，４中３７℃で
測定したとき、６．０Ｘ１０−’〜４．ＯＸ　１０−’
／秒の範囲である。

誘導体の加水分解の擬−次速度定数は６．０Ｘ１０−’
〜２．７５Ｘ１０−’／秒、好ましくは６．０Ｘ１０−
１〜２．５Ｘ　Ｉ　Ｏ−７秒、よシ好ましくは６．ＯＸ
　１０−’　〜２．ＯＸ　１０−’／秒、さらに好まし
くは６．ＯＸ　１０−５〜１．５Ｘ１０−７秒、最も好
まり、＜Ｇ！　７．ｏｘｔｏ−ｓ　〜１．５Ｘ１０−’
／秒の範囲であるのが好適である。

好ましくは、２−アミノベンゾイル基はその４位がハロ
ゲン原子で置換され、ノ・ロゲン原子はフッ素、塩素ま
たは臭素である。この基がざらに置換てれる場合、好適
な基は環の３位または４位のＣＩ−６アルキル、ＣＩ−
アルコキシまたはＣＩ−６フルケニル置換基である。有
利には、遮断基は４−フルオロ−２−アミノベンゾイル
、４−クロロ−２−アミノベンゾイルもしくは４−プロ
モー２−アミノベンゾイルである。

緩衝液中の好適な界面活性剤は商標名Ｔｗｅｅｎ８０を
有する製品である。

本発明訪導体の製造方法はプラスミノーゲン活性化因子
を遮断剤ＪＫ　（ここでＪは酵素の触媒部置換され且つ
場合によ９１個以上の弱い電子吸引基または電子供与基
で嘔らに置換された２−アミノベンゾイル基である）と
反応きせることから成っている。基Ｊの例には４−アミ
ジノフェニルおよび２−クロロ−４−アミジノフェニル
が含まれる。好適な遮断剤ＪＫは４−アミジノフェニル
２′−アミノ−４′−フルオロベンゾエート；４−アミ
ジノフェニル２′−アミノ−４’−クロロベンゾエート
：および４−アミジノフェニル２′−アミノ−４′−ブ
ロモペンゾエートである。上記の遮断剤ＪＫはＥＰ−０
２９７８８２（ＵＳＳＮ２１２９１０）に開示されてい
る。

遮断反応は好ましくは水性媒体中７、θ〜８．５のｐＨ
および０〜３０℃の温度で実施される。遮断剤の好適な
濃度範囲は０．Ｏ１〜２、θミリモルであシ、好適な酵
素濃度範囲は１〜５００マイクロモルである。

ある場合には、１−アルギニン、１−リシンまたは６−
アミノヘキサン酸のような酵素可溶化または安定化用添
加剤の存在下で遮断反応を実施することが望ましい。こ
れらの物質は遮断剤と適合しうろことが判明した。

本発明のタンパク質および誘導体は適当には薬剤組成物
の形で投与される。従って、本発明は本発明のタンパク
質または誘導体を製剤学的に許容しうる担体と組み合わ
せて成る薬剤組成物を提供する。

本発明による組成物は、ヒトへの静脈内投与に適した薬
剤組成物として常法に従って製剤化することができる。

一般に、静脈内投与に適した組成物は滅鉋等張水性緩衝
液中の無菌酵素の溶沿である。必要に応じて、組成物は
タンパク質または銹導体を溶解状態に保つための可溶化
剤および注射部位の痛みをやわらげるためのリグノカイ
ンのような局所麻酔剤をさらに含有する。一般に、タン
パク質または誘導体は単位投与形態で、例えば活性単位
のタンパク質量を示すアンプルまたは小袋のような気密
容器に入れた乾燥粉末または無水濃縮物として供給され
るであろう。組成物が本発明の誘導体を含む場合、また
はタンパク質が除去しうる遮断基を含む場合には、遊離
のタンパク質を放出する時間が表示されるであろう。タ
ンパク質が点滴によって投与される場合、それは無菌の
薬品縁１注射用水ｍ″！または生理食塩水を含むぴんと
共に分配されるであろう。タンパク質が注射によって投
与される場合、それは注射用滅菌水または生理食塩水の
アンプルと共に分配される。注射用または点滴用組成物
は投与に先立って諸成分を混合するととｋよシ調製され
るであろう。

投与すべき物質の量は必要とされる線維素溶解の量、線
維素溶解の速度、血栓塞栓症の重症度、並びに血餅の位
置および大きさに左右されるだろう。正確な投与量およ
び投与方法は、必然的に症状の本質を考慮した上で、諸
般の情況に応じて医師によって決定されねばならない。

しかしながら、一般に、血栓症を治療しようとする患者
は０．０１〜１０ＩＩｖ／に４体重（例えば０．１０〜
２．Ｏｖ／Ｉｖ）の１日分の用量を、例えば５回までの
注＃ｇまたは点滴のいずれかで受は取るであろう。

上記の投与量範囲において、有毒な副作用は本発明化合
物に関して全く見られなかった。

従って１本発明の別の面において、有効かつ無毒性量の
本発明タンパク質または誘導体を患者に投与することか
ら成る、血栓症の治療方法が提供される。

その他の面において、本発明は血栓症の治療用医薬を製
造する際の本発明タンパク質または誘導体の使用を提供
する。

本発明はまた活性治療物質として用いるための、特に血
栓症の治療に用いるための本発明タンパク質または誘導
体を提供する。

（ｏ　　ＤＮＡ切断 一般的に、約１μｔのプラスミドＤ　Ｎ　Ａ　ｔ　？、
：　ハＤＮＡ断片の切断は、約２０μｔの適当な緩衝液
中で約５単位の制限酵素（ｉたは酵素）を用いて行った
。

（ｉＤ　　平滑末端の形成 平滑末端を必要とする場合は、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ
ａｌ、　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ　
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ
ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　］［、ａｂｏｒａｔｏｒｙ。

１９８２）　　に記載されるように、ＤＮＡ調製物をＤ
ＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ断片）で処理するこ
とによシ形成させた。

（ｉｉｉ　）　　　ンカー　　いての“付着末端″の形
成単一の又は複数の制限部位をコードするキナーゼ処理
した短鎖オリゴヌクレオチドリンカーを平滑末端化した
断片に連結し、リンカ−を適当な制限エンドヌクレアー
ゼで消化して、以後の操作に必ｇｆｋ″″付着末端”を
形成させた。（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ−Ａ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　ＣｏｌｄＳ
ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　
１９８２）（ｉｖ）ＤＮＡ断片の連結 連結反応・はＭａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ　、（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ　−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａ
ｒｂｏｒ　Ｉ、ａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８２）に記
載されるとおシに行った。

（Ｖ）　　形質転換 プラスミドＤＮＡのＥ、ｅｏｔｔ　　への形質転換は、
Ｑｉｂｃｏ　ＢＲＬ（ス”　’）トランド、ベーズリー
）Ｋより供給されるコンピテントＨＢＩＯＩ細胞を用い
て、製造者の説明書どおシに行った。

（■１）プラスミドの調製 プラスミドＤＮＡの大規模！！Ｉａｌ製およびプラスミ
ドのミニ調製はＭａｎｉａｔｉｓ　ａｔ　ａｌ　、　（
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ　−Ａ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　
Ｈａｒｂｏｒ　Ｉ、ａｂｏｒａｔｏｒｙ、　（１９８２
））に記載嘔れるとおりに実施した。

ＤＮＡ断片はＭａｎｉａｔｉｓ　ａｔ　ａｌ、（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ　Ｍａｎｕａｌ　、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ
ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８２）に記載され
るとおシに、ＬＭＰアガロースゲルから分離した。別法
として、切り出したゲルバンドはＧＥＮＥＣＬＥＡＮＴ
Ｍ（Ｓｔｒａｔｅｅｈ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ。

ロンドン）を用いて、製造者の説明書どおりに精製した
。

（ｖｉｉｉ）　ＤＮＡ断片の放射性標識ＤＮＡ断片はｐ
ｅｉｎｂｅｒｇおよびＶｏｇｅｌｓｔｅｌｎの方法に従
って〔α−”Ｐ）ｄＣＴＰで放射性標識した。この方法
はＯｌｉｇｏｌａｂｅｌｌｉｎｇ”Ｋｉｔを用いて行っ
た（スウェーデン国つプサラ、ｐｈａｒｍａｃｌａ　。

ｐｈａｒｍａｅｌａ　ＡＢ、分子生物学部門）。

（ｉｘ）オリゴヌクレオチド オリゴヌクレオチドはアプライド・バイオシステムダ３
８１人型ＤＮＡ合成機で製造者の説明書どおシに作製し
、　Ｍａｎｉ１目ｓ　らの上記文献に記載されるように
キナーゼで処理した。プラスミドの構築に使用する場合
は、オリゴヌクレオチドを（特に指定しない限り）９５
℃で５分間−緒に加熱し、次に室温まで徐々に冷やして
アニーリングした。アニーリングしたオリゴヌクレオチ
ドはその後連結反応で使用した。４種のオリゴヌクレオ
チドをアニーリングする場合、アニーリング反応は上記
のとおシに行ったが、２つの反応混合物がそれぞれ一対
の相補オリゴヌクレオチドを含むように実施した。冷却
後、２つの反応混合物は連結に先立って混合した。

（Ｘ）ＤＮＡ塩基配列決定 （荀　１本鎖法：ヌクレオチド配列の決定は、■Ｓ標識
したｄＡＴＰを用いて、Ｓａｎｇｅｒ、　Ｓ、、　Ｎ１
ｃｋｌｅｎ。

Ｓ、　ａｎｄ　Ｃｏｕｌｓｏｎ、　Ａ、　Ｒ，（１９７
７）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｅａｄ、Ｓｃｉ、ＵｓＡ　　７４．５４６３−５４６
７に記載されるようにＳａｎｇｅｔのジデオキシ・チエ
イン・ターミネーション法により実施した。この方法は
主として長鎖ＤＮＡの配列決定に使用した。

（ｂ）２本鎖法：塩基配列決定は３ｅｇｕｅｎａｓｅＴ
Ｍ″（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて、本質的に
製造者の説明書どおシに行った。この方法は主としてオ
リゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド／プラスミ
ド連結配列の確認のために使用した。

（ａ）　　小規模 細胞の調製：細胞はトリプシン処理し、約２６４×１０
’細胞／３５露培養皿でまき、５％ＣＯ鵞／９５％窒気
の雰囲気にて加湿インキユベーター（３７℃）を用いて
１．５　ｍ増殖培地〔これは１０チ崩清（０２１−６０
１０）、ペニシリン／ストレプトマイシンの１チ原液（
０４３−５０７０）、２％重炭酸ナトリウム溶液（０４
３−５０８０）、１チグルタミン原液（０４３−５０３
０）を含有するヘペス緩衝化ＲＰＭ１１６４０培地（０
４１−２４００）であるＳ　Ｇｉｂｃｏ社、スコツトラ
ンド、ペーズリー〕中でインキエペートした。７２時間
後、細胞に新しい培地を再供給し、２４時間後トランス
フェクションのために使用した。

トランスフェクション法：トランスフェクションの３時
間前に培地をイーグルＭＥＭ（０４１−１０９５）、１
０％血ｍ、１ｓペニシリン／ストレプトマイシン、１％
グルタミンおよび１％非必須アミノ酸（０４３−１１４
０）Ｋ変ｔた。トランスフェクションは’ＤＮＡ　　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ’　Ｅｄ、Ｄ、Ｍ、Ｇｌｏｖｅｒ（Ｃｈａ
ｐ、　１５．　Ｃ，Ｇｏｒｍａｎ）　Ｋ記載されるよう
なカルシウム共沈を使用した。グリセロール原液および
５ｍＭブチレート処理を用いた。トランスフェクトした
細胞から分泌されたプラスミノーゲン活性化因子は１．
０ｍ／ＲＰＭＩ　　１６４０培地〔上記のとおシである
が、自消を含まず４％大豆ペプトン（Ｓ　ｉ　ｇｍａ　
）上階）中で２４時間収穫し、そして標準ｔ−ＰＡに関
連してフィブリン平板を用いて活性を測定した（Ｊ、　
Ｈ６１ｌｊｏｂｉｎｓｏｎ、　Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｒｅｓ
、。

１９８４：３３．１５５）ｃ これとは別に％　ＨＩＬＪＬ細胞は５　Ｘ　Ｉ　Ｑ’／
培養皿でまき、この場合細ｊｌは２４時間後に新しい培
地を再供給し、その後上記のとおりに使用した。

（ｂ）　　大規模 細胞の調製：細胞はトリプシン処理し、　３０＋１１／
増殖培地（上記のとおシ）中に約２．５Ｘ１０’細胞／
１７５α意フラスコの密度でまいた。７２時間後、追加
の２５ｍ増殖培地を加え、細胞は（上記のように）２４
時間後にＤＮＡ　）ランス７エクシヨンのために使用し
た。フラスコあたｆｉ２５＋ｄの収穫培地を用いた。

これとは別に、細胞は約２．０Ｘ１０’細胞／フラスコ
の密度でまき、９６時間のインキュベーション後に２５
−の増殖培地を加え、その後上記のように細胞を使用し
た。

小規模および大規模プロトコールで用いた２つの異なる
播種率および培地再供給時期は、実験の最大効果をあげ
るための時機を選ぶために考え出された。両方の組のプ
ロトフールとも活性化因子の効率のよい発現をもたらし
た。

泳動することＫよジニトロセルロース（ＮＣ）上にプロ
ッティングした。ＮＣ上の未反応部位は５チウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）／リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）ＰＨ７
，２で１時間遮断し、続いてｌチＢ５Ａ１０、ｓ＊　Ｔ
ｖｅｅｎ　８０／ＰＢＳ　ｐＨ７，２（希釈剤）中のウ
サギ抗ｔ−ＰＡＢ鎖１ｔｒＧ　（４８μＰ／−）と共に
２時間インキュベートした。ＮＣを９．５　％　’）ｗ
ｅａｎ８０／ＰＢＳｐＨ７，２中で５分間ずつ３回洗い
、その後ビオチニル化第二抗体（Ｊａｎａｓｅｎ　：２
ｐｔ／−希釈剤）中で１時間インヤニベートした。ＮＣ
を上記のとおυに洗い、希釈剤中のＡｕｒｏｐｒｏｂｅ
ＴＭＢＬ＋ストレブトアビジｙ　（Ｊａｎｓｓｅｎ）１
　：１００と共Ｋ。

２時間インキュベートした。ＮＣは上記のように洗った
後、脱イオン水中で１分間洗い、工ｎｔｅｎ３ＥＴＭＩ
　Ｋｉｔ（Ｊａｎｓｓｅｎ）を用いて１５〜２０分間銀
増強させた。全工程は穏やかに振とうしながら周囲温度
で行った。

いくつかの場合に、第一抗体はプラスミノーゲンに対す
るネズミモノクローナル抗体（製品３６４２、Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）に変えた：その場
合には、第二抗体もウサギＩｇＧではなくネズミに対し
て誘導された抗体に変えた。

＜　ｘｉｉ＋　＞プラスミノーゲン／ストレプトキナー
ゼ複フィブリン平板は内因性プラスミノーゲン、ウシト
ロンビン（４ＮＩ−Ｈｕ／ｓｄ）およびストレプトキナ
ーゼ（３０ｎＭ）と共にウシフィブリノーゲン（４ｓｖ
／ｄ）を含んでいた。培地または標品の１０μを試料を
二通りずつフィブリン平板に加え、３７℃で１６時間イ
ンキュベートした。溶解ゾーン ンの直径に対してｌｏｇ　　プラスミノーゲン／ストレ
プトキナーイ濃度をプロットすることによシ、本質的に
直線状の検量線が得られるであろう。

（ｘｉｖ）ストレプトキナーゼ／８２２５１検定プラス
ミノーゲンは発色性基質検定で測定し、適宜に対照の未
使用収穫培地または緩衝液中のｇｌｕ−プラスミノーゲ
ン（０，３〜３０ｎＭ）によシ修正した。

２５μｔの標準または被検試料は０．２１１ｉｄ−’大
豆トリプシン阻害剤を含む０．１　Ｍ　）ジェタノール
アミンｐＨ８，０中の１　ｍＭ　Ｈ−Ｄ−ｖａｌ−１ｅ
ｕ−１ｙｓ・ｐ−ニトロアニリド・２ＨＣＬ　（Ｓ　２
２５１　：ＦｌｏｗＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　２５
０ｐＬと、場合によルストレプトキナーゼ（３μＭ）と
共に１混合した。この溶液を存在する活性レベルに応じ
て１〜２４時間３７℃でインキュベートした。Ａ４＋ｌ
Ｉ値はＩ）ｙｎａｔｅｅｈ　Ｍｉｎｉｒｅａｄｅｒ　Ｉ
Ｉ　？イクロタイタープレート読取装置を用いて測定し
た。

形態の確認 （ｉ）配列 プラスミノーゲンアミノ酸のナンバリングは、５ｏｔｔ
ｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ　　（１９７８）　
Ａｔ１ａｓ　ｏｆＰｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　
ａｎｄ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ＶＯＩ。

５、５ｕｐｐｌ、　３．　ｐ９１．　Ｎａｔｉｏｎａｌ
　１３ｉｏｍｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　ｐｏｕｎ
ｄｓ’■ｏｎ、　５ｉｌｖｅｒ　Ｓｐｒｉｎｇ。

ＭＤ、　　に基づくものであるが、Ｆｏｒａｇｒｅｎ、
　ｙｌ。

ｅｔ　ａｌ　　（１９８７）　ＦＥＢＳ　　Ｌｅｔｔｅ
ｒｓ、　２１３゜２５４−２６０　　によって確認され
た追加のアミノ酸残基を含めるように変更した。プラス
ミノーゲンのヌクレオチド配列はＦｏｒｓｇｒｅｎらの
上記文献に記載のとおシである。全部のｔ−ＰＡのナン
バリングはｐｅｎｎｉｃａらの上記文献（１９８３）に
記載の通シである。特に指定しない限シ、ヌクレオチド
番号はプラスミノーゲンに関するものである。

（ｉＤ　　Ｎ末端 ｇｌｕｌ　　タンパク質が天然（成熟）プラスミノーゲ
ンＮ末端、すなわちアミノ酸残基１、を含むことを示す
。

１ｒ３７ｓ　　タンパク質が７゛ロセツシングされた１
ｙｓｙｓ　Ｎ末端を含むことを示す。また、別のプロセ
スはｍｅｔ＠＠　　またはｖａ１７ｇＫ形成する。

（ｍ　＞タンパク質ドメイン 実施例に記載されるタンパク質ドメインは便宜上次のよ
うに略記される： １、　　ｔ−ＰＡ：　　Ｂｔ＝アミノ酸残基２７６−５
２７２、　プラスミノーゲン： ＫＩＰ＝アミノ酸残基　８４−１６２ に鵞Ｐ＝　　　ｚ　　　　１６６−２４３ＫｓＰ−Ｉ　
　　　２５６−３３３ ＫａＰ冨　　　ｚ　　　　　　　３５８−４３５ＫｓＰ
＝　　　　１　　　　　４６２−５４１５つのプラスミ
ノーゲンクリングル Ｋｔ　−Ｋｓ　＝アミノ酸残基８４−５４１（ｉｖ）タ
ンパク質傾の形態 ＳＣタンパク質が単鎖形態であることを示す。

ｔｃタンパク質が２本鎖形態であることを示す。

（Ｖ）ニヱＬ二 ｐＴＲＥ１２−（ＥＰ−０２０１１５３）−基本的な発
現ベクターｐＴＲＥ１５−（ｇＰ−０２０１１５３）−
野生型ｔ−ＰＡをコードする ■、ベクターの構築およびハイブリッドタンパク質の発
現 参考例１および２、並びに実施例１〜１２におけるタン
パク質発現は）ｌ　ａ　Ｌａ細胞によシ実施された。

参考例１ プラスミノーゲン１−５４４／１−ＰＡ２６２−５２７
（Ｈ２Ｏ２） プラスミドの構築 部分プラスミノーゲンｅＤＮＡクローンは、ヒト肝臓ｅ
ＤＮＡライブラリーから、Ｍａｌｉｎｏｗａｋｉａｔ　
ａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２３．　ｐ４２４３
（１９８４）に記載される配列のヌクレオチド４９−６
８に対応する配列（Ａ）： ５’ＣＣＣＣＴ　ＣＡＣＡＣＡ　ＣＡＴ　ＡＡＣＡＧＧ
　３’■ のオリゴヌクレオチドプローブを用いるスクリーニング
後に、２つの重複する単離物として得られた。

このタンパク質のＡ鎖をコードするプラスミノーゲンｅ
ＤＮＡクローンの部分のＤＮＡ配列を決定し、Ｆｏｒｓ
ｇｒｅｎ　　ａｔ　　ａｔ　（１９８７）のプラスミノ
ーゲンコード配列との２つの差異に気がついた。

８４６位のヌクレオチドはＴであ、９，９４８位のヌク
レオチドはＧである。

このｃＤＮＡの５′末端はｐｏｒｓｓｇｒｅｎ　ａｔリ
エ（１９８７）の配列のヌクレオチド２７に和尚するこ
とが分かル、このｅＤＮＡは３′方向にヌクレオチド１
８６５ｔで伸長していた。

部分プラスミノーゲンｅＤＮＡはベクターｐＵＣ８（ｖ
ｉｅｉｒａ　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ、　１９８２．　
Ｇｅｎ＠１９゜２５９）のＨｉｎｅｌ［およびｇｃ　Ｏ
ＲＩ部位へサブ／。

−ニングしてプラスミドｐＴＲＨ６（第１図）を作製し
た。

１．２　　ｐＴＲＥ１２の修飾 プラスミドＰＴＨＥ１．２（ＥＰ−Ａ−０２０１１５３
）中の単一のＮａｒ１部位は制限切断、平滑末端化およ
び再連結によシ破壊してｐＴＲＥ１２Ｄ　Ｎａｒを形成
した。Ｎａｒ１部位の除去は以後の操作に役立った。

３つの断片が制限消化およびアガロースゲル電気泳動に
よシ得られた。これらの断片は次のとおシである： Ｉ：　約１．６Ｋｂ　：　ｐＴＲＨ６のＨｉｎｄｆｌｌ
＋ＡｈｓＬＩＩ消、化物（Ｈｔｎｄｌｌｌ（プラスミノ
ーゲンコード配列の５つからＡｈａ　ｎ　（１５７２）
まで〕。

ｒｌ：　　約０．１８Ｋｂ：ｐＴＲＨ６のＡｈａｌ［＋
Ｄｄｅｌ消化物（Ａｈａ　ＩＩ（１５７２）から１）ｄ
ｅｌ（１７４８）ｔで〕。

■＝　　約５．３　Ｋｂ　：　ｐＴＲＥ１２Ｄ　Ｎａｒ
のＨｉｎｄ１１１＋Ｂｇｌｌ消化からの最も大きい断片
。

この断片はｐＴＲＥ１２Ｄ　Ｎａｒのベクター機能を保
有している。

これらの断片（Ｉ％ＩＩ、ＩＩＩ）は次の配列：片ｍお
よびりンカー■の連結点を示す）から明らかなように、
唯一のＮａｒ１部位が導入される。

の２本のオリゴヌクレオチドから成るキナーゼ処理済み
オリゴヌクレオチドリンカー（リンカ−めを用いて連結
した。

Ｅ、　ｃｏｌｔ　ＨＢＩＯＩへの形質転換後に、プラス
ミドｐＴＲＨ９（第２図）を単離した。

プラスミドｐＴＲＨＱ中のＤＮＡ　はプラスミノーゲン
Ａ鎖の大部分、プロリン５４４ｉで（すなわちクリング
ル１−５）をコードしておシ、プラスミノーゲンＢ鎖を
コードするＤＮＡ訃よび残シのＡ鎖は存在していなかっ
た。ｐＴＲＨ９の構築においてリンカ−■を使用すると
、表１（断片■、断プラスミノーゲンのアミノ酸配列を
示す。米これはプラスミノーゲンｅＤＮＡ中ではＣであ
る。ヌクレオチド番号を配列の上に示す。

７５　スミ）’ｐＴＲＨ９はＢｇｌｒｉテ制限し、ｐＴ
ＲＥ１５（ＥＰ−Ａ−０２０１１５３）　　から分離し
た成熟ｔ−ＰＡポリペプチドをコードする２ＫｂＢｇｌ
ｌ［断片と連結した。プラスミノーゲンＡ鎖ＤＮＡと同
じ方向（５′→３つでｔ−ＰＡ挿入物を含む’Ｂ、　ｃ
ｏｌｉ　ＨＢＩＯＩクローンを単離した。このプラスミ
ドはＰＴＲＨ２０（第３図）と名づけだ。

プラスミドＰＴＲＨ２０はトリペプチドｇｌｙ−ｔｈｒ
−ａｒｇを介して成熟ｔ−ＰＡのＮ末端に結合されたｐ
ＴＲＨ２０の１ラスミノーゲンＡ鎖ＤＮＡとｔ−ＰＡＡ
ｇｌＤＮＡとの連結点を表２に示す。

５ＩＡＧＴＡＣ４ＣＣＡＧＣＣＴＣＡ ＧＴｒＴＣＧＣＡＴＣＡＡＡＧＧＡＧＧＧＣＴ　　３’
　　　　　　　　　　　Ｑ）を合成し、キナーゼ処理し
、組み合わせてリンカ−■を炸った。リンカ−■は断片
ＶのＮａｒｌ付着末端と適合する５’Ｎａｒｌ付着末端
、および断片■のＢａｎ１ｌ（ヌクレオチド１０２４）
付着末端と１合する３’　Ｂａｎ　Ｍ　付着末端を有す
る。

断片Ｖ、断片■およびリンカ−■を一緒に連結し、これ
を用いてＥ、　ｅｏｌｉ　ＨＢＩＯＩを形質転換した。

第４図に示した構造を有するプラスミド（ＰＴＲＨ２０
４）が単離された。断片Ｖとリンカ−■の連結点を嵌３
に示す。

ｔ−ＰＡ　　Ａ鎖およびＢ鎖の一部をコードするＤＮＡ
は、ｐＴＲＨ２０をＮａｒｌおよびＳａｔ　１（ｐｅｎ
ｎｉｃａ　ｅｔ　ａｌ　　１９８３に記載されるように
ｔ−ＰＡヌクレオチド１４１７に存在する）で消化する
ことによシ、このｐＴＲＨ２０から除−た。大きい５ｓ
ｔｌ−Ｎａｒｌ断片（７，９Ｋｂ）を単離した（断片Ｖ
ｌＯ ＰＴＲＥ１５から約０．４Ｋｂの１３ａｎｌｌ断片（断
片■）を単離した。２つの関連した１３ａｎ１部位がｐ
ｅｎｎｔｅａ　ｅｔ　ａｌ　　（１９８３）　ＩＣ記載
されるｔ−ＰＡｅＤＮＡ配列のヌクレオチド１０２４お
よび１４１７に存在する。Ｂ＆ｎＩは同義性認識部位：
すなわち５””Ｇ　Ｐｕ　ＧＣｐｙ　Ｃ＠＠”＠３’３
’　１１１１１１＠Ｃｐｙ　（Ｑ　ｐｕＧ１１＠１１１
１１１５’を有する。１４１７位のＢａｎ１部位は１４
１７位のＳａｔ１部位に一致し、また形成された付着末
端は５ｓｔｌ付着末端と適合しうることに気づく。０．
４Ｋｂの１３ａｎｌｉ断片はｔ−ＰＡ　Ｂ鎖の大部分を
コードしている。

２本のオリゴヌクレオチド０および［Ｆ］：連結点にお
けるプラスミノーゲンとｔ−ＰＡのアミノ酸配列を示す
（プラスミノーゲン番号５３９−５４４およびｔ−ＰＡ
番号２６３−２６６）。米を付けた七リン残基はプラス
ミノーゲンセリン５４５またはｔ−ＰＡセリン２６２に
等しいと考えられる。

Ｂａｎ１ｌ（１４１７）および５ｓｔｌ付着末端を介し
ての断片Ｖと断片■の連結は％　ｔ−ＰＡ　Ｂ鎖コード
領域の再構築を完成させた。

プラスミドｐＴＲＨ２０４を用いてヒトＨｅＬａ細胞を
前記のとおシにトランスフェクトし、そして次の構造： フ゛ラスミノーゲン１−５４４／１−ＰＡ２６２−５２
７を有するプラスミノーゲン活性化因子（Ｈ２Ｏ２）を
生産させた。

プラスミドｐＴＲＨ２０４（参考例１．３）でトランス
フェクトしたＨ＠Ｌａ細胞培養物から得た収穫培地２０
０−は９０００Ｆで３０分間遠心し、上清を回収した。

それをＰＢＳ　（ＤｕｌｂｅｃｅｏＡ）１０．０１％Ｔ
ｗｅｅｎ８０　Ｐ）１７．４　（ＰＢＳ／ＴＶ）中で平
衡化した５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２５’のカラム（内径９
０　ｍ　：高さ２２０　ｗｍ　）に入れた。最初の約０
．３５　Ｖｔを捨てた。次の５００ｄを集め、（Ｄｏｄ
ｄ、　１．ｅｔ　ａｌ（１９８６ａ）　ＦＥＢＳ　　Ｌ
ｅｔｔ　２０９１３）　　Ｋ本質的に記載されるような
亜鉛キレート−８ｅｐｈａｒｏｓｅ（ｖｔ−８０ｍ）お
よびリシｙ　Ｓ＠ｐｈａｒｏｓｅ（Ｖｔ＝２０−）でク
ロマトグラフィーにかけた。主な相違点は、精製された
活性化因子が０．Ｏ２Ｍｇ−アミノカプロン酸（ε−Ａ
ｃＡ）を含む０．０５Ｍリン酸ナトリウム／　０．１　
Ｍ塩化ナトリウム１０．０１チＴｗｅｅｎ８０　ｐＨ７
，４（ＰＳＴ）を用いて第二カラムから解離されたこと
であった。ＰＳＴ／ｇ−ＡｅＡ！衝液によシ溶出された
活性画分は発色性基質Ｈ−Ｄ−ｉ１ｅ−ｐｒｏ−ａｒｇ
−ｐ　　二）　ｏアニリド（ｐｏｄｄ、　Ｉ。

ｅｔ　ａｔ（１９８６ｂ）Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅｍ、
５５９４）を用いて同定し、攪拌槽限外濾過（ＹＭＩ　
Ｏ％Ａｍｉ　ｃｏｎ）Ｋよって濃縮した。限外濾過保持
物（２，０ｍ）は１４４００　　ＩＵおよび４８００Ｓ
Ｕを含んでいた（Ｄｏｄｄ、　Ｉ、　ｅｔ　　ａｌ　（
１９８６ｂ）、ドデシル硫酸ナトリウム／ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ＳＤＳＰＡＧＥ）、　　これに続
くフイブリンザイモグラフイ（Ｄｏｄｄ、　１．　ｅｔ
　ａｔ、　１９８６ｂ）によシ、コノ産物は見掛けＭｒ
約１０００００（ハイブリッド活性化因子のｇｌｕ　１
形態の分離と一致する）の主要な線維素溶解物質を含む
ことが分かった。

来５ｅｐｈ＆ｄ＠Ｘおよび３ｅｐｈａｒｏｓｅは商標名
である。

合成 ＰＳＴ／１０Ｗｍ−凰マンニトール１５０μＭｇ−ＡＣ
Ａに緩衝液交換したＨ２Ｏ４タンパク質調製物（参考例
１．４に記載のとおシに精製したもの）（８９０００Ｉ
Ｕ、　１．９ｓｄ）は０．０１倍過刹モルのプラスミン
で２５℃、１６時間処理し、その後−４０℃で保存した
。この生成物の分析は、それが６８０００ＩＵおよび３
２０００ＳＵを含むことを示した。この活性化因子の見
掛けｙｒは、ＳＯ８ＰＡＧＥおよびフイプリンザイモグ
ラフイーで測定して約９０．０００であった。この生成
物のｌｙｓ、　ｔｃ形態は５ＤＳＰＡＧＥ、それに続＜
ｔ−ＰＡＢ鎖に対するポリクローナル抗体を用いるイム
ノプロッティングによシ確認した。

参考例２ プラスミノーゲン１−５４１／１−ＰＡ２６２−５２７
（Ｈ３７） ２．１　プラスミドｐＴＲＨ３７の構築プラスミドｐＴ
ＲＨ３７はｐＴＲＨ２０４（参考例１）由来の２つの断
片をｐＴＲＨ１５由来の断片■およびオリゴヌクレオチ
ドリンカー（リンカ−Ｘ）と連結することＫよシ構築し
た： 断片Ｖｌｌｌ　　：　ｐＴＲＨ２０４の７．２ｋｂ断片
：　ｔ−ＰＡ　Ｂ鎖コード領域中の５ｓｔ１部位（ｔ−
ＰＡ配列中のヌクレオチド１４１７）からプラのヌクレ
オチド１２０９）まで（従って断片ｖｍはすべてのベク
ター配列を含 む）。

断片ＩＸ　　：　ｐＴＲＨ２０４の０．４８ｋｂ断片：
プラスミ位（１２０９）からＡｖａｉ１部位（１６９３
）まで。

断片’Ａ　　：　（Ｓｓｔｌ−Ｂａｎｌ［）は参考例１
で説明した。

リンカ−Ｘは次の配列： ＣＧＧＣＣ３’ ［Ｆ］ ５’　　ＴＧＡＧＡＣＡＧＴＡ　ＣＡＧＣＣＡＧＣＣＴ
　ＣＡＧＴＴＴＣＧＣＡＴＣＡＡＡＧＧＡＧＧ　ＧＣＴ
　ｓ’　　　　　　　　　　　　　　　　　０（ＰＴＲ
Ｈ３７）が単離嘔れた。このプラスミドは、ヒト１ｉｅ
Ｌａ細胞に導入したとき、タンパク質Ｈ２Ｏ４（参考例
１）と同じアミノ酸配列を有するが、クリングル５ドメ
インのすぐＣ末端＠にあるアミノ酸残基アラニン（５４
２）、アラニン（５４３）、およびプロリン（５４４）
を欠失している新規なプラスミノーゲン活性化因子（Ｈ
３７）の発現へ銹導した。クリングル５とプロテアーゼ
切断部位との間のハイブリッドタンパク質構造を一文字
表記法を用いて以下に示す： ５４１’　　　　　　　　　２７６ ＡＣＴＧＴＣＴＣＡＧ　ＧＣＣＧＣＡＧＧＴＣＧＡＡＣ
ＡＣＴＧＡＧＧＧ　３’　　　　■の４本のオリゴヌク
レオチド（Ｆ、　Ｇ、　Ｈおよび工）をアニーリングす
ることによシ形成した０第５図に示す構造を有するプラ
スミド 残基５４１はクリングル５中の最後のシスティンである
。星印を付けたセリンは、プラスミノーゲンのセリン５
４５またはｔ−ＰＡのセリン２６２であると同定するこ
とができる。

プラスミドｐＴＲＨ３７（参考例２．１）でトランスフ
ェクトしたＨ・Ｉ、ａ細胞培養物から得られた５１０ｍ
の澄明化した収穫培地は、本質的に参考例１．４でＨ２
Ｏ４Ｋついて説明したとおシに精製した。ハイブリッド
活性化因子はＰＳＴ／２０ｍＭ？−ＡＣＡ　を用いてリ
シン３ｅｐｈａｒｏｓｅカラムから解離し、限外濾過で
濃縮し、その後ＰＳＴ／１０岬−−凰”：／二）−に１
５（ＩＭ＃−ＡＣＡ（２，０ｄ）Ｋ緩衝液交換した。こ
の生成物は３６，０ＯＯＩＵおよび１５．０ＯＯ８Ｕを
含んでいた。ＳＤＳ　　ＰＡＧＥおよびフイプリンザイ
モグラフイーによる分析は、この調製物が見掛けＭｒ約
１００，０００および９０．０００の２ｔ［［類の主要
な腿維素溶解物質を含むことを示した。これらは活性化
因子のｇｌｕ　１および１ｙｓｙ・形態であると考えら
れる。非還元活性化因子のＳＤＳ　　ＰＡＧＥおよびそ
の後の銀染色は、この調製物がＭｒ約９０，０００に主
要なタンパク質バンドを含むことを示した。

ＳＤＳ　　ＰＡＧＥおよびその後のｔ−ＰＡ　　Ｂ鎖に
対するポリクローナル抗体を用いるイムノブロッティン
グによる分析はｓ　ｇｌｕｌおよび１ｙａＢ形態の存在
を示すザイモグラフイー結果を支持し、嘔らに生成物が
すべて２本鎖であるととを示した。

実施例１ 参考例１に記載のとおシに生産し、精製した１３’１１
７１　　ｔｅ　Ｈ２Ｏ４タンパク質（４００ｐｍｏｌｅ
。

１５０ｐｔ）は２５ｍＭ　ＮａＨ＊　ＰＯ４／２５ｍＭ
　ＥＤＴＡｌｏ、５％　　）　リ　トンｘ−１００ｐＨ
７，５中３７Ｃで、全インキュベーション容ｘ２６ｏｐ
ｔｖｃ−ｃ、グＩＪ　ｓぺ１チダーゼＦ奈（７Ｕ、　３
６ｐｔ、　ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）で
２４時間処理した。この生成物はフィブリン平板上で天
然糖タンパク質と同様の用量応答を示し、次の理由： １）ＳＤＳ　　ＰＡＧＥおよびその稜のフイブリンザイ
モｌラフイーにより、天然物質と比較して、グリコペプ
チダーゼＦ処理済みの１ｙｓｙｇｔｃＨ２０４タンパク
質の見掛けＭｒにわずかな減少が見られた； ２）還元条件下でのＳＤＳ　　ＰＡＧＥおよびその後の
ウェスターンプロッティング／イムノゴールド銀染色に
よシ、グリコペプチダーゼＦ処理済みの１７１１７ｓ　
ｔｃ　Ｈ２Ｏ４タンパク質のｔ−ＰＡ　Ｂ鎖部分のＭｒ
　にわずかな減少が見られた から脱グリコジル化された１ｙｓｙ＠ｔｃ　Ｈ２Ｏ４タ
ンパク質であると同定された。

来グリコペプチダーゼＦは商標名である。

実施例２ 参考例１に記載のとおシに精製したｓｃ　Ｈ２Ｏ４タン
パク質の調製物（０，２ｎｍｏｌｅ、　８０ｐＬ）は２
５ｍＭ　　ＮａＨｔＰＯ４／２５ｍＭ　　ＥＤＴＡｌｏ
、５％　　）　　リドンＸ−１００ｐＨ７，５中３７℃
で、全インキュペｔ” 一ジョン容ｆｉ１００μｔにて、グリコペブチダーβＦ
　ＴＭ（２，９Ｕ、１４．４　Ｐｔ％Ｂｏｅｈｒ　ｉ　
ｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅ　ｉｍ）で２４時間処理した。

生成物はフィブリン平板上で天然糖タンパク質と同様の
用量応答を示し、実施例１に記載した方法によシ脱グリ
コジル化された５ｓｅＨ２０４タンパク質であると同定
された◎実施例３ プラスミドｐＴＲＨ３８はＰＴＲＨ２０４（参考例１）
から誘導された３つのＤＮＡ断片をオリゴヌクレオチド
リンカー（リンカ−ＸＩＶ）と連結することによシ構築
した。

断片ｘｌ：　ｐＴＲＨ２０４の７．６ｋｂ断片：プラス
ミノーゲン中のＮｅｏ１部位（１２０９）からプラスミ
ノーゲン中のＡｖａ［１１部位（６３１）まで。この断
片はすべてのベクター配 列を含む。

断片Ｘｌｌ：　ＰＴＲＨ２０４からの０．３４ｋｂ　Ａ
ｖａｎｌ（６３１）−８ｎｏｌ（９７４）断片。

断片ＸＯＩ　：　ｐＴＲ）１２０４からのプラスミノー
ゲン中の１０７２と１２０９のＮｅｏ１部 位間の０．１４ｋｂ　Ｎｃｏｌ断片。

リンカ−ＸＦ／：２本のオリゴヌクレオチド（Ｊおよび
Ｋ）をアニーリングすることＫ よシ形成した： ＴＧＣＣＧＣＡＡＴＣＣＴＧＡＣＧＧＡＡＡ　ＡＡＧＧ
ＧＣＣＣ３’　　　　　　（Ｊ）第６図に示す構造をも
ったプラスミド（ＰＴＲＨ３８）が単離された。ヒトＨ
ｅＬａ細胞をプラスミドｐＴＲＨ３８でトランスフェク
トしたとき、Ｈ２Ｏ４と同じ構造を有するが、この分子
のプラスミノーゲンＡ鎖部分に存在するａｓｎｌｇｇの
Ｎ結合グリコジル化部位がグルタミン残基で置き換えら
れた新規なプラスミノーゲン活性化因子（Ｈ２Ｓ）が生
産された。従って、このタンパク質はこの部位でグリコ
ジル化されない。

ｇｉｎ）／１−ＰＡ　２６２−５２７　（［３８）の精
製プラスミドｐＴＲＨ３８でトランスフェクトしたＨｅ
Ｌａ細胞培養物から得られた３８０−の収穫培地は９０
００Ｆで３０分遠心し、上清を回収した。それをＰＢＳ
　（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　Ａ）１０．０１％Ｔｗｅｅｎ　
８０ｐ）１７．４（ＰＢＳ／ＴＷ）で平衡化した５ｅｐ
ｈａｄａｘＧ２５のカラム（内径９０■：高さ２５７■
）に加えた。初めの約０．３５　Ｖｔを捨てた。次の５
６０ａ７！を取っておいた。この両分は緩衝液交換され
たＨ２Ｓを含んでいた。その後、それは本質的Ｋ　（Ｄ
ｏｄｄ。

１、　ｅｔ　ａｌ　　１９８６ａ　ＦＥＢＳ　　Ｌｅｔ
ｔ、　２０９　１３）に記載されるように亜鉛キレート
ｓｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ４Ｂ（Ｖｔ＝８０ｍｇ）および
リシｙ　５ｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ４ＢＣＶｔ＝４０ｄ）
ＩＩＣよるりａマドｆラフイー１１Ｃかけた。主な相違
点は、Ｈ３８タンパク質が０．０２Ｍ＆−アミノカブ０
７酸（ｇ−ＡＣＡ）を含有する０、０５Ｍリン酸ナトリ
ウム／　０．１　Ｍ塩化ナトリウム／　０．０１　’１
６　Ｔｗｅ＠ｎ８０　（ＰＳＴ）を用いてリシン３ｅｐ
ｈａｒｏｓｅから解離されたことであった。

精製されたＨ３８タンパク質を含む両分は８２２８８を
用いる発色性基質検定（Ｄｏｄｄ、　１．　、ｐｔ料１
９８６ｂＴｈｒｏｍｂ、Ｈａｅｍｏｓｔａａ、５５　９
４ンによシ同定し、プールし、分子量カットオフが１０
．０００の膜（ＹＭＩＯ，Ａｍ１ｃｏｎ）を用いる攪拌
槽限外−過によシ濃縮した。限外濾過保持物は３ｅｐｈ
ａｄｅｘ　Ｇ２５（ＰＤＩＯ，Ｐｈａｒｍａｅｌａ）を
用いてＰＳＴ／１０１１１１　ｍ−１１ン二ト一ル１５
０μＭ　ｇ−ＡＣＡ　ｐＨ７，４（１５１ｄ）に緩衝液
交換した。このＧ２５溶出物は精製された産物であると
見なされた。

この精製産物は２９０００ＩＵ／−および１１５００Ｓ
Ｕ／−を含んでいた（Ｄｏｄｄ、　１．１９８６ｂ）。

ＳＤＲＰＡＧＥ　　およびフイプリンザイモグラフイ−
（Ｄｏｄｄ、　１．１９８６ｂ）　Ｋ　ヨル分析１’１
２８Ｗ４ｆ）物質の存在を示し、１つは見掛けＭｒｌｏ
ｏ、０００を有し、より少ない方の物質は見掛けＭｒ９
０，０００を有していた。これらはタンパク質Ｈ３８の
ｇｌｕｌおよびｔｙｓｙｓ　　形態であると考えられる
。これらの物質は、ＳＤＳ　　ＰＡＧＥ　分離物質のペ
ージブルー８３（ＢＤＨ）染色で調べたとき、すべて２
本鎖であった。

実施例４ プラスミドｐＴＲＨ４１はｐＴＲＨ３８（実施例３）の
単一のＮｃｏｌ断片をオリゴヌクレオチドリンカー（リ
ンカ−ＸＭ）と連結することにょシ構築した。

断片Ｘｖ：すべてのベクター配列を含むｐＴＲＨ３ｇの
８．Ｏｋｂ　　Ｎｅｏｌ断片。

リンカ−ＸＭ：下記配列の４本のオリゴヌクレオチドＬ
、　Ｍ、　ＮおよびＯをアニーリングすることによシ形
成した： ＡＣＴＣＣＴＣＣＣＣＡＧＴ　３’ Ｎ）　５’　ＣＡＴＧＧＴＡＧＣＡ　ＧＴＣＣＴＧＧＡ
ＣＣＡＣＡＧＧＧＧＴＴＡＧＣＴＣＡＧＧＴＧＧ　ＴＧ
ＣＡＧＣＧＧＧＡ　ＧＣＣＡＡＴＴＧＴ’Ｉ’　ＣＣＧ
　３’第７図に示す構造をもったプラスミド（ｐＴＲＨ
４１）が単離された。ヒトＮ　ｅ　Ｌ　ａ細胞をこの７
ラスミドｐＴＲＨ４１でトランスフェクトしたとき、Ｈ
２Ｏ４と同じ構造を有するが、この分子のフラスミノー
ゲンＡ鎖部分に存在するａａｎＨ−のＮ結合グリコジル
化部位およびｔ　ｈ　ｒ３４１のＯ結合グリコジル化部
位がそれぞれグルタミンとアラニン残基によって置き換
えられた新規なプラスミノーゲン活性化因子（Ｈ４１）
が生産された。従って、この生産物はこれらの部位でグ
リコジル化されない。

４．２　　タンパク＊Ｈ４１の精製 プラスミドｐＴＲＨ４１でトランスフェクトしたＨｅ１
ａ細胞からの４５０−ならし培地は５ｅｐｈａｄｅｘＧ
２５、亜鉛キレートＳ＠ｐｈａｒｏｓｅおよびリシン５
ｅｐｈａｒｏｓｅを用いて精製し、実施例３．２に記載
されるように調製した。フィブリン平板で検定したとき
、この生産物は８０，０ＯＯＩＵを含んでいた。

５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびその後のフィンリンザイモグラ
フイーによる分析は約１００，０００のＭｒＫ主要な線
維素溶解活性を示した。この調製物のタンパク質含量は
、標準としてウシ血清アルブミンを用いるブラッドフォ
ード検定（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈａｍ、。

１９７６、７２２４８−２５４）によシ３６０μ？であ
ると決定された。

実施例５ プラスミドＰＴＲＨ４２はｐＴＲＨ４１（実施例４）お
よびｐＴＲＨ２０４（参考例１）の２つの断片をオリゴ
ヌクレオチドリンカー（リンカ−ＸＩＸ）と連結するこ
とによシ構築した。

断片Ｘ■：　大部分のベクター配列を含むｐＴＲＨ４１
の６．５　ｋｂ　ＢａｍＨＩ−８ｓｔｌ断片。

（Ｓｓｔｌは１４１７でＢｔドメインを切断する。） 断片ＸＶＩＩＩ　：　ｐＴＲＨ４１または類似のプラス
ミド（例、ＰＴＲＨ２０４）の１．５　ｋｂ　　Ａｐａ
　［−ＢａｍＨＩ断片。（Ａｐａｌは１５８２でＢｔ。

−ドドメインを切断する。） リンカ−ＸＩＸ：下記配列の４本のオリゴヌクレオチド
Ｐ、　Ｑ、　ＲおよびＳをアニーリングすることにより
形成した： ＴＣＡＴＧＴＣＡＧＡ　ＣＴＧＴＡＣＣＣＡＴ　ＣＣＡ
　３’ＧＡＧＡＣＡＣＴＣＧ　ＧＡＧＣＧＧＣＧＧＧ　
ＣＣ３’ＧＴＴＧＴＧＡＴＧＴ　ＧＣＡ　３’ Ｓ）５’ＧＣＧＧＣＴＧＧＡＴ　ＧＧＧＴＡＣＡＧＴＣ
ＴＧＡＣＡＴＧＡＧＣ第８図に示す構造をもったプラス
ミド（ｐＴＲＨ４２）が単離された。ヒ）　ＨｅＬａ細
胞は、プラスミドｐＴＲＨ４２でトランスフェクトされ
ると、Ｈ２Ｏ２と同じ構造を有するが、この分子のプラ
スミノーゲンＡ鎖部分に存在するａａｎＩＨのＮ結合グ
リコジル化部位およびｔｈｒｓｉ＠の０結合グリコジル
化部位がそれぞれグルタミンとアラニン残基で置き換え
られ且つこの分子のｔ−ＰＡ部分のＢ鎖に存在するＩＬ
ｌｌｎ４４１のＮ結合グリコジル化部位がグルタミン残
基で置き換えられた新規なプラスミノーゲン活性化因子
（Ｈ４２）を生産した。従って、このタンパク質は完全
に非グリコジル化されていると考えられる、 ５．２　　タンパク質Ｈ４２の＄１＃製フラスミドｐＴ
ＲＨ４２でトランスフェクトしたＨ　ｅ　Ｌ　ａ細胞か
らの５１０−ならし培地は５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２５、
亜鉛キｖ　−）　５ｅｐｈａｒｏｓｅおよびリシン５ｅ
ｐｈａｒｏｓｅを用いて精製し、実施例３．２に記載さ
れるように調製した。この生成物は１７．０ＯＯＩＵを
含んでいた（フィブリン平板検定）。

５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびその後のフイブリンザイモグラ
フイーによる分析は見掛けＭｒ８５，０００　および９
５．０００　　に主要なダブレットの線維素溶解活性を
示した。これら２つの物質はタンパク質Ｈ４２のｇｌｕ
　１および一１７ｓ７６Ｎ末端形態であると考えられれ
る。

実施例に のプラスミド、ｐＴＲＨ４５、は本質的ＫｐＴＲＨ３７
と同じであるが、Ｈ３７コード領域の３′末端に導入さ
れた追加の制限部位を有する。

ｐＴＲＨ３７の大きいＢｇｌｌｌ−ＢｓｔＥＩＩ断片は
下記配列のオリゴヌクレオチドと連結させた：Ｔ）　５
’　ＧＴＴＡＣＣＡＡＣＴ　　　　　　　　　　　ＡＡ
ＣＡＴＧＣＧＡＣＣＧＴＧＡＧＧＣＣＴＡＣＴＡＧＧＣ
ＣＡＡＧＣＴＴＡ　３’Ｕ）５’　　ＧＡＴＣＴＡＡＧ
ＣＴＴＧＧＣＣＴＡＧＴＡＧＧＣＣＴＣＡＣＧＧＴＣＧ
ＣＡＴこれらのオリゴヌクレオチドはＨ３７コード領域
の３′側に唯一の５ｆｉ１部位と第二のＢｉｎｄ　１１
部位を導入する。プラスミドｐＴＲＨ４５を第９図に示
す。

（Ｈ４２ｂ　） プラスミドＰＴＲＨ４２ｂ　は非グリコジル化ハイブリ
ッドをフードするように作製され、その際ＫｓｐとＢｔ
ドメインをつなぐアミノ酸配列はプラスミドｐＴＲＨ３
７（参考例２）Ｋよってコードされるものと同じである
：すなわち ・・拳・・Ｋｓｐ′１ＳＴＣＧＬＲＱＹＳＱＰＱＦＲＣ
Ｂ１〕ｐＴＲＨ４２ｂの構築にあたっては４つの断片を
連結した（効果的にはｐＴＲＨ４２の９９０ｂｐＢｓｔ
Ｘ１−Ｓｓｔｌ断片をｐＴＲＨ３７からの同等の断片と
置き換える）： 断片ＸＸ　：　ｐＴＲＨ４１の５．５ｋｂ　　ＢａｍＨ
Ｉ−Ｂ畠ｔＸｔ断片 断片ＸＸＩ　：　　ｐＴＲＨ３７の９９０ｂｐ　Ｂｓｔ
ＸＩ　−８ｓｔｌ断片 断片ＸＸＩ　：　　ｐＴＲＨ４５の９７０ｂｐＢ農ｔＥ
Ｉ［−ＢａｍＨＩ断片 断片ＸＸＩＩＩ：　　ｐＴＲＨ４２の　３１１ｂｐ　５
ｓｔｌ−ＢｓｔＥＩＩ断片 第１０図はプラスミドｐＴＲＨ４２ｂ　の構造および誘
導を示す。

Ｈ４２ｂタンパク質はＨ４２（実施例５）の代わＤＫ発
現された。プラスミドｐＴＲＨ４２ｂでトランスフェク
トしたＨｅＬａ細胞からの培地はヒトフィブリン平板上
で線維素溶解活性を示した。

実施例８ 参考例２に記載嘔れるとお、ＤＫ合成し、精製したｔｅ
Ｈ３７タンパク質調製物（３７ｐｍｏｌｅ。

４０ｐｔ）は２５ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４／２５ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡｌｏ、５９６　　）リドンＸ−１００ｐＨ７，５
中３７℃で、全インキエベーション容量１００／ＪｔＫ
て、グリコヘフチダーゼＦ　　　（１，５Ｕ、　７．５
　ｐＬ、ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）で２
４時間処理した。この生成物はフィブリン平板上で天然
糖タンパク質と類似した用量応答を示し、以下の理由： １）ＳＤＳ　　ＰＡＧＥおよびその後のフィプリンザイ
モクラフィーによシ、天然物質と比較して、グリコペプ
チダーゼＦ処理済みのｔｃＨ３７タンパク質の見掛けＭ
ｒにわずかな減少が見られた； ２）還元争件下でのＳＤＳ　　ＰＡＧＥおよびそれに続
くウェスターンブロッティング／イムノゴールド銀染色
によシ、天然物質と比較して、グリコペプチダーゼＦ処
理済みのｔｃＨ３７タンパク質のｔ−ＰＡ・Ｂ鎖部分の
Ｍｒにわずかな減少が見られた から脱グリコジル化されたｔｅＨ３７タンパク質である
と同定された。

実施例９ プラスミノーゲンｅ　ＤＮＡ　　クローン（ｈは、参考
例１に記載の部分プラスミノーゲンｃＤＮＡから得られ
たＳ鵞Ｐｔｊ識ＢｓｔＸ１制限断片（１２０９−１８４
０）でスクリーニングすることによシ、ヒト肝臓ｃＤＮ
Ａライブラリーから分離した。この新しい（！ＤＮＡク
ローンは塩基配列を決定し、プラスミノーゲンＢ鎖の全
体をコードすることが分かった。Ｂ鎖のＤＮＡ配列はＦ
ｏ　ｒ　ｓｇｒｅｎらのものと同じであったが、２つの
例外を有していた：すなわち、１つ目はヌクレオチド１
８２１でのＧ−＋Ａの変化であって、これはコードされ
るｖａｌｓｓｓを変更しない：２つ目はヌクレオチド２
１７６でのＡ→Ｇの変化であり、この変化はコードされ
る１ｌｅ４１Ｈをｖａｌへ変更させる。このクローンの
５′末端はヌクレオチド１６８６であシ、３′末端はヌ
クレオチド２５２３（Ｆｏｒｓｓｇｒｅｎ　ｅｔ　ａｌ
）である。すなわち、３′末端は非翻訳領域に存在して
いる。

完全なプラスミノーゲンＣＤＮＡクローンはその後下記
の断片を連結することによ）組み立てた：断片ＸＸ■：
　ｐＴＲＨ２０４の５，４ｋｂ断片：３’Ｂｇｌ１１部
位からＢｓｔＸ１部位（１２０９）まで（この断片はす
べてのベクター配列 を含む）。

断片ＸＸＶ　　：参考例１に記載の部分プラスミノーゲ
ンｃＤＮＡからの０．６３　ｋｂ　ＢｓｔＸＩ断片（１
２０９−１８４０）。

断片ＸＸＭ　：単離したプラスミノーゲンＢ鎖クローン
の０．７ｋｂ　ＢｓｔＸＩ（１８４０）　−ＥｃｏＲＩ
（λベクターと結合したクローンβの３′末端の部位）
断片。

リンカ−（ＸＸ■）：下記配列の２本のオリゴヌクレオ
チド（ＶおよびＷ）（１０μＭ濃度 で２６ｐｔ）を６８℃で５分間−緒に 加熱することによシ形成した。それ らは少なくとも１５分間にわたって 室温まで冷やしてアニーリングさせ た。形成したリンカ−はキナーゼ処 理した。

プラスミドｐＴＲＰ１が単離された（第１１図）。

それは５′非翻訳領域に）（ｉｎｄ　０１部部位　ＰＴ
ＲＨ２０４と同様）および３Ｉ非翻訳領域にＢｇｌＩ部
位を有する。

ｐＴＲＰｌはＨａＬａ　細胞により発現でれ、抗プラス
ミノーゲン抗体を用いるウェスターンプロッティングで
測定したとき予期した大きさのタンパク質をコードして
いた。

ｖａｌｓｓｓ残基は以前に報告されたことがない。

従って、我々は３ｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ　ａｔ　
ａｌ、。

Ｍａｌｉｎｏｗｉｋｉ　ｅｔ　ａｌ、およびＦｏｒｓｇ
ｒｅｎ　ｅｔ　ａｌに記載されるようなプラスミノーゲ
ンアミノ酸配列をフードするよう、プラスミノーゲンｃ
ＤＮＡクローンを変換することに決めた。これは１ｎｖ
ｉｔｒｏ　変異導入により達成され、プラスミドｐＴＲ
Ｐ２が得られた。

ｐＴＲＰ２は次のものを連結して構築した：断片ＸＸＶ
Ｉ　：　ｐＴＲＰｌの７．４ｋｂ断片：　３’Ｂｇｌｌ
［部位からＲａｒ１１部位（２１６１）まで（この断片
はすべてのベクター配列 を含む）。

断片ＸＸＩＸ　：　ｐＴＲＰｌ　の０．３５ｋｂ断片：
３’Ｂｇｌ１１部位から５ｔｙ１部位（２１９６）まで
。

リンカ−ＸＸＸ：　　下記配列の２本のオリゴヌクレオ
チド（ＸおよびＹ）（１０μＭ）を ６８４で５分間−緒に加熱すること により形成した。それらは１５分間 かけて室温まで冷やしてアニーリン グさせた。形成したリンカ−はキナ ーゼ処理した。

プラスミドｐＴＲＰ２が単離された。それは（ｐＴＲＨ
２０４と同様に）５′非翻訳領域にＨｉ　ｎｄｌｕ部位
および３′非翻訳領域にＢｇｌ　ｎ部位を有する。

ｐＴＲＰ２はＨｅＬＩＬ細胞によシ発現され、抗プラス
ミノーゲン抗体を用いるウェスターンブロッティングで
測定したとき予期した大きさのタンパク質をコードして
いた。

プラスミドｐＴＲＰ４３はｐＴＲＰ２の６．６ｋｂＢｓ
ｔＸＩ−Ｈｉｎｄ　Ｉおよび６３１ｂｐ　ＢｓｔＸ１断
片をｐＴＲＨ４１（実施例４）の１．１６　ｋｂ　Ｈｉ
　ｎｄｌｌｌ−ＢｓｔＸＩ断片と連結させることによシ
構築した。

ｐＴＲＨ４１からの１．１６ｋｂ　Ｈｉｎｄｌｌｌ−Ｂ
１１ｔＸＩ断片はグラスミノーゲンＡ＃コード領域中）
（＆８ｎｚｓｅ→ｇｌｎおよびｔｂｒ３４ｓ→ａ１ｇ、
変異を含んでいる。プラスミドｐＴＲＰ４３（第１２図
）は、Ｈ４！Ｌ、ＪＬ細胞に導入した場合、アグリコ１
コンセンサス”プラスミノーゲン分子（Ｐｄ２）の合成
を訴導した。

Ｈｅ　Ｌ　ａ細胞からの４８０ｄならし培地は、本質的
に実施例３．２に記載のとおシに３ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ
２５、亜鉛キレ−）　５ｅｐｈａｒｏｓｅおよびリシン
５ｅｐｈａｒｏｓｅを用９て精製した。Ｐ４３タンパク
質を含むリシンＳｅｐｈａｒｏｇｅカラムからめ両分は
ストレプトキナーゼを用いた発色性基質検定で同定し、
その後限外濾過とＰ　Ｓ　Ｔ／　１０　ｗ９　ｄ−”　
−ｒ　ｙ　＝トール１５０ｐＭｇ−ＡＣＡへの緩衝液交
換によシ調製した。ストレプトキナーゼを用−た発色性
基質検定でｇｌｕプラスミノーゲンについて検定したと
き、生成物（２，５ｍ　）は６４ｎＭプラスミノーゲン
の等量を含んでいた。非還元条件下での５Ｏ８−ＰＡＧ
Ｅとこれに続く銀染色による分析は３つのバンドを明ら
かにし、このうち最も強く染色されたものは約９０，０
００　　の見掛けＭｒを有していた。

実施例１０ プラスミドｐＴＲＰ４３でトランスフェクトした実施例
９．３からの２５μｔのならし培地は２５ｐｔのストレ
プトキナーゼ（Ｋａｂｉ）（０，ＩＭ　）リエタノール
アミンｐＨ８，ｏ１０．２ｑａｔ−’大豆トリプシン阻
害剤（ＴＲＩＥＮ／５ＢＴＩ、Ｓｉｇｍａ）中２０／ｊ
Ｍ）と混合し、３７℃で１５分間インキエベートした。

その後、ＴＲＩＥＮ／５ＢＴＩ中の１ｍＭ発色性基質Ｈ
−Ｄ−パリルーロイシル−リシン・２ＨＣＡ（Ｓ−２２
５１、ｌｉ’ｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）２５
０μｔを加え、仁の溶液を３７℃で２４時間インキュベ
ートマ した。適当な対照ならし培地を平行し停検定した。

Ａ４０！値は］）ｙｎａｔｅｅｈ　Ｍｉｎｉｒｅａｄｅ
ｒ　ＩＩ　マイクロタイタープレート読取装置を用いて
測定した。

Ａ４・Ｓの上昇はＳ−２２５１に対し酵素学的に活性で
あるが５ＢＴＩＫ感受性でない物質の形成を意味する。

プラスミン（プラスミノーゲンへのストレプトキナーゼ
作用によシ生成しうる）は５ＢＴＩによって阻害される
ので、Ｓ−２２５１に対する活性の出現は５ＢＴＩに抵
抗するストレプトキナーゼプラスミン複合体のためであ
ると考えられる。得られた対照修正したＡ４６ｉ値を、
Ａａｏｓ値対プラスミノーゲン濃度の検量！（既知プラ
スミノーゲン濃度の予備形成てれたストレプトキナーゼ
／ヒト１ｙｓ−プラスミノーゲン（ｉｍｍｕｎｏ）複合
体を上記条件下で検定することＫよシ作成した）と比較
することによ〕、ストレプトキナーゼ／アグリコ１コン
センサス”プラスミノーゲン複合体の形成を検出した。

実施例１１ ２０チ（”／ｖ　）　　グリセロールを含有するＰＳＴ
／１０１１９ｄ−宜マンニトール１５０μＭｌ−ＡＣＡ
　ｐＨ７，４中の、実施例９．４に記載のとおシに精製
したアグリコブラスミノーゲン（１，８ｄ：　０．１　
ｎｍｏｌｅ）はストレプトキナーゼ（２５ｐｔ：０．５
ｎｍｏｌｅ）および４−アミジノフェニル−４′−アニ
セート・ＨＣｔ（１８ｐｔ：１．８μｍｏ　ｌ　ｅ　）
で２５℃、６０分間処理した。

この物質はＰＳＴ７１０■−一１マンニトール１５０μ
Ｍ　ｔ−ＡＣＡ／２０％（Ｗ／ｖ）グリセロールｐ　Ｈ
７，４（２，２ａｔ）に緩衝液交換し、アリコートに分
けて一４０℃で保存した。９シフイブリン平板において
、この生成物は標準としてＥＭＩＮＡＳＥ”を用いて１
２．６ｍｊＪ／−を与えた。

＃ｋＥＭＩＮＡＳＥはＢｅｅｃｈａｍ　Ｇｒｏｕｐ　ｐ
ｉｅの商標名である◎ 実施例１２ ｐｓ’ｒ／１ｏｑｄ−”−ｖｙ＝　）−ル１５０ｐＭｘ
−ＡＣＡ　ｐＨ７，４中の、実施例９．４に記載のとお
シに精製したアグリコプラスミノーゲン（１，５ａｇ：
４０ｐｍｏｌｅ）はプラスミン（３０ｐｔ；０．４ｐｍ
ｏｌｅ）で３７℃、２０分間処理した。この生成物はそ
の後２０　％　（Ｗ／ｖ）グリセロール中２５℃にテス
）　Ｖブトキナーゼ（１０ｐｔ；２００ｐｍｏｌｅ）お
よび４−アミジノフェニル−４′−アニセート・ＨＣｌ
　（１８ｐｔ：　１、ｇｐｍｏｌ＠）で６０分間処理し
た。この物質を０．０５Ｍ　ＮＨ４ＨＣＯｓ　／　１０
　ＰＭ　ｌ　−ＡＣＡ　ｐＨ７，６に緩衝液交換し、凍
結乾燥した。これを１００７７ｔｄｄ）（！Ｑ中で再調
製し、ウシフィブリン平板において標準としてＥＭＩＮ
ＡＳＥを用いて検定したとき、この生成物は０．２６ｍ
Ｕ／ｌＩ／を与えた。

実施例１３ 脱グリコプラスミノーゲン７８−５４６／ｕ−ＰＡ１３
．１７ラスミドｐＴＲＨ２５の構築プラスミドｐＵＣ８
をＨｌｎｄ［ｌｌで消化した。得られた約２．７　ｋｂ
ベクター断片を２本のオリゴヌクレオチドｒおよびδ（
以下器１１）から成るオリゴヌクレオチドリンカーＸＸ
Ｘ　Ｉと連結させ、その後Ｅ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩＫ
形質転換してプラスミドｐＴＲＨ８を単離した。表４に
示すＤＮＡリンカ−配列はプラスミノーゲンのアミノ酸
５４３−５４６およびウロキナーゼのアミノ酸１３７−
１５０から成るポリペプチドをコードしている。

ウロキナーゼのアミノ酸１４３および１４４は天然のヌ
クレオチドトリプレットＧＡＡ　ＴＡＡではなくＧＡＧ
　　ＣＴＣによってコードされ、ζうして５ｅｔ１部位
が組み込まれる。リンカ−はまた新たなりｇ１１部位を
もフーードしている。

ヒトクロキナーゼｅＤＮＡクローンはオリゴヌクレオチ
ドプローブによって同定し、慣用手段で単離した（Ｈｏ
１ｍｅａ旦ａ　１　（１９８５）　ＢｉｏＴｅｅｈｎｏ
ｌｏｇｙ３、９２３−９２９）。このｃＤＮＡクローン
の部分消化により単離した約１．５ｋｂ　　Ｂｇｌｌ断
片は、ウロキナーゼＢ鎖の大部分および３′非翻訳領域
の一部（ヌクレオチド５８３−２１５４に相当する）を
コードしている。これをＢａ１ｌ消化したｐＴＲＨ８と
連結嘔せ、Ｅ、　ｅｏｌｉ　ＨＢＩＯＩに形質転換して
プラスミドｐＴＲＵ２を単離した（第１３図）。

ハイブリッド酵素のコード配列を作製するために、プラ
スミドｐＴＲＨ９（参考例１）をＮａｒｌおよびＢｇｌ
ｌで消化し、ベクター機能と大部分のプラスミンＡ鎖コ
ード領域を有する約７ｋｂ断片（ＸＸＸＩＩ）を分離し
た。プラスミドｐＴＲＵ２はＮａｒ■オ！ヒＢｇ１１［
ｆ消化し、約１．５ｋｂ断片（ＸＸＸＩＩＩ）（プラス
ミノーゲンＡ鎖の一部、ウロキナーゼＢ鎖の全部、およ
び３′非翻訳領域の一部をコードする）を単離した。

断片ｘＸＸｒｉオヨヒＸＸＸｍハ連結シ、ｌｉｄ、ｃｏ
ｌｔＨＢＩＯＩＩＣ形質転換し、そしてプラスミドｐＴ
ＲＨ２５（第１４図）を分離した。

１３゜２　タンパク質Ｈ２５の精製 プラスミドｐＴＲＨ２５でトランスフェクトしたＨｅＬ
＆細胞からの、５００ＫＩＵ／−アプロチニンを含む、
５１０ｗｔならし培地は実施例３．２に記載のとおシに
５ｅｐｈａｄｅｔ　Ｇ２５、亜鉛キレート５ｅｐｈａｒ
ｏｓｅおよびリシ：／　５ｅｐｈａｒｏｓｅで精製し調
製した。主な相違点は、標的タンパク質のニック形成を
最小限に抑えるために、クロマトグラフィー緩衝液の多
くにアプロチニン（５０に工Ｕ／−）が存在していたこ
とであった。

フィブリン平板で検定したとき、精製した生産物の用量
応答はｕ−ＰＡよシもむしろｔ−ＰＡによシー層類似し
ていた。従って、これらの結果はｔ−ＰＡの国際標準に
対して表すととｋする。この生産物（２，５ｓｄ　）は
１１０，０ＯＯＩＵを含んでいた。

非還元条件下での５ＤＳ−ＰＡＧＥとこれに続くタンパ
ク質染色による分析は、見掛けＭｒ約１００．０００に
単一の主要バンドをもたらした。このバンドは５ＤＳ−
ＰＡＧＥおよびフイプリンザイモグラフイーで測定した
主要な紗維素溶解活性と完全に一致した。この生産物を
一４０℃で約２ケ月保存した（この期間中時々凍結／解
凍サイクルを行った〕後で分析した場合、それは主とし
て２本鎖の１ｙａＢ形態であると思われた。

実施例１３．２からの１３’ａｙｓ　ｔｃ　Ｈ２５タン
パク質（５６ｐｍｏｌｅ１５０ｐｔ）は２５　ｍＭ　Ｎ
ａＨｔ　ＰＯａ　／２５ｍＭＥＤＴＡ１０．５　　％　
　ト　　リ　　ト　　ン　Ｘ−１００ｐＨ７，５中　３
７　℃で、全インキュベーション容量１００μｔにて、
グリコペプチダーゼＦ　　　Ｃ０，６Ｕ、　３　ｐ　Ｌ
、　ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）で２０時
間処理した。この生成物はフィブリン平板上で天然の糖
タンパク質と類似した用量応答を示し、実艶例１に記載
したような手法を用いて脱グリコジル化された１ｙｓ７
１１　ｔｅＨ２５タンパク質であると同定された。

【図面の簡単な説明】

第１図：　ＰＴＲＨ６の構造 ■■醜＝ｐＵＣ８配列 □＝プラスｉノーゲンｅＤＮＡ配列 ＝つ＝構築の際に使用した制限部位 −一一＝他の制限部位 第２図：　ｐＴＲＨ９の構造 断片（１）〜（Ｉｌｌ）およびリンカ−（ＥＶ）を示す
。 ａｉａｉｉａｗ　＝　ｐＴＲＥ１２Ｄ　Ｎａｒ配列＝挿
入物配列 Ｐ１ｇｎＡ＝プラスミノーゲンＡ鎖コード領域＝キ＝構
築の際に使用した制限部位 −→＝他の制限部位 Ｉ−−一＝タンパク質コード領域 １ユ１：　ＴＲＨ２Ｏの構造 一一■＝ベクター配列 □＝挿入物ＤＮＡ ＝つ＝構築に用いた制限部位 −）＝他の制限部位 毫　＝結合アミノ酸配列 ＝タンパク質コード領域 Ｐ１ｇｎＡ＝プラスミノーゲンＡ鎖コード領域Ａｔ　　
＝ｔ−ＰＡ　Ａ鎖コード領域 Ｂｔ　＝ｔ−ＰＡＢ鎖コード領域 第４図：　ｐＴＲＨ２０４の構造 断片（ｖ）　（Ｓｓｔｌ−Ｎａｒｌ）、（Ｍ）（Ｂａｎ
…−８ｓｔｌ）およびリンカ−（■）　（Ｎａｒｌ−Ｂ
ａｎｌＴ）を示す。 １１−＝ベクター配列 □＝挿入物ＤＮＡ ：■　＝構築に用いた制限部位 一一→＝他の制限部位 毫＝連結点でのプラスミノーゲンセリン５４５／１−Ｐ
Ａ　　セリン２６２に等しいセリン 一一一１＝タンパク質フード領域 ｐｌｇｎＡ　＝プラスミノーゲンＡ鎖コード領域（ｇｌ
ｕｔ−ｐｒｏｓ＜４） ｔ−ＰＡ　＝　ｔ−ＰＡＴ−ド領域（ｔｈｒｚｇｓ−Ｐ
ｒＯｓｚｙ）第５図：　　ｐＴＲＨ３７の構造 断片（ＶＤ　（Ｂａｎｆｌ−８ｓｔｌ）　、　（■）（
Ｓｓｔｌ−ＢｓｔＸｌ）。 （ＩＸ）（ＢａｔＸＩ−Ａｖａｉｌ）およびリンカ−■
（Ａｖａｌｌ−Ｂａｎｌｌ）を示す、 鴎に＝ベクター配列 ＝挿入物配列 ＝さ　＝構築に用いた制限部位 一一→＝他の制限部位 ←−←：タンパク質コード領域 Ｐ１ｇｎ＝プラスミノーゲン配列（ｇｌｕｔ−ｃｙｓｓ
４ｔ）ｔ−ＰＡ＝　ｔ−ＰＡ配列（Ｓｅｒ＊ｓｚ　−Ｐ
ｒＯｓｚｙ　）第６図：　ｐＴＲＨ３８の構造 断片（ＸＩ）　（Ｎｃｏｌ−Ａｖａｎｌ）、　（Ｘｌｌ
）（Ａｖａ［［ｌ−８ｎｏｌ）。 （Ｘｎｌ）（Ｎｃｏｌ断片）およびリンカ−（ＸＴＩ／
）　（Ｓｎｏ　１−Ｎｃｏｌ）を示す。 一晦■＝ベクター配列 □＝挿入物ＤＮＡ ＝５　＝構築に用いる制限部位 μ−−−−−−− １ｇｎ −ＰＡ 来 第７図： 断片（ を示す、 瓢慕−−四η１ ＝＝判ン 米 トーーーー−１ １ｇｎ ＝タンパク質コード領域 ＝プラスミノーゲンコード領域（ｇｌｕｔ−ＰｒＯｓｎ
ｉｓ　＆８ｎｔｓｓ→ｇｌｎ変化あシ）＝ｔ−ＰＡ：ｌ
１ｌ−ド領域（ｔｈｒｓｓｍ　−ｐｒＯｓｚｙ　）＝連
結点でのプラスミノーゲンセリン ５４５またはｔ−ＰＡセリン　２６２に等しいセリン ＝変更したアミノ酸（ａｌｌｎ＊ｓ＊−ｇｌｎ）の位置 ｐＴＲＨ４１の構造 ＸＶ）　（Ｎｃｏｌ断片）およびリンカ−（ＸＭ）；ベ
クター配列 ＝挿入物ＤＮＡ ＝構築に用いた制限部位 ＝連結点におけるプラスミノーゲンセリン５４５／ｌ　
−ＰＡ　セリン２６２に等し９七リン ；タンパク質コード領域 ＝プラスミノーゲン配列（ａｓｎ＊ａｓ−ｇｌｎおよび
ｔｈｒ３４＠→ａｌａの変化を有するｇｌｕｌ　−Ｐｒ
Ｏｓ４ｎ　） ｔ−ｐＡ＝ｔ−ＰＡコード配列（ｔｈｒｅａｔ　−Ｐｒ
Ｏｓｚｙ　）−−−→＝変更したアミノ酸（ｔｈｒ３Ｂ
−＋ａｌａ）の位置 第８図：　ＴＲＨ４２の構造 断片（Ｘ■ン（ＢａｍＨＩ−Ｓａｔｌ）、（ＸＶＩＩＩ
）　（Ａｐａｌ−ＢａｍＨｌ）およびリンカ−（ＸＩＸ
）　（Ｓａｔｌ−Ａｐａｌ）を示す。 一一一＝ベクター配列 ＝挿入物ＤＮＡ ＝５　＝構築に用いた制限部位 来＝連結点におけるプラスミノーゲンセリン５４５／１
−ＰＡセリン２６２に等しいセリン 葛−一一一＝タンパク質コード領域 ＜Ｉｇｎ　　＝プラスミノーゲン配列（ａ８ｎｆｉＢ　
−＋ｇｌｎおよびｔ　ｈ　ｒ２４　ｓ→ａｌａの変化を
有するｇｌｕｔ　−ｐｒｏｓａ＜　） ｔ−ＰＡ＝ｔ−ＰＡ配列 ”−Ｐｒｅｓｓフ　） ｗ、変更したアミノ酸（ＩＬｌｌｎ４４ｓ→ｇｉｎ）の
位置 第９図：　　ｐＴＲＨ４５の構造 膳麿園　＝ベクター配列 冨挿入物ＤＮＡ ニミ〉＝構築に用いた制限部位 一一→冨他の制限部位 オー−（”タンパク質コード領域 ｐｌｇｎ　　＝プラスミノーゲン配列（ｇｌｕｓ−ｅｙ
ｌｓ４ｔ） ｔ−ＦＡ　　＝ｔ−ＰＡ配列（ｔｈｒ！６３　　　ｐｒ
ｏ　ｓａｔ　）第１０図：　　ｐＴＲＨ４２ｂ　構造 断片（ＸＸ）、　（ＸＸＩ）、　（ＸＸＩ［）　オ！ヒ
（ＸＸＩＩＩ）を示す。 ｓａｍｍ−ベクター配列 □＝挿入物ＤＮＡ ＝５　＝構築で用いた制限部位 一−→＝他の制限部位 μｍ−＝構築に用いた断片の起源 第１１図：　　ｐＴＲＰｌの構造 断片（ＸＸｆｌ／）、　（ＸＸＶ）、　（ＸＸＭ）　オ
！びリンカ−（ＸＸ■）を示す。 橿自閣　＝ベクター配列 □；挿入物ＤＮＡ ＝）＝構築に用いた制限部位 一一一千ブラスミノーゲンコード領埴 第１２図：　ｐＴＲＰ４３の構造 御飯１＝ベクター配列 □＝挿入物ＤＮＡ 二二〉　＝構築に用いた制限部位 一一一＝プラスミノーゲンコード領域（ａ８１’Ｌｚｓ
ｓ→ｇｉｎおよびｔｈｒ３４ｇ−＋ａｌａの変化を有す
る　ｇｌｕｔ−ａａｎｔｓｔ） 第１３図：　ｐＴＲＵ２の構造 １都劇　＝ベクター配列 □　＝挿入物ＤＮＡ −−−−−−−＝導入したリンカ−配列＝〉＝構築に用
いた制限部位 −−→＝他の♂１１限部位 一一一＝タンパク質のコード配列 Ｕ　＝ｆｙａキナーゼ配列＜ｐｒｏｌｓｔ　−１ｅｕ４
ｘｔ）第１４図：　ＴＲＨ２５の構造 断片（ＸＸＸｕ　）　オ！び（ＸＸＸＩＩＩ）を示す。 −口■　＝ベクター配列 −〉＝挿入物ＤＮＡ ＝５　＝構築に用いた制限部位 １−一→　＝タンパク質コード領域 Ｐ１ｇｎ　　＝プラスミノーゲン配列（ｇｌｕｌ−Ｐｒ
Ｏｓ４ｎ）Ｕ　−ウロキナーゼ配列（ｐｒＯｓｓｙ　−
１ｅｕ４１１　）代理人　弁理士　　秋　沢　政　光 他１名 第 図 第４図 ５ｓｔｌ／１ｌａｎｌ 第２図 虫”Ｋ　３　ＬＳＫ、１ ；σ６１区１ リンカ−ｘｘｖｔｔ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、炭水化物構造がアミノ酸２８９に結合し得ないこと
   を特徴とする、プラスミノーゲンの５つのクリングルド
   メインを含むプラスミノーゲンまたはプラスミノーゲン
   活性化因子。 ２、２８９位がアスパラギン以外のアミノ酸残基から成
   る、請求項１記載のプラスミノーゲンまたはプラスミノ
   ーゲン活性化因子。 ３、２８９位のアミノ酸残基がグルタミン酸またはアス
   パラギン酸である、請求項２記載のプラスミノーゲンま
   たはプラスミノーゲン活性化因子。 ４、３４６位がトレオニン以外のアミノ酸残基から成る
   、請求項１〜３のいずれか１項記載のプラスミノーゲン
   またはプラスミノーゲン活性化因子。 ５、実質的に内部ペプチド結合切断が存在しないｐ−ア
   ニソイルストレプトキナーゼ−ｌｙｓプラスミノーゲン
   （ａｓｎ＿２＿８＿９→ｇｌｎ；ｔｈｒ＿３＿４＿６→
   ａｌａ）活性化因子複合体； 実質的に内部ペプチド結合切断が存在しないｐ−アニソ
   イルストレプトキナーゼ−ｇｌｕプラスミノーゲン（ａ
   ｓｎ＿２＿８＿９→ｇｌｎ；ｔｈｒ＿３＿４＿６→ａｌ
   ａ）活性化因子複合体；および 以下の物質から選ばれるハイブリッドプラスミノーゲン
   活性化因子： Ｐｌｇ１−５４１（ａｓｎ＿２＿８＿９→ｇｌｎ）〔Ａ
   ＡＰＳＴＣＧＬＲＱＹＳＱＰＱＦＲ）ｔ−ＰＡ２７６−
   ５２７、Ｐｌｇ１−５４１（ａｓｎ＿２＿８＿９→ｇｌ
   ｎ；ｔｈｒ＿３＿４＿６→ａｌａ）〔ＡＡＰＳＴＣＧＬ
   ＲＱＹＳＱＰＱＦＲ）ｔ−ＰＡ２７６−５２７、Ｐｌｇ
   １−５４１（ａｓｎ＿２＿８＿９→ｇｌｎ；ｔｈｒ＿３
   ＿４＿６→ａｌａ）〔ＡＡＰＳＴＣＧＬＲＱＹＳＱＰＱ
   ＦＲ）ｔ−ＰＡ２７６−５２７（ａｓｎ＿４＿４＿３→
   ｇｌｎ）、 Ｐｌｇ１−５４１（ａｓｎ＿２＿８＿９→ｇｌｎ；ｔｈ
   ｒ＿３＿４＿６→ａｌａ）〔ＳＴＣＧＬＲＱＹＳＱＰＱ
   ＦＲ〕ｔ−ＰＡ２７６−５２７（ａｓｎ＿４＿４＿３→
   ｇｌｎ）、 脱グリコｐｌｇ１−５４１〔ＡＡＰＳＴＣＧＬＲＱＹＳ
   ＱＰＱＦＲ）ｔ−ＰＡ２７６−５２７（グリコシル化化
   合物をペプチド：Ｎ−グリコシダーゼＦで処理した生成
   物）、および 脱グリコｐｌｇ１−５４１〔ＡＡＰＳＦＰＳＳＰＰＥＥ
   ＬＫＦＱＣＧＱＫＴＬＲＰＲＦＫ〕ｕ−ＰＡ１５９−４
   １１（グリコシル化化合物をペプチド：Ｎ−グリコシダ
   ーゼ下で処理した生成物） 〔ここでＰｌｇ１−５４１はプラスミノーゲンの残基１
   −５４１（すなわち、クリングル１−５を含む）を表し
   、かつこ内の記号は一文字アミノ酸表記によるアミノ酸
   残基を表す〕 これらの１本鎖および２本鎖変異型、ｌｙｓ＿７＿８お
   よびｇｌｕ１変異型、並びにこれらの混合物；から選ば
   れる、請求項１記載のプラスミノーゲン活性化因子。 ６、線維素溶解活性に必要な触媒部位が除去しうる遮断
   基で場合により遮断されている、請求項１〜５のいずれ
   か１項記載のプラスミノーゲン活性化因子。 ７、除去しうる遮断基が４−クロロ−２−アミノベンゾ
   イルである、請求項６記載のプラスミノーゲン活性化因
   子。 ８、請求項１〜７のいずれか１項記載のプラスミノーゲ
   ンまたはプラスミノーゲン活性化因子の製造方法であつ
   て： （ａ）ａｓｎ＿２＿８＿９の位置に炭水化物構造を有す
   る対応タンパク質をペプチド：Ｎ−グリコシ ダーゼＦで処理する；または （ｂ）上記タンパク質をコードするＤＮＡを組換え宿主
   細胞内で発現させ、そのタンパク質産物を回収する；そ
   の後場合により修飾プラスミノーゲンとストレフトキナ
   ーゼの複合体を形成し、そして／また場合により線維素
   溶 解活性に必要な触媒部位を除去しうる遮断基で遮断する ことから成る上記方法。 ９、請求項１〜７のいずれかに記載のプラスミノーゲン
   またはプラスミノーゲン活性化因子を、製剤学的に許容
   しうる担体と組み合わせて成る薬剤組成物。 １０、血栓症の治療用医薬を製造するための、請求項１
   〜７のいずれかに記載のプラスミノーゲンまたはプラス
   ミノーゲン活性化因子の使用。