JPH05194264A - 血栓塞栓障害治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 血栓塞栓障害の治療に有効な組成物およびそ
の使用法を提供する。 【構成】 フィンガー領域、成長因子領域およびクリン
グル１領域が欠如している組織プラスミノーゲン活性化
因子のジグリコシル化体が、そのモノグリコシル化体お
よび従来の血栓溶解剤と比較して出血合併症の危険が低
く、また高度な線維素選択性を有する点で血栓溶解剤と
して優れていることを発見し、これが血栓塞栓障害の治
療に有効であることを明らかにした。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、血栓塞栓障害の治療において、
フィンガー（Ｆｉｎｇｅｒ）ドメイン、成長因子（Ｇｒ
ｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）ドメイン、およびクリングル
（Ｋｒｉｎｇｌｅ）１ドメインが欠失した組織プラスミ
ノーゲン活性化因子のジグリコシル体を使用する方法に
関する。

【０００２】プラスミノーゲン活性化因子は、プラスミ
ノーゲンをその活性酵素型であるプラスミンに変換す
る、他に類のない酵素群である。プラスミンは血塊の線
維素網を分解するセリンプロテアーゼである。現在いく
つかのプラスミノーゲン活性化因子が、急性の心筋梗塞
の治療におけるインビボ線維素溶解剤として使用されて
いる。これらのプラスミノーゲン活性化因子の１つであ
る組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）は、線
維素の存在下でそのプラスミノーゲン活性化能が有意に
増大する。したがってインビボ線維素溶解剤として使用
した場合、ｔ−ＰＡは線維素塊に注がれる。

【０００３】ヒトｔ−ＰＡは、血管内皮細胞が分泌する
複数ドメインから成るセリンプロテアーゼである。５種
類の異なった構造ドメインが、成熟したｔ−ＰＡ分子の
５２７アミノ酸を構成している。この分子は単一鎖ポリ
ペプチドとして合成され、これはアルギニン２７５−イ
ソロイシン２７６における、プラスミンが介在する切断
によって、二本鎖型に変換できる。ヒトｔ−ＰＡのＤＮ
Ａおよびアミノ酸構造については、Pennica等、1983、Nat
ure 301:214に記述されている。本明細書では、Pennica
等の番号付与法を使用する。ゲノムｔ−ＰＡの遺伝子マ
ッピングの研究によって、ｔ−ＰＡをコードする遺伝子
は、イントロンで分割された１２のエクソンから構成さ
れていることが示された（Ny等、1984、Proc.Natl.Acad.S
ci.USA81:5355）。これらのイントロンは、アミノ酸レ
ベルにおけるドメイン接合部に部分的に対応している。

【０００４】この分子のアミノ末端部分は、フィンガー
ドメイン（Ｆ）と呼ばれるジスルフィド架橋環を含んで
いる。このドメインは、フィブロネクチンに線維素結合
性を与えるフィブロネクチンのフィンガードメインに対
して高度に相同である。成長因子ドメイン（Ｅ）と呼ば
れる第２のドメインは、表皮成長因子と高度に相同であ
る。類似の成長因子ドメインは、ウロキナーゼ、プロテ
インＣ、凝固因子ＩＸおよびＸなどのセリンプロテーゼ
にも存在する。第３および第４のドメインは高度にジス
ルフィド架橋された構造であって、クリングル（Ｋ１お
よびＫ２）と呼ばれている。類似のクリングル構造は、
プラスミノーゲンやプロトロンビンなどの血漿タンパク
質中にも存在する。線維素が介在するプラスミノーゲン
の活性化に両クリングルドメインが関与するのか、ある
いは第２のクリングルドメインのみが関与するのかにつ
いては、相反する証拠が存在する。カルボキシ末端に位
置する第５のドメインは、セリンプロテアーゼドメイン
（ＳＰ）である。このセリンプロテアーゼドメインは、
ウロキナーゼ、血漿セリン凝固プロテアーゼ、およびト
リプシン中の類似のドメインと相同である。

【０００５】虚血性の心筋層への血流の早期修復のため
の血栓溶解療法は、かなりの支持を集めてきた。血漿寿
命が短いので、組換え組織プラスミノーゲン活性化因子
は、その血栓溶解有効性を確実にするために静脈内注入
によって投与しなければならない。冠状血栓溶解の最近
の総説は、新しい血栓溶解剤の理想的な性質として、ス
トレプトキナーゼ、ｔ−ＰＡ、あるいはウロキナーゼと
比較して、線維素特異的であること、１回の注射投与が
可能なようにより長い血漿寿命を有すること、より迅速
な再灌流を生み出すこと、再閉塞を防ぐこと、またより
安全であること（即ち出血の危険が低いこと、非免疫原
性であること）、と提案している（Collen,D.,Klin.Woc
henschr.1988;66(Suppl.12):15-23；Bang等、1989、Annu.
Rev.Pharmacol.Toxicol.29:322-341；Minno等、1989、Pha
rmacol.Res.21(2):153-161；Mueller等、1989、Med.Clin.
North Am,73(2):387-407）。

【０００６】組換えｔ−ＰＡの生産以来、研究者たちは
ｔ−ＰＡやウロキナーゼについてより多くの知見を得る
ために、これらのセリンプロテアーゼの修飾組換え体を
作成してきた（Krause,J.、1988、Fibrinolysis 2:133-14
2；Pannekoek等、1988、Fibrinolysis 2:123-133；Haigwo
od等、1989、Protein Engineering 2:611-620；Higginsお
よびBennett、1990、Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.30:9
1）。誘導体の設計における主要な力点は、内因性の天
然タンパク質と比較した場合の線維素特異性の増大、循
環血漿寿命の増大、および出血傾向の減少であった。

【０００７】天然ｔ−ＰＡのある誘導体が、Burck等、19
90、Journal of Biological Chemistry 265(9):5176に記
述されている。ｍｔ−ＰＡ６として知られているこの誘
導体は、ヒトｔ−ＰＡをコードするｃＤＮＡへの部位特
異的変異導入によって構築された。発現した時に得られ
るｔ−ＰＡ誘導体が、シグナルペプチドおよびプロペプ
チドドメイン、成熟したｔ−ＰＡの最初の３アミノ酸、
並びにクリングル２およびセリンプロテアーゼドメイン
からなるように、アミノ酸４−１７５をコードするＤＮ
Ａが削除された。ｍｔ−ＰＡ６は、天然のｔ−ＰＡより
高い線維素溶解活性と、天然のｔ−ＰＡより高い、血栓
に結合したプラスミノーゲンを活性化する能力を有する
ことがわかった（Jackson等、1990、Circulation 82:930-
940）。

【０００８】メラノーマ（黒色腫）細胞由来のｔ−ＰＡ
と、ＣＨＯ細胞から組換えＤＮＡ法によって生産された
ｔ−ＰＡは、共にアミノ酸１１７、１８４、２１８およ
び４４８の位置に、一致した４つのアスパラギン結合型
（Ｎ結合型）グリコシル化部位を含んでいる。天然のｔ
−ＰＡでは、アミノ酸２１８はグリコシル化されず、ま
たアミノ酸１８４は時々グリコシル化される（Higgins
およびBennett、1990）。したがって２種類の天然ｔ−Ｐ
Ａグリコシル化体が単離されてきた。１つのグリコシル
化体では、クリングル１ドメイン中のアミノ酸１１７と
セリンプロテアーゼドメイン中のアミノ酸４４８がグリ
コシル化されている。またもう１つのグリコシル化体で
は、アミノ酸１１７、４４８および１８４がグリコシル
化されている。

【０００９】アミノ酸１８４および４４８のオリゴ糖は
複合型オリゴ糖であるが、アミノ酸１１７は高マンノー
ス型オリゴ糖で占められている（Spellman等、1989、J.of
Biol.Chem.264(24):14100）。ＣＨＯ細胞由来の天然ｔ
−ＰＡ中のこれらのオリゴ糖の構造については、Spellm
an等(1989）によって記述されている。Ｎ結合グリコシ
ル化部位は、特異的に認識されグリコシル化されるトリ
ペプチド配列である。トリペプチドコンセンサス（cons
ensus）配列の例には、アスパラギン−Ｘ−スレオニン
およびアスパラギン−Ｘ−セリン（Ｘはプロリン以外の
任意のアミノ酸）が含まれる。

【００１０】真核細胞培養によって生産された場合、ｍ
ｔ−ＰＡ６もまた２種類のグリコシル化体を持つ。これ
ら２つの形態は、ゲル電気泳動で精製酵素を分析した場
合に見られる４０および４２ｋＤバンドの二重線の原因
となる。主要（Ｐｒｉｍａｒｙ）ｍｔ−ＰＡ６ではアミ
ノ酸４４８のみがグリコシル化される。変種（Ｖａｒｉ
ａｎｔ）ｍｔ−ＰＡ６ではアミノ酸４４８および１８４
がグリコシル化される。ｍｔ−ＰＡ６はＫ１ドメインを
欠いており、したがってアミノ酸１１７のグリコシル化
部位も欠失している。クリングル２中のアミノ酸２１８
はグリコシル化されない。変種ｍｔ−ＰＡ６は、シリア
ンハムスター（Syrian hamster）株化細胞から分泌され
るｍｔ−ＰＡ６分子の１５−２５％を占めている（Burc
k等、前述）

【００１１】フィンガードメインおよび成長因子ドメイ
ンが削除されているｔ−ＰＡ誘導体のグリコシル化様式
の変化が及ぼす影響に関する研究は、部分的に、もしく
は全くグリコシル化されていない誘導体が、完全にグリ
コシル化されているものより高い線維素溶解／線維素原
溶解比を有することを示している（Hansen等、1988、Jour
nal of Biological Chemistry 263(30):15713-19）。こ
れらの結果は本発明の方法とは別のことを教示してい
る。フィンガードメイン、ＥＧＦおよびクリングル１ド
メインが欠失しているジグリコシル化ｔ−ＰＡ誘導体、
とりわけ変種ｍｔ−ＰＡ６は、血栓塞栓障害の治療にお
いて、部分的に、もしくは全くグリコシル化されていな
いもの対して複数の利点を有している。変種ｍｔ−ＰＡ
６は主要ｍｔ−ＰＡ６と比較して、プラスミノーゲンか
らプラスミンへの全身性の変換を引き起こしにくく、ま
たその二本鎖体への代謝傾向が著しく低く、より高い線
維素溶解／線維素原溶解比を有するという予期されなか
った有利な性質を示す。驚くべきことに、変種ｍｔ−Ｐ
Ａ６は冠状血流のより高い維持をももたらす。

【００１２】本発明の目的のために、本明細書において
用いられる次の用語を以下のように定義する。 ＡｐＲ：アンピシリン耐性表現型、あるいはそれを与え
る遺伝子。 ＥｌＡ：ポリＧＴ要素を活性化してエンハンサー活性を
発現させ、またＢＫウイルスエンハンサーを活性化する
こともできる、アデノウイルスの直前（immediate）初
期遺伝子産物。 ｅｐ：Ｔ抗原遺伝子、Ｔ抗原結合部位、およびＳＶ４０
複製起源のＳＶ４０初期プロモーターを含有するＤＮＡ
断片。 ＧＢＭＴ転写制御単位：アデノウイルスの主後期プロモ
ーターの上流の調節要素の近傍に位置するＢＫウイルス
のＰ２エンハンサー因子（ＭＬＴＦ）、アデノウイルス
２主後期プロモーター、およびアデノウイルス２のスプ
ライスされた３部分先導配列をコードするＤＮＡと該プ
ロモーターを刺激する位置にあるポリＧＴ要素を含有す
る、改良された転写制御単位。ＧＭＢＴ転写制御単位の
最適な具体例は、大腸菌Ｋ１２ ＡＧ１／ｐＧＴＣ（Ｎ
ＲＲＬ Ｂ−１８５９３）中に存在するプラスミドｐＧ
ＴＣ中にある、約９００塩基対のＨｉｎｄIIIカセット
である。 ＧＴ−エンハンサー系：ＭＬＰにようなプロモーターに
連結された任意のポリＧＴ要素であって、そのポリＧＴ
要素自体はエンハンサー活性を有さないが、ＥｌＡ遺伝
子産物のような巨大ＤＮＡウイルスの直前初期遺伝子産
物や、同様に活性化する任意のウイルス遺伝子産物によ
って、エンハンサーとして活性化されるもの。 ＨｍＲ：ハイグロマイシン耐性表現型、あるいはそれを
与える遺伝子。 ＩＶＳ：イントロンをコードするＤＮＡ、介在（interv
ening）配列とも呼ばれる。 巨大ＤＮＡウイルス：真核細胞に感染するウイルスであ
って、〜１０ｋｂより大きいゲノムを有するもの。即
ち、任意のポックスウイルス、アデノウイルス、および
ヘルペスウイルス。 ＭＬＰ：アデノウイルスの主後期プロモーター。本明細
書においてはアデノウイルス後期プロモーター、アデノ
ウイルス２型後期プロモーター、あるいはＡｄ２後期プ
ロモーターとも呼ぶ。 ＭＬＴＦ結合部位：主後期転写因子（ＭＬＴＦ）が結合
するアデノウイルスＤＮＡ中の部位。ＭＬＴＦはＭＬＰ
活性にとって必要である。 Ｎ結合型グリコシル化：Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配
列中のアスパラギン残基におけるＮ−グリコシド結合を
介して、タンパク質にオリゴ糖が付加すること。 ＮｅｏＲ：ネオマイシン耐性付与遺伝子。これはＧ４１
８耐性を真核宿主細胞に与えるためにも使用できる。 ｏｒｉ：プラスミドの複製起源。 ｐＡ：ポリアデニル化信号をコードするＤＮＡ配列。 ポリＧＴ要素：（ＧＴ）_ｎ−（ＣＡ）_ｎであるＤＮＡ配
列。本明細書ではｎ＝２１の配列が例示されているが、
ｎが２１より大きいか、もしくは小さいような種々の長
さの配列をも意味し、また化学的に合成された（ＧＴ）
_ｎ−（ＣＡ）_ｎ配列や、（ＧＴ）_ｎ−（ＣＡ）_ｎ領域を
含有するヒトのゲノムＤＮＡ断片を意味することもあ
る。 再閉塞：血栓の再形成および／または血管収縮によって
おこる、血栓溶解成功後の血流の完全な停止。 再灌流：血栓溶解の成功によっておこる血流の修復。

【００１３】本発明は、有効な投与量のジグリコシル化
ｔ−ＰＡ誘導体を投与することによる、血栓塞栓障害治
療法を提供する。ただし該誘導体は、フィンガードメイ
ン、成長因子ドメイン、およびクリングル１ドメインが
欠失しているものである。本血栓塞栓障害治療法は、好
ましくは、有効投与量の変種ｍｔ−ＰＡ６を投与するこ
とによる。

【００１４】また本法は、フィンガードメイン、ＥＧＦ
およびクリングル１ドメインを欠くｔ−ＰＡ誘導体のジ
グリコシル体を、深静脈血栓症、散在性血管内凝固、心
臓もしくは末梢動脈から発する塞栓、急性心筋梗塞、血
栓性発作、および侵入性癌腫に伴う線維素沈着を含む、
血栓塞栓障害の治療における医薬品として使用するため
に提供する。

【００１５】本発明は、より長いインビボ寿命を示し、
また冠状血流をより良く維持する一方、プラスミノーゲ
ンおよびフィブリノーゲンを節約する（sparing）とい
う極めて望ましい性質を有するプラスミノーゲン活性化
因子を提供することによって、現在の療法の改良を提供
する。

【００１６】真核細胞培養から組換えＤＮＡ技術によっ
て生産した場合、ｍｔ−ＰＡ６のようにフィンガードメ
イン、ＥＧＦおよびクリングル１ドメインが欠失してい
るｔ−ＰＡ誘導体は、モノグリコシル体（主要型）およ
びジグリコシル化体（変種型）の両形態で存在する。本
発明は当該技術分野に対して、フィンガードメイン、Ｅ
ＧＦおよびクリングル１ドメインを欠くｔ−ＰＡ誘導体
のジグリコシル化体を使用する血栓塞栓障害の治療法を
提供する。

【００１７】変種ｍｔ−ＰＡ６は本発明の好ましい態様
であり、天然のｔ−ＰＡのフィンガードメイン、ＥＧＦ
およびクリングル１ドメインが欠失しているジグリコシ
ル化ｔ−ＰＡ誘導体の実例である。ｍｔ−ＰＡ６をコー
ドするＤＮＡは、実施例２に記述するように発現ベクタ
ー中に構築クローニングされ、プラスミドｐｍｔ６−ｈ
ｄをもたらした。プラスミドｐｍｔ６−ｈｄを、従来の
真核細胞形質転換技術を用いて、シリアンハムスターＡ
Ｖ１２−６６４細胞中に導入した。Buruck等（前述）に
よって記述されているようにして、この形質転換細胞を
培養し、その培養培地からｍｔ−ＰＡ６を単離精製し
た。

【００１８】本発明の有効性を例証するために、変種ｍ
ｔ−ＰＡ６を８５％以上含有するｍｔ−ＰＡ６試料を、
主要ｍｔ−ＰＡ６を９２％以上含有するｍｔ−ＰＡ６試
料と比較した。Einarsson等、1985、Biochim.Biophys.Act
a 830:1-10、およびRijken等、1985、Thromb.and Haemost
as.54(4),788-791の方法に実質的に従ってアフィニティ
ークロマトグラフィーを実施すれば、ｍｔ−ＰＡ６のこ
の２つの形態を分離することができる。変種ｍｔ−ＰＡ
６の血栓溶解能を、Jackson等が記述したイヌの血栓症
モデル（Jackson等、1990、Circulation 82:930-940）中
で研究した。またフィブリノーゲン分解およびプラスミ
ノーゲン分解における変種ｍｔ−ＰＡ６の役割も、Jack
son等（前述）の方法で調べた。

【００１９】変種ｍｔ−ＰＡ６と主要ｍｔ−ＰＡ６の間
には著しい薬学的相違が認められた。主要ｍｔ−ＰＡ６
による治療はプラスミノーゲンの全身性の活性化をもた
らし、血漿フィブリノーゲンを減少させた。著しく対照
的に、変種ｍｔ−ＰＡ６は全身性のプラスミノーゲン活
性化が極めて小さくてフィブリノーゲン分解が少なく、
また二本鎖型に代謝されにくかった。また驚くべきこと
に、変種ｍｔ−ＰＡ６は冠状血流をより良く維持した。

【００２０】ｍｔ−ＰＡ６コードＤＮＡを、ｍｔ−ＰＡ
６の発現がＥｌＡ応答性の（responsive）ＢＬ転写単位
によって駆動されるような多シストロンベクター中に挿
入した。得られたプラスミドは、ハイグロマイシンホス
ホトランスフェラーゼおよびジヒドロフォレートリダク
ターゼ（ＤＨＦＲ）をコードするＤＮＡの発現のための
シストロンをも含有しており、これらは共にＳＶ４０初
期プロモーターによって駆動される。

【００２１】ｔ−ＰＡのアミノ酸−１３から−３５まで
は、シグナル配列を含む疎水性アミノ酸であり、このシ
グナル配列は宿主細胞からｔ−ＰＡ分子を分泌させる
（Vehar等、1984、Bio/Technology 2(12):1050）。このシ
グナル配列は分泌過程中にｔ−ＰＡから切り離され、ア
ミノ末端に１２アミノ酸プロペプチド領域を伴ったｔ−
ＰＡ分子を与える。ｔ−ＰＡが細胞培養技術を用いてメ
ラノーマ細胞によって生産される場合は、得られる培養
培地から単離されるｔ−ＰＡ分子は２種類の形態で存在
する（Wallen等、1983、Eur.J.Biochem.132:681-686）。
１つの形態は、プロペプチドの１２アミノ酸うちの９ア
ミノ酸が切断されていて、そのためにトリペプチドアミ
ノ末端領域Ｈ₂Ｎ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇを伴ってい
るｔ−ＰＡである。またもう１つの形態は、全プロペプ
チド領域が切断されている、完全なプロッセシングを受
けた成熟ｔ−ＰＡである（Vehar等、1984）。ｍｔ−Ｐ
Ａ６もまた培養培地中に、部分的にプロッセシングされ
た形態で、あるいは完全にプロセッシングされた形態で
存在する。ｍｔ−ＰＡ６のこの２種類のアミノ末端型の
インビトロ活性には相違が認められたかった（Burk等、
前述）。

【００２２】細胞に付随するプロテアーゼによって均一
に切断され得るようなプロペプチド領域を与えることに
よって、アミノ末端のこのような不均一性を除外するこ
とができる。アメリカ合衆国特許出願番号０７／６０９
５１０（代理人事件Ｘ−７８０９、１９９０年１１月６
日出願）は、均一に分布したｔ−ＰＡ分子の生産を可能
にする方法とその組成物について記述している。プロペ
プチド切断のアミノ酸配列は、成熟したｔ−ＰＡ分子の
アミノ酸＋１（Ｓｅｒ）に直接先行して位置する次に配
列によってコードすることができる：Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｐ
３ Ｐ２ Ｐ１（配列識別番号：１） Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｐ３ Ｐ２ Ｐ１（配列識別番号：２） Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｐ３ Ｐ２ Ｐ１（配列識別番号：３） Ｖａｌ Ａｒｇ Ｐ３ Ｐ２ Ｐ１（配列識別番号：４） （ただし、位置Ｐ３、Ｐ２、およびＰ１のアミノ酸は、
ＬｙｓあるいはＡｒｇである）。均一に切断され得る細
胞付随プロテアーゼ切断部位のうち、より好ましいもの
は： Ａｒｇ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ（配列識別番号：
５） Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｒｇ（配列識別番号：
６） Ｇｌｕ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ（配列識別番号：
７） Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｒｇ（配列識別番号：
８） である。均一に切断され得る細胞付随プロテアーゼ切断
配列のうち最も好ましいものは、配列識別番号５であ
る。これらの切断配列をコードするＤＮＡ配列を、ｔ−
ＰＡ分子をコードする組換えＤＮＡベクターに組み込む
ことができる。Maniatis等が記述している部位特異的変
異導入法など、当該技術分野においてよく知られている
方法によって、これらのＤＮＡ配列の組み込みが実施で
きることは、当業者には理解されるであろう。したがっ
てｍｔ−ＰＡ６の変種型は、分子のアミノ末端がトリペ
プチド配列Ｈ₂Ｎ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇを欠いてい
るように生産することができる。

【００２３】新規なプロペプチド領域に連結されたｍｔ
−ＰＡ−６を高レベルで発現させるために、プラスミド
ｐＳＢＬ−Ｂｔ６を構築した。このプラスミドによる発
現は、アデノウイルス−２後期プロモーターに近接して
位置するＢＫウイルスのＰ２エンハンサーに連結された
ＳＶ４０エンハンサーを含有するＳＢＬ単位によって提
供される。ＳＢＬ単位は、適切に位置された有用物質の
高レベルな発現を駆動するであろう。プラスミドｐＳＢ
Ｌ−Ｂｔ６は、均一に切断され得るプロペプチド領域に
機能するように連結されたｍｔ−ＰＡ−６を発現させる
ために、適切に位置するＳＢＬ単位を含有している。

【００２４】さらに本発明を例証するために、プラスミ
ドｐＧＴ−ｔ６Ｂ−ｄを構築した。このプラスミドは、
均一に切断され得るプロペプチド領域に連結されたｍｔ
−ＰＡ−６の高レベルな発現を可能にする。このプラス
ミドによる発現は、アデノウイルスの主後期プロモータ
ーの上流の調節要素に近接して位置するＢＫウイルスの
Ｐ２エンハンサー、アデノウイルス−２後期プロモータ
ー、アデノウイルスの３部分先導配列をコードするＤＮ
Ａ配列および該プロモーターを刺激する位置にあるポリ
ＧＴ要素を含有するＧＢＭＴ単位によって提供される。
適切に位置させるならば、ＧＢＭＴ単位は有用物質の高
レベルな発現を駆動するだろう。プラスミドｐＧＴ−ｔ
６Ｂ−ｄは、ｍｔ−ＰＡ−６の発現に適した位置にＧＢ
ＭＴ単位を含有している。

【００２５】上記のベクターを用いて、アデノウイルス
ＥｌＡ直前初期遺伝子産物が発現する宿主細胞を形質転
換することが好ましい。この際、ベクター上のＢＫエン
ハンサーは、ＥｌＡの存在下で最も効果的に発現を促進
するように機能する。宿主細胞のいくつかが、ＥｌＡの
ような巨大ＤＮＡウイルスの直前遺伝子産物を発現す
る、あるいは発現するようにできるということは、当業
者には理解されるであろう。好ましい株化細胞は、シリ
アンハムスターＡＶ１２−６６４株（アメリカンタイプ
カルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、ロックビル Ｍ
Ｄ，２０８５２）より受託番号ＣＲＬ ９５９５の下で
入手可能）、あるいはヒトの腎２９３株化細胞（ＡＴＣ
Ｃ ＣＲＬ １５７３）である。ＡＶ１２−６６４株化細
胞が最も好ましい。

【００２６】本発明に有効なベクターを種々の真核宿主
細胞に導入し、発現させることができる。安定な真核形
質転換細胞を同定し単離するのに有効な選択標識を含有
していない本発明のベクターは、仮検定のためだけでな
く、同時形質転換（アメリカ合衆国特許４３９９２１６
（１９８３年８月２６日発行）および本明細書の一部を
構成する文献に開示されている操作法））のためにも有
効である。さらにこのベクターは、大腸菌内での複製を
可能にする配列をも含み得る。これは通常、他の宿主生
物中よりも大腸菌内でプラスミドＤＮＡを調製する方が
効率が良いからである。

【００２７】本発明のベクターによってコードされてい
るｔ−ＰＡ誘導体の発現は、ｔ−ＰＡ誘導体遺伝子に付
随する特定のプロモーターが機能するような宿主細胞に
おいて実現する。本発明で使用するのに適した宿主細胞
の例には、ＢＨＫ−２１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １
０）、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ６１）、お
よびＣ１２７Ｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１６）が含
まれる。

【００２８】多くの哺乳類宿主細胞は、本発明の初期タ
ンパク質上のシグナルペプチドの認識と適切なプロセッ
シングや、グリコシル化のような翻訳後の修飾を行うの
に必要な細胞機構を有している。以下に論じる広範囲に
わたる多様なベクターが、このような真核宿主細胞の形
質転換に適しており、以下に例示される特定のベクター
は本発明の範囲を限定するものではない。

【００２９】ｐＳＶ２型ベクターは、定義された真核転
写単位プロモーター（ｅｐ）、介在配列（ＩＶＳ）、お
よびポリアデニル化（ｐＡ）部位を構成するＳＶ４０ゲ
ノム断片を含有している。ＳＶ４０ Ｔ抗原の非存在下
でプラスミドｐＳＶ２型ベクターは、宿主細胞染色体Ｄ
ＮＡへの組み込みによって哺乳類および他の真核宿主細
胞を形質転換する。種々のプラスミドｐＳＶ２型ベクタ
ーが構築されている（Eukaryotic Viral Vectors、Gluzm
an編、コールドスプリングハーバーラボラトリーズ、ニュ
ーヨーク、１９８２）。これらの例としては、プラスミ
ドｐＳＶ２−ｇｐｔ、ｐＳＶ２−ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄ
ｈｆｒ、ｐＳＶ２−ｈｙｇ、およびｐＳＶ２−β−グロ
ビンなどを挙げることができ、これらのＳＶ４０プロモ
ーターは挿入された遺伝子の転写を駆動する。これらの
ベクターは本発明のコード配列と共に使用するのに適し
ており、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａ
ＴＣＣ）（ロックビル、メリーランド）あるいはノーザ
ンリジョナルリサーチラボラトリー（ＮＲＲＬ）（ペオ
リア、イリノイ）のどちらからでも入手できる。

【００３０】プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ
３７１２６）は、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下
に、ネズミのジヒドロフォレートリダクターゼ（ｄｈｆ
ｒ）遺伝子を含有している。適切な条件下では、宿主染
色体中でこのｄｈｆｒ遺伝子が増幅、もしくは複製され
ることが知られている。Schimke、1984、Cell 37:705-713
の総説に記述されているこの増幅は、例えば本発明のｔ
−ＰＡ化合物のように、ｄｈｆｒ遺伝子に緊密に連続し
ているＤＮＡ配列を含むことができ、したがって本発明
のｔ−ＰＡ分子の生産を増大させるために利用すること
ができる。

【００３１】本発明のｔ−ＰＡ化合物を哺乳類および他
の真核宿主細胞内で発現させるために構築されたプラス
ミドは、広範囲にわたる多様なプロモーターを利用する
ことができる。本発明が、本明細書に例示される特定の
真核プロモーターの使用に限定されることは全くない。
ＳＶ４０後期プロモーターや、Bucher等、1986、Nuc.Acid
s Res.14(24):1009に開示されている真核プロモータ
ー、あるいは真核遺伝子（例えば、エストロゲン誘発性
のチキン卵白アルブミン遺伝子、インターフェロン遺伝
子、糖質コルチコイド誘発性のチロシンアミノトランス
フェラーゼ遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、および主
初期および後期アデノウイルス遺伝子など）のプロモー
ターなどのプロモーターは容易に単離でき、真核宿主細
胞中でヒトの組織プラスミノーゲン活性化因子を生産す
るための組換えＤＮＡ発現ベクター上で使用するために
修飾することができる。本発明のコード配列の発現を駆
動するために、真核プロモーターを直列につないで使用
することもできる。さらに、多くのレトロウイルスが極
めて多様な真核宿主細胞に感染することも知られてい
る。レトロウイルスＤＮＡ中の長い末端反復はしばしば
プロモーター活性をコードしているので、本発明のコー
ド配列の発現を駆動するために利用できる。

【００３２】プラスミドｐＲＳＶｃａｔ（ＡＴＣＣ ３
７１５２）は、ニワトリおよび他の宿主細胞に感染する
ことが知られているラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の長
い末端反復部分を含有している。このＲＳＶ長末端反復
配列を、プラスミドｐＲＳＶｃａｔの、〜０.７６ｋｂ
ＮｄｅＩ−ＨｉｎｄIII制限断片上に単離することがで
きる。ＲＳＶ長末端反復中のプロモーター（Gorman等、1
982、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:6777）は、本発明のベ
クター中で用いるのに適している。プラスミドｐＭＳＶ
ｉ（ＮＲＲＬ Ｂ−１５９２９）は、マウスおよび他の
宿主細胞に感染することが知られているネズミ肉腫ウイ
ルス（ＭＳＶ）の長末端反復を含有している。これらの
反復配列は、本発明のベクター中のプロモーターとして
使用するのに適している。マウスのメタロチオネイン
（ＭＭＴ）プロモーターも、真核宿主細胞中で利用する
ために良く特徴づけられており、本発明のベクター中で
使用するのに適している。このＭＭＴプロモーターは、
本発明の他のプラスミドを構築するための出発物として
役立つ１５ｋｂのプラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ
（ＡＴＣＣ ３７２２４）中に存在する。

【００３３】本明細書に例示されるＤＮＡ配列およびプ
ラスミドの多くの修飾および変形が考えられる。例えば
遺伝コードの縮重は、ポリペプチドコード領域の至ると
ころで、また翻訳終止シグナル中で、コードされている
ポリペプチドコード配列を変化させることなく、ヌクレ
オチドを置換することを可能にする。このように置換可
能な配列は、ヒトｔ−ＰＡの既知のアミノ酸配列あるい
はＤＮＡ配列から推定することができ、従来の合成法
か、もしくは部位特異的変異導入法によって構築するこ
とができる。合成ＤＮＡ法は、Itakura等、1977、Science
198:1056、およびCrea等、1978、Proc.Natl.Acad.Sci.US
A 75:5765の方法に実質的に従って行うことができる。
部位特異的変異導入法については、Maniatis等、Molecul
ar Cloning:A Laboratory Manual コールドスプリング
ハーバー、ニューヨーク（第２版、１９８９年）に記述
されている。したがって本発明が、特に例示されるＤＮ
Ａ配列やプラスミドに限定されることは全くない。

【００３４】本発明のベクターで真核宿主細胞を形質転
換した後、選択可能な表現型に基づいて形質転換体を選
択することができる。この表現型は、その発現ベクター
上か、あるいはこの発現ベクターと同時に宿主に導入さ
れる他のベクター上に存在する選択標識によって付与す
ることができる。形質転換体を選択したら、どの形質転
換体が、その発現ベクター上にコードされている目的の
タンパク質を最も高いレベルで発現しているかを同定す
ることが望ましい。このような同定は、選択標識を含有
するプラスミドのみを含み、発現ベクターを含まない形
質転換体がいくつか生成する同時形質転換操作の後で
は、特に重要である。

【００３５】ジヒドロフォレートリダクターゼ（ｄｈｆ
ｒ）遺伝子を選択遺伝子として、遺伝子あるいはプラス
ミドをｄｈｆｒ欠失株化細胞中に導入するために使用
し、次いでメソトレキセートを、プラスミドのコピー数
を増幅するために用いることは、文献中に十分確立され
ている。ｄｈｆｒ産生細胞の使用は十分には研究されて
いないが、霊長類細胞中での効率的な同時増幅には、メ
ソトレキセートを使用する同時増幅の前に、直接的に選
択可能な標識を用いて初期選択することが必要である。
本発明の使用は、使用された選択標識に限定されない。
さらに、メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナ
ーゼ遺伝子、あるいはポリジーン（multigene）耐性群
の構成要素（例、Ｐ−グリコプロテイン）のように増幅
可能な標識も使用できる。

【００３６】本発明のジグリコシル化ｔ−ＰＡ誘導体は
出血併発症の可能性が従来の血栓溶解剤よりも低いの
で、手術直後の期間における血栓塞栓症の治療におい
て、従来の血栓溶解剤の魅力的な代替物である。急性動
脈閉塞の状況下で虚血性の肢節の切断を免れるためにし
ばしば必要な外科的操作である血栓摘出および塞栓摘出
に先立って、あるいはこれらと同時に、このジグリコシ
ル化ｔ−ＰＡ誘導体を使用することもできる。

【００３７】心臓から生じる動脈塞栓は、心臓弁を含む
心臓の疾患、人工心臓弁を付けている患者、急性の心筋
梗塞、およびある型の心臓不整脈の合併症であることが
多い。従来の血栓溶解剤でこれらの問題を治療しても有
効でないことが多い。特に塞栓が主大脳動脈内に留まっ
ている場合には、出血合併症の危険性が重大である。本
発明のジグリコシル化ｔ−ＰＡ誘導体は、出血合併症の
危険が低く、心臓源の塞栓の治療に実質的な有用性を有
する極めて有効な血栓溶解剤である。

【００３８】さらに抹消動脈、とりわけ頸動脈中の血栓
から生じる塞栓を従来の血栓溶解剤で治療する場合に
も、患者を主大脳動脈内出血合併症の極めて高い危険性
にさらすことになる。出血合併症の可能性が減少した本
発明のジグリコシル化ｔ−ＰＡ誘導体は、この診療状況
における有用性を十分有し得る。

【００３９】本発明のジグリコシル化ｔ−ＰＡ誘導体
は、血栓性発作、とりわけ、いわゆる“進展する発作
（stroke in evolution）”の治療にも有効であり得
る。発作あるいは“進展する発作”の終わった患者に従
来の血栓溶解剤を与えると、重度の衰弱や致命的な大脳
内出血の形で、破滅的な結果を招いていた。さらに、ヘ
パリンや経口抗凝血剤による発作の治療は、ときおりは
有効であるけれども、梗塞した脳の領域内での出血によ
って、発作に伴う神経学的な欠損を悪化させるという高
い危険性を伴っている。出血合併症を引き起こす可能性
が低いこと、およびその選択性ゆえに、本発明のジグリ
コシル化ｔ−ＰＡ誘導体を発作患者に与えることがで
き、またその兆候が始まってから十分早い時期にこの薬
剤を投与すれば、それが閉塞している血栓を溶解するこ
とによって、発作がもたらす神経学的な欠損を減少させ
る効果を有すると考えられる。

【００４０】本発明のジグリコシル化ｔ−ＰＡ誘導体は
急性心筋梗塞の治療に有効となるだろう。実証されてい
るように、標準（authentic）ｔ−ＰＡを３０〜１００
ｍｇの投与量でＩ.Ｖ.に１〜３時間かけて投与すれば、
閉塞している冠状血栓を溶解し、心筋の灌流を再確立
し、虚血性の心筋層の広い領域を救うのに有効である。

【００４１】従来の血栓溶解剤ストレプトキナーゼ、プ
ラスミン、およびウロキナーゼ侵入性の悪性腫瘍の治療
に有効であるという証拠は、実験動物中で確認されてい
る。多くの腫瘍細胞は、局所的な線維素沈着をもたらす
凝固系活性化の引金となる物質を産生する。これらの線
維素沈着は、癌細胞がその中で分裂して転移性の病巣を
形成し得る“巣”として機能する。これらの線維素沈着
を溶解することは、転移性の悪性疾患の成長を阻害する
と考えられる。広範囲に及ぶ癌を伴う患者に従来の血栓
溶解剤を与えることは、おそらく、許容できない出血合
併症の危険を引き起こすだろう。侵入性癌に冒された患
者は、通常、深刻な血小板減少をもたらす激しい化学療
法管理下に置かれ、血小板減少症と線維素溶解性凝固欠
損症の協同作用は、ほとんどの患者に重度の出血問題を
疑いなく生み出す。出血合併症の可能性が低いこと、お
よびその選択性ゆえに、本発明のジグリコシル化ｔ−Ｐ
Ａ誘導体を、激しい癌化学療法の結果として血小板減少
症にかかっている患者に対して安全に与えることができ
ると思われる。

【００４２】内皮細胞由来のｔ−ＰＡの合成および／ま
たは分泌の欠損ゆえに、かなりの数の患者に静脈性の血
栓塞栓症が発生していると考えられてきた。過去におい
てこのような患者は、アナボリックステロイド類と、固
有のｔ−ＰＡ合成の増大をもたらすフェンホルミンを組
み合わせて、効果的に治療されていた。この長期にわた
る管理は、再発性の深静脈血栓症および肺動脈塞栓症の
どちらか、もしくは両者の発生を急速に減少させること
がわかった。しかしこの治療的管理は許容できない重大
な副作用の危険性が高いので、放棄された。ボーラス静
脈内注射によって、あるいは軽量の携帯用ポンプ系を用
いて連続的に注入することによって投与される本発明の
ジグリコシル化ｔ−ＰＡ誘導体は、適切に選択された患
者における再発性血栓塞栓症を予防するのに本質的な有
効性を有し得る。

【００４３】医薬的に有用な組成物を調製するための既
知の方法に従って、ジグリコシル化ｔ−ＰＡ誘導体を医
薬的に許容され得る担体賦形剤と混合することによっ
て、本発明のジグリコシル化ｔ−ＰＡ誘導体を調剤する
ことができる。適切な担体賦形剤およびその製剤は、他
のヒトのタンパク質（例えばヒト血清アルブミン）を含
めて、例えば Remington's Pharmaceutical Sciences
第１６版、１９８０、マックパブリッシングカンパニー、O
slo等共編（これは本明細書の一部を構成する）に記述
されている。このような組成物は、有効量の本発明のジ
グリコシル化ｔ−ＰＡ誘導体を、患者への効果的な投与
に適した医薬組成物を調製するのに適した量の担体賦形
剤と共に含有するだろう。このような組成物は、非経口
的に投与することもできるし、また確実に有効な形態で
血流へ送達される他の手段によっても投与できる。本発
明のジグリコシル化ｔ−ＰＡ誘導体の好ましい投与法
は、静脈内へのボーラス投与である。好ましい投与量
は、約０.０１ｍｇ／ｋｇないし１０ｍｇ／ｋｇの範囲
である。より好ましい投与量は、約０.１ｍｇ／ｋｇな
いし１ｍｇ／ｋｇの範囲である。最も好ましい投与量
は、約０.４ｍｇ／ｋｇである。

【００４４】以下の実施例は、本発明のさらなる理解を
助けることを意図するものである。使用される特定の素
材、種、および条件は本発明をさらに例証することを意
図するものであって、本発明の合理的な範囲を限定する
ものではない。実施例において言及される酵素は、特に
示さない限り、ベセスダリサーチラボラトリーズ（ＢＲ
Ｌ)（ガイサースブルグ、ＭＤ ２０８７７）、ニューイ
ングランドバイオラブスインコーポレーテッド（ＮＥ
Ｂ)（ビバリー、ＭＡ ０１９１５）、もしくはベーリン
ガーマンハイムバイオケミカルズ（ＢＭＢ)（７９４１
カッスルウェイドライブ、インディアナポリス、ＩＮ.
４６２５０）から入手可能であり、製造者の推薦すると
ころに実質的に従って使用する。本明細書で用いられる
技術の多くは当業者一般によく知られている。分子生物
学的技術は、Maniatis等、MolecularCloning：A Laborat
ory Manual コールドスプリングハーバー Ｎ.Ｙ.（第２
版、１９８９年）およびCurrent Protocols in Molecul
ar Biology（Ausubel等共編、１９８７年）などの実験
書に詳しく記述されている。以下の種々の操作法を別の
操作法に置換できることは、当業者には理解されるであ
ろう。

【００４５】実施例１：ｐＬＰ５３−ＴＬＢの構築 Ａ．ＢａｍＨＩ−ＢｇｌII消化したｐＬＰ５３の調製 プラスミドｐＬＰ５３は従来のように実施例１Ｆの方法
に従って、大腸菌Ｋ１２ ＡＧ１／ｐＬＰ５３から単離
できる。大腸菌Ｋ１２ ＡＧ１／ｐＬＰ５３は１９９０
年９月２１日にノーザンリジョナルリサーチセンター
（ＮＲＲＬ）、アグリカルチャラルリサーチサービス、
アメリカ合衆国農業省（ペオリア、イリノイ６２６０
４）に寄託され、受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１８７１４の
下で該機関の永久保存培養コレクションの一部を成して
いる。ｐＬＰ５３の制限部位と機能地図を図１に示す。

【００４６】ｐＬＰ５３ ＤＮＡ ５μｌ（５μｇ）を、
ＢａｍＨＩ ２μｌ（２０単位）およびＢｇｌII ２μｌ
（２０単位）を用いて、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８.０）（Ｔｒｉｓ：トリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、および５０
ｍＭ ＮａＣｌを含む反応液容量５０μｌ中で完全に消
化した。この試料を当容量のフェノール／クロロホルム
（５０：５０）混合液で２回抽出し、その水層を回収し
た。水層に０.１容量の３Ｍ 酢酸ナトリウムと２.５容
量の無水エタノールを添加することによって、この水層
からＤＮＡを回収した。消化されたＤＮＡを遠心分離で
集め、その上清を除去して、ＤＮＡを乾燥し、水中に再
懸濁させた。

【００４７】Ｂ．ＴＬＢリンカーの調製 以下に示す一本鎖ＤＮＡ断片を、当該技術分野において
よく知られている方法によって従来のように自動ＤＮＡ
合成機（モデル３８０Ａ アプライドバイオシステムズ
８５０ リンカーンセンタードライブ、フォスターシテ
ィー ＣＡ ９４４０４）上で、β−シアノエチルホスホ
アミダイト化学を用いて合成した。ＢＧＴ３（配列識別
番号：９）

【化１】 ＢＧＴ４（配列識別番号：１０）

【化２】

【００４８】ＢＧＴ３およびＢＧＴ４は相補ＤＮＡ分子
である。この合成ＤＮＡ断片をＴＥ緩衝液（ＴＥ：１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.４)＋１ｍＭ エチレン
ジアミンテトラ酢酸(ＥＤＴＡ)）５０μｌに溶解して、
０℃で保存した。

【００４９】このＤＮＡ鎖を以下に述べるようにアニー
ルした。ＢＧＴ３およびＢＧＴ４それぞれ５０ｐｍｏｌ
ｅを混合し、９５℃で１５分間加熱した。この混合物を
ゆっくり室温に戻して２つの相補鎖をアニールさせ、Ｔ
ＬＢとして知られている二本鎖ＤＮＡリンカーを形成さ
せた。

【００５０】Ｃ．ｐＬＰ５３−ＴＬＢの最終的構築 実施例１Ａで調製したＤＮＡをＴＬＢに連結した（配列
識別番号：７）。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ １μｌ（１０単
位）、６６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.６）、６.
６ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ ジチオスレイトール（Ｄ
ＴＴ）、および６６ｍＭ アデノシン５'−トリホスフェ
ート（ＡＴＰ）を総容量１０μｌ中に含む反応液中で、
実施例１Ａで得たＤＮＡ １μｌおよびＴＬＢ １μｌを
連結させた。この混合物を４℃で１６時間インキュベー
トした。この連結混合物を使って、大腸菌Ｋ１２ ＡＧ
１を以下に記述するように形質転換した。

【００５１】Ｄ．形質転換操作 凍結した感応性（competent）の大腸菌Ｋ１２ ＡＧ１細
胞を、ストラタジーン（３７７９ タンゼイロード、サ
ンディエゴ、カルフォルニア ９２１２１）から入手す
る。連結反応液約５μｇを感応性細胞１００μｌと混合
した後、この細胞−ＤＮＡ混合物を氷上で１時間インキ
ュベートし、４２℃で４５秒間熱衝撃を加え、次いで氷
上で約２分間冷した。この細胞−ＤＮＡ混合物をファル
コン２０５９チューブ（カーチンマセソン、シガゴ、Ｉ
Ｌ.）中のＳＯＣ培地（２％ トリプトン、０.０５％ 酵
母エキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２.５ｍＭ ＫＣｌ、１
０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ ＭｇＳＯ₄、２０ｍＭ グ
ルコース、および蒸留水）１ｍｌ中に希釈し、３７℃で
１時間インキュベートする。このうち約１００μｌを、
１００μｇ／ｍｌ アンピシリンを含むＬＢ寒天プレー
ト（１％ トリプトン、０.５％ 酵母エキス、１％ Ｎａ
Ｃｌ、および１.５％ 寒天、ｐＨ７.０）に接種し、３
７℃でコロニーが現れるまでインキュベートする。

【００５２】あるいは、以下の方法で細胞を形質転換感
応性にすることもできる。大腸菌Ｋ１２ ＡＧ１細胞の
５０ｍｌ培養を、Ｌブロス（水１ｌあたり１０ｇ トリ
プトン、１０ｇ ＮａＣｌ、５ｇ 酵母エキス、ｐＨ７.
５に調整）中でＯ.Ｄ.₅₉₀が０.５吸光度単位になるまで
生育する。この培養を氷上で１０分間冷却した後、細胞
を遠心分離によって集める。冷５０ｍＭ ＣａＣｌ₂：１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）２５ｍｌ中に細
胞ペレットを再懸濁させ、氷上で１５分間インキュベー
トする。細胞を遠心分離によって集め、細胞ペレットを
冷５０ｍＭ ＣａＣｌ₂：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８.０）２.５ｍｌ中に再懸濁させて、その試料を
１６時間４℃に保つ。これらの感応性細胞の形質転換は
上述のように行う。

【００５３】Ｅ．ＤＮＡ単離 形質転換に続いて、アンピシリン耐性細胞を選択し、こ
れを１００μｌ／ｍｌアンピシリンを含むＴＹブロス
（１％ トリプトン、０.５％ 酵母エキス、１％ＮａＣ
ｌ、ｐＨ７.４）２ｍｌに植菌した。これらの培養を３
７℃で１６時間通気培養した。この培養からプラスミド
ＤＮＡを以下のように単離した。特に示さない限り、す
べての操作を室温で行った。各培養の１.５ｍｌを微量
遠心チューブに移した。１分間の遠心分離によって細胞
を集めた。上清を微小チップ吸引器で除去し、５０ｍＭ
グルコース、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、および２５ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）を含む溶液１００μｌ中
に細胞ペレットを懸濁させた。室温で５分間インキュベ
ートした後、アルカリドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）溶液（０.２Ｎ ＮａＯＨ、１％ ＳＤＳ）２００μ
ｌを加えた。チューブを穏やかに反転させて混合し、次
いで氷上で５分間維持した。次に、酢酸カリウム溶液
（氷酢酸 １１.５ｍｌおよび水 ２８.５ｍｌを５Ｍ 酢
酸カリウム ６０ｍｌに加えて、カリウムイオンに関し
て３Ｍ、酢酸イオンに関して５Ｍの溶液を得ることによ
って調製した）１５０μｌを加え、緩やかにボルテック
ス（渦動）することによってチューブの内容物を混合し
た。この試料を氷上に５分間保った後、１０分間遠心分
離した。上清を新しい遠心分離チューブに移し、等容量
のフェノール（０.１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.
０）で飽和しているもの）／クロロホルム混合液を加え
た。この試料を混合した後、５分間遠心分離した。上清
を集めた。この上清に氷冷無水エタノール１ｍｌを加え
た。これを混合して室温に５分間保った後、５分間の遠
心分離によってＤＮＡを集めた。上清を吸引によって除
去し、ＤＮＡペレットに７０％ エタノール ５００μｌ
を加えた。この試料を緩やかにボルテックスしてペレッ
トを洗浄し、２分間遠心分離した。上清を除去し、ＤＮ
Ａペレットを真空下で乾燥した。このＤＮＡをＴＥ緩衝
液５０μｌ中に溶解し、４℃で保存した。ｐＬＰ５３−
ＴＬＢの制限地図および機能地図を図２に示す。

【００５４】Ｆ．プラスミドＤＮＡの大量単離 プラスミドＤＮＡの大量単離は以下の操作によって実行
することができる。大腸菌Ｋ１２ ＡＧ１／ｐＬＰ５３
−ＴＬＢの終夜培養液の少量を、１００μｇ／ｍｌ ア
ンピシリンを含むＬ寒天プレート上に、分離した単一コ
ロニーが得られるように広げる。得られた単一コロニー
を、１００μｇ／ｍｌ アンピシリンを含むＬブロス １
０ｍｌに植菌し、激しく振盪しながら３７℃で終夜イン
キュベートする。この終夜培養液１０ｍｌを、１００μ
ｇ／ｍｌ アンピシリンを含むＬブロス ５００ｍｌに植
菌し、激しく振盪しながら、培養が定常期に達するまで
３７℃でインキュベートする。

【００５５】以下の操作法は、Maniatis等、1982、Molecu
lar Cloning（コールドスプリングハーバーラボラトリ
ー）から翻案する。

【００５６】４℃、４０００ｘｇ、１０分間の遠心分離
によって細胞を回収し、上清を捨てる。細胞ペレットを
氷冷ＳＴＥ緩衝液（０.１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.８）、および１ｍＭ ＥＤＴＡ）
１００ｍｌで洗浄する。洗浄後、細胞ペレットを、５μ
ｇ／ｍｌ リゾチームを含む溶液１（５０ｍＭ グルコー
ス、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、および
１０ｍＭ ＥＤＴＡ）１０ｍｌ中に再懸濁させ、室温で
１０分間放置する。次いで溶液２（０.２Ｎ ＮａＯＨお
よび１％ ＳＤＳ）２０ｍｌをリゾチーム処理した細胞
に加え、この溶液を反転させることによって穏やかに混
合する。この混合物を氷上で１０分間インキュベートす
る。

【００５７】氷冷５Ｍ 酢酸カリウム（ｐＨ４.８）１５
ｍｌを細胞溶解混合物に加え、この溶液を反転させるこ
とによって混合する。これを氷上で１０分間インキュベ
ートする。５Ｍ 酢酸カリウムは、氷酢酸１１.５ｍｌを
水２８.５ｍｌおよび５Ｍ 酢酸カリウム６０ｍｌに加え
ることによって調製する；得られた溶液はカリウムイオ
ンに関して３Ｍ、酢酸イオンに関して５Ｍである。

【００５８】溶解した細胞混合物をベックマンＳＷ２７
遠心分離機（あるいはその等価物）中で、４℃、２００
００ｒｐｍ、２０分間遠心分離する。細胞ＤＮＡと細胞
残渣はチューブの底にペレットを形成した。約３６ｍｌ
の上清を回収し、０.６容量のイソプロパノールを加え
て混合し、得られた溶液を室温で１５分間放置する。プ
ラスミドＤＮＡを、室温で１２０００ｇ、３０分間の遠
心分離によって集める。上清を捨て、室温でＤＮＡペレ
ットを７０％エタノールで洗浄する。エタノール洗浄液
をデカンテーションによって除去し、ペレットを真空デ
シケーター中で乾燥する。次いでペレットをＴＥ緩衝液
８ｍｌ中に再懸濁させる。

【００５９】塩化セシウム（ＣｓＣｌ）８ｇをこのＤＮ
Ａ溶液に加える。ＣｓＣｌ−ＤＮＡ溶液１０ｍｌあたり
約０.８ｍｌの１０μｇ／ｍｌ エチジウムブロミド水溶
液を加える。この溶液の最終密度は約１.５５ｇ／ｍｌ
であり、エチジウムブロミド濃度は約６００μｇ／ｍｌ
である。この溶液をベックマンタイプ５０遠心管に移
し、その上部をパラフィン油で満たし、封印し、２０
℃、４５０００ｒｐｍで２４時間遠心分離する。遠心分
離後、通常の光下で２本のＤＮＡバンドが見える。チュ
ーブの蓋を除去した後、＃２１皮下注射針の付いた注射
器を遠心管の側部に挿入して下側のＤＮＡバンドを取り
出す。

【００６０】水飽和１−ブタノールで数回抽出すること
によってエチジウムブロミドを除去する。ＴＥ緩衝液に
対して透析することによってＣｓＣｌを除去する。緩衝
化フェノールで抽出し、次いでクロロホルムで抽出した
後、ＤＮＡを沈殿させ、７０％ エタノールで洗浄し、
乾燥する。

【００６１】実施例２：ｐｍｔ６−ｈｄの構築 Ａ．中間体プラスミドｐＴＰＡ１０３の構築 プラスミドｐＴＰＡ１０２はヒト組織プラスミノーゲン
活性化因子のコード配列を含有している。プラスミドｐ
ＴＰＡ１０２は大腸菌Ｋ１２ ＭＭ２９４／ｐＴＰＡ１
０２から単離することができる。この菌株はノーザンリ
ジョナルリサーチラボラトリーから受託番号ＮＲＲＬ
Ｂ−１５８３４の下で入手できる。プラスミドｐＴＰＡ
１０２の制限部位および機能地図を添付の図面の図３に
示す。プラスミドｐＴＰＡ１０２ ＤＮＡを、実施例１
Ｆの方法に実質的に従って、大腸菌Ｋ１２ ＭＭ２９４
／ｐＴＰＡ１０２から単離する。

【００６２】ＴＥ緩衝液約５０μｌ中のプラスミドｐＴ
ＰＡ１０２ ５０μｇを、１０Ｘ Ｔｔｈ１１１Ｉ緩衝液
（０.５Ｍ ＮａＣｌ、８０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７.４）、８０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、８０ｍＭ ２メルカプ
トエタノール、および１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（ウシ血清
アルブミン））１０μｌ、および水８０μｌに加えた。
制限酵素Ｔｔｈ１１１Ｉ １０μｌ（〜５０単位）をこ
のＤＮＡ溶液に加え、得られた反応液を６５℃で２時間
インキュベートした。このインキュベーションが終わっ
た後に、この試料にローディング（充填）緩衝液を加え
た。ローディング緩衝液の最終濃度は２.５％（ｖ／
ｖ） グリセロール、０.００５％（ｗ／ｖ） ブロモフ
ェノールブルー、および０.０５％（ｖ／ｖ） キシレン
シアノールである。この試料をアガロースゲルによるゲ
ル電気泳動によって分別した。電気泳動後、ゲルをエチ
ジウムブロミド希釈液で染色した。消化したＤＮＡを３
００ｎｍの紫外線で可視化して、ｔ−ＰＡコード配列を
含む〜４.４ｋｂのＴｔｈ１１１Ｉ制限断片をゲルから
単離した。調製用ゲル電気泳動の方法は当該技術分野に
おいてよく知られている。これらの方法のいくつかは、
Maniatis等、MolecularCloning:A Laboratory Manual コ
ールドスプリングハーバー Ｎ.Ｙ.(第２版、１９８９
年）に記述されており、上記の操作を実施する際の手引
として有用である。目的の〜４.４ｋｂＴｔｈ１１１Ｉ
制限断片約１０μｇが得られ、これをＴＥ緩衝液１０μ
ｌ中に懸濁させた。

【００６３】１０Ｘ クレノー緩衝液（５００ｍＭ リン
酸カリウム（ｐＨ７.５）、３０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、およ
び１０ｍＭ ２メルカプトエタノール）約５μｌおよび
水３０μｌを、〜４.４ｋｂＴｔｈ１１１Ｉ制限断片を
含有する溶液に加え、さらにクレノー酵素約５μｌ（〜
５単位）を加えた後、この反応混合物を１６℃で３０分
間インキュベートした。このクレノー反応の後、ＤＮＡ
をエタノールで沈殿させ、１０Ｘ リガーゼ緩衝液（６
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.６）、６６ｍＭ
ＭｇＣｌ₂、１００ｍＭ ＤＴＴ、および１０ｍＭ ＡＴ
Ｐ）３μｌおよび水１４μｌ中に再懸濁させた。

【００６４】次の配列：

【化３】 を有するＢａｍＨＩリンカー（Ｎ.Ｅ.Ｂ.から入手可
能）をキノーゼ処理し、以下の方法で連結させるために
調製した。ＢａｍＨＩリンカー４μｌ（〜２μｇ）を、
水２０.１５μｌおよび１０Ｘ キナーゼ緩衝液（５００
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.６）および１００ｍＭ
ＭｇＣｌ₂）５μｌに溶解して、９０℃で２分間インキ
ュベートし、次いで室温に冷却した。γ−³²Ｐ−ＡＴＰ
５μｌ（〜２０μＣｉ）、１Ｍ ＤＴＴ ２.５μｌ、お
よびポリヌクレオチドキナーゼ５μｌ（〜１０単位）を
この混合物に加えた後、３７℃で３０分間インキュベー
トした。次いで０.０１Ｍ ＡＴＰ ３.３５μｌおよびキ
ナーゼ ５μｌを加え、さらに３７℃で３０分間反応を
続けた。放射性ＡＴＰは、目標ＤＮＡにリンカーが連結
されたかどうかを決定する際に役立つ。

【００６５】キナーゼ処理したＢａｍＨＩリンカー 約
１０μｌを〜４.４ｋｂＴｔｈ１１１Ｉ制限断片の溶液
に加え、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ ２μｌ（〜１０００単
位）およびＴ４ ＲＮＡリガーゼ １μｌ（〜２単位）を
加えた後に、この連結反応液を終夜４℃でインキュベー
トした。連結したＤＮＡをエタノールで沈殿させ、１０
ＸＨｉｎｄIII緩衝液（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８.０）、１００ｍＭＭｇＣｌ₂、および５００ｍ
Ｍ ＮａＣｌ）５μｌおよび水４０μｌ中に再懸濁させ
た。制限酵素ＨｉｎｄIII 約５μｌ（〜５０単位）をこ
のＤＮＡ溶液に加え、得られた反応液を３７℃で２時間
インキュベートした。

【００６６】このＨｉｎｄIII消化したＤＮＡを抽出し
た後、エタノールで沈殿させ、実施例１Ａに記述したよ
うにして集め、１０Ｘ ＢａｍＨＩ緩衝液（５００ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、１００ｍＭ ＭｇＣｌ
₂、１Ｍ ＮａＣｌ）１０μｌおよび水９０μｌ中に再懸
濁させた。制限酵素ＢａｍＨＩ 約１０μｌ（〜１００
単位）をこのＤＮＡ溶液に加え、得られた反応液を３７
℃で２時間インキュベートした。ＢａｍＨＩ消化の後、
反応混合物をアガロースゲル上にのせ、上述のようにし
てゲルから〜２.０ｋｂのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII制限
断片を単離した。目的の断片約４μｇが得られ、これを
ＴＥ緩衝液約５μｌ中に懸濁させた。

【００６７】プラスミドｐＴＰＡ１０３を構築するため
に、プラスミドｐＴＰＡ１０２由来の〜２.０ｋｂＢａ
ｍＨＩ−ＨｉｎｄIII制限断片を、ＢａｍＨＩ−Ｈｉｎ
ｄIII消化したプラスミドｐＲＣ中に挿入した。大腸菌
ｔｒｐオペロンのプロモーターおよびオペレーター（ｔ
ｒｐＰＯ）配列を含有する〜２８８ｂｐのＥｃｏＲＩ−
ＣｌａＩ制限断片を、ＥｃｏＲＩ−ＣｌａＩ消化したプ
ラスミドｐＫＣ７中に挿入することによって、プラスミ
ドｐＲＣを構築した。プラスミドｐＫＣ７はアメリカン
タイプカルチャーコレクションから受託番号ＡＴＣＣ
３７０８４の下で、大腸菌Ｋ１２ Ｎ１００／ｐＫＣ７
中に入った形態で入手できる。ｔｒｐＰＯを含有する〜
２８８ｂｐＥｃｏＲＩ−ＣｌａＩ制限断片は、プラスミ
ドｐＴＰＡ１０２から単離できる。プラスミドｐＫＣ７
およびプラスミドｐＴＰＡ１０２ＤＮＡは前記の株化細
胞から、本質的に実施例１Ｆの方法に従って得ることが
できる。プラスミドｐＴＰＡ１０２の〜０．２９ｋｂＥ
ｃｏＲＩ−ＣｌａＩ制限断片は、大腸菌ｔｒｐ遺伝子の
転写活性化配列、並びに翻訳活性化配列の大部分を含有
しており、次に示す配列（配列識別番号：１１）を有し
ている。

【化４】 ＤＮＡの相補性ゆえに、この二本鎖ＤＮＡ化合物の反対
鎖を推定することができる。

【００６８】プラスミドｐＲＣを構築するために、ＴＥ
緩衝液１０μｌ中のプラスミドｐＫＣ７ 約２μｇを１
０Ｘ ＣｌａＩ緩衝液（０.５Ｍ ＮａＣｌ、６０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.９）、６０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、
および１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）２μｌおよび水６μｌに
加えた。制限酵素ＣｌａＩ 約２μｌ（〜１０単位）を
このプラスミドｐＫＣ７ ＤＮＡ溶液に加え、得られた
反応液を３７℃で２時間インキュベートした。ＣｌａＩ
消化したプラスミドｐＫＣ７ ＤＮＡを精製し、エタノ
ール沈殿によって回収した。このＤＮＡを１０Ｘ Ｅｃ
ｏＲＩ緩衝液（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.
０）、１００ｍＭ ＭｇＣｌ₂、および１ＭＮａＣｌ）２
μｌおよび水１６μｌ中に再懸濁させた。制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩ 約２μｌ（〜１０単位）を、このＣｌａＩ消化
したプラスミドｐＫＣ７ ＤＮＡ溶液に加え、得られた
反応液を３７℃で２時間インキュベートした。ＥｃｏＲ
Ｉ−ＣｌａＩ消化したプラスミドｐＫＣ７ ＤＮＡを抽
出し、エタノールで沈殿させ、１０Ｘ リガーゼ緩衝液
３μｌおよび水２０μｌ中に再懸濁させた。プラスミド
ｐＫＣ７の制限部位および機能地図は、Maniatis等、Mol
ecular Cloning（コールドスプリングハーバーラボラト
リー、１９８２年）、８頁に記載されている。

【００６９】ＴＥ緩衝液約２０μｌ中のプラスミドｐＴ
ＰＡ１０２ 約２０μｇを、１０Ｘ ＣｌａＩ緩衝液１０
μｌおよび水６０μｌに加えた。制限酵素ＣｌａＩ 約
１０μｌ（〜５０単位）をこのプラスミドｐＴＰＡ１０
２ ＤＮＡ溶液に加え、得られた反応液を３７℃で２時
間インキュベートした。ＣｌａＩ消化したプラスミドｐ
ＴＰＡ１０２ ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、１０Ｘ
ＥｃｏＲＩ緩衝液１０μｌおよび水８０μｌ中に再懸濁
させた。制限酵素ＥｃｏＲＩ 約１０μｌ（〜５０単
位）を、このＣｌａＩ消化したプラスミドｐＴＰＡ１０
２ ＤＮＡ溶液に加え、得られた反応液を３７℃で２時
間インキュベートした。

【００７０】ＥｃｏＲＩ−ＣｌａＩ消化したプラスミド
ｐＴＰＡ１０２ ＤＮＡをフェノールで１回抽出し、７
％ポリアクリルアミドゲル上にのせ、ｔｒｐＰＯを含有
する〜２８８ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＣｌａＩ制限断片が他
の消化産物から分離するまで電気泳動した。〜２８８ｂ
ｐのＥｃｏＲＩ−ＣｌａＩ制限断片をゲルから単離した
（調製用アクリルアミドゲル電気泳動の方法は、Maniat
is等（上述）によって記述されている）。目的の断片約
１μｇが得られた。これをＴＥ緩衝液５μｌ中に懸濁さ
せて、上述のように調製したＥｃｏＲＩ−ＣｌａＩ消化
したプラスミドｐＫＣ７ ＤＮＡの溶液に加えた。次い
でこのＤＮＡ混合物にＴ４ ＤＮＡリガーゼ 約２μｌ
（〜１０００単位）を加え、得られた連結反応液を１６
℃で２時間インキュベートした。連結したＤＮＡは目的
のプラスミドｐＲＣ ＤＮＡを構成していた。

【００７１】連結したこのＤＮＡを用いて、実質的に実
施例１Ｄの方法に従って、大腸菌Ｋ１２ ＨＢ１０１感
応性細胞（ＢＲＬから入手可能）を形質転換した。１０
０μｇ／ｍｌ アンピシリンを含むＬ寒天上にこの形質
転換細胞を接種し、目的の大腸菌Ｋ１２ ＨＢ１０１／
ｐＲＣコロニーを同定するために、アンピシリン耐性形
質転換体を、そのプラスミドＤＮＡの制限酵素分析によ
ってスクリーニングした。実質的に実施例１Ｆの方法に
従って、大腸菌Ｋ１２ ＨＢ１０１／ｐＲＣ形質転換体
からプラスミドｐＲＣ ＤＮＡを得た。

【００７２】ＴＥ緩衝液２μｌ中のプラスミドｐＲＣ
ＤＮＡ 約２μｇを１０Ｘ ＨｉｎｄIII緩衝液２μｌお
よび水１６μｌに加えた。制限酵素ＨｉｎｄIII 約２μ
ｌ（〜１０単位）をこのプラスミドｐＲＣ ＤＮＡ溶液
に加え、得られた反応液を３７℃で２時間インキュベー
トした。ＨｉｎｄIII消化したプラスミドｐＲＣ ＤＮＡ
をエタノールで沈殿させ、１０Ｘ ＢａｍＨＩ緩衝液２
μｌおよび水１６μｌ中に再懸濁させた。制限酵素Ｂａ
ｍＨＩ 約２μｌ（〜１０単位）を、このＨｉｎｄIII消
化したプラスミドｐＲＣ ＤＮＡ溶液に加え、得られた
反応液を３７℃で２時間インキュベートした。

【００７３】ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII消化したプラス
ミドｐＲＣ ＤＮＡをフェノールで１回抽出し、次いで
クロロホルムで２回抽出した。ＤＮＡをエタノールで沈
殿させ、１０Ｘ リガーゼ緩衝液３μｌおよび水２０μ
ｌ中に再懸濁させた。次いでプラスミドｐＴＰＡ１０２
の〜２.０ｋｂＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ制限断片〜４μ
ｇ（ＴＥ緩衝液〜５μｌ中）を、ＢａｍＨＩ−Ｈｉｎｄ
III消化したプラスミドｐＲＣ ＤＮＡの溶液に加えた。
Ｔ４ リガーゼ 約２μｌ（〜１０００単位）をこのＤＮ
Ａ混合物に加え、得られた反応液を１６℃で２時間イン
キュベートした。連結したＤＮＡは目的のプラスミドｐ
ＴＰＡ１０３ ＤＮＡを構成していた。

【００７４】目的外の形質転換体を減少させるために、
連結したＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩで消化した。この制
限酵素はプラスミドｐＲＣを切断するが、プラスミドｐ
ＴＰＡ１０３を切断しない。したがって連結したＤＮＡ
をＮｃｏＩで消化することによって目的外の形質転換体
が減少する。なぜなら、直鎖型ＤＮＡは閉環した環状Ｄ
ＮＡよりも低い頻度で大腸菌を形質転換するからであ
る。連結したＤＮＡを消化するために、このＤＮＡをま
ずエタノールで沈殿させ、次いで１０Ｘ ＮｃｏＩ緩衝
液（１.５Ｍ ＮａＣｌ、６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７.８）、６０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、および１ｍｇ／
ｍｌ ＢＳＡ）２μｌおよび水１６μｌ中に再懸濁させ
た。制限酵素ＮｃｏＩ約２μｌ（〜１０単位）をこのＤ
ＮＡ溶液に加え、得られた反応液を３７℃で２時間イン
キュベートした。

【００７５】連結し、次いでＮｃｏＩ消化したこのＤＮ
Ａを用いて大腸菌Ｋ１２ ＲＶ３０８（ＮＲＲＬ Ｂ−１
５６２４）を形質転換した。実質的に実施例１Ｄの方法
に従って大腸菌Ｋ１２ ＲＶ３０８細胞を感応性にし、
形質転換した。この形質転換混合物を、１００μｇ／ｍ
ｌ アンピシリンを含むＬ寒天上に接種した。プラスミ
ドｐＲＣはカナマイシン耐性を付与するが、プラスミド
ｐＴＰＡ１０３はしないので、アンピシリン耐性形質転
換体のカナマイシンン感受性を試験した。次いで、アン
ピシリン耐性、カナマイシンン感受性の形質転換体を使
用してプラスミドＤＮＡを調製し、大腸菌Ｋ１２ ＲＶ
３０８／ｐＴＰＡ１０３形質転換体を同定するために、
そのプラスミドＤＮＡを制限酵素分析によって調べた。
プラスミドｐＴＰＡ１０３の制限部位および機能地図
を、添付の図面の図４に示す。実施例１Ｆの方法に実質
的に従って、プラスミドｐＴＰＡ１０３ ＤＮＡを大腸
菌Ｋ１２ ＲＶ３０８／ｐＴＰＡ１０３から単離した。

【００７６】Ｂ．中間体プラスミドｐＴＰＡ６０２の構
築 ガラス蒸留水（glass-distilled H₂O）４５μｌ中のプ
ラスミドｐＴＰＡ１０３ 約５０μｇを、１０Ｘ Ｅｃｏ
ＲＩ緩衝液３０μｌおよび水２２５μｌに加えた。制限
酵素ＥｃｏＲＩ約１０μｌ（〜８０単位）をこのプラス
ミドｐＴＰＡ１０３ ＤＮＡ溶液に加え、この混合物を
３７℃で９０分間インキュベートした。ＥｃｏＲＩ消化
したこのプラスミドｐＴＰＡ１０３ ＤＮＡをエタノー
ルで沈殿させて、これを１Ｘ ローディング緩衝液（１
０％ グリセロールおよび０.０２％ ブロモフェノール
ブルー）５０μｌ中に再懸濁させ、アガロースゲル上に
のせて、〜１.１ｋｂのＥｃｏＲＩ制限断片が他の反応
産物から分離するまで電気泳した。ｔ−ＰＡアミノ末端
コードＤＮＡを含有するこの〜１.１ｋｂＥｃｏＲＩ制
限断片をゲルから単離し、水１６０μｌ中に再懸濁させ
た。

【００７７】１０Ｘ ＨｇａＩ緩衝液（０.５Ｍ ＮａＣ
ｌ、６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.４）、および
０.１Ｍ ＭｇＣｌ₂）約４０μｌ、ガラス蒸留水２００
μｌ、および制限酵素ＨｇａＩ ２０μｌ（約１０単
位）を、〜１.１ｋｂＥｃｏＲＩ制限断片の溶液に加
え、得られた反応液を３７℃で４時間インキュベートし
た。ＨｇａＩ消化したこのＤＮＡをエタノールで沈殿さ
せた後、５％ アクリルアミドゲル上で電気泳動し、Ｔ
ＰＡのアミノ末端をコードする〜５２０ｂｐの制限断片
をゲルから単離した。〜５２０ｂｐＨｇａＩ断片約５μ
ｇが得られ、これを水５０μｌ中に懸濁させた。

【００７８】１０Ｘ クレノー緩衝液（０.５Ｍ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.４）および０.１Ｍ ＭｇＣｌ₂）約
１２.５μｌ、４種のデオキシヌクレオチド三リン酸各
６.２５ｍＭを含む溶液 ２μｌ、０.２Ｍ ＤＴＴ ２μ
ｌ、７μｇ／ｍｌ ＢＳＡ １μｌ、ガラス蒸留水５７.
５μｌ、およびクレノー酵素２μｌ（〜１０単位）を、
〜５２０ｂｐＨｇａＩ制限断片溶液に加え、得られた反
応液を２０℃で３０分間インキュベートした。クレノー
処理したこのＤＮＡを７０℃で１５分間インキュベート
し、エタノールで沈殿させた。

【００７９】ＢａｍＨＩリンカー約５００ｐｍｏｌｅ
を、総反応液容量２５μｌ中でポリヌクレオチドキナー
ゼを用いてリン酸化した。この反応は実質的に実施例２
Ａに記述した方法に従って行った。クレノー処理した〜
５２０ｂｐＨｇａＩ制限断片の溶液に、このキナーゼ処
理したＢａｍＨＩリンカーを、１０Ｘ リガーゼ緩衝液
１５μｌ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ ７μｌ（〜７ヴァイス
（Weiss）単位）と共に加え、さらにガラス蒸留水を加
えて反応液容量を１５０μｌにした。得られた反応液を
１６℃で終夜インキュベートした。

【００８０】この連結反応を熱で不活化し、ＤＮＡをエ
タノールで沈殿させ、これを１０ＸＢａｍＨＩ緩衝液５
μｌおよび水４５μｌ中に再懸濁させた。制限酵素Ｂａ
ｍＨＩ約１μｌ（〜１６単位）をこのＤＮＡ溶液に加
え、得られた反応液を３７℃で９０分間インキュベート
した。次いで、この反応混合物にＢａｍＨＩ酵素１６単
位をさらに加え、これをさらに９０分間３７℃でインキ
ュベートした。次いでこの反応混合物を５％ ポリアク
リルアミドゲル上で電気泳動し、ＢａｍＨＩ末端を伴っ
ている〜５３０ｂｐＨｇａＩ制限断片をゲルから精製し
た。目的の断片約２μｇが得られ、これを水２０μｌ中
に懸濁させた。

【００８１】ＢａｍＨＩ消化した脱リン酸化プラスミド
ｐＢＲ３２２ ＤＮＡは、ニューイングランドバイオラ
ブスから入手できる。ＢａｍＨＩ末端を持つプラスミド
ｐＴＰＡ１０３の〜５３０ｂｐＨｇａＩ制限断片１μ
ｌ、水１４μｌ、１０Ｘ Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液 ２
μｌ、およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ １μｌ（〜１ヴァイ
ス単位）に、水２μｌ中のＢａｍＨＩ消化脱リン酸化プ
ラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡ 約０.１μｇを加え、得ら
れた反応液を１６℃で終夜インキュベートした。連結し
たＤＮＡは目的のプラスミドｐＴＰＡ６０２を構成して
おり、挿入されている〜５３０ｂｐの制限断片の配向が
異なる以外は、ｐＴＰＡ６０１と命名したプラスミドと
等価であった。プラスミドｐＴＰＡ６０２の制限部位お
よび機能地図を、添付の図面の図５に示す。

【００８２】この連結したＤＮＡを用いて、実質的に実
施例１Ｄの方法に従って、大腸菌Ｋ１２ ＭＭ２９４
（ＮＲＲＬ Ｂ−１５６２５）を形質転換した。アンピ
シリンを含むＬ寒天上にこの形質転換細胞を接種し、プ
ラスミドＤＮＡを制限酵素分析することによって、アン
ピシリン耐性の大腸菌Ｋ１２ ＭＭ２９４／ｐＴＰＡ６
０２および大腸菌Ｋ１２ ＭＭ２９４／ｐＴＰＡ６０１
を同定した。〜５３０ｂｐのＢａｍＨＩ制限断片の存在
によって、そのプラスミドがｐＴＰＡ６０２か、あるい
はｐＴＰＡ６０１であることが示された。

【００８３】Ｃ．中間体プラスミドｐＴＰＡ６０３の構
築 プラスミドｐＴＰＡ６０２ 約５μｇを、１０Ｘ Ｂｇｌ
II緩衝液（５００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.
０）、１００ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１Ｍ ＮａＣｌ）２０μ
ｌおよび水１８０μｌ中に溶解した。制限酵素ＢｇｌII
約３μｌ（〜２４単位）をこのプラスミドｐＴＰＡ６
０２ ＤＮＡ溶液に加え、得られた反応液を３７℃で９
０分間インキュベートした。次いで１０Ｘ ＢａｍＨＩ
緩衝液 〜１３μｌをこの反応混合物に加えることによ
って、この反応混合物の塩濃度をＳａｌＩ消化に適した
濃度にし、これに制限酵素ＳａｌＩ ２μｌ（〜２０単
位）を加えた。この反応液をさらに２時間３７℃でイン
キュベートした。次いでＤＮＡをエタノールで沈殿させ
て、１Ｘ ローディング緩衝液 ７５μｌ中に再懸濁さ
せ、アガロースゲル上にのせて、〜４.２ｋｂのＢｇｌI
I−ＳａｌＩ制限断片が他の消化産物から分離するまで
電気泳動した。〜４.２ｋｂＢｇｌII−ＳａｌＩ制限断
片を含むゲル部分をゲルから切り出して凍結し、凍結し
た切片をプラスチックで包んで圧搾することによって、
〜４.２ｋｂ断片を取り出した。このＤＮＡを沈殿さ
せ、水２０μｌ中に再懸濁させた。目的の断片約２００
ナノグラムが得られた。

【００８４】プラスミドｐＴＰＡ１０３ 約１２μｇ
を、１０Ｘ ＢｇｌII緩衝液１５μｌおよび水１３５μ
ｌに溶解した。制限酵素ＢｇｌII 約２μｌ（〜１６単
位）をこのプラスミドｐＴＰＡ１０３ ＤＮＡ溶液に加
え、得られた反応液を３７℃で９０分間インキュベート
した。このＢｇｌII消化したプラスミドｐＴＰＡ１０３
ＤＮＡの溶液に１０Ｘ ＢａｍＨＩ緩衝液 約１０μｌを
加えることによって、この反応混合物の塩濃度をＳａｌ
Ｉ消化に必要な塩濃度にした。次いで制限酵素ＳａｌＩ
約２μｌ（〜２０単位）を、このＢｇｌII消化したプラ
スミドｐＴＰＡ１０３ ＤＮＡ溶液に加え、この反応液
をさらに９０分間３７℃でインキュベートした。Ｂｇｌ
II−ＳａｌＩ消化したプラスミドｐＴＰＡ１０３ ＤＮ
Ａをエタノール沈殿によって濃縮した後、アガロースゲ
ル上に乗せて、アミノ末端以外の全ｔ−ＰＡをコードす
る〜２.０５ｋｂＢｇｌII−ＳａｌＩ制限断片をゲルか
ら単離し、エタノールで沈殿して、水２０μｌ中に再懸
濁させた。目的の断片約２μｇが得られた。

【００８５】プラスミドｐＴＰＡ６０２の〜４.２ｋｂ
ＢｇｌII−ＳａｌＩ制限断片 約５μｌ、およびプラス
ミドｐＴＰＡ１０３の〜２.０５ｋｂＢｇｌII−Ｓａｌ
Ｉ制限断片を、１０Ｘ リガーゼ緩衝液 ２μｌ、水１０
μｌ、およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ １μｌ（〜１ヴァイ
ス単位）に加え、得られた連結反応液を１６℃で終夜イ
ンキュベートした。連結したＤＮＡは目的のプラスミド
ｐＴＰＡ６０３を構成していた。プラスミドｐＴＰＡ６
０３の制限部位および機能地図を、添付の図面の図６に
示す。

【００８６】連結したこのＤＮＡを用いて、実質的に実
施例１Ｄの方法に従って、大腸菌Ｋ１２ ＭＭ２９４を
形質転換した。アンピシリンを含むＬ寒天上にこの形質
転換細胞を接種し、プラスミドＤＮＡを制限酵素分析す
ることによって、アンピシリン耐性大腸菌Ｋ１２ ＭＭ
２９４／ｐＴＰＡ６０３形質転換体を同定した。

【００８７】Ｄ．プラスミドｐｍｔ６−ｈｄの最終的構
築 ＴＰＡコード領域の部位特異的変異導入およびプラスミ
ドｐｍｔ６−ｈｄの構築を以下のように行う。蒸留水１
０μｌ中のプラスミドｐＴＰＡ１０３ 約５μｇを、１
０Ｘ ＨｉｎｄIII緩衝液 約１０μｌおよび蒸留水８０
μｌに加える。このプラスミドｐＴＰＡ１０３ ＤＮＡ
溶液に制限酵素ＨｉｎｄIII １μｌ（２０単位）を加
え、得られた反応液を３７℃で９０分間インキュベート
する。ＨｉｎｄIII消化したこのプラスミドｐＴＰＡ１
０３ ＤＮＡ溶液に制限酵素ＳｓｔＩ１μｌ（２０単
位）および１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.６）１０μ
ｌを加え、得られた反応液を３７℃で９０分間インキュ
ベートする。調製用ゲル電気泳動によって、１.４ｋｂ
のＨｉｎｄIII−ＳｓｔＩ制限断片を単離する。

【００８８】蒸留水３５μｌ中のＭ１３ｍｐ１８ ＤＮ
Ａの複製可能型（ＲＦ）（ＮＥＢから入手可能）約４.
５μｇを、１０Ｘ ＨｉｎｄIII緩衝液１０μｌおよび蒸
留水５５μｌに加える。このＭ１３ｍｐ１８ ＤＮＡ溶
液に制限酵素ＨｉｎｄIII １μｌ（約２０単位）を加
え、得られた反応液を３７℃で１時間インキュベートし
た。ＨｉｎｄIII消化したこのＭ１３ｍｐ１８ ＤＮＡ溶
液に制限酵素ＳｓｔＩ１μｌ（約２０単位）および１Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.６）１０μｌを加え、得ら
れた反応液を３７℃で１時間インキュベートする。調製
用ゲル電気泳動によってＭ１３ｍｐ１８のＨｉｎｄIII
−ＳｓｔＩ大制限断片を得て、これを蒸留水２０μｌ中
に懸濁させた。Ｍ１３ｍｐ１８のＨｉｎｄIII−Ｓｓｔ
Ｉ大制限断片 約２μｌ、１０Ｘ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
緩衝液 ２μｌ、蒸留水１２μｌ、およびＴ４ ＤＮＡリ
ガーゼ 〜１μｌ（約１ヴァイス単位）を、プラスミド
ｐＴＰＡ１０３の〜１.４ｋｂＨｉｎｄIII−ＳｓｔＩ制
限断片 ３μｌに加え、得られた連結反応液を１６℃で
終夜インキュベートする。

【００８９】BRL M13 Cloning/‘Dideoxy’Sequencing
Instruction Manualに記述されている方法に実質的に従
って、大腸菌ＪＭ１０３細胞を感応性にし、連結混合物
でトランスフェクションした。ただしトランスフェクシ
ョンあたりに使用するＤＮＡ量を変更した。（ＪＭ１０
３以外の宿主細胞もこの操作に使用できる。適切な宿主
細胞の例は、Maniatis等、１９８９、第１巻、４１４−４
１５頁を参照のこと。）この方法は、Maniatis等、１９
８９、１：４.３７にも記述されている。β−ガラクトシ
ダーゼ α−断片コード遺伝子の挿入失活によって組換
えプラークを同定する。この挿入失活は、Ｘ−Ｇａｌ
（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−
ガラクトピラノシド）を切断してそのインディゴ色の切
断産物を生産するという能力の欠失をもたらす。スクリ
ーニングのために、いくつかの白プラークをＬブロス
２.５ｍｌ中に接種し、これに、ｐｒｏＡＢを運ぶＦエ
ピソームの保持を確実にするために最少培地ストックで
培養した対数増殖期の大腸菌Ｋ１２ ＪＭ１０３ ０.４
ｍｌを加える。プラークを含有する細胞懸濁液２.５ｍ
ｌを、空気振盪機中で３７℃で８時間インキュベートす
る。このうち１.５ｍｌを用いて細胞をペレット状に
し、実施例１Ｅのアルカリミニスクリーン法に実質的に
従ってＲＦ ＤＮＡを単離する。各培養の残りを４℃で
保存する。ＭＰ１８ＢＷ４７と命名した目的のファージ
は、Ｍ１３ｍｐ１８の〜７.２ｋｂＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎ
ｄIII制限断片に連結されたプラスミドｐＴＰＡ１０３
の〜１.４ｋｂＨｉｎｄIII−ＳｓｔＩ制限断片を含有し
ている。

【００９０】対数増殖期の大腸菌ＪＭ１０３ 約５０ｍ
ｌをＭＰ１８ＢＷ４７に感染させ、空気振盪機中で３７
℃で１８時間インキュベートする。この感染細胞を低速
の遠心分離でペレット状にし、指導書の方法をスケール
アップすることによって、培養上清から一本鎖ＭＰ１８
ＢＷ４７ ＤＮＡを調製する。Adelman等、1983、DNA 2
(3):183-193の教示するところに実質的に従って、一本
鎖ＭＰ１８ＢＷ４７に変異を導入する。ただしクレノー
反応は室温で３０分間、次いで３７℃で６０分間、次い
で１０℃で１８時間行う。さらに、Ｓ１処理を２０℃で
行い、緩衝液の塩濃度は製造者が薦める濃度の半分に
し、Ｍ１３シークエンス用プライマー（ＢＲＬ）を用い
る。天然ＴＰＡのアミノ酸残基４から１７５までのコー
ド配列の削除に利用した合成オリゴデオキシリボヌクレ
オチドプライマーは次の配列（配列識別番号：１２）で
ある。

【化５】

【００９１】得られた変異混合物を用いて、実質的に上
述の感染操作法に従って大腸菌Ｋ１２ ＪＭ１０３をト
ランスフェクションする。ＲＦ ＤＮＡの制限酵素分析
およびマキシム−ギルバートのＤＮＡ配列決定法（Maxa
m,A.M.およびGilbert,W. 1980、Proc.Natl.Acad.Sci.U.
S.A. 74:560)によって、目的の変異体を同定する。天然
ＴＰＡのアミノ酸残基４から１７５までのコード配列が
削除されている目的の変異体を、ＭＰ１８ＢＷ５２と命
名した。

【００９２】プラスミドｐｍｔ６−ｈｄを以下のように
構築した。まずプラスミドｐＴＰＡ６０３を、上述の方
法に従ってＢａｍＨＩで完全に消化し、調製用ゲル電気
泳動によって〜１.９ｋｂのＢａｍＨＩ断片を単離し
た。次に、プラスミドｐＡｃ３７３（Miyamoto等、1985、
Mol.Cell.Biol.5:2860-2865）をＢａｍＨＩで消化し、
抽出して、エタノール沈殿させた。ＢａｍＨＩ消化した
このプラスミドｐＡｃ３７３ ＤＮＡをプラスミドｐＴ
ＰＡ６０３の〜１.９ｋｂＢａｍＨＩ断片に連結するこ
とによって、中間体プラスミドｐＬ１００を作成した。
プラスミドｐＡｃ３７３中には都合の良いクローニング
部位が存在するので、このプラスミドを使用した。プラ
スミドｐＡｃ３７３の代わりに他のプラスミドを、プラ
スミドｐＬ１００を作成するために使用することもでき
る。そのようなプラスミドの例には、ｐＢＲ３２２、ｐ
ＵＣ１８、およびｐＵＣ１９が含まれ、これらはすべて
一般に入手可能である。連結したこのＤＮＡを用いて、
実質的に実施例１Ｄの方法に従って大腸菌Ｋ１２ ＭＭ
２９４を形質転換した。アンピシリンを含むＬ寒天上に
この形質転換細胞を接種し、プラスミドＤＮＡの制限酵
素分析によって、アンピシリン耐性大腸菌Ｋ１２ ＭＭ
２９４／ｐＬ１００形質転換体を同定した。

【００９３】プラスミドｐＬ１００ ＤＮＡを制限酵素
ＢｇｌIIおよびＳｓｔＩで完全に消化し、調製用ゲル電
気泳動によって９.７ｋｂのＢｇｌII−ＳｓｔＩ断片を
単離した。上で得たＭＰ１８ＢＷ５２ ＤＮＡを制限酵
素ＢｇｌIIおよびＳｓｔＩで消化し、調製用ゲル電気泳
動によって〜７１８ｂｐのＢｇｌII−ＳｓｔＩ断片を単
離した。実施例１Ｃの方法に従ってこの断片をプラスミ
ドｐＬ１００の９.７ｋｂＢｇｌII−ＳｓｔＩ断片に連
結することによって、中間体プラスミドｐＬ２２９を作
成した。プラスミドｐＬ２２９を用いて、実質的に実施
例１Ｄの方法に従って大腸菌Ｋ１２ ＭＭ２９４を形質
転換した。アンピシリンを含むＬ寒天上にこの形質転換
細胞を接種し、プラスミドＤＮＡの制限酵素分析によっ
て、アンピシリン耐性大腸菌Ｋ１２ ＭＭ２９４／ｐＬ
２２９形質転換体を同定した。実施例１Ｅに記述したよ
うにしてプラスミドｐＬ２２９ ＤＮＡを単離した後、
これを制限酵素ＢａｍＨＩで消化した。調製用ゲル電気
泳動によって〜１.４ｋｂのＢａｍＨＩ断片を単離し
た。

【００９４】大腸菌Ｋ１２ ＧＭ４８／ｐｈｄ細胞は、
ノーザンリジョナルリサーチラボラトリーから受託番号
ＮＲＲＬ Ｂ−１８５２５の下で、凍結乾燥体として入
手する。分離した単一コロニーを得るために、１００μ
ｇ／ｍｌ アンピシリンを含むＬ寒天プレート上にこの
凍結乾燥細胞を接種して３７℃でインキュベートする。
プラスミドＤＮＡはこれらの細胞から、実施例１Ｆに記
述した方法で単離できる。プラスミドｐｈｄの制限地図
および機能地図を図７に示す。プラスミドｐｈｄをＢｃ
ｌＩで消化し、エタノール沈殿によって精製回収した。
ＢｃｌＩ消化したこのｐｈｄ ＤＮＡを、プラスミドｐ
Ｌ２２９の〜１.４ｋｂＢａｍＨＩ断片に連結すること
によって、目的のｐｍｔ６−ｈｄを作成した。連結した
このＤＮＡを用いて、実質的に実施例１Ｄの方法に従っ
て大腸菌Ｋ１２ ＭＭ２９４を形質転換した。アンピシ
リンを含むＬ寒天上にこの形質転換細胞を接種し、プラ
スミドＤＮＡを制限酵素分析することによって、アンピ
シリン耐性大腸菌Ｋ１２ ＭＭ２９４／ｐｍｔ６−ｈｄ
形質転換体を同定した。ｐｍｔ６−ｈｄの制限地図およ
び機能地図を図８に示す。

【００９５】実施例３：ｐＴＬＢ−ｔ６の構築 Ａ．ｐＬＰ５３−ＴＬＢの３２７３塩基対ＢｇｌII−Ｘ
ｍａＩ制限断片の調製 実施例１で調製したプラスミドｐＬＰ５３−ＴＬＢ Ｄ
ＮＡ １μｇを、ＢｇｌII １μｌ（１０単位）およびＸ
ｍａＩ ９μｌ（９単位）を用いて、５０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、および
５０ｍＭ ＮａＣｌを含む反応液容量２００μｌ中で完
全に消化した。消化したこのＤＮＡを実施例１Ａに記述
したようにして精製回収した。

【００９６】Ｂ．ｐｍｔ６−ｈｄの１０７３塩基対Ｂｇ
ｌII−ＸｍａＩ制限断片の調製 実施例２で調製したプラスミドｐｍｔ６−ｈｄ ＤＮＡ
３０μｇを、実施例３Ａに記述した緩衝液条件の反応液
容量２５０μｌ中で、ＢｇｌII ２μｌ（２０単位）お
よびＸｍａＩ ２５μｌ（２５単位）で完全に消化し
た。インキュベーション後、ローディング緩衝液（２５
％（ｖ／ｖ）グリセロール、０.０５％（ｗ／ｖ）ブロ
モフェノールブルー、０.５％（ｖ／ｖ）キシレンシア
ノール）２５μｌをこの試料に加え、ゲル電気泳動によ
って、消化したＤＮＡを分別した。１０７３塩基対のＢ
ｇｌII−ＸｍａＩ制限断片をゲルから回収精製した。回
収したＤＮＡ断片を水２０μｌに溶解した。

【００９７】Ｃ．ｐＴＬＢ−ｔ６の最終的構築 実施例３Ａで調製したプラスミドｐＬＰ５３−ＴＬＢ
ＤＮＡの３２７３塩基対ＢｇｌII−ＸｍａＩ制限断片
５０ナノグラムを、実質的に実施例１Ｃの連結操作方法
に従って、実施例３Ｂで調製したプラスミドｐｍｔ６−
ｈｄ ＤＮＡの１０７３塩基対ＢｇｌII−ＸｍａＩ制限
断片 ０.２μｇに連結した。この連結混合物の一部を用
いて、実施例１Ｄに記述した方法に従って感応性大腸菌
Ｋ１２ＡＧ１細胞を形質転換した。１００μｇ／ｍｌ
アンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上で、３７℃終夜
で生育した形質転換体を選択した。実施例１ＥのＤＮＡ
単離操作法によって、アンピシリン耐性クローンからプ
ラスミドＤＮＡを単離した。制限酵素分析によってプラ
スミドｐＴＬＢ−ｔ６を同定した。ｐＴＬＢ−ｔ６の制
限部位および機能地図を図９に示す。

【００９８】実施例４：ｐＢＫｎｅｏ１およびｐＢＫｎ
ｅｏ２の構築 Ａ．ＢＫウイルスＤＮＡの調製 ＢＫウイルスを、アメリカンタイプカルチャーコレクシ
ョンから受託番号ＡＴＣＣ ＶＲ−８３７の下で入手す
る。このウイルスは凍結乾燥体で送達され、これをハン
クス平衡塩類溶液（ギブコ、３１７５ スタレーロー
ド、グランドアイランド、ＮＹ １４０７２）中に約１
０^５プラーク形成単位（ｐｆｕ）／ｍｌの力価で再懸濁
させる。ＢＫウイルスＤＮＡ調製のために選択する宿主
は、一次ヒト胚腎臓（ＰＨＥＫ）細胞である。この細胞
はフローラボラトリーズインク（７６５５ オールドス
プリングハウスロード、マクレーン、ＶＡ ２２１０１）
からカタログ番号０−１００の下で、あるいはＭ.Ａ.バ
イオプロダクツからカタログ番号７０−１５１の下で入
手できる。あるいは、ＢＫウイルスをＶｅｒｏ細胞（Ａ
ＴＣＣカタログ番号ＣＣＬ８１）中で増殖させることも
できる。

【００９９】約１０^６ＰＨＥＫ細胞の全面単層を含む約
５個の７５ｍｍ²のポリスチレンフラスコをウイルスの
調製に使用する。各フラスコに力価１０^５ｐｆｕ／ｍｌ
のＢＫウイルス約１ｍｌを加え、３７℃で１時間インキ
ュベートした後、新鮮な培養培地（１０％ 胎児ウシ血
清を補足したダルベッコ改良イーグル培地（ギブコ））
を加え、感染した細胞を３７℃で１０ないし１４日間、
あるいはウイルスによる完全な細胞変性効果が認められ
るまでインキュベートする。この細胞変性効果は株化細
胞によって、またウイルスによって異なるが、通常は細
胞の顆粒化、凝集、培養盤からの痂皮形成乖離（かい
り）からなる。

【０１００】３回の凍結-融解によってウイルスを細胞
から放出させ、５０００Ｘｇで遠心分離することによっ
て細胞残渣を除去する。上清液１ｌにＰＥＧ-６０００
１００ｇを添加し、この溶液を４℃で２４時間インキュ
ベートし、５０００Ｘｇで２０分間遠心分離することに
よって、ウイルスを沈殿させ回収する。このペレットを
０.１Ｘ ＳＳＣ（１Ｘ ＳＳＣは０.１５Ｍ ＮａＣｌお
よび０.０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７）に溶解
して元の体積の１／１００にした。このウイルス懸濁液
を遠心管中の飽和ＫＢｒ溶液１５ｍｌに上層し、これを
７５０００Ｘｇで３時間遠心分離した。遠心分離後、Ｋ
Ｂｒ溶液中に２つのバンドがはっきり見える。完全なウ
イルス粒子を含む下のバンドを集め、セファデックスＧ
-５０カラム（シグマケミカルカンパニー、私書箱１４
５０８、セントルイス、ＭＯ ６３１７８）で、ＴＥを
溶出緩衝液に使って脱塩する。

【０１０１】このカラムから得られた精製ウイルス粒子
溶液にドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を１％濃度に
なるように加え、プロナーゼを１００μｇ／ｍｌの濃度
になるように添加し、この溶液を３７℃で２時間インキ
ュベートする。次いでこの溶液に塩化セシウムを加えて
密度を１.５６ｇ／ｍｌにし、これに臭化エチジウムを
加えて終濃度を１００μｇ／ｍｌにする。この溶液をソ
ーバル（デュポンインスティチュートプロダクツ、バイ
オケミカル部門、ニュートン、ＣＴ ０６４７０）８６
５ローターか、あるいは類似の垂直ローター中で、２６
００００Ｘｇで２４時間遠心分離する。遠心分離後、ウ
イルスＤＮＡのバンドを単離し、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ７.８）で飽和したイソアミルアルコー
ルで５回抽出する。次いでこのＢＫウイルスＤＮＡ溶液
をＴＥ緩衝液に対して、ＤＮＡの２６０ｎｍ／２８０ｎ
ｍの吸光度比が１.７５から１.９０の間になるまで透析
する。ＮａＣｌ濃度を０.１５Ｍに調節し、２容量のエ
タノールを加え、その溶液を−７０℃で少なくとも２時
間インキュベートした後、１２０００Ｘｇで１０分間遠
心分離ことによってＤＮＡを沈殿させる。得られたＢＫ
ウイルスＤＮＡのペレットをＴＥ緩衝液中に１ｍｇ／ｍ
ｌの濃度で懸濁させる。

【０１０２】Ｂ．プラスミドｐＢＫｎｅｏ１およびｐＢ
Ｋｎｅｏ２の構築 大腸菌Ｋ１２ ＨＢ１０１／ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ
細胞は、アメリカンタイプカルチャーコレクションから
受託番号ＡＴＣＣ ３７２２４の下で、凍結乾燥体とし
て入手する。分離した単一コロニーを得るために、この
凍結乾燥された細胞を１００μｇ／ｍｌのアンピシリン
を含むＬ寒天プレート上に接種し、３７℃でインキュベ
ートする。プラスミドＤＮＡはこれらの細胞から実施例
１Ｆに記述したプラスミド単離法に従って単離できる。

【０１０３】上で調製したプラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭ
Ｔｎｅｏ ＤＮＡ 約５μｇ（５μｌ）および実施例４Ａ
で調製したＢＫウイルスＤＮＡ 約５μｇ（５μｌ）の
それぞれを、１０Ｘ ＢａｍＨＩ緩衝液（１.５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.９）、６
０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、および１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）２μ
ｌ、制限酵素ＢａｍＨＩ １μｌおよび水７μｌを含む
溶液中で、３７℃で２時間消化した。等量のフェノール
で抽出することによって反応を止め、続いて２回クロロ
ホルム抽出した。次いで、ＢａｍＨＩ消化した各ＤＮＡ
を沈殿させ、遠心分離によって集め、水５μｌ中に再懸
濁させた。

【０１０４】ＢａｍＨＩ消化したプラスミドｐｄＢＰＶ
−ＭＭＴｎｅｏ（１μｌ）およびＢａｍＨＩ消化したＢ
ＫウイルスＤＮＡ（１μｌ）の混合物に１０Ｘ リガー
ゼ緩衝液約１μｌを加えた。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ １μ
ｌ(〜１０００単位）および水６μｌをこのＤＮＡ混合
物に加えた後、得られた反応液を１６℃で終夜インキュ
ベートした。この連結したＤＮＡは目的のプラスミドｐ
ＢＫｎｅｏ１およびｐＢＫｎｅｏ２を構成し、両者の違
いはＢＫウイルスＤＮＡの配向の点だけである。プラス
ミドｐＢＫｎｅｏ１の制限部位と機能地図を、添付の図
面の図１０に示す。

【０１０５】大腸菌Ｋ１２ ＨＢ１０１細胞はノーザン
リジョナルリサーチラボラトリーから受託番号ＮＲＲＬ
Ｂ−１５６２６の下で凍結乾燥体として入手できる。
実質的に実施例１Ｄの方法に従って、大腸菌Ｋ１２ Ｈ
Ｂ１０１細胞を培養し、形質転換感応性にし、上で調製
した連結ＤＮＡで形質転換した。１００μｇ／ｍｌのア
ンピシリンを含むＬ寒天プレート上にこの形質転換細胞
を接種した。大腸菌Ｋ１２ ＨＢ１０１／ｐＢＫｎｅｏ
１および大腸菌Ｋ１２ ＨＢ１０１／ｐＢＫｎｅｏ２形
質転換菌を、そのアンピシリン耐性表現型およびそのプ
ラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって同定した。

【０１０６】実施例５ Ａ．中間体プラスミドｐＬＰｃａｔの構築 アデノウイルス２（Ａｄ２）のウイルス粒子ＤＮＡは、
約３５.９４ｋｂの大きさの二本鎖直鎖状分子である。
Ａｄ２後期プロモーターをＡｄ２ゲノムの〜０.３１６
ｋｂのＡｃｃＩ−ＰｖｕII制限断片上に単離することが
でき、この〜０.３２ｋｂの制限断片はＡｄ２ゲノムの
ヌクレオチド位置５７５５と６０７１の間の配列に相当
する。目的の〜０.３２ｋｂＡｃｃＩ−ＰｖｕII制限断
片を単離するために、Ａｄ２ ＤＮＡをまず制限酵素Ｂ
ａｌＩで消化し、〜０.３２ｋｂＡｃｃＩ−ＰｖｕII制
限断片の全配列を含む〜２.４ｋｂＢａｌＩ制限断片を
単離する。次に、この〜２.４ｋｂＢａｌＩ制限断片を
ＡｃｃＩおよびＰｖｕIIで消化して目的の断片を得る。

【０１０７】Ａｄ２ ＤＮＡ（ＢＲＬから入手可能）約
５０μｇを、水８０μｌおよび１０Ｘ ＢａｌＩ緩衝液
（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.６）、１２０
ｍＭＭｇＣｌ₂、１００ｍＭ ＤＴＴ、および１ｍｇ／ｍ
ｌ ＢＳＡ）１０μｌに溶解する。制限酵素ＢｇｌＩ 約
１０μｌ（〜２０単位）をこのＡｄ２ ＤＮＡ溶液に加
え、得られた反応液を３７℃で４時間インキュベートす
る。

【０１０８】ＢａｌＩ消化したこのＤＮＡをアガロース
ゲルにのせ、この制限断片が十分に分離されるまで電気
泳動する。電気泳動したＤＮＡの可視化は、臭化エチジ
ウムの希釈溶液（０.５μｇ／ｍｌ）中でゲルを染色
し、染色したゲルに長波長の紫外（ＵＶ）線をあてるこ
とによって行った。アガロースからＤＮＡを単離する方
法の一つを以下に述べる。目的の断片の直前のゲルに小
さな切り込みを入れ、ＮＡ-４５ ＤＥＡＥ膜（シュライ
カーアンドシュネル、キーン、ＮＨ ０３４３１）の小
片を各切り込みに入れる。さらに電気泳動を行うと、Ｄ
ＮＡはこのＤＥＡＥ膜に非共有結合的に結合する。目的
の断片がＤＥＡＥ膜に吸着した後、この膜を取り出し、
低塩濃度緩衝液（１００ｍＭ ＫＣｌ、０.１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、および２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８））
で濯ぐ。次にこの膜を小さな試験官に入れて、高塩濃度
緩衝液（１Ｍ ＮａＣｌ、０.１ｍＭ ＥＤＴＡ、および
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８））に浸し、これ
を６５℃で１時間インキュベートすることによってＤＥ
ＡＥ膜からＤＮＡを分離する。６５℃でインキュベーシ
ョンした後、このインキュベーション緩衝液を集め、膜
を高塩濃度緩衝液で濯ぐ。高塩濃度洗浄液を高塩濃度イ
ンキュベーション緩衝液と一緒に貯蔵する。

【０１０９】高塩濃度ＤＮＡ溶液の容量を、ＮａＣｌ濃
度が０.２５Ｍになるように調節した後、この溶液に３
容量の冷無水エタノールを加える。得られた溶液を混合
し、−７０℃で１０-２０分間静置する。次にこの溶液
を１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離する。残ってい
る塩を除くために再度沈殿させた後、ＤＮＡペレットを
エタノールで濯ぎ、乾燥し、ＴＥ緩衝液２０μｌ中に再
懸濁させて、目的のＡｄ２の制限断片約３μｇを得る。
得られた精製断片をＴＥ緩衝液１０μｌに溶解する。

【０１１０】水約６μｌおよび１０Ｘ ＡｃｃＩ緩衝液
（６０ｍＭ ＮａＣｌ、６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７.５）、６０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、６０ｍＭ ＤＴＴ、お
よび１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）２μｌをＡｄ２の〜２.４ｋ
ｂＢａｌＩ制限断片溶液に加える。このＤＮＡ溶液に制
限酵素ＡｃｃＩ 約２μｌ（〜１０単位）を添加した
後、その反応液を３７℃で２時間インキュベートする。
ＡｃｃＩ消化の後、ＤＮＡをエタノール沈殿によって集
め、これを水１６μｌおよび１０Ｘ ＰｖｕII緩衝液
（６００ｍＭ ＮａＣｌ、６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７.５）、６０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、６０ｍＭ ＤＴ
Ｔ、および１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）２μｌ中に再懸濁さ
せる。このＤＮＡ溶液に制限酵素ＰｖｕII 約２μｌ
（約１０単位）を加えた後、その反応液を３７℃で２時
間インキュベートする。

【０１１１】ＡｃｃＩ−ＰｖｕII消化したＡｄ２の〜
２.４ｋｂＢａｌＩ制限断片を〜６％ポリアクリルアミ
ドゲルにのせ、Ａｄ２の後期プロモーターを含有する〜
０.３２ｋｂＡｃｃＩ−ＰｖｕII制限断片が他の消化産
物から分離するまで電気泳動する。ゲルを臭化エチジウ
ムで染色し、ＵＶ光線を用いて調べ、〜０.３２ｋｂＡ
ｃｃＩ−ＰｖｕII制限断片を含むゲル断片をゲルから切
り離し、砕き、抽出緩衝液（５００ｍＭ ＮＨ₄ＯＡｃ、
１０ｍＭ ＭｇＯＡｃ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および０.１
％ ＳＤＳ）〜２５０μｌ中に室温で終夜浸す。翌朝こ
の混合物を遠心分離し、ペレットを捨てる。上清中のＤ
ＮＡをエタノールで沈殿させる。このとき目的の断片を
確実に完全に沈殿させるために、ｔＲＮＡ 約２μｇを
添加する。〜０.３２ｋｂＡｃｃＩ−ＰｖｕII制限断片
約０.２μｇが得られ、これを水７μｌ中に懸濁させ
る。

【０１１２】実施例２に記述した方法に実質的に従って
キナーゼ処理したＢｃｌＩリンカー（５'-ＣＴＧＡＴＣ
ＡＧ-３'、ＮＥＢから入手可能）約０.２５μｇ（０.５
μｌ中）を〜０.３２ｋｂＡｃｃＩ−ＰｖｕII制限断片
の溶液に加えた後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ １μｌ（〜１
０００単位）および１０Ｘ リガーゼ緩衝液 １μｌをこ
のＤＮＡ溶液に加え、得られた反応液を１６℃で終夜イ
ンキュベートした。ＢｃｌＩリンカーは、このＡｃｃＩ
−ＰｖｕII制限断片のＰｖｕII末端にのみ結合可能であ
った。後に、４つのＢｃｌＩリンカーが、このＡｃｃＩ
−ＰｖｕII制限断片のＰｖｕII末端に結合していること
がＤＮＡ配列決定からわかった。これらの余分なＢｃｌ
ＩリンカーはＢｃｌＩ消化および再連結によって除去す
ることができるが、このリンカーは、これらの余分なリ
ンカーを含有するベクターの適正な機能を妨害しないの
で、余分なＢｃｌＩリンカーを除去しなかった。

【０１１３】大腸菌Ｋ１２ ＨＢ１０１／ｐＳＶ２ｃａ
ｔ細胞をＡＴＣＣから受託番号ＡＴＣＣ ３７１５５の
もとで凍結乾燥体として入手し、実質的に実施例１Ｆの
操作に従って、この細胞からプラスミドｐＳＶ２ｃａｔ
ＤＮＡを単離した。プラスミドｐＳＶ２ｃａｔの制限
部位と機能地図を、添付の図面の図１１に示す。プラス
ミドｐＳＶ２ｃａｔ ＤＮＡ 約１ｍｇが得られ、これを
ＴＥ緩衝液１ｍｌに溶解する。プラスミドｐＳＶ２ｃａ
ｔ ＤＮＡ 約３μｇ（３μｌ）を１０Ｘ ＡｃｃＩ緩衝
液２μｌおよび水１６μｌに加えた後、制限酵素Ａｃｃ
Ｉ ３μｌ（約９単位）をこのｐＳＶ２ｃａｔ ＤＮＡ溶
液に添加し、得られた反応液を３７℃で２時間インキュ
ベートした。次に、ＡｃｃＩ消化したこのプラスミドｐ
ＳＶ２ｃａｔ ＤＮＡに、１０Ｘ ＳｔｕＩ緩衝液（１.
０Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８.０）、１００ｍＭ ＭｇＣｌ₂、６０ｍＭ ＤＴＴ、お
よび１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）３μｌ、水５μｌ、および
制限酵素ＳｔｕＩ 約２μｌ（約１０単位）を加えるこ
とによって、これを制限酵素ＳｔｕＩで消化した。得ら
れた反応液を３７℃で２時間インキュベートした。この
反応混合物をフェノールで１回抽出し、次いでクロロホ
ルムで２回抽出することによって反応を停止した。目的
の断片約０.５μｇが得られ、これをＴＥ緩衝液２０μ
ｌに溶解した。

【０１１４】ＡｃｃＩ−ＳｔｕＩ消化したプラスミドｐ
ＳＶ２ｃａｔ ＤＮＡ 約４μｌをＡｄ２の〜０.３２ｋ
ｂＡｃｃＩ−ＰｖｕII（ＢｃｌＩリンカーが結合してい
る）制限断片 約７μｌと混合し、１０Ｘ リガーゼ緩衝
液 ３μｌ、水１５μｌ、およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ
２μｌ（約１０００単位）を添加した後、この連結反応
液を１６℃で終夜インキュベートした。連結したＤＮＡ
は目的のプラスミドｐＬＰｃａｔを構成し、このプラス
ミドはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ遺伝子の転写を駆動し、従って発現させるような位置
にＡｄ２後期プロモーターを含有している。プラスミド
ｐＬＰｃａｔの制限部位および機能地図を、添付の図面
の図１２に示す。

【０１１５】連結したこのＤＮＡを用いて、実質的に実
施例１Ｄの操作に従って大腸菌Ｋ１２ ＨＢ１０１細胞
を形質転換した。５０μg／ｍｌ アンピシリンを含むＬ
寒天上にこの形質転換細胞を蒔いた。大腸菌Ｋ１２ Ｈ
Ｂ１０１／ｐＬＰｃａｔ形質転換体を同定するために
は、プラスミドＤＮＡの制限酵素分析を用いた。次の構
築に使用するために、実施例１Ｆで記述したプラスミド
単離操作法に実質的に従って、形質転換体からプラスミ
ドｐＬＰｃａｔ ＤＮＡを単離した。

【０１１６】Ｂ．プラスミドｐＢＬｃａｔの構築 ＴＥ緩衝液５０μｌ中のプラスミドｐＢＫｎｅｏ１ Ｄ
ＮＡ（実施例４Ｂ）約８８μｇを、１０Ｘ ＡｃｃＩ緩
衝液 ７.５μｌ、水３０μｌおよび制限酵素ＡｃｃＩ
１５μｌ（約７５単位）に加え、得られた反応液を３７
℃で２時間インキュベートした。ＡｃｃＩ消化したＢＫ
ウイルスＤＮＡをアガロースゲルにのせ、ＢＫエンハン
サーを含む〜１.４ｋｂの断片を他の消化産物から分離
した。次に、〜１.４ｋｂのＡｃｃＩ制限断片をゲルか
ら単離した。この断片約５μｇを、１０Ｘ ＰｖｕII緩衝
液 ５μｌ、水４５μｌおよび制限酵素ＰｖｕII ５μl
（約２５単位）中に懸濁させ、得られた反応液を３７℃
で２時間インキュベートした。次いで、ＰｖｕII消化し
たＤＮＡを精製し、エタノールで沈殿させた。目的の〜
１.２８ｋｂＡｃｃＩ−ＰｖｕII断片 約２μｇを得ら
れ、これをＴＥ緩衝液５μｌに溶解した。

【０１１７】プラスミドｐＬＰｃａｔ ＤＮＡ 約１μｇ
を１０Ｘ ＡｃｃＩ緩衝液５μｌおよび水４０μｌに溶
解した。制限酵素ＡｃｃＩ 約５μｌ（〜２５単位）を
このプラスミドｐＬＰｃａｔ ＤＮＡ溶液に加え、得ら
れた反応液を３７℃でインキュベートした。ＡｃｃＩ消
化したプラスミドｐＰＬｃａｔ ＤＮＡをエタノールで
沈殿させ、１０Ｘ ＳｔｕＩ緩衝液 ５μｌ、水４０μｌ
および制限酵素ＳｔｕＩ ５μｌ(約２５単位)中に懸濁
させ、得られた反応液を３７℃で２時間インキュベート
した。ＡｃｃＩ−ＳｔｕＩ消化したプラスミドｐＬＰｃ
ａｔ ＤＮＡをエタノールで数回沈殿させることによっ
て、大腸菌の複製起源およびＡｄ２後期プロモーターを
含む〜４.８１ｋｂＡｃｃＩ−ＳｔｕＩ制限断片を、約
１６ｂｐの大きさの制限断片である消化副産物から分離
精製した。目的の〜４.８１ｋｂ制限断片約１μｇが得
られ、これをＴＥ緩衝液２０μｌに溶解した。

【０１１８】プラスミドｐＬＰｃａｔの〜４.８１ｋｂ
ＡｃｃＩ−ＳｔｕＩ制限断片 ５μｌを、プラスミドｐ
ＢＫｎｅｏ１の〜１.２８ｋｂＡｃｃＩ−ＰｖｕII制限
断片 ５μｌに加えた。このＤＮＡ混合物に１０Ｘ リガ
ーゼ緩衝液 ３μｌ、水１５μｌおよびＴ４ ＤＮＡリガ
ーゼ ２μｌ（約１０００単位）を加えた後、得られた
連結反応液を１６℃で終夜インキュベートした。連結し
たこのＤＮＡは目的のプラスミドｐＢＬｃａｔを構成し
ていた。プラスミドｐＢＬｃａｔの制限部位および機能
地図を、添付の図面の図１３に示す。

【０１１９】この連結したＤＮＡを用いて、実質的に実
施例１Ｄに記述した操作に従って、大腸菌Ｋ１２ ＨＢ
１０１細胞を形質転換した。プラスミドＤＮＡの制限酵
素分析によって、大腸菌Ｋ１２ ＨＢ１０１０／ｐＢＬ
ｃａｔ形質転換体を同定した。次の構築に使用するため
に、実施例１Ｆの操作に実質的に従って、プラスミドｐ
ＢＬｃａｔ ＤＮＡを調製した。

【０１２０】Ｃ．プラスミドｐＳＢＬｃａｔの最終的構
築 プラスミドｐＢＬｃａｔ ＤＮＡ 約１００μｇを、１０
Ｘ ＨｉｎｄIII緩衝液（０.５Ｍ ＮａＣｌ、０.１Ｍ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、０.１Ｍ ＭｇＣｌ₂、お
よび１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）１０μｌおよび水８０μｌ
に溶解した。制限酵素ＨｉｎｄIII 約１０μｌ（約１０
０単位）をこのプラスミドｐＢＬｃａｔＤＮＡ溶液に加
え、得られた反応液を３７℃で２時間インキュベートし
た。ＨｉｎｄIII消化したこのプラスミドｐＢＬｃａｔ
ＤＮＡをアガロースゲル上にのせ、ＢＫエンハンサーお
よびＡｄ２後期プロモーターを含む〜０.８７ｋｂＨｉ
ｎｄIII制限断片が他の消化産物から十分分離するまで
電気泳動した。次いでこの０.８７ｋｂ断片をゲルから
単離精製し、エタノール沈殿させた。目的の断片約１０
μｇが得られ、これをＴＥ緩衝液５０μｌに溶解した。

【０１２１】ＴＥ緩衝液１μｌ中のプラスミドｐＳＶ２
ｃａｔ ＤＮＡ 約１μｇを、１０ＸＨｉｎｄIII緩衝液
２μｌおよび水１６μｌに溶解した。制限酵素Ｈｉｎｄ
III約１μｌ（約１０単位）をこのＤＮＡ溶液に加え、
得られた反応液を３７℃で２時間インキュベートした。
この反応混合物をまずフェノールで抽出し、次いでクロ
ロホルムで２回抽出することによって、反応を停止し
た。ＨｉｎｄIII消化したプラスミドｐＳＶｃａｔ ＤＮ
Ａをエタノールで沈殿させ、ＴＥ緩衝液１００μｌ中に
再懸濁させた。ウシ腸アルカリホスファターゼ 約０.０
６単位をこの溶液に加え、得られた混合物を３７℃で３
０分間インキュベートした。１Ｘ ＳＥＴ（５ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.８）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、および
１５０ｍＭ ＮａＣｌ）、０.３Ｍ 酢酸ナトリウムおよ
び０.０５％ ＳＤＳを含有するようにこの溶液を調節し
た後、６５℃で４５分間インキュベートした。ＤＮＡを
フェノールで２回抽出し、次いでクロロホルムで抽出し
た。実施例１に記述したようにしてＤＮＡをエタノール
沈殿させ、これをＴＥ緩衝液１０μｌ中に再懸濁させ
た。このホスファターゼ処理は、ｐＳＶ２ｃａｔ ＤＮ
Ａの自己連結を阻害する。

【０１２２】プラスミドｐＢＬｃａｔの〜０.８７ｋｂ
ＨｉｎｄIII制限断片 約５μｌを、ＨｉｎｄIII消化し
たプラスミドｐＳＶ２ｃａｔ １０μｌに加えた後、１
０Ｘリガーゼ緩衝液 ３μｌ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ ２
μｌ（約１０００単位）および水１３μｌをこのＤＮＡ
溶液に加え、得られた反応液を１６℃で２時間インキュ
ベートした。この連結したＤＮＡは目的のプラスミドｐ
ＳＢＬｃａｔを構成していた。この連結したＤＮＡを用
いて、実質的に実施例１Ｄの方法に従って大腸菌Ｋ１２
ＨＢ１０１を形質転換した。アンピシリンを含むＬ寒
天上にこの形質転換細胞を接種し、アンピシリン耐性形
質転換体のプラスミドＤＮＡを制限酵素分析で調べるこ
とによって、大腸菌Ｋ１２ ＨＢ１０１／ｐＳＢＬｃａ
ｔ形質転換体を同定した。ＢＫエンハンサーおよびＡｄ
２プロモーターをコードする〜０.８７ｋｂＨｉｎｄIII
制限断片は、ＨｉｎｄIII消化したプラスミドｐＳＢＬ
ｃａｔ中に、２つの配向のうちのどちらかで挿入するこ
とができるが、そのうちの１つだけがプラスミドｐＳＢ
Ｌｃａｔである。プラスミドｐＳＢＬｃａｔの制限部位
および機能地図を、添付の図面の図１４に示す。

【０１２３】実施例６：ｐＳＢＬ−Ｂｔ６−ｄの構築 Ａ．ｐｍｔ６−ｈｄの３８６５ｂｐＡａｔII−ＸｍａＩ
制限断片の調製 実施例２で調製したｐｍｔ６−ｈｄ ２０μｇを、１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、５０ｍＭ ＫＣ
ｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂および１ｍＭ ＤＴＴを含む反
応液容量１５０μｌ中で、ＡａｔII １０μｌ（２０単
位）で完全に消化した。この試料を３７℃で３時間イン
キュベートした。インキュベーション後、実施例１Ａに
記述したようにしてこの試料を精製し、エタノール沈殿
で集め、水２１０μｌ中に再懸濁させた。

【０１２４】上記のＤＮＡをＸｍａＩを用いて、以下の
ように完全に消化した。１０Ｘ ＢＲＬコア（Core）緩
衝液（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、１
００ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５００ｍＭ ＮａＣｌ）２５μｌ
およびＸｍａＩ １５μｌ（１５単位）をこの試料に加
えた。この試料を混合した後、３７℃で１６時間インキ
ュベートした。インキュベーション後、実施例１Ａに記
述したようにして試料を精製回収し、水２１０μｌ中に
再懸濁させた。

【０１２５】上記のＤＮＡをＭｓｔIIでさらに消化し
て、ゲル電気泳動による目的の３８６５ｂｐＡａｔII−
ＢｇｌII制限断片の分離を可能にした。１０Ｘ ＭｓｔI
I緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.
５）、１.５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、２ｍＭ
Ｂ−メルカプトエタノール）２５μｌおよびＭｓｔII
１５μｌ（ｘ単位）をこの試料に加えた。この試料を混
合した後、３７℃で２時間インキュベートした。インキ
ュベーション後、調製用ゲル電気泳動によって３８６５
ｂｐのＡａｔII−ＢｇｌII制限断片を単離した。

【０１２６】Ｂ．ｐＳＢＬｃａｔの３２２８ｂｐＡａｔ
II−ＢｃｌＩ制限断片の調製 ３２２８ｂｐＡａｔII−ＢｃｌＩ制限断片をプラスミド
ｐＳＢＬから単離した。プラスミドｐＳＢＬは、実施例
５に記述したプラスミドｐＳＢＬｃａｔの誘導体であ
る。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
（ＣＡＴ）遺伝子をｐＳＢＬｃａｔから削除することに
よってｐＳＢＬを作成した。あるいは以下のようにし
て、ｐＳＢＬｃａｔから３２２８ｂｐＡａｔII−Ｂｃｌ
Ｉ制限断片を単離することもできる。

【０１２７】実施例４で調製したｐＳＢＬｃａｔ ２５
μｇを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、５
０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂および１ｍＭ ＤＴ
Ｔを含む反応液容量２００μｌ中で、ＡａｔII ２０μ
ｌ（４００単位）で完全に消化する。この試料を３７℃
で３時間インキュベートする。インキュベーション後、
１０Ｘ コア緩衝液（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８.０）、１００ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５００ｍＭ ＮａＣ
ｌ）３０μｌ、水６０μｌおよびＢｃｌＩ １０μｌ
（１００単位）をこの試料に加える。この試料を３７℃
で３時間インキュベートする。インキュベーション後、
調製用ゲル電気泳動によって３２２８ｂｐＡａｔII−Ｂ
ｃｌＩ制限断片を単離する。

【０１２８】Ｃ．ｐＴＬＢ−ｔ６の１１９０ｂｐＢａｍ
ＨＩ−ＸｍａＩ制限断片の調製 実施例３で調製したｐＴＬＢ−ｔ６ ２５μｇを、Ｘｍ
ａＩ ２０μｌ（２０単位）、ＢａｍＨＩ ５μｌ（５０
単位）、１０Ｘ コア緩衝液（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８.０）、１００ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５００ｍ
Ｍ ＮａＣｌ）２０μｌおよび水８０μｌを含む反応液
中で完全に消化した。この試料を３７℃で２時間インキ
ュベートした。インキュベーション後、各試料から調製
用ゲル電気泳動によって１１９０ｂｐＢａｍＨＩ−Ｘｍ
ａＩ制限断片を単離した。

【０１２９】Ｄ．プラスミドｐＳＢＬ−Ｂｔ６−ｄの最
終的調製 実施例１Ｃの連結法に実質的に従って、実施例６Ａで調
製したプラスミドｐｍｔ６−ｈｄの３８６５ｂｐＡａｔ
II−ＸｍａＩ制限断片 ５０ナノグラムを、実施例６Ｂ
で調製した３２２８ｂｐＡａｔＩ−ＢｃｌＩ制限断片
０.１μｇ、および実施例６Ｃで調製したｐＴＬＢ−ｔ
６の１１９０ｂｐＢａｍＨＩ−ＸｍａＩ制限断片 ０.０
５μｇに連結する。この連結混合物の一部を用いて、実
施例１Ｄに記述した方法に従って大腸菌Ｋ１２ ＡＧ１
を形質転換する。１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む
ＬＢ寒天プレート上で３７℃で終夜生育させて、形質転
換体を選択する。実施例１ＥのＤＮＡ単離操作法によっ
て、アンピシリン耐性クローンからプラスミドＤＮＡを
単離する。ｐＳＢＬ−Ｂｔ６−ｄの制限部位および機能
地図を図１５に示す。

【０１３０】実施例７：プラスミドｐＧＴ−ｔ６Ｂ−ｄ
の構築 Ａ．ｐｍｔ６−ｈｄの３８６５ｂｐＡａｔII−ＸｍａＩ
制限断片の調製 ｐｍｔ６−ｈｄの３８６５ｂｐＡａｔII−ＸｍａＩ制限
断片を、実施例６Ａに記述したように単離した。

【０１３１】Ｂ．ｐＧＴＣの３５６０ｂｐＢｃｌＩ−Ａ
ａｔII制限断片の調製 大腸菌Ｋ１２ ＡＧ１／ｐＧＴＣはノーザンリジョナル
リサーチセンター（ＮＲＲＬ）、アグリカルチャラルリ
サーチサービス、アメリカ合衆国農業省、ペオリア、イ
リノイ ６１６０４に、受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１８５９
３の下で１９９０年１月１８日に寄託され、該機関の永
久保存カルチャーコレクションの一部を構成している。
プラスミドｐＧＴＣはこの大腸菌Ｋ１２ ＡＧ１／ｐＧ
ＴＣから従来の方法で単離できる。ｐＧＴＣの制限部位
および機能地図を図１５に示す。

【０１３２】実施例１Ｄに記述したようにして、プラス
ミドｐＧＴＣでｄａｍ株化細胞大腸菌Ｋ１２ ＧＭ４８
を形質転換した。大腸菌Ｋ１２ ＧＭ４８はＮＲＲＬか
ら受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５７２５の下で入手可能で
ある。他のｄａｍ株化細胞も使用できる。実施例１Ｅに
記述したようにして、これらの形質転換体からプラスミ
ドＤＮＡを単離した。

【０１３３】ｐＧＴＣ ２５μｇを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ₂および１ｍＭ ＤＴＴを含む反応液容量２００μ
ｌ中で、ＡａｔII ２０μｌ（４０単位）で完全に消化
した。この試料を３７℃で３時間インキュベートした。
インキュベーション後、１０Ｘ コア緩衝液 ３０μｌ、
水６０μｌおよびＢｃｌＩ １０μｌ（１００単位）を
この試料に加えた。この試料を３７℃で３時間インキュ
ベートした。インキュベーション後、調製用ゲル電気泳
動によって３５６０ｂｐＡａｔII−ＢｃｌＩ制限断片を
単離した。

【０１３４】Ｃ．ｐＴＬＢ−ｔ６の１１２０ｂｐＢａｍ
ＨＩ−ＸｍａＩ制限断片の調製 実施例６Ｃに記述したようにしてｐＴＬＢ−ｔ６の１１
２０ｂｐＢａｍＨＩ−ＸｍａＩ制限断片を単離した。

【０１３５】Ｄ．ｐＧＴ−ｔ６Ｂ−ｄの最終的構築 実施例１Ｃの連結法に実質的に従って、実施例７Ａで調
製したｐｍｔ６−ｈｄのＡａｔII−ＸｍａＩ制限断片
５０ｎｇを、実施例７Ｂで調製したｐＧＴＣのＢｃｌＩ
−ＡａｔII制限断片 ５０ｎｇ、および実施例７Ｃで調
製したｐＴＬＢ−ｔ６のＢａｍＨＩ−ＸｍａＩ制限断片
５０ｎｇに連結した。この連結混合物の一部を用い
て、実施例１Ｄに記述した方法に従って大腸菌Ｋ１２
ＡＧ１を形質転換した。１００μｇ／ｍｌ アンピシリ
ンを含むＬＢ寒天プレート上で３７℃で終夜生育させ
て、形質転換体を選択した。実施例１ＥのＤＮＡ単離操
作法によって、アンピシリン耐性クローンからプラスミ
ドＤＮＡを単離した。ｐＧＴ−ｔ６Ｂ−ｄの制限部位お
よび機能地図を図１６に示す。

【０１３６】実施例８：形質転換および培養 Ａ．ＡＶ１２−６６４細胞の形質転換 以下に記述する形質転換操作法は宿主株化細胞ＡＶ１２
−６４４細胞に関する。しかしこの操作法はほとんどの
真核株化細胞一般に適用できる。

【０１３７】ＡＶ１２−６４４細胞はＡＴＣＣから受託
番号ＣＲＬ ９５９５の下で入手可能であり、これは１
０％ 熱不活化ウマ血清を添加したイーグル最少必須培
地中に約５.５ｘ１０^６細胞の全面単層を含有する２５
ｍｍ^２フラスコに入っている。このフラスコを３７℃で
インキュベートする。培地を２週間毎に交換する。培地
を除去し、ハンクス平衡塩類溶液（ギブコ、３１７５ス
タレーロード、グランドアイランド、Ｎ.Ｙ.１４０７
２）で濯ぎ、０.２５％ トリプシンを１〜２分間加え、
新鮮な培地で濯ぎ、吸引し、継代比１：５あるいは１：
１０で新しいフラスコ中に分配することによって、細胞
を継代培養する。

【０１３８】形質転換の前日に、細胞を１００ｍｍある
いは５５ｃｍ^２培養皿あたり０.７ｘ１０^６細胞で接種
する。培地を形質転換の４時間前に交換する。水に溶解
した滅菌エタノール沈殿プラスミドＤＮＡを用いて、２
０μｇ／ｍｌ ＤＮＡおよび２５０ｍＭ ＣａＣｌ₂を含
む２Ｘ ＤＮＡ−ＣａＣｌ_２溶液を調製する。２８０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（Ｎ−２−ヒドロキ
シエチルピペラジン−Ｎ'−２−エタンスルホン酸）お
よび１.５ｍＭ リン酸ナトリウムを含む２Ｘ ＨＢＳを
調製し、ｐＨを７.０５〜７.１５に調節する。滅菌２Ｘ
ＨＢＳにゆっくり空気を送り込みながら、これに等量
の２Ｘ ＤＮＡ−ＣａＣｌ_２溶液を綿栓の付いた１ｍｌ
滅菌プラスチックピペットで滴下する。これ以上撹拌さ
ずに、室温で３０〜４５分間リン酸カルシウム−ＤＮＡ
の沈殿を形成させる。

【０１３９】次いでプラスチックピペットで緩やかにピ
ペッティングすることによってこの沈殿を混合し、感受
性細胞を覆っている生育培地１０ｍｌに、１プレートあ
たり０.５ｍｌの沈殿を直接加える。３７℃で４時間イ
ンキュベートした後、培地を１０％ 胎児ウシ血清を含
むＤＭＥＭに置換し、選択圧を加える前に細胞をさらに
７２時間インキュベートする。真核細胞中で機能する選
択標識を含有しないプラスミドについては、選択標識を
持たない本発明の発現ベクターと真核細胞中で機能する
選択標識を含有する発現ベクターの混合物を使用する形
質転換を行う。この同時形質転換技術を用いれば、選択
圧下で生育するコロニーを単離し、有用なタンパク質を
検定することによって、これらの形質転換プラスミドの
両方を含有する細胞を同定することができる。

【０１４０】ハイグロマイシン耐性付与遺伝子を含有す
るプラスミドでトランスフェクションした細胞について
は、ハイグロマイシンを最終濃度約２００ないし４００
μｇ／ｍｌで生育培地に添加する。ネズミのｄｈｆｒ遺
伝子を含有するベクターでＡＶ１２−６４４細胞を形質
転換した場合には、その形質転換細胞をメソトレキセー
ト（２００〜５００ｎＭ）で直接選択することもでき
る。次いで、３ないし４日毎に培地を交換しながら、細
胞を３７℃で２〜４週間インキュベートする。得られた
ハイグロマイシン耐性あるいはメソトレキセート耐性ク
ローンを各培養フラスコに移して特徴づける。

【０１４１】実施例９：有効性の立証 本発明の組織プラスミノーゲン活性化因子分子を、Burc
k等（前述）などの当該技術分野でよく知られた方法で
培養培地から単離する。ｍｔ−ＰＡ６の２つの形態は、
Einarsson等、1985、Biochim.Biophys.Acta 830:1-10、お
よびRijiken等、1985、Thromb.and Haemostas.54(4)、788-
791の方法に実質的に従って、アフィニティークロマト
グラフィーで分離することができる。好ましくは、ＴＳ
Ｋフェニル−５ＰＷカラム（２０ｍｍ ＩＤｘ１５０ｍ
ｍ長）を用いる調製用疎水相互作用クロマトグラフィー
で、以下のように変種ｍｔ−ＰＡ６を単離する。移動層
Ａを１Ｍ リン酸カリウム、２Ｍ 尿素、０.０２％ ナト
リウムアジド、ｐＨ８.５とし、また移動層Ｂはリン酸
カリウム濃度が０.０２Ｍであること以外は移動層Ａと
同じにした。プラスミノーゲン活性化因子を５０％ 移
動層Ａ／５０％ 移動層Ｂのカラムに充填した。２０％
移動層Ｂの初溶出液組成で分離を行った。１５分後、溶
出液組成を５０％ 移動層Ｂに増大させた後、さらに移
動層Ｂに増大させた。各分画をＨＣｌでｐＨ３に調節し
て、０.００１Ｍ ＨＣｌ／０.００１％ ツウィーン８０
に対して透析し、凍結乾燥した。この分画を２０℃で保
存した。

【０１４２】本発明の方法の有効性を、Jackson等（前
述）が記述した方法に実質的に従ってイヌの血栓症モデ
ルで調べた。全身性のプラスミノーゲン分解および線維
素分解の測定、並びに再灌流および流量維持のインビボ
実験で用いた方法も、Jackson等（前述）によって記述
されている。

【０１４３】イヌの血栓症モデルの血漿試料を、単一鎖
型変種ｍｔ−ＰＡ６および二本鎖型変種ｍｔ−ＰＡ６に
ついて分析した。免疫的に捕捉された変種ｍｔ−ＰＡ６
の鎖組成は、二本鎖型プラスミノーゲン活性化因子が単
一鎖型プラスミノーゲン活性化因子よりも著しく速くＳ
−２２８８（Ｈ−Ｄ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮ
Ａ）を加水分解するという事実に基づいて分析できる。
従って、免疫的に捕捉した変種ｍｔ−ＰＡ６を含有する
プレート（プレート＃１）にＳ−２２８８を添加し、免
疫的に捕捉した変種ｍｔ−ＰＡ６によるＳ−２２８８の
加水分解を測定した。さらに、別のプレート（プレート
＃２）中の免疫的に捕捉したすべての変種ｍｔ−ＰＡ６
を微量のプラスミン試薬で処理することによって、これ
を二本鎖型に変換した。次いでＳ−２２８８をこのプレ
ートに添加し、免疫的に捕捉した二本鎖変種ｍｔ−ＰＡ
６によるＳ−２２８８の加水分解を測定した。プレート
＃１とプレート＃２の間に観測されるＳ−２２８８加水
分解活性の差は、試料中に存在する単一鎖変種ｍｔ−Ｐ
Ａ６の量に比例する。プレート＃１およびプレート＃２
のウェル中に対照標準単一鎖天然ｔ−ＰＡを一連の既知
濃度で加え、対照標準に観測される変化を未知の試料に
関して定量数を付すために用いることによって、定量的
な分析を行った。

【０１４４】希釈試料および希釈標準の検定プレートへ
の添加、すべての検定用試薬の添加、およびプレート洗
浄操作を含むこの検定中のすべての操作を、バイオメッ
ク１０００ラボラトリーワークステーションオートメー
テッドサンプルハンドラー（自動式試料操作機、ベック
マン）を使用して行う。実質的にJackson等（前述）の
方法に従って、イヌの血栓症モデルの血漿試料から変種
ｍｔ−ＰＡ６を免疫的に捕捉した。Ｓ−２２８８基質
（ヘレナラボラトリーズ、＃５２７９）は、３ｍＭの保
存水溶液 １ｍｌを緩衝液（０.５Ｍ Ｔｒｉｓ、０.００
１％ ツウィーン８０、ｐＨ８.８）１５ｍｌと混合する
ことによって調製した。トラシルオール(モーベイケミ
カルコーポレイション）を最終濃度２０ ＫＩＵ／ｍｌ
で加えた。

【０１４５】イヌ血栓症モデルの血漿試料から得た変種
ｍｔ−ＰＡ６が免疫的に捕捉されているプレート（プレ
ート＃１）のウェルに、Ｓ−２２８８基質２００μｌを
添加した。室温における４０５ｎｍの光学密度を、Ｖｍ
ａｘプレートリーダー（モレキュラーデバイスインコー
ポレーテッド、パロアルト、ＣＡ）を用いて測定した。
１〜６ｎｇ／ｍｌの試料１０μｌにつき２０時間の反応
時間が必要である。１００〜１０００ｎｇ／ｍｌの試料
１０μｌは６〜９時間の反応時間が必要である。これら
の測定結果を、カーブフィッティングプログラム ソフ
トマックス（モレキュラーデバイスインコーポレーテッ
ド）によって分析した。

【０１４６】イヌ血栓症モデルの血漿試料から得た変種
ｍｔ−ＰＡ６が免疫的に捕捉されている第２のプレート
（プレート＃２）のウェルに、１０ｎＭ プラスミン溶
液（０.０３Ｍ Ｔｒｉｓ／０.１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ
７.４）２０.１ｍｌ中の２ｍｇ／ｍｌ プラスミン保存
液（アメリカダイアゴノスチカ、＃４１１）１０μｌ）
２００μｌを添加した。プレート＃２を穏やかに混合し
ながら室温で１時間インキュベートした。次いでこのプ
レートをＰＥＴ緩衝液（アメリカンダイアゴノスチカ、
キット番号１２２）で４回洗浄した。Ｓ−２２８８基質
２００μｌをウェルに加えた。上述のように光学密度を
測定し、その結果を分析した。

【０１４７】表１に示すように、変種ｍｔ−ＰＡ６と主
要ｍｔ−ＰＡ６の薬学的性質には顕著な相違がある。主
要ｍｔ−ＰＡ６で処理したイヌは８０％ないし９０％の
血漿線維素原減少を示した。驚くべきことに、変種ｍｔ
−ＰＡ６で処理したイヌは実質的な線維素原減少がはる
かに少なかった。

【０１４８】また表１は、主要ｍｔ−ＰＡ６処理したイ
ヌの血漿プラスミノーゲンレベルが、変種ｍｔ−ＰＡ６
と比較して、より大きく減少したことを示している。こ
のことは、プラスミノーゲンの減少（これはプラスミノ
ーゲンの活性化と、これに続いて起こるα₂−抗プラス
ミンによる不活化を示す）が線維素原分解に先行してお
こるという事実と一致している。変種ｍｔ−ＰＡ６で処
理したイヌはいずれも有意なプラスミノーゲン減少を示
さなかった。

【０１４９】さらにインビボ試験によって、変種ｍｔ−
ＰＡ６で灌流を再開させたイヌでは、主要ｍｔ−ＰＡ６
で処理したイヌよりもより有意に冠状血流が維持される
ことがわかった（表２）。また、変種ｍｔ−ＰＡ６で処
理したイヌにおいて、単一鎖型が主要ｍｔ−ＰＡ６の単
一鎖よりも長い期間存在する（表３）。

【０１５０】

【表１】 全身性のプラスミノーゲン分解および線維素原分解の測定 （０.４５ｍｇ／ｋｇ、ボーラス） イヌ＃ 線維素（ｍｇ／ｍl) プラスミノーゲン 最初 最後 （塩基の率(％)) 変種 6248 3.2 2.7 99 6348 2.9 2.9 98 6345 4.2 2.4 98 6349 3.3 3.1 96 主要 6245 2.9 0.4 76 6347 2.7 0.3 74 6399 2.7 0.3 59 変種＝８５％ 変種、１２％ 主要。 主要＝９２％ 主要、５.５％ 変種。

【０１５１】

【表２】 ｍｔ−ＰＡ６の変種型および主要型のインビボ比較 （０.４５ｍｇ／ｋｇ） イヌ＃ 再灌流までの時間 流量維持 （分） （％前刺激流量） 変種 6345 27 56 6248 13 73 6348 16 59 主要 6245 42 34 6399 8 25 6437 38 21 変種＝８５％ 変種、１２％ 主要。 主要＝９１％ 主要、５.５％ 変種。

【０１５２】

【表３】 単一鎖代謝の測定 （０.４５ｍｇ／ｋｇ、ボーラス） イヌ＃ 単一鎖（％) t=0 t=30 t=60 最後 変種 6248 100 75 65 60 6348 100 80 60 40 6345 100 80 55 45 主要 6245 100 70 15 0 変種＝８５％ 変種、１２％ 主要。 主要＝９２％ 主要、５.５％ 変種。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ｐＬＰ５３の制限地図および機能地図であ
る。

【図２】 ｐＬＰ５３−ＴＬＢの制限地図および機能地
図である。

【図３】 ｐＴＰＡ１０２の制限地図および機能地図で
ある。

【図４】 ｐＴＰＡ１０３の制限地図および機能地図で
ある。

【図５】 ｐＴＰＡ６０２の制限地図および機能地図で
ある。

【図６】 ｐＴＰＡ６０３の制限地図および機能地図で
ある。

【図７】 ｐｈｄの制限地図および機能地図である。

【図８】 ｐｍｔ６−ｈｄの制限地図および機能地図で
ある。

【図９】 ｐＴＬＢ−ｔ６の制限地図および機能地図で
ある。

【図１０】 ｐＢＫｎｅｏ１の制限地図および機能地図
である。

【図１１】 ｐＳＶ２ｃａｔの制限地図および機能地図
である。

【図１２】 ｐＬＰｃａｔの制限地図および機能地図で
ある。

【図１３】 ｐＢＬｃａｔの制限地図および機能地図で
ある。

【図１４】 ｐＳＢＬｃａｔの制限地図および機能地図
である。

【図１５】 ｐＳＢＬ−Ｂｔ６の制限地図および機能地
図である。

【図１６】 ｐＧＴＣの制限地図および機能地図であ
る。

【図１７】 ｐＧＴ−ｔ６Ｂｄの制限地図および機能地
図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 チャールズ・バン・ジャクソン アメリカ合衆国46256インディアナ州イン ディアナポリス、プルマン・コート7433番 (72)発明者 ジェラルド・フロイド・スミス アメリカ合衆国46217インディアナ州イン ディアナポリス、クイーンズウッド・コー ト825番

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 フィンガー、ＥＧＦおよびクリングル１
   ドメインが欠如しているジグリコシル化ｔ−ＰＡ誘導体
   の血栓溶解有効量を投与することによる血栓塞栓障害治
   療法。
2. 【請求項２】 血栓溶解有効量の変種ｍｔ−ＰＡ６を投
   与することによる請求項１の血栓塞栓障害治療法。
3. 【請求項３】 該血栓塞栓障害が、深静脈血栓症、散在
   性の血管内凝固、心臓あるいは抹消動脈起源の塞栓、急
   性心筋梗塞、血栓性発作および浸入性癌に伴う線維素沈
   着からなる群から選択される、請求項１あるいは請求項
   ２の方法。
4. 【請求項４】 フィンガー、ＥＧＦおよびクリングル１
   ドメインが欠如しているジグリコシル化ｔ−ＰＡ誘導体
   の血栓溶解有効量を、医薬的に許容し得る担体と混合し
   て含有する組成物。
5. 【請求項５】 有効量の変種ｍｔ−ＰＡ６を医薬的に許
   容し得る担体と混合して含有する請求項４の組成物。