JPH02219590A - 抗ヒト―テネイシンモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ヒトのフィブロブラストが産生ずるヒト−テ
ネイシンに対するモノクローナル抗体に関する。

（従来の技術） テネイシンは、タイプ■コラーゲンに対するモノクロー
ナル抗体を得ようとした際に偶然にもタイプＶコラーゲ
ンとは異なる特異な染色性を示す抗体の抗原として発見
された糖蛋白質であり、細胞の間質側に発現される物質
である。テネイシンは、細胞外基質成分の一つとして、
様々な生理作用を有することが明らかにされつつある。

すなわち、テネイシンはフィブロネクチンよりも強い赤
血球凝集能を有することから、組織形成の場において、
制御的に作用することが示唆されている（大地ら、生体
の科学、３９巻−８月号、１９８８年）。また、他の分
子との非共有結合的相互作用としては、フィブロネクチ
ンとの相互作用が明らかにされており　（チケットら、
セル、５３巻：３８３−３９０頁、１９８８年）、プロ
テオグリカンとの相互作用も示唆されている（チケット
ら、ジャーナル　オブ　セル　バイオロジー、９８巻＝
１９２６−１９３６頁、１９８４年）。さらには、カル
シウムに依存的な細胞接着活性を有しており（ボートン
ら、ジャーナル　オブ　セル　バイオロジー、１０５巻
：１３８ａ）、また上皮性の癌の発生に伴い間充織側に
誘導され、細胞に対して増殖促進効果を持つことが明ら
かにされる（チケットら、セル、４７巻：１３１−１３
９頁、１９８６年）など、多岐にわたる生理作用を有し
、細胞増殖や形態形成に重要な役割を担っている。

本発明者は、先にヒト−フィブロブラストから純生化学
的手法を用いて高純度のヒト−テネイシンを精製する方
法を開発した。この方法により、極めて純度の高いヒト
−テネイシンを高収量で得ることができるようになり、
ヒト−テネイシンを用いた各種の実験が可能となった。

一方、細胞融合技術は、ケーラーとミルスタイン（ネー
チャー：４９５−４９７頁、１９７５年）により、哺乳
動物の牌細胞とマウス骨髄腫細胞を融合して得たハイブ
リドーマが、単一抗原決定基のみを認識するモノクロー
ナル抗体を産生ずることが報告されて以来、種々の蛋白
質等の生体物質に対するモノクローナル抗体を産生ずる
ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体を生産する試み
がなされている。

高純度のヒト−テネイシンを用いて、ヒト−テネイシン
に特異的に反応するモノクローナル抗体を得ることがで
きれば、上皮癌等の診断が可能になり有用である。

（発明が解決しようとする課題） 従って、本発明の目的は、従来得られなかった高純度の
ヒト−テネイシンを用いて、ヒト−テネイシンに特異的
に反応するモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドー
マ細胞を製造し、かつ該モノクローナル抗体を大量に供
給することにある。

（課題を解決するための手段） 本発明者は、ヒトのフィブロブラストからヒト−テネイ
シンを抽出した後、フィブロネクチンを除去し、さらに
生体高分子用陰イオン交換樹脂を用いて精製することに
より得た高純度のヒト−テネイシンにより免疫したラッ
トの膵臓細胞を用いて細胞融合すると、ヒト−テネイシ
ンに特異的なモノクローナル抗体を産生ずるハイブリド
ーマが得られ、上記課題が解決できることを見出し、本
発明を完成するに至った。

すなわち、本発明はヒト−テネイシンに対して特異的な
モノクローナル抗体及びヒト−テネイシンに対して特異
的なモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマを提
供するものである。

以下、本発明の詳細な説明する。テネイシン精製方法に
用いられるとトーテネイシンの供給源としては、ヒトの
フィブロブラスト細胞の他、ヒトグリオーマ細胞やヒト
グリオーマ細胞等を用いることができる。

ヒトのフィブロブラスト細胞等を用いる場合には、牛胎
児血清等を培養液として、細胞がコンフルエントに達し
た後に、テネイシンを含むタンパク混合物を抽出すれば
よい。

これらの細胞から、常法により細胞表面抽出物を抽出す
ることができる。抽出には、尿素、グアニジン塩酸塩、
グアニジンイソチオシアネート等を用いることができる
が、−船釣には、尿素は、１Ｍ〜８Ｍ、好ましくは２Ｍ
の濃度で用いることができ、グアニジン塩酸塩、グアニ
ジンインチオシアネートは３Ｍ以上の濃度で用いること
ができる。さらに、その他の添加剤、例えばフェニルメ
チルスルホニウムフルオライド（ＰＭＳＦ）等を添加し
て用いることもできる。

ヒトフィブロブラスト細胞を用いる場合には、該細胞の
細胞壁から２Ｍ　尿素／燐酸パフフγ−セーライン（Ｐ
　Ｂ　Ｓ）　／　２　ｍＭ−ＦＭＳ　Ｆ等の抽出液を用
いて抽出すればよい。

その後に、該抽出液から硫酸アンモニウム等を用いてテ
ネイシンを含むタンパク混合物を沈澱させることができ
る。硫酸アンモニウムは、通常６０−８０％として用い
ればよく、４℃で約２時間処理することにより、テネイ
シン、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチ
ンその他の未知タンパクを含むタンパク混合物を沈澱さ
せることができる。

通常、このタンパク混合物には約３００μｇ／−、テネ
イシンに対して約５０倍のフィブロネクチンを含むので
、フィブロネクチンを除去することが必要である。沈澱
させたタンパク混合物を、２Ｍ尿素を含む溶液、好まし
くは４℃の、２Ｍ尿素１０．１５Ｍ塩化ナトリウム１５
０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐｔ１８．０　）に溶解した
後、ゲル濾過法により粗精製することが好ましい。

ゲル濾過に用いる充填剤としては、ゲル濾適用樹脂であ
るセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　ＣＬ　２　Ｂ
。

ＣＬ４Ｂ、ＣＬ６Ｂ　（ファルマシア社製）等を用いる
ことができ、特にセファロース−ＣＬ４Ｂが好ましい。

その他にバイオゲル（Ｂｉｏ−ｇｅｌ）　　５　ｍ。

１５ｍ（バイオ−ラッド社製）や、セファクリル（Ｓｅ
ｐｈａｃｒｙｌ）　　Ｓ　５００．３１０００　　（フ
ァルマシア社製）を用いることもできる。

カラムより溶出するテネイシンは、テネイシン依存の細
胞接着活性により検出することができる（メソーズ　イ
ン　エンザイモロジー、８２巻＝８０３−８３１頁　１
９８２年）。細胞接着性試験に用いることができる細胞
としては、ヒトメラノーマの他、ヒトフィブロブラスト
、ヒト上皮性ガン細胞等を挙げることができる。他の同
定法としては、ニワトリテネイシンに対するポリクロー
ン抗体を用いた、エンザイムーリンクトーイムノアッセ
イ（ＥＬＩＳＡ）法等を用いることもできる。またフィ
ブロネクチンは、フィブロネクチンに対する抗原性を測
定することにより検出できる（アーカイブス　オブ　バ
イオケミストリー　アンドバイオフィジクス：３９９−
４０６頁、１９８１年）。

テネイシンを２０％、好ましくは１０％以上含有する分
画を集めることにより、粗精製テネイシンを得ることが
できる。このようにして得られた粗精製テネイシンには
、通常５０％のフィブロネクチンが含まれるので、通常
の操作により濃縮、透析を行った後；こ、さらにゼラチ
ンゲルによりフィブロネクチンを除去する必要がある。

濃縮操作は、例えばセントリフロー膜（アミコン社製）
を用いて４℃、２５００　Ｘｇで遠心濃縮することが好
ましく、また、透析は０．５Ｍ尿素を含む緩衝液、好ま
しくは０．５Ｍ尿素１０．１５Ｍ塩化ナトリウム１５０
ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７，４）を用いて、４℃で１２時
間行えばよい。

ゼラチンゲルとしては、ゼラチンセファロース（ファル
マシア社製）、イモビライズドゼラチン（ピアース社製
）、ゼラチンアガロース（シグマ社製）等を挙げること
ができ、これらはゼラチンが共有結合されたアフィニテ
ィークロマトグラフィーである。フィブロネクチンに対
する親和性の高い該ゼラチンカラムを用いることにより
、テネイシンは通過画分に溶出され、溶質に対しフィブ
ロネクチンを１重量％以下に除くことができる。

フィブロネクチンは、抗ヒトフィブロネクチンポリクロ
ーン抗体を用いたＥＬ　Ｉ　ＳＡ法で同定することがで
き、またテネイシンも同様にＥＬ　Ｉ　ＳＡ法により同
定可能である。

この様にして得られた分画を、通常の操作により濃縮し
、２Ｍ尿素を含む溶液、好ましくは２Ｍ尿素１５０ｍＭ
）リス塩酸（ｐＨ８，０）に対して透析して、テネイシ
ンを高濃度で含む溶液を得ることができる。

該溶液は通常テネイシン１００μｇ／−を含むが、さら
に生体高分子分離用アニオン型イオン交換樹脂を用いた
精製をす、ることにより、極めて高純度のテネイシンを
得ることができる。

その方法として、該溶液を、例えばＤＥＡＦ　（ジエチ
ルアミノエチル）基を交換基として有するＤＥＡＥ−５
ＰＷカラム（東ソー■製）を用いたイオン交換高速液体
クロマトグラフィーにより精製する方法を挙げることが
できる。さらに、Ｄ［ＥＡＥ−トヨパール６５０（東ソ
ー側製）　、Ｍｏｎｏ−Ｑ　（７フル７シ７社製）、口
ＥＡＥ−ＣＬ６Ｂ　、　ＤＥＡＥ−セファセル（ファル
マシア社製’）　、ＤＥＡＥ−セルロファイン（生化学
工業社製）などのカラムを用いることもできる。これら
のうち、口εＡ　Ｅ　−５Ｐ　ｔ’ｌｉを用いることが
好ましい。

溶出；ご用いる溶媒としては、１〜８Ｍの尿素、好まし
くは２Ｍの尿素中で０〜１Ｍ、好ましくは０〜０．４Ｍ
の塩化す）　ＩＪウムを用いればよい。

ＤＥＡＥ−５ＰＩＩｌカラムを用いたイオン交換高速液
体クロマトグラフィーにおいて、２Ｍ尿素中で０−０．
４Ｍの塩化ナトリウムを直線濃度勾配として溶出する場
合には、通常０．２−０．３Ｍ、好ましくは約０．２．
５Ｍの塩化ナトリウムでテネイシンが溶出される。溶出
されるテネイシンは、紫外吸収や、テネイシンに特異的
な細胞接着性により同定することができる。

この様な精製法により、純度がほぼ１００％のテネイシ
ンを得ることができる。ヒト−テネイシンは、５Ｏ３−
ＰＡＧＥによる分析で、２５０Ｋ及び、２００Ｋにヒト
−テネイシンに特徴的なバンドを明瞭に与えた。上記精
製方法によるテネイシンの収率は、通常８０％以上であ
る。

さらに、培養液中からも３０−３５％、好ましくは３３
．３％の硫酸アンモニウムを用いることにより、粗テネ
イシン分画を得ることができ、前記の操作と全く同一の
方法により精製テネイシンを得ることができる。

この様に精製されたヒト−テネイシンに対して特異的な
モノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマは、たと
えば以下の様にして製造される。

抗原としてヒト−テネイシンを用いて免疫した動物から
抗体産生細胞を精製するには、常法に準じて行えばよく
、抗原であるヒト−テネイシンで動物を免疫し、その動
物の抗体産生細胞を取得する方法によれば良い。用いる
ことの出来る動物としては、マウス、ラット、ウサギ、
モルモット、ヒツジ等をあげることができる。これらの
動物のうち、ラットの場合には、例えばウィスター系ラ
ットを用いることができる。抗体の産生細胞としては、
ｐｍ、リンパ節、末梢血液等より分離した細胞を用いる
ことができるが、膵臓細胞を用いることが好ましい。該
動物を免疫するには、フロイントコンプリードアシュバ
ンドを併用でき、例えば、フロイントコンプリードアシ
ュバンドに上記精製を行ったヒト−テネイシンを混合し
て用いれば良い。ウィスター系のラットを用いて免疫す
る場合には、ヒト−テネイシン２０μｇ（蛋白量）で３
−４回免疫することにより、所望の免疫動物を得ること
ができる。

細胞融合に用いることができる骨髄腫細胞としては、種
々の哺乳動物由来の細胞が利用できる。

この場合、抗体産生細胞の調製に用いた動物と同種の動
物由来の骨髄腫細胞を用いることもできる。

これらの細胞は特定の選択培地では生存できないので、
細胞融合の後に未融合の骨髄腫細胞を培養操作により除
去することができる。例えば、８−アザグアニン抵抗性
の細胞は、ＨＡＴ培地中（ヒポキサンチン−アミノプテ
リン−チミジン培地）で成育できない性質を有するので
、バイプリドーマ細胞を未融合の骨髄腫細胞と分離する
ことが可能である。マウスの骨髄腫細胞をもちいる場合
には、例えばＦＡＩ、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８、Ｐ３Ｘ６３Ａ
ｇ８Ｕ１、Ｐ３ＮＳＩ／ｌＡｇ４１、Ｘ６３Ａｇ８．６
５３、ＳＰ２１０Ａｇ　１４、ＦＯ，Ｓ　１９４１５Ｘ
ＸＯＢＵ１．ＭＰＣ１１４５６ＴＧ１７等を用いること
ができる。

細胞融合は、通常ＭＥＭ培地、Ｉ　Ｍ　Ｅ　Ｍ培地等の
培地を用いて、上記骨髄腫細胞と抗体産生細胞とを混合
することにより行われる。骨髄腫細胞と抗体産生細胞を
１＝１０以下、好ましくは１：５の比率で混合し、好ま
しくは融合促進剤としてポリエチレングリコールを用い
ることにより融合することができる。ポリエチレングリ
コールとしては、平均重合度が１．０００−６．０００
のものを用いることができ、通常３０−５０％として用
いればよい。マウス骨髄腫細胞としてＸ６３Ａｇ８゜６
５３を用いる場合には、平均重合度３．８００のポリエ
チレングリコールを４２．８％としてヒト−テネイシン
抗体産生ラット膵臓細胞と３７℃で１〜３分間反応させ
て融合することにより、所望の融合細胞を得ることがで
きる。さらには、細胞融合方法として知られた他の方法
、例えばエレクトロラニージョン法や、ビオチン−アビ
ジン架橋ト電気パルスを併用する方法等を用いることも
できる。

細胞融合を終えた細胞は、適当な培地で希釈した後、遠
心分離して得ることができる。その後にＨＡＴ培地を用
いて選択的に融合細胞のみを培養することができる。Ｈ
ＡＴ培地にインシユリンを加えたＨＩＡＴ培地等の培地
を用いることもできる。ヒト−テネイシン抗体産生細胞
とマウス骨髄腫細胞を融合してできるハイブリドーマ細
胞は、ＨＡＴ培地を用いて、５％炭酸ガス下で３−７℃
で選択的に培養することができる。ヒト−テネイシンに
対して特異的なモノクローナル抗体を産生ずるハイブリ
ドーマの１例としては、ＨＴＮ２−９８２（微工研菌寄
第１０５４７号、ＦＥＲＭＰ−１０５４７）を挙げるこ
とができる。

（発明の効果） 本発明により、ヒト−テネイシンに対するモノクローナ
ル抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞を得ることができ
、ヒト−テネイシンに対するモノクローナル抗体を高収
量で得ることができた。

以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、
本発明は本実施例により限定されることはない。

（実施例） ヒトフィブロブラスト細胞を、ダルベツコ変法イーグル
培地／ハムＦ１２培地、１０％牛脂児血清を培養液とし
て、ローラーボトル（８５０ｃｎｆ）１００本を用い、
３７℃、１１０ｍ１’／本、１．　ｌ　ｒｐｍで培養し
続け、細胞がコンフルエントに達した後に５日目ごとに
培地を交換した。この培地１００１を４℃に冷却し、硫
酸アンモニウムを３３％飽和となるように加えて静かに
攪拌した後、４℃で１２０分間放置して、ヒト−テネイ
シンの他、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネ
クチン、その他のタンパク質を含むタンパク混合物を沈
澱させた。

該タンパク混合物を４℃で６０分間、２０．０００　Ｘ
ｇで遠心して分離し、上清をデカントして除いた後、沈
澱物を４℃、７５０−の２Ｍ尿素１０．１５Ｍ塩化ナト
リウム１５０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ８，０）に溶解せし
めた。タンパク量は、ＢＣＡプロティンアッセイ　（ピ
アス社製）で３．９ｇであった１該タンパク混合物溶液
２５−を、セファロースＣＬＢＢカラム（ファルマシア
社製、約５００ｍ）にアプライし、２Ｍ尿素１０．１５
Ｍ塩化ナトリウム１５０ｒｎＭ）リス塩酸（ｐＨ８，０
）を用いて、１５℃でテネイシンとフィブロネクチンを
分離溶出させた。

テネイシン依存性の細胞接着活性は、以下に述べる方法
にしたがった。各画分から２００μｍの試料を、ＢＬＩ
ＳＡプレー）（Ｌｉｂｒｏ、　７６−２０３−０５、Ｔ
ｉｔｅｒｔｅｋ社製）のウェルに入れ、さらに各ウェル
に２０μ１０５０ｍＭ　　炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
９，６）を入れ、４℃で１２時間コートした。その後ウ
ェルをＰＢＳｌｏ、５％−ＢＳＡで３回洗った後、抗フ
ィブロネクチン抗体（Ｃａｐｐｅ１社製、ＰＢＳｌｏ、
５％−ＢＳＡ中５％）２００μｌを加え、３７℃で２時
間保温し、その後各ウェルをＰＢＳｌｏ、５％−ＢＳＡ
で洗った。一方、ヒトフィブロブラスト細胞をコンフル
エントになるまで、ダルベツコ変法イーグル培地／ハム
Ｆ１２培地、１０％牛脂児血清中で維持し、［ｌ：ＤＴ
Ａを含まないトリプシン（タイプ■、シグマ社製、Ｏ，
１ｍｇ／−）溶液で３７℃、１時間保温して細胞をはが
し、ｌＸｌ０’セル／ｍ１（ＰＢＳ／ソイビーン　トリ
プシン　インヒビター０．５　ｍｇ、シグマ社）に細胞
溶液を調製した。この細胞溶液をミクロタイタープレー
トのウェルに１００μβずつ加え３７℃で１時間保温し
た。ついで、プレートをＰＢＳｌｏ、５％−ＢＳＡで１
回洗い、プレートに接着した細胞を３％のパラホルムア
ルデヒドで固定し、１％−トルイジンブルー（メルク社
製）／３％−バラホルムアルデヒドで染色して、接着し
た細胞数を顕微鏡下で観測した。

フィブロネクチンはフィブロネクチンに対する抗原性を
測定することにより、以下の方法を用いて検出した。各
画分から２０μｌの試料を取り、ＥＬＩＳＡプレート（
３９１２ファルコン社製）のウェルに移し、５０ｍＭの
炭酸ナトリウム緩衝液（ｐｉ（９，６）　１８０μｌを
各ウェルに加えて４℃で１２時間保温し゛た。各ウェル
をＰＢＳｌｏ、５％（Ｗ／Ｗ）−７ウイー：／２０１０
．５％（Ｗ／Ｗ）　　　ＢＳＡを用いて３回洗った後に
、ウサギの抗フィブロネクチン抗体（０，４％、Ｃａｐ
ｐｅ１社製）２００μｊ２を加えス２０℃で１時間保温
した。さらに、抗体溶液をすて、Ｐ　Ｂ　Ｓ　／　０．
５％（１！ｉ／Ｉ’；）−ツウィーン２０１０．５％（
１１／Ｗ）　−Ｂ　Ｓ　Ａで各ウェルを洗い、パーオキ
シダーゼ標識されたヤギの抗ウサギ抗体（０，４％、Ｃ
ａｐｐｅＩａｌｌりを加えて更に１時間反応させた。

ＰＢＳｌｏ、５％（１髪ハ〜）−ツウィーン２０１０．
５％（Ｗ／１１）　−Ｂ　Ｓ　Ａで各ウェルを洗い、オ
ルト−フェニレンジアミン塩酸塩を基質として、パーオ
キシダーゼ活性を４９２μｍの吸収で測定した。

以上の操作を３０回繰り返した。両者の溶出パターンを
第１図に示す。図から明らかなように、テネイシンとフ
ィブロネクチンはセファロースカラムによりやや分離さ
れ、テネイシンは、Ｋｄ値がＯの所に溶出された。フラ
クションＸα２５−Ｎα３０　（各フラクションは５ｒ
ｎｌ）を集めることにより、テネイシンを高濃度で含む
溶液９００−を得た。タンパクの収量は９０．０　ｍｇ
であった。

該溶液をセントリフロー膜（アミコン社製）を用いて、
４℃、２５００Ｘｇで遠心して１００ｍ！！に濃縮した
後、０．５Ｍ尿素１０．１５Ｍ塩化す）　ＩＪウム１５
０ｍＭ）リス塩酸（ｐｔ１７．４）２Ｉ！に対して、４
℃で１２時間透析した。

該溶液１２０ｍｊ！を、ゼラチンカラム（ゼラチンセフ
ァロース、ファルマシア社製、３０ｄ）にアプライし、
フィブロネクチンを特異的に吸着せしめた。テネイシン
は通過画分に溶出され、フィブロネクチンを含まないテ
ネイシン溶液２２０ｍ１ｉ！を得ることができた。

該溶液をセントリフロー膜（アミコン社製）を用いて４
℃、２５００ｘｇで遠心して４０ｍ１に濃縮した後、２
１０２Ｍ尿素１５０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ８，０）を用
いて、４℃で１２時間透析した。

透析後、該溶液を口ＥＡε−５ＰＷ（東ソー０＠製、カ
ラム径７．５Ｍ、カラム長５０ｍｍ）のカラムをもちい
て高速液体クロマトグラフィーにより精製した。

該溶液の１ｍＮをカラムにインジェクトした後、２Ｍの
尿素中Ｑ　−０，４Ｍの塩化ナトリウム直線濃度勾配溶
液を用い、流速０．’５ｍ１７／分、カラム圧１５ｋｇ
　／　ｃｕｔ　、カラム温度１５℃で分離すると、目的
とするテネイシンは、４２分−４５分に２Ｍ尿素１０、
２５　Ｍ塩化ナトリウムで溶出された。テネイシーンは
２８０μｍの吸収、及びテネイシンに特異的な細胞接着
活性により検出した。その結果を第２図及び第３図に示
す。図から明らかな様：こテネイシンはシャープな単一
ピークとして分離された。

ローラーボトル１００本（細胞数的２００×１０”個）
、培地１００１’より総収量６．６　ｍｇのヒト−テネ
イシンを得ることができた。

得られたヒト−テネイシン５μｇを、１％−２−メルカ
プトエタノール／２％−３０３１５０ｍＭトリス塩酸（
ｐＨ６，８）を用いて１００℃で３分間還元した後、４
％−２０％の５ＯＳ−ＰＡＧＥで分析した。

ヒト−テネイシンに特徴的な２５０にと２００にのバン
ドを検出することができた。他にバンドは検出されず、
得られたヒト−テネイシンの純度は、はぼ１００％であ
ることが確認できた。

上記ヒト−テネイシン２０μｇ（１００μりに、１００
μｌのフロイントコンプリードアシュバンド（Ｄｉｆｃ
ｏ社製）を加えて良く攪拌し、エマルジョンになったと
ころで、ウィスター系ラット（雌、４週齢、２匹）のリ
ンパ節に１００μｌずつを注射した。その後さらｊ＝２
週問おきに、同様に調製したヒト−テネイシンーエマル
ジョンを注射して、計４回免疫した。

最終的なヒト−テネイシンに対する抗体価は、以下に示
すＥＬＩＳＡ法で測定した。０．１Ｍｇ／ウェルになる
様にεＬＩＳＡプレー）　（３９１２、ファルコン社製
）にコートし、第４図に示される１次抗体の希釈系列を
作成し反応させビオチン化された２次抗体（１：２５０
、ラビット−抗ラットＩｇＧ。

カペル社製）で１時間反応させたのち、上記の様にプレ
ートを洗い、パーオキシダーゼ−アビジン（１：２５０
、カペル社製）でさらに１時間反応し、プレートを３回
洗った後、各ウェル当たり１５０μ１０２％−オルトー
フェニレンジアミン（シグマ社製）１０．００１％−Ｈ
２Ｏ２で発色させた。

各ウェルに、５０μｌの２　Ｎ−８２ＳＯ，を加えて反
応を止め、４９２　ｎｍの吸収を測定して（ＭＴＰｌｏ
ｏ、コロナ社製）抗体価を測定した。

ラットの膵臓を摘出し、注射針で穴をあけ、リンパ球を
ＲＰ！、１１１６４０培地中に調製し、細胞を３回（１
２００Ｘｇ、８分間）洗った。細胞の収量はラット１匹
あたり２．５Ｘ１０’であった。

一方、ペアレント細胞となるＸ　６３．Ａｇ８．６５３
ミエローマ細胞は、１０ｍｇ／ｊ！の８−アザグアニン
を含むＲＰ？ＪＩ　１６４０　／　１０％−ＦＣＳ中で
１週間維持し、５Ｘ１０’個の細胞を、ＲＰλ１１１６
４０培地中で３回（１２００ｘｇ　、　８分間）洗った
。

該リンパ球とＸ６３Ａｇ８．　６５３　ミｚｏ　−７細
胞を混合し、ＲＰＭＩ　１６４０培地で１回洗った。細
胞融合操作は以下の様に行った。５００μｌの４２．８
％−ポリエチレングリコール（分子量３８００、シグマ
社ｍ）／１５％−ジメチルスルホキシド（シグマ社製）
／ＰＢＳを、３７℃で９０秒間かけて細胞の混合物に静
かに加えた後、さらに６０秒間静置した。反応の停止は
、ＲＰ　’、１１１６４０／１０％−ＦＣ３（３７℃）
を１滴ずつ１分間かけて滴下しく計１ｍ１）、残りの２
４ｒｎ！！を続く２分間で加えることにより行った。

５００Ｘｇで５分間遠心することにより沈澱させた反応
物に、ＲＰ！Ｊｌ　　１６４０／１０％−ＦＣ３／ＨＡ
Ｔを加え、９６大のプレート３０枚（１匹あたり）を用
いて、１ウエルに１００μβずつ接種した。１週間後、
１００μβのＲＰ′：ＡＩ　１６４０　／　１０％−Ｆ
ＣＳ／　ＨＡ　Ｔを各ウェルに加えた。その後、第３８
目、第７８目、第１４日月、第２１８目に各ウェルから
１００μβずつサンプリングし、ハイブリドーマ細胞が
ヒト−テネイシンに対する抗体を産生じているかどうか
をＥＬＩＳＡ法で測定した。１回目の融合では、プレー
トの金穴のうち約１５０個、２回目の融合では同様に約
５００個のヒト−テネイシン陽性のハイブリドーマが得
られた。

そのハイブリドーマのうち、抗体産生能の良好なりロー
ン１４個を選出し、１セル／ウエルとなるように９６穴
のプレートに接種してＨＡＴ培地中でクローニングを行
った。ハイブリドーマ細胞のコロニーが成長した時点で
再びＥＬＩＳＡを行い、抗体を産生ずるクローンをオリ
ジナルクローンあたり２個ずつ選出し、さらに１セル／
ウエルとなるように９６穴のプレートに接種し、ＨＡＴ
培地中でクローニングを行った。上述した様に抗体産生
株をＥＬＩＳＡで固定し、安定なハイブリドーマ細胞（
１４クローン）をＲＰ！、ＩＩ　１６４０　／　１０％
−Ｆ［’Ｓ中での大量培養に移した。一部のクローンに
ついてはヌードマウスに移植し、腹水型の抗体を作成し
た。第１表には、クローンの産生ずる抗体のサブクラス
を、ラフト−イムノグロブリン−サブタイプ−タイピン
グキット（Ｚｙｍｅｔ社製）で決定した結果を示す。尚
、モノクローナル抗体９Ｂ２を産生ずるハイブリドーマ
細胞はＨＴＮ２−９Ｂ２であり、微工研菌寄第１０５４
７号として寄託されており、何人も入手可能である。

第１表 １）　　＋　＋　　　・よく染色される。　　＋　　や
や染色される２）＋＋・・よく染色される。　−・−染
色されないヒト腫瘍に対する免疫染色は以下の方法でお
こなった。

標本として病理解剖された遺体の、ホルマリン固定され
た各種組織のパラフィン包埋切片を、ＶＥＣＴＡＳＴＡ
ＩＮ　ＡＢＣＫＩＴ　（Ｖｅｃｔｏｒ社）のラットＩｇ
Ｇキットを用い、ペルオキシダーゼによる酵素抗体法で
染色し、発色法としてアビジン−ビオチン結合法を用い
て、ＤＡＢにより発色させた。緩衝溶液としては、ＰＢ
Ｓを用いた。

ペルオキシダーゼ等の内因性酵素活性を抑えるために、
メタノール−０，６％Ｈ２０□溶液に３０分間浸し、そ
の後ＰＢＳで５分間、３回洗浄した。また、非特異的；
こ抗体と電気的に結合する組織をブロックするため、ラ
ットで作成した一次抗体に対して、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩ
Ｎ　ＡＢＣＫＩＴ中ノウサギ正常血清を用いてこれをブ
ｄツクした。インキ二ベーター中、室温で３０分間作用
させ、効果を持続させるために洗浄せず；二次の行程に
移った。

ＰＢＳによって１００倍に調整された抗ヒトーテネＡシ
ン抗体（ハイブリドーマ細胞培養液）に、５．５℃で一
晩浸して作用させた。その後ＰＢＳで５分間、３回洗浄
しり。また、ＶＥＣＴＡＳＴＡｌ’ｌｉ　ＡＢＣＫＩＴ
中にある、ビオチン化抗ラット抗体を、室温インキュベ
ーター中で３０分間作用させた後、ＰＢＳｔ’５分間３
回洗浄した。さらｌ、：　、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ＾Ｂ
ＣにＩＴ中のＡＢＣを、室温インキュベーター中で３０
分間作用させた後、ＰＢＳで５分間３回洗浄した。

ＤＡ８５ｍｇ／ＰＢＳ　１０−／３％８２０２２５　μ
ｐの溶液を、室温インキュベーター中で４分間作用させ
た後、直ちにＰＢＳで５分間洗浄した。対比染色のため
へマドキシリン溶液に数十秒浸した後、流水で１０分間
洗浄し、脱水して封入をした。

本発明のモノクローナル抗体８Ｃ９，９Ｂ２゜１３Ｆ６
．２００６は、テネイシン特異的に、ガンの間充織のみ
を染色した。

ウェスタン　ブロッティングは以下の様に評価した。

１００μｇ／−のゼラチン通過粗テネイシン画分（７５
μＪ）に、２５ａｌｌの８％ｗ／ｖｓＤｓ１０、２　Ｍ
　）リス塩酸（ｐＨ６，８）　／　４％ｖ／ｖ　２−メ
ルカプトエタノール１５註 え、７０℃で３０分間加熱して、試料を調製した。

５ＤＳ−ＰＡＧＥは４％〜２０％グラジェントゲル　プ
レート（第一化学）を用いた。２５μｍの試料を電気泳
動（１５ｍＡ４時間）した（ネーチャー．２２７巻：６
８０−８８５頁．１９７０年）。

ウェスタン　ブロッティングは、トウビン（７ｏｗｂｉ
ｎ）らの方法（Ｐｒｏｃ，　Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ　Ｓｃ
ｉ．Ｕ，Ｓ。

Ａ．、７６巻：　４３５０−４３５４頁．１９７９）に
よった。

トランスファースル際に、ニトロセルロース膜テナく、
ニトロプラス膜（マイクロメンブレン社）を使用した。

トランスファー後のアンチゲニックポリペプチドの検出
には、膜を１％ＢＳＡ１５０ｍＭ）リス塩ｅ　（ｐ）１
７．　４　）　／　０．　ｌ　５　Ｍ　ＮａＣ１で洗い
、その後、ＥＬ　Ｉ　ＳＡの方法に準じて一次抗体（モ
ノクローナル抗体）と反応させ、さらに、二次抗体（パ
ーオキシダーゼ標識の抗ラット　ウサギ抗体、ｌ：２５
０）と反応させた。染色は、４−クロロ−１−ナフトー
ル（　１　ｍｇ／　ｍｊ？）　／　０．　１％Ｈ２０。

で行ない、膜を水洗することにより反応を停止した。本
発明のモノクローナル抗体８Ｃ９及び９Ｂ２は高い染色
性を示したが、１３Ｆ６及び２０Ｄ６は染色性を示さな
かった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヒトフィブロブラスト細胞の培養液より得た
ヒト−テネイシンをセファロースＣＬ−４Ｂカラムで分
離溶出させたパターンであり、第２図、第３図は、それ
ぞれゼラチンカラム通過画分を口εＡ　Ｅ　−　５　Ｐ
　を優用いて分離した場合の、高速液体クロマトグラフ
ィーのＵＶ吸収パターン、細胞接着性パターンである。 第４図は細胞融合する前のラット抗ヒト−テネイシン血
清の抗体価を、ＥＬＪＳＡ法で測定した結果であり、第
５図はゼラチンセファロース通過粗テネイシン画分をＤ
ＥＡＥ−５ＰＷに付した溶出画分を、ラット抗ヒト−テ
ネイシン血清に対する抗原性によりＥＬＩ　ＳＡ法で分
析した結果を示す。第４図中、横軸は希釈倍率を示す。 第２図 フラクシヨンＮｏ。 フラクションＮｏ。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト−テネイシンに対して特異的なモノクローナ
   ル抗体。
2. （２）ヒト−テネイシンに対して特異的なモノクローナ
   ル抗体を産生するハイブリドーマ。