JPH0683676B2

JPH0683676B2 - 抗ヒト―テネイシンモノクローナル抗体

Info

Publication number: JPH0683676B2
Application number: JP1039953A
Authority: JP
Inventors: 照好坂倉; 康照大池; 秀樹平岩; 一左哲川勝
Original assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd; RIKEN
Current assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd; RIKEN
Priority date: 1988-09-21
Filing date: 1989-02-20
Publication date: 1994-10-26
Anticipated expiration: 2009-10-26
Also published as: JPH02219590A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、ヒトのフィブロブラストが産生するヒト−テ
ネイシンに対するモノクローナル抗体に関する。

（従来の技術）テネイシンは、タイプＶコラーゲンに対するモノクロー
ナル抗体を得ようとした際に偶然にもタイプＶコラーゲ
ンとは異なる特異な染色性を示す抗体の抗原として発見
された糖蛋白質であり、細胞の間質側に発現される物質
である。テネイシンは、細胞外基質成分の一つとして、
様々な生理作用を有することが明らかにされつつある。
すなわち、テネイシンはフィブロネクチンよりも強い赤
血球凝集能を有することから、組織形成の場において、
制御的に作用することが示唆されている（大池ら、生体
の科学、39巻−８月号、1988年）。また、他の分子との
非共有結合的相互作用としては、フィブロネクチンとの
相互作用が明らかにされており（チケットら、セル、53
巻:383−390頁、1988年）、プロテオグリカンとの相互
作用も示唆されている（チケットら、ジャーナルオブ
セルバイオロジー、98巻:1926−1936頁、1984
年）。さらには、カルシウムに依存的な細胞接着活性を
有しており（ボードンら、ジャーナルオブセルバ
イオロジー、105巻:138a）、また上皮性の癌の発生に伴
い間充織側に誘導され、細胞に対して増殖促進効果を持
つことが明らかにされる（チケットら、セル、47巻:131
−139頁、1986年）など、多岐にわたる生理作用を有
し、細胞増殖や形態形成に重要な役割を担っている。

本発明者は、先にヒト−フィブロブラストから純生化学
的手法を用いて高純度のヒト−テネイシンを精製する方
法を開発した。この方法により、極めて純度の高いヒト
−テネイシンを高収量で得ることができるようになり、
ヒト−テネイシンを用いた各種の実験が可能となった。

一方、細胞融合技術は、ケーラーとミルスタイン（ネー
チャー:495−497頁、1975年）により、哺乳動物の脾細
胞とマウス骨髄腫細胞を融合して得たハイブリドーマ
が、単一抗原決定基のみを認識するモノクローナル抗体
を産生することが報告されて以来、種々の蛋白質等の生
体物質に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマ及びモノクローナル抗体を生産する試みがなされ
ている。

高純度のヒト−テネイシンを用いて、ヒト−テネイシン
に特異的に反応するモノクローナル抗体を得ることがで
きれば、上皮癌等の診断が可能になり有用である。

（発明が解決しようとする課題）従って、本発明の目的は、従来得られなかった高純度の
ヒト−テネイシンを用いて、ヒト−テネイシンに特異的
に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ細胞を製造し、かつ該モノクローナル抗体を大量に供
給することにある。

（課題を解決するための手段）本発明者は、ヒトのフィブロブラストからヒト−テネイ
シンを抽出した後、フィブロネクチンを除去し、さらに
生体高分子用陰イオン交換樹脂を用いて精製することに
より得た高純度のヒト−テネイシンにより免疫したラッ
トの脾臓細胞を用いて細胞融合すると、ヒト−テネイシ
ンに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマが得られ、上記課題が解決できることを見出し、本
発明を完成するに至った。

すなわち、本発明はヒト−テネイシンに対して特異的な
モノクローナル抗体及びヒト−テネイシンに対して特異
的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提
供するものである。

以下、本発明を詳細に説明する。テネイシン精製方法に
用いられるヒト−テネイシンの供給源としては、ヒトの
フィブロブラスト細胞の他、ヒトメラノーマ細胞やヒト
グリオーマ細胞等を用いることができる。

ヒトのフィブロブラスト細胞等を用いる場合には、牛胎
児血清等を培養液として、細胞がコンフルエントに達し
た後に、テネイシンを含むタンパク混合物を抽出すれば
よい。

これらの細胞から、常法により細胞表面抽出物を抽出す
ることができる。抽出には、尿素、グアニジン塩酸塩、
グアニジンイソチオシアネート等を用いることができる
が、一般的には、尿素は、1M〜8M、好ましくは2Mの濃度
で用いることができ、グアニジン塩酸塩、グアニジンイ
ソチオシアネートは3M以上の濃度で用いることができ
る。さらに、その他の添加剤、例えばフェニルメチルス
ルホニウムフルオライド（PMSF）等を添加して用いるこ
ともできる。

ヒトフィブロブラスト細胞を用いる場合には、該細胞の
細胞壁から2M 尿素／燐酸バッファーセーライン（PB
S）/2mM−PMSF等の抽出液を用いて抽出すればよい。

その後に、該抽出液から硫酸アンモニウム等を用いてテ
ネイシンを含むタンパク混合物を沈澱させることができ
る。硫酸アンモニウムは、通常60−80％として用いれば
よく、４℃で約２時間処理することにより、テネイシ
ン、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン
その他の未知タンパクを含むタンパク混合物を沈澱させ
ることができる。

通常、このタンパク混合物には約300μg/ml、テネイシ
ンに対して約50倍のフィブロネクチンを含むので、フィ
ブロネクチンを除去することが必要である。沈澱させた
タンパク混合物を、2M尿素を含む溶液、好ましくは４℃
の、2M尿素/0.15M塩化ナトリウム/50mMトリス塩酸緩衝
液（pH8.0）に溶解した後、ゲル濾過法により粗精製す
ることが好ましい。

ゲル濾過に用いる充填剤としては、ゲル濾過用樹脂であ
るセファロース（Sepharose）CL2B、CL4B、CL6B（ファ
ルマシア社製）等を用いることができ、特にセファロー
ス−CL4Bが好ましい。その他にバイオゲル（Bio−gel）
5m、15m（バイオ−ラッド社製）や、セファクリル（Sep
hacryl）S500、S1000（ファルマシア社製）を用いるこ
ともできる。

カラムより溶出するテネイシンは、テネイシン依存の細
胞接着活性により検出することができる（メソーズイ
ンエンザイモロジー、82巻:803−831頁 1982年）。
細胞接着性試験に用いることができる細胞としては、ヒ
トメラノーマの他、ヒトフィブロブラスト、ヒト上皮性
ガン細胞等を挙げることができる。他の同定法として
は、ニワトリテネイシンに対するポリクローン抗体を用
いた、エンザイム−リンクト−イムノアッセイ（ELIS
A）法等を用いることもできる。またフィブロネクチン
は、フィブロネクチンに対する抗原性を測定することに
より検出できる（アーカイブスオブバイオケミスト
リーアンドバイオフィジクス:399−406頁、1981
年）。

テネイシンを20％、好ましくは10％以上含有する分画を
集めることにより、粗精製テネイシンを得ることができ
る。このようにして得られた粗精製テネイシンには、通
常50％のフィブロネクチンが含まれるので、通常の操作
により濃縮、透析を行った後に、さらにゼラチンゲルに
よりフィブロネクチンを除去する必要がある。

濃縮操作は、例えばセントリフロー膜（アミコン社製）
を用いて４℃、2500×ｇで遠心濃縮することが好まし
く、また、透析は0.5M尿素を含む緩衝液、好ましくは0.
5M尿素/0.15M塩化ナトリウム/50mMトリス塩酸（pH7.4）
を用いて、４℃で12時間行えばよい。

ゼラチンゲルとしては、ゼラチンセファロース（ファル
マシア社製）、イモビライズドゼラチン（ピアース社
製）、ゼラチンアガロース（シグマ社製）等を挙げるこ
とができ、これらはゼラチンが共有結合されたアフィニ
ティークロマトグラフィーである。フィブロネクチンに
対する親和性の高い該ゼラチンカラムを用いることによ
り、テネイシンは通過画分に溶出され、溶質に対しフィ
ブロネクチンを１重量％以下に除くことができる。フィ
ブロネクチンは、抗ヒトフィブロネクチンポリクローン
抗体を用いたELISA法で同定することができ、またテネ
イシンも同様にELISA法により同定可能である。

この様にして得られた分画を、通常の操作により濃縮
し、2M尿素を含む溶液、好ましくは2M尿素/50mMトリス
塩酸（pH8.0）に対して透析して、テネイシンを高濃度
で含む溶液を得ることができる。

該溶液は通常テネイシン100μg/mlを含むが、さらに生
体高分子分離用アニオン型イオン交換樹脂を用いた精製
をすることにより、極めて高純度のテネイシンを得るこ
とができる。

その方法として、該溶液を、例えばDEAE（ジエチルアミ
ノエチル）基を交換基として有するDEAE−5PWカラム
（東ソー（株）製）を用いたイオン交換高速液体クロマ
トグラフィーにより精製する方法を挙げることができ
る。さらに、DEAE−トヨパール650（東ソー（株）
製）、Mono−Ｑ（ファルマシア社製）、DEAE−CL6B、DE
AE−セファセル（ファルマシア社製）、DEAE−セルロフ
ァイン（生化学工業社製）などのカラムを用いることも
できる。これらのうち、DEAE−5PWを用いることが好ま
しい。

溶出に用いる溶媒としては、１〜8Mの尿素、好ましくは
2Mの尿素中で０〜1M、好ましくは０〜0.4Mの塩化ナトリ
ウムを用いればよい。

DEAE−5PWカラムを用いたイオン交換高速液体クロマト
グラフィーにおいて、2M尿素中で０−0.4Mの塩化ナトリ
ウムを直線濃度勾配として溶出する場合には、通常0.2
−0.3M、好ましくは約0.25Mの塩化ナトリウムでテネイ
シンが溶出される。溶出されるテネイシンは、紫外吸収
や、テネイシンに特異的な細胞接着性により同定するこ
とができる。

この様な精製法により、純度がほぼ100％のテネイシン
を得ることができる。ヒト−テネイシンは、SDS−PAGE
による分析で、250K及び、200Kにヒト−テネイシンに特
徴的なバンドを明瞭を与えた。上記精製方法によるテネ
イシンの収率は、通常80％以上である。

さらに、培養液中からも30−35％、好ましくは33.3％の
硫酸アンモニウムを用いることにより、粗テネイシン分
画を得ることができ、前記の操作と全く同一の方法によ
り精製テネイシンを得ることができる。

この様に精製されたヒト−テネイシンに対して特異的な
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、たと
えば以下の様にして製造される。

抗原としてヒト−テネイシンを用いて免疫した動物から
抗体産生細胞を精製するには、常法に準じて行えばよ
く、抗原であるヒト−テネイシンで動物を免疫し、その
動物の抗体産生細胞を取得する方法によれば良い。用い
ることの出来る動物としては、マウス、ラット、ウサ
ギ、モルモット、ヒツジ等をあげることができる。これ
らの動物のうち、ラットの場合には、例えばウィスター
系ラットを用いることができる。抗体の産生細胞として
は、脾臓、リンパ節、末梢血液等より分離した細胞を用
いることができるが、脾臓細胞を用いることが好まし
い。該動物を免疫するには、フロイントコンプリートア
ジュバンドを併用でき、例えば、フロイントコンプリー
トアジュバンドに上記精製を行ったヒト−テネイシンを
混合して用いれば良い。ウィスター系のラットを用いて
免疫する場合には、ヒト−テネイシン20μｇ（蛋白量）
で３−４回免疫することにより、所望の免疫動物を得る
ことができる。

細胞融合に用いることができる骨髄腫細胞としては、種
々の哺乳動物由来の細胞が利用できる。この場合、抗体
産生細胞の調製に用いた動物と同種の動物由来の骨髄腫
細胞を用いることもできる。これらの細胞は特定の選択
培地では生存できないので、細胞融合の後に未融合の骨
髄腫細胞を培養操作により除去することができる。例え
ば、８−アザグアニン抵抗性の細胞は、HAT培地中（ヒ
ポキサンチン−アミノプテリン−チミジン培地）で成育
できない性質を有するので、ハイブリドーマ細胞を未融
合の骨髄腫細胞と分離することが可能である。マウスの
骨髄腫細胞をもちいる場合には、例えばPAI、P3X63Ag
8、P3X63Ag8U1、P3NSI/1Ag41、X63Ag8,653、SP2/0Ag1
4、FO、S194/5XXOBU1、MPC11456TG17等を用いることが
できる。

細胞融合は、通常MEM培地、IMEM培地等の培地を用い
て、上記骨髄腫細胞と抗体産生細胞とを混合することに
より行われる。骨髄腫細胞と抗体産生細胞1:10以下、好
ましくは1:5の比率で混合し、好ましくは融合促進剤と
してポリエチレングリコールを用いることにより融合す
ることができる。ポリエチレングリコールとしては、平
均重合度が1,000−6,000のものを用いることができ、通
常30−50％として用いればよい。マウス骨髄腫細胞とし
てX63Ag8,653を用いる場合には、平均重合度3,800のポ
リエチレングリコールを42.8％としてヒト−テネイシン
抗体産生ラット脾臓細胞と37℃で１〜３分間反応させて
融合することにより、所望の融合細胞を得ることができ
る。さらには、細胞融合方法として知られた他の方法、
例えばエレクトロフュージョン法や、ビオチン−アビジ
ン架橋と電気パルスを併用する方法等を用いることもで
きる。

細胞融合を終えた細胞は、適当な培地で希釈した後、遠
心分離して得ることができる。その後にHAT培地を用い
て選択的に融合細胞のみを培養することができる。HAT
培地にインシュリンを加えたHIAT培地等の培地を用いる
こともできる。ヒト−テネイシン抗体産生細胞とマウス
骨髄腫細胞を融合してできるハイブリドーマ細胞は、HA
T培地を用いて、５％炭酸ガス下で37℃で選択的に培養
することができる。ヒト−テネイシンに対して特異的な
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの１例と
しては、HTN2−9B2（微工研菌寄第10547号、FERMP−105
47）を挙げることができる。

（発明の効果）本発明により、ヒト−テネイシンに対するモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を得ることがで
き、ヒト−テネイシンに対するモノクローナル抗体を高
収量で得ることができた。

以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、
本発明は本実施例により限定されることはない。

（実施例）ヒトフィブロブラスト細胞を、ダルベッコ変法イーグル
培地／ハムF12培地、10％牛胎児血清を培養液として、
ローラーボトル（850cm²）100本を用い、37℃、110ml/
本、1.1rpmで培養し続け、細胞がコンフルエントに達し
た後に５日目ごろに培地を交換した。この培地100を
４℃に冷却し、硫酸アンモニウムを33％飽和となるよう
に加えて静かに撹拌した後、４℃で120分間放置して、
ヒト−テネイシンの他、コラーゲン、プロテオグリカ
ン、フィブロネクチン、その他のタンパク質を含むタン
パク混合物を沈澱させた。

該タンパク混合物を４℃で60分間、20,000×ｇで遠心し
て分離し、上清をデカントして除いた後、沈澱物を４
℃、750mlの2M尿素/0.15M塩化ナトリウム/50mMトリス塩
酸（pH8.0）に溶解せしめた。タンパク量は、BCAプロテ
インアッセイ（ピアス社製）で3.9gであった。

該タンパク混合物溶液25mlを、セファロースCL6Bカラム
（ファルマシア社製、約500ml）にアプライし、2M尿素/
0.15M塩化ナトリウム/50mMトリス塩酸（pH8.0）を用い
て、15℃でテネイシンとフィブロネクチンを分離溶出さ
せた。

テネイシン依存性の細胞接着活性は、以下に述べる方法
にしたがった。各画面から200μの試料をELISAプレー
ト（Libro、76−203−05、Titertek社製）のウェルに入
れ、さらに各ウェルに20μの50mM 炭酸ナトリウム緩
衝液（pH9.6）を入れ、４℃で12時間コートした。その
後ウェルをPBS/0.5％−BSAで３回洗った後、抗フィブロ
ネクチン抗体（Cappel社製、PBS/0.5％−BSA中５％）20
0μを加え、37℃で２時間保温し、その後各ウェルをP
BS/0.5％−BSAで洗った。一方、ヒトフィブロブラスト
細胞をコンフルエントになるまで、ダルベッコ変法イー
グル培地／ハムF12培地、10％牛胎児血清中で維持し、E
DTAを含まないトリプシン（タイプIII、シグマ社製、0.
1mg/ml）溶液で37℃、１時間保温して細胞をはがし、１
×10⁶セル/ml（PBS/ソイビーントリプシンインヒビ
ター0.5mg、シグマ社）に細胞溶液を調製した。この細
胞溶液をミクロタイタープレートのウェルに100μず
つ加え37℃で１時間保温した。ついで、プレートをPBS/
0.5％−BSAで１回洗い、プレートに接着した細胞を３％
のパラホルムアルデヒドで固定し、１％−トルイジンブ
ルー（メルク社製）/3％−パラホルムアルデヒドで染色
して、接着した細胞数を顕微鏡下で観測した。

フィブロネクチンはフィブロネクチンに対する抗原性を
測定することにより、以下の方法を用いて検出した。各
画分から20μの試料を取り、ELISAプレート（3912
ファルコン社製）のウェルに移し、50mMの炭酸ナトリウ
ム緩衝液（pH9.6）180μを各ウェルに加えて４℃で12
時間保温した。各ウェルをPBS/0.5％（W/W）−ツウィー
ン20/0.05％（W/W）−BSAを用いて３回洗った後に、ウ
サギの抗フィブロネクチン抗体（0.4％、Cappel社製）2
00μを加え、20℃で１時間保温した。さらに、抗体溶
液をすて、PBS/0.5％（W/W）−ツウィーン20/0.05％（W
/W）−BSAで各ウェルを洗い、パーオキシダーゼ標識さ
れたヤギの抗ウサギ抗体（0.4％、Cappel社製）を加え
て更に１時間反応させた。PBS/0.5％（W/W）−ツウィー
ン20/0.05％（W/W）−BSAで各ウェルを洗い、オルト−
フェニレンジアミン塩酸塩を基質として、パーオキシダ
ーゼ活性を492nmの吸収で測定した。

以上の操作を30回繰り返した。両者の溶出パターンを第
１図に示す。図から明らかなように、テネイシンとフィ
ブロネクチンはセファロースカラムによりやや分離さ
れ、テネイシンは、Kd値が０の所に溶出された。フラク
ションNo.25−No.30（各フラクションは5ml）を集める
ことにより、テネイシンを高濃度で含む溶液900mlを得
た。タンパクの収量は90.0mgであった。

該溶液をセントリフロー膜（アミコン社製）を用いて、
４℃、2500×ｇで遠心して100mlに濃縮した後、0.5M尿
素/0.15M塩化ナトリウム/50mMトリス塩酸（pH7.4）２
に対して、４℃で12時間透析した。

該溶液120mlを、ゼラチンカラム（ゼラチンセファロー
ス、ファルマシア社製、30ml）にアプライし、フィブロ
ネクチンを特異的に吸着せしめた。テネイシンは通過画
分に溶出され、フィブロネクチンを含まないテネイシン
溶液220mlを得ることができた。

該溶液をセントリフロー膜（アミコン社製）を用いて４
℃、2500×ｇで遠心して40mlに濃縮した後、２の2M尿
素/50mMトリス塩酸（pH8.0）を用いて、４℃で12時間透
析した。

透析後、該溶液をDEAE−5PW（東ソー（株）製、カラム
径7.5mm、カラム長50mm）のカラムをもちいて高速液体
クロマトグラフィーにより精製した。該溶液の1mlをカ
ラムにインジェクトした後、2Mの尿素中０−0.4Mの塩化
ナトリウム直線濃度勾配溶液を用い、流速0.5ml/分、カ
ラム圧15kg/cm²、カラム温度15℃で分離すると、目的と
するテネイシンは、42分−45分に2M尿素/0.25M塩化ナト
リウムで溶出された。テネイシンは280nmの吸収、及び
テネイシンに特異的な細胞接着活性により検出した。そ
の結果を第２図及び第３図に示す。図から明らかな様に
テネイシンはシャープな単一ピークとして分離された。

ローラーボトル100本（細胞数約200×10⁸個）、培地100
より総収量6.6mgのヒト−テネイシンを得ることがで
きた。

得られたヒト−テネイシン５μｇを、１％−２−メルカ
プトエタノール/2％−SDS/50mMトリス塩酸（pH6.8）を
用いて100℃で３分間還元した後、４％−20％のSDS−PA
GEで分析した。ヒト−テネイシンに特徴的な250Kと200K
のバンドを検出することができた。他にバンドは検出さ
れず、得られたヒト−テネイシンの純度は、ほぼ100％
であることが確認できた。

上記ヒト−テネイシン20μｇ（100μ）に、100μの
フロイントコンプリートアジュバンド（Difco社製）を
加えて良く撹拌し、エマルジョンになったところで、ウ
ィスター系ラット（雌、４週齢、２匹）のリンパ節に10
0μずつを注射した。その後さらに２週間おきに、同
様に調製したヒト−テネイシン−エマルジョンを注射し
て、計４回免疫した。

最終的なヒト−テネイシンに対する抗体価は、以下に示
すELISA法で測定した。0.1μg/ウェルになる様にELISA
プレート（3912、ファルコン社製）にコートし、第４図
に示される１次抗体の希釈系列を作成し反応させビオチ
ン化された２次抗体（1:250、ラビット−抗ラットIgG、
カペル社製）で１時間反応させたのち、上記の様にプレ
ートを洗い、パーオキシダーゼ−アビジン（1:250、カ
ペル社製）でさらに１時間反応し、プレートを３回洗っ
た後、各ウェル当たり150μの２％−オルト−フェニ
レンジアミン（シグマ社製）/0.001％−H₂O₂で発色させ
た。各ウェルに、50μの2N−H₂SO₄を加えて反応を止
め、492nmの吸収を測定して（MTP100、コロナ社製）抗
体価を測定した。

ラットの脾臓を摘出し、注射針で穴をあけ、リンパ球を
RPMI 1640培地中に調製し、細胞を３回（1200×ｇ、８
分間）洗った。細胞の収量はラット１匹あたり2.5×10⁸
であった。

一方、ペアレント細胞となるX63Ag8,653ミエローマ細胞
は、10mg/の８−アザグアニンを含むRPMI 1640/10％
−FCS中で１週間維持し、５×10⁷個の細胞を、RPMI 16
40培地中で３回（1200×ｇ、８分間）洗った。

該リンパ球とX63Ag8,653ミエローマ細胞を混合し、RPMI
1640培地で１回洗った。細胞融合操作は以下の様に行
った。500μの42.8％−ポリエチレングリコール（分
子量3800、シグマ社製）/15％−ジメチルスルホキシド
（シグマ社製）/PBSを、37℃で90秒間かけて細胞の混合
物に静かに加えた後、さらに60秒間静置した。反応の停
止は、RPMI 1640/10％−FCS（37℃）を１滴ずつ１分間
かけて滴下し（計1ml）、残りの24mlを続く２分間で加
えることにより行った。

500×ｇで５分間遠心することにより沈澱させた反応物
に、RPMI 1640/10％−FCS/HATを加え、96穴のプレート
30枚（１匹あたり）を用いて、１ウェルに100μずつ
接種した。１週間後、100μのRPMI 1640/10％−FCS/
HATを各ウェルに加えた。その後、第３日目、第７日
目、第14日目、第21日目に各ウェルから100μずつサ
ンプリングし、ハイブリドーマ細胞がヒト−テネイシン
に対する抗体を産生しているかどうかをELISA法で測定
した。１回目の融合では、プレートの全穴のうち約150
個、２回目の融合では同様に約500個のヒト−テネイシ
ン陽性のハイブリドーマが得られた。

そのハイブリドーマのうち、抗体産生能の良好なクロー
ン14個を選出し、１セル／ウェルとなるように96穴のプ
レートに接種してHAT培地中でクローニングを行った。
ハイブリドーマ細胞のコロニーが成長した時点で再びEL
ISAを行い、抗体を産生するクローンをオリジナルクロ
ーンあたり２個ずつ選出し、さらに１セル／ウェルとな
るように96穴のプレートに接種し、HAT培地中でクロー
ニングを行った。上述した様に抗体産生株をELISAで固
定し、安定なハイブリドーマ細胞（14クローン）をRPMI
1640培地/10％−FCS中での大量培養に移した。一部の
クローンについてはヌードマウスに移植し、腹水型の抗
体を作成した。第１表には、クローンの産生する抗体の
サブクラスを、ラット−イムノグロブリン−サブタイプ
−タイピングキット（Zymet社製）で決定した結果を示
す。尚、モノクローナル抗体9B2を産生するハイブリド
ーマ細胞はHTN2−9B2であり、微工研菌寄第10547号とし
て寄託されており、何人も入手可能である。

ヒト腫瘍に対する免疫染色は以下の方法でおこなった。

標本として病理解剖された遺体の、ホルマリン固定され
た各種組織のパラフィン包埋切片を、VECTASTAIN ABC K
IT（Vector社）のラットIgGキットを用い、ペルオキシ
ダーゼによる酵素抗体法で染色し、発色法としてアビジ
ン−ビオチン結合法を用いて、DABにより発色させた。
緩衝溶液としては、PBSを用いた。

ペルオキシダーゼ等の内因性酵素活性を抑えるために、
メタノール−0.6％H₂O₂溶液に30分間浸し、その後PBSで
５分間、３回洗浄した。また、非特異的に抗体と電気的
に結合する組織をブロックするため、ラットで作成した
一次抗体に対して、VECTASTAIN ABC KIT中のウサギ正常
血清を用いてこれをブロックした。インキュベーター
中、室温で30分間作用させ、効果を持続させるために洗
浄せずに次の行程に移った。

PBSによって100倍に調整された抗ヒト−テネイシン抗体
（ハイブリドーマ細胞培養液）に、5.5℃で一晩浸して
作用させた。その後PBSで５分間、３回洗浄した。ま
た、VECTASTAIN ABC KIT中にある、ビオチン化抗ラット
抗体を、室温インキュベーター中で30分間作用させた
後、PBSで５分間３回洗浄した。さらに、VECTASTAIN AB
C KIT中のABCを、室温インキュベーター中で30分間作用
させた後、PBSで５分間３回洗浄した。

DAB5mg/PBS10ml/3％H₂O₂25μの溶液を、室温インキュ
ベーター中で４分間作用させた後、直ちにPBSで５分間
洗浄した。対比染色のためヘマトキシリン溶液に数十秒
浸した後、流水で10分間洗浄し、脱水して封入をした。

本発明のモノクローナル抗体8C9,9B2,13F6,20D6は、テ
ネイシン特異的に、ガンの間充織のみを染色した。

ウエスタンブロッティングは以下の様に評価した。

100μg/mlのゼラチン通過粗テネイシン画分（75μ）
に、25μの８％w/vSDS/0.2Mトリス塩酸（pH6.8）/4％
v/v2−メルカプトエタノール/50％v/vグリセロールを加
え、70℃で30分間加熱して、試料を調製した。

SDS−PAGEは４％〜20％グラジエントゲルプレート
（第一化学）を用いた。25μの試料を電気泳動（15mA
４時間）した（ネーチャー,227巻:680−685頁,1970
年）。

ウエスタンブロッティングは、トウビン（Towbin）ら
の方法（Proc.Natl.Acad Sci.U.S.A.,76巻:4350−4354
頁,1979）によった。トランスファーする際に、ニトロ
セルロース膜でなく、ニトロプラス膜（マイクロメンブ
レン社）を使用した。トランスファー後のアンチゲニッ
クポリペプチドの検出には、膜を１％BSA/50mMトリス塩
酸（pH7.4）/0.15M NaClで洗い、その後、ELISAの方法
に準じて一次抗体（モノクローナル抗体）と反応させ、
さらに、二次抗体（パーオキシダーゼ標識の抗ラット
ウサギ抗体、1:250）と反応させた。染色は、４−クロ
ロ−１−ナフトール（1mg/ml）/0.1％H₂O₂で行ない、膜
を水洗することにより反応を停止した。本発明のモノク
ローナル抗体8C9及び9B2は高い染色性を示したが、13F6
及び20D6は染色性を示さなかった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヒトフィブロブラスト細胞の培養液より得た
ヒト−テネイシンをセファロースCL−4Bカラムで分離溶
出させたパターンであり、第２図、第３図は、それぞれ
ゼラチンカラム通過画分をDEAE−5PWを用いて分離した
場合の、高速液体クロマトグラフィーのUV吸収パター
ン、細胞接着性パターンである。第４図は細胞融合する
前のラット抗ヒト−テネイシン血清の抗体価を、ELISA
法で測定した結果であり、第５図はゼラチンセファロー
ス通過粗テネイシン画分をDEAE−5PWに付した溶出画分
を、ラット抗ヒト−テネイシン血清に対する抗原性によ
りELISA法で分析した結果を示す。第４図中、横軸は希
釈倍率を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｖ 8310−2Ｊ 33/574 Ａ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 8310−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）微生物の受託番号ＦＥＲＭＰ−１０５４７審査前置に係属中 (72)発明者坂倉照好茨城県つくば市高野台３丁目１番１理化学研究所ライフサイエンス筑波研究センター内 (72)発明者大池康照茨城県つくば市高野台３丁目１番１理化学研究所ライフサイエンス筑波研究センター内 (72)発明者平岩秀樹茨城県つくば市高野台３丁目１番１理化学研究所ライフサイエンス筑波研究センター内 (72)発明者川勝一左哲茨城県つくば市高野台３丁目１番１理化学研究所ライフサイエンス筑波研究センター内 (56)参考文献ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣａｌｌＢｉｏｌｏｇｙ，105（４ｐａｒｔ２），138ａ（1987) 生体の科学，39（４），303−305 （1988) Ｃｅｌｌ，53（３），383−390（1988)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ホリマリン固定パラフィン包埋した組織に
おけるヒト−テネイシンに対して反応するモノクロナー
ル抗体。
【請求項２】哺乳動物由来の抗体産生細胞と哺乳動物由
来の骨髄腫細胞とを細胞融合することにより得られ、か
つホリマリン固定パラフィン包埋した組織におけるヒト
−テネイシンに対して反応するモノクロナール抗体を産
生するハイブリドーマ。