ES2255202T3

ES2255202T3 - Anticuerpos monoclonales contra antigenos asociados a tumores, procedimiento para su preparacion, asi como su uso.

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Publication number: ES2255202T3
Application number: ES99103484T
Authority: ES
Inventors: Klaus Dr. Bosslet; Bernhard Dr. Auerbach; Helmut Dr. Peters
Original assignee: Dade Behring Marburg GmbH
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1990-02-22
Filing date: 1991-02-22
Publication date: 2006-06-16
Anticipated expiration: 2011-02-22
Also published as: DE59109270D1; AU2029295A; EP0955361B1; JP3174778B2; JP3074193B2; AU661653B2; AU7125491A; USRE37596E1; JP2000249710A; DE4005630A1; EP0955361A1; EP0443599A2; CA2036814C; US5639622A; DE59109156D1; EP0443599B1; ATE185196T1; JPH0530990A; ATE316135T1; AU677120B2

Abstract

LA INVENCION TRATA DE ANTICUERPOS MONOCLONALES (MAK) Y SUS FRAGMENTOS, QUE SE UNEN A ANTIGENOS DEFINIDOS ASOCIADOS A TUMORES PRINCIPALMENTE DE CARCINOMA DE PULMON DE CELULAS PEQUEÑAS (SCLC), DE MELANOMAS, DE NEUROBLASTOMAS Y DE OTROS TUMORES DE ORIGEN NEUROECTODERMICO; HIBRIDOMAS PARA SU PREPARACION, ASI COMO LOS ANTIGENOS DEFINIBLES Y/O AISLABLES CON AYUDA DE ESTOS ANTICUERPOS O FRAGMENTOS DE ANTICUERPOS. LOS ANTICUERPOS, FRAGMENTOS DE ANTICUERPOS Y ANTIGENOS SE PUEDEN UTILIZAR COMO DIAGNOSTICO, PRINCIPIO ACTIVO O SOPORTE DE PRINCIPIO ACTIVO.

Description

Anticuerpos monoclonales contra antígenos asociados a tumores, procedimiento para su preparación, así como su uso.

La invención se refiere a anticuerpos monoclonales (AcMo), y a sus fragmentos, que se fijan a antígenos definidos asociados a tumores, en particular de carcinoma pulmonar microcístico (siglas inglesas SCLC), melanoma, neuroblastoma y otros tumores de origen neuroectodérmico, a células de hibridoma, a su preparación, y a antígenos definibles y/o aislables con ayuda de estos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo. Los anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y antígenos pueden ser empleados como agentes de diagnóstico, sustancias activas, o vehículos de sustancias
activas.

La identificación, caracterización y terapia de tumores se encuentran entre los campos más importantes del diagnóstico y de la terapia. Gracias a la posibilidad de producir anticuerpos monoclonales de alta especificidad, la investigación en este campo ha hecho grandes avances. Se ha revelado especialmente importante en este caso la identificación de los denominados marcadores tumorales. Se entienden por marcadores tumorales productos de la célula tumoral, por ejemplo antígenos asociados a tumores, pero también sustancias que son formadas por tejidos sanos como reacción del organismo al crecimiento maligno. Son marcadores tumorales conocidos, por ejemplo, el CEA, el AFP, y también antígenos tumorales definidos mediante anticuerpos monoclonales, tales como el CA 19-9 o el CA 125.

El principal campo de uso de los marcadores tumorales en el diagnóstico in vitro consiste en la terapia y en el control del curso clínico en pacientes cancerosos. También se pueden emplear determinados marcadores tumorales para el diagnóstico diferencial o para el análisis discriminante rápido de grupos de riesgo.

Se han iniciado ya diversos intentos para identificar el carcinoma bronquial microcístico (siglas inglesas SCLC). Es conocido, por ejemplo, que tumores malignos de origen neuroectodérmico tales como, por ejemplo, el carcinoma bronquial microcístico o el neuroblastoma, producen acrecentadamente enolasa específica de neuronas (siglas inglesas NSE), una isoenzima de la enolasa (EC 4.2.1.11), apareciendo en concentraciones elevadas en el suero de pacientes con tumores.

No obstante, se ha evidenciado que una parte de los pacientes que padecen los tumores antes mencionados son clasificados como falsos negativos. Al contener los glóbulos rojos, y también los trombocitos, grandes cantidades de NSE, se da además el caso de que a causa de su lisis se miden niveles falsamente elevados de NSE en el suero o en el plasma, que dan valores falsamente positivos (Pahlman y otros, Tumour Biology 5: 127 - 139, 1984).

Es conocido a partir de la solicitud de patente EP 0 323 802 un anticuerpo monoclonal contra un antígeno de la superficie celular de carcinomas pulmonares. Sin embargo, se sabe a partir del artículo de MAIER y otros (Br. J. Cancer, 1989, 59, 692 - 695), que el anticuerpo SWA 20 utilizado en la EP 0 323 802 reconoce un epítope (agregado 5) que muestra una reacción de mediana a fuertemente positiva sólo en 45% de las muestras de SCLC ensayadas.

Es deseable, por tanto, producir otro marcador tumoral, independiente de la NSE y específico para el neuroblastoma o para el carcinoma pulmonar microcístico.

De acuerdo con la invención, se proponen ahora anticuerpos monoclonales contra un antígeno asociado a tumor, procediendo el antígeno de tumores principalmente del grupo de los tumores neuroectodérmicos tales como, por ejemplo, el carcinoma pulmonar microcístico (SCLC), el melanoma y el neuroblastoma, y del sobrenadante de cultivo de líneas celulares procedentes de estos tumores, en especial antígenos procedentes de líneas celulares de SCLC que en una SDS-PAGE no reductora presentan un peso molecular de 170 \pm 10 kDa, 140 \pm 10 kDa, 105 \pm 10 kDa,
67 \pm 10 kDa y 50 \pm 10 kDa, o procediendo el antígeno de fluidos corporales de pacientes con tumores, en especial antígenos procedentes del suero de pacientes de SCLC que en una SDS-PAGE no reductora presentan pesos moleculares de 220-260 kDa y de 160-200 kDa. Estas bandas se detectan con el AcMo BW SCLC-1 en la tinción tipo Western, y se encuentran en 5 de 5 pacientes cancerosos con SCLC. En 2 de 4 sueros normales no se observó ninguna banda, y en otros 2 se encontraron bandas muy débiles en la misma posición que en los sueros cancerosos.

Los anticuerpos monoclonales conformes a la invención se fijan al mismo epítope que el anticuerpo de referencia AcMo BW SCLC-1.

Son especialmente preferidos los anticuerpos monoclonales producidos por la línea de células de hibridoma BW SCLC-1.

La invención se refiere además a la línea de de células de hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal conformes a la invención, es decir, la línea celular de hibridoma BW SCLC-1 (depósito número 90 022 110 en la ECACC).

También se entienden por anticuerpos monoclonales, en el sentido de esta invención, fragmentos de anticuerpos tales como, por ejemplo, Fab y F(ab)_{2}, y derivados.

Las líneas celulares de hibridoma BW SCLC-1 y 2, que producen los anticuerpos monoclonales AcMo BW SCLC-1 y AcMo BW SCLC-2, fueron depositadas el 21 de febrero de 1990 en la European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) (colección europea de cultivos celulares animales) con los números 90 022 110 y 90 022 109, respectivamente.

Los anticuerpos monoclonales pueden ser obtenidos según procedimientos en sí conocidos para el técnico, empleándose preferentemente para la inmunización antígenos procedentes del sobrenadante de líneas celulares de SCLC que en una SDS-PAG no reductora presentan un peso molecular de 170 \pm 10 kDa, 140 \pm 10 kDa, 105 \pm 10 kDa,
67 \pm 10 kDa ó 50 \pm 10 kDa. La invención se refiere también a antígenos que pueden ser fijados por inmunoadsorción a un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1.

Se entienden por inmunoadsorción, en el sentido de la invención, procedimientos de aislamiento en sí conocidos para el técnico, en los cuales al menos un paso de purificación se basa en una reacción inmunoquímica con uno de los anticuerpos de acuerdo con la invención según la reivindicación 1, y preferentemente según la reivindicación 2. La separación del complejo Ak-Ag se puede efectuar en este caso de manera en sí conocida para un técnico, por ejemplo por fijación del anticuerpo a una fase sólida.

La invención se refiere también al uso de un antígeno de acuerdo con la invención para producir una respuesta inmunológica en animales mamíferos, entre los que se incluye expresamente el ser humano.

La invención se refiere también al uso de los anticuerpos y/o antígenos de acuerdo con la invención en el diagnóstico y/o la terapia.

Preferentemente, en el diagnóstico se emplean anticuerpos en métodos de detección inmunoquímicos heterogéneos u homogéneos en sí conocidos para el técnico, prefiriéndose en el caso de los procedimientos homogéneos la nefelometría o turbidimetría reforzadas mediante partículas. Entre los inmunoensayos heterogénos se prefiere el ensayo en emparedado fijado a fase sólida, en el cual la fase sólida es preferentemente un tubito de poliestireno, una partícula de látex, una partícula magnetizable, o una fase sólida de forma plana.

Se prefiere un procedimiento de diagnóstico para detectar un antígeno asociado a tumor, en el cual se emplee, como participante específico en la fijación, un anticuerpo de acuerdo con la invención.

Los anticuerpos y antígenos de acuerdo con la invención pueden emplearse también en biosensores. Los biosensores son en sí conocidos para el técnico. Se prefiere especialmente un procedimiento en el cual se emplea un segundo participante específico en la fijación tal como, por ejemplo, un anticuerpo, una lectina o un receptor.

Es muy especialmente preferido en este caso un procedimiento en el cual el segundo participante específico en la fijación reconoce específicamente ácido siálico, poli(ácido siálico) o ácido N-acetil-neuramínico con enlace \alpha(2-8).

Para la detección y la cuantificación, uno de los participantes específicos en la fijación puede llevar una marca detectable. Estas marcas son en sí conocidas para el técnico, y pueden ser, por ejemplo, un cromóforo, un luminóforo, un fluoróforo, una enzima, un isótopo radiactivo o una partícula, tanto coloreada como incolora.

Se prefiere un procedimiento en el cual el participante específico en la fijación no marcado ha sido unido a una fase sólida mediante procedimientos en sí conocidos para el técnico, directa o indirectamente, por ejemplo a través de otro anticuerpo o bien a través de un puente de biotina-avidina.

Se prefieren, además, las formas de realización descritas en los Ejemplos.

A causa de su fijación inmunohistoquímica a tejidos humanos normales y a tumores, se pueden clasificar los AcMo BW SCLC-1 y -2 como conjunto 1 de AcMo para SCLC (Souhami y otros, LANCET, 8 de agosto de 1987, páginas 325 - 326). Este agregado contiene AcMo que se fijan de manera óptima a carcinomas pulmonares microcísticos. Además, estos AcMo se fijan a tejidos neurales, a neuroblastomas, y a algunos melanomas.

Patel y otros (Int. J. Cancer 44: 573 - 578, 1989) han demostrado que este conjunto 1 de AcMo reconoce N-CAM, y en concreto principalmente las isoformas de 140 y de 180 kDa (Patel y otros, Int. J. Cancer 44: 573 - 578, 1989). No se había descrito hasta la fecha que la N-CAM y en especial las isoformas de 160 - 180, 130 - 150, 95 - 115, 57 - 77 y
40 - 60 kDa (sobrenadante de cultivo) y las de 220 - 260 kDa y de 160 a 200 kDa (suero) fueran segregadas activamente por células tumorales y pudiesen utilizarse por tanto como marcadores tumorales. Puesto que la N-CAM es detectable también en el tejido nervioso, muscular, y renal, entre otros (Roth y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2999 - 3003, 1988; Roth y otros, Virchows Archiv B 56, 95 - 102, 1998), se puede esperar que también en otros procesos morbosos, en especial en los que afecten a estos tejidos, se puedan producir variaciones de la concentración de N-CAM en los fluidos corporales de los pacientes, de manera que la N-CAM puede servir como marcador diagnóstico también para estas enfermedades.

La especificidad de los AcMo BW SCLC-1 y -2 se puede aprovechar no sólo para una diferenciación inmunohistoquímica entre distintos tejidos tumorales y los tejidos normales, sino que, sorprendentemente, se ha demostrado que una combinación de un AcMo anti-N-CAM como anticuerpo en fase sólida reconoce el ácido N-acetil-neuramínico con enlace \alpha(2-8) (Finne y otros, J. Immunol. 138: 4402 - 4407, 1987; Häyrinen y otros, Molecular Immunology 26: 523 - 529, 1989), siendo especialmente adecuados los AcMo BW SCLC-1 y -2, como anticuerpos conjugados, para desarrollar un inmunoensayo con marcador tumoral. Con este ensayo se ha detectado que los antígenos reconocidos se encuentran en el suero o plasma de pacientes con SCLC o neuroblastoma frecuentemente en una concentración claramente elevada frente al suero o plasma de personas testigo sanas. De ello se puede deducir una buena sensibilidad del ensayo hacia los tumores mencionados.

También se pueden marcar radiactivamente los anticuerpos BW SCLC-1 y -2, o sus fragmentos, por procedimientos conocidos para el técnico, con el fin de emplearlos para la inmunoescintilografía o también para la inmunoterapia. Estos anticuerpos monoclonales se pueden utilizar además como vehículos para sustancias activas, por ejemplo para toxinas celulares, y para la terapia de enfermedades malignas. También es técnicamente posible la producción de construcciones de anticuerpos, por ejemplo mediante el uso de regiones hipervariables en un esqueleto de AcMo humano, tras el análisis de la secuencia nucleotídica completa del gen V de los AcMo SCLC-1 y -2 (Jones y otros, Nature 321: 522 - 525, 1986; Verhoeyen y otros, Science 239: 1534 - 1536, 1988).

Los antígenos de acuerdo con la invención pueden emplearse también para preparar una vacuna activa, o bien se pueden emplear anticuerpos adecuados para preparar una vacuna pasiva.

Los siguientes Ejemplos sirven para ilustrar la invención, sin limitarla en modo alguno.

Ejemplo 1 Producción de los anticuerpos monoclonales BW SCLC-1 y -2

Se utilizaron como inmunógenos las líneas celulares de carcinoma pulmonar microcístico GOT y MR 22. Su cultivo in vitro se llevó a cabo como cultivo en suspensión en medio básico (DMEM) al que se había añadido 10% de suero bovino. Se inmunizaron ratones Balb/c con células lavadas 3 veces en solución salina (PBS) de acuerdo con el siguiente esquema:

Día de inyección	Número de células por ratón	Vía	Coadyuvante	Tipo celular

0	1,5 x 10^{7}	s.c.	CFA	MR 22
7	1 x 10^{7}	s.c.	CFA	GOT
14	1 x 10^{7}	s.c.	IFA	MR 22
21	1 x 10^{7}	s.c.	IFA	GOT
28	1 x 10^{7}	s.c.	IFA	MR 22
32	2 x 10^{6}	i.v.	PBS	GOT
33	2 x 10^{6}	i.v.	PBS	MR 22

\hskip1cm (abreviaturas: \hskip0,5cm CFA = coadyuvante de Freund completo,
\hskip3,55cm IFA = coadyuvante de Freund incompleto,
\hskip3,55cm s.c. = subcutánea
\hskip3,55cm i.v. = intravenosa)

El día 35 se extirparon los bazos de los ratones así inmunizados, y se fusionaron en una relación de 6 : 1 (células de bazo respecto a células de mieloma) con la línea de mieloma SP-2 (Shulman y otros, Nature 276: 269, 1978) según la técnica descrita por Köhler y Milstein (Köhler y Milstein, Nature 256: 495, 1975).

Los híbridos que maduraron en el período de 8 - 28 días fueron analizados mediante análisis fluorocitométrico para averiguar si segregaban AcMos que se fijasen a las líneas celulares GOT y MR 22 de SCLC. Se clonaron 3 veces, mediante la técnica de dilución limitada, los híbridos positivos, y se sometieron a distintos procedimientos inmunológicos de ensayo a los AcMos producidos por estos subclones. Se congelaron en nitrógeno líquido los híbridos que, según estos ensayos inmunológicos, segregaban anticuerpos monoclonales interesantes, y se depositaron en la ECACC bajo las denominaciones BW SCLC-1 y BW SCLC-2, con los números de depósito 90 022 110 y 90 022 109, respectivamente. Los anticuerpos monoclonales segregados por estos híbridos se denominan AcMo BW
SCLC-1 y AcMo BW SCLC-2.

Ejemplo 2 Caracterización inmunohistoquímica de la especificidad de los AcMo BW SCLC-1 y AcMo BW SCLC-2

Por medio de la técnica APAAP (Cordell y otros, J. Histochem. Cytochem. 32: 219, 1984) se determinó la expresión del epítope, que fue reconocido por ambos AcMos, en tejidos normales y en tumores humanos crioconservados. De ello se dedujo que la expresión está limitada a tumores de origen neuroectodérmico, es decir, más de 80% de los tumores pulmonares microcísticos (Figura 1), neuroblastomas y tumores cerebrales fueron claramente positivos (Tabla 1), junto con una gran parte de los melanomas. La mayoría de otros tumores no derivados del neuroectodermo resultaron negativos (véase la Tabla 1). En la Tabla 2 se resumen las reacciones del AcMo BW SCLC-1 con tejidos humanos normales crioconservados. El AcMo BW SCLC-2 muestra un patrón de reacción comparable. Solamente su fijación a la médula ósea es mucho más pronunciada.

Ejemplo 3 Caracterización de los antígenos y epítopes reconocidos por los AcMo BW SCLC-1 y AcMo BW SCLC-2

Se purificó el AcMo BW SCLC-1 mediante cromatografía de afinidad con proteína A, y se fijó a Sepharose activada con CN-Br del mismo modo que el AcMo 735 dirigido contra ácido N-acetil-neuramínico con enlace \alpha(2-8) (Ey y otros, Inmunochemistry 15: 429, 1978; Pharmacia Fine Chemicals, Affinity Chromatography, Principles and Methods, páginas 15 - 18, 1979).

Se bombearon medios de cultivo celular en los cuales se había cultivado la línea celular GOT a través de la columna de Sepharose activada con CN-Br y cargada con AcMo BW SCLC-1, y se eluyó a pH 2,5 el material antigénico específicamente fijado a pH 7. El eluato así obtenido fue separado mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (siglas inglesas SDS-PAGE) tanto en condiciones reductoras como en condiciones no reductoras, y a continuación se sometió a una tinción con plata según procedimientos conocidos para el técnico o bien se transfirió a nitrocelulosa (tinción tipo Western) y se investigó inmunoquímicamente la presencia de antígenos con especificidad hacia AcMo BW SCLC-1 ó -2, u otros AcMos.

Así se hicieron las siguientes observaciones:

a) Tanto los antígenos reconocidos por el AcMo BW SCLC-1 como los reconocidos por el AcMo BW SCLC-2 están presentes en el sobrenadante de líneas celulares de carcinoma pulmonar microcístico positivo respecto al epítope.

b) El peso molecular de los antígenos se sitúa, en una SDS-PAGE no reductora, en 170 \pm 10 kDa, 140 \pm 10 kDa, 105 \pm 10 kDa, 67 \pm 10 kDa y 50 \pm 10 kDa. La anchura de las bandas denota glicoproteínas. En condiciones reductoras los antígenos ya no son reconocidos por el AcMo BW SCLC-1 ni por el AcMo BW SCLC-2.

Tras la tinción inmunológica de la transferencia tipo Western con el AcMo BW SCLC-1 sólo se pueden detectar los antígenos con un peso molecular de 170 \pm 10 kDa, 140 \pm 10 kDa, y 105 \pm 10 kDa.

c) Tras el tratamiento de los antígenos con neuraminidasa de Vibrio cholerae (0,1 U/ml durante 12 horas a 37°C) o bien tras el tratamiento con NaIO_{4} (1 mM; 1 hora, 25°C), ambos AcMo seguían en condiciones de fijar el antígeno. Estos hallazgos indican que los epítopes definidos por los AcMo BW SCLC-1 y -2 constituyen epítopes proteicos sobre los antígenos glicoproteicos.

Estos hallazgos se confirman por el hecho de que los epítopes son destruidos por tratamiento con proteasas (Pronase P, 0,1 mg/ml; 72 horas, 37°C).

d) Dos AcMo contra N-CAM (molécula de adhesión neural) empleados como comparación (Kibbelaar y otros, Journal of Pathology, 159: 23 - 28, 1989) mostraron ambos una fijación a los antígenos de 170 \pm 10 kDa, 140 \pm
10 kDa, y 105 \pm 10 kDa. El AcMo 735 está dirigido hacia ácido N-acetil-neuramínico con enlace \alpha(2-8). Se ha de admitir que en el caso de las bandas de glicoproteína de 105 \pm 10 kDa, más pequeñas y que se tiñen de manera preferencial, se trata probablemente de las más pequeñas de las 3 iso-formas de la N-CAM, que a concentraciones superiores son detectables junto a las iso-formas de mayor tamaño de la N-CAM en sobrenadantes de líneas celulares de carcinoma pulmonar microcístico. Se ha determinado la constante de afinidad del AcMo BW SCLC-1 en un ensayo de fijación a células, en 3 líneas de células de glioma humano diferentes, y se sitúa en torno a 1 x 10^{10} M^{-1}.

e) Mediante cromatografía de afinidad con el AcMo BW SCLC-1, y tras SDS-PAGE en condiciones no reductoras, se han identificado en la tinción tipo Western, a partir de sueros de pacientes con SCLC, dos antígenos con un peso molecular de 70 - 80 y 90 - 120 kDa, que probablemente son iso-formas de la N-CAM. Además, a partir de sueros de pacientes con SCLC, y mediante cromatografía de afinidad con el antígeno AcMo 735-Sepahrose, se han aislado antígenos que presentan en una SDS-PAGE en condiciones no reductoras, un peso molecular de 220 - 260 kDa y 160 - 200 kDa, y que se pueden teñir inmunoquímicamente con el AcMo BW SCLC-1 en la tinción tipo Western. En el suero de donantes de sangre sanos no se han podido detectar estos antígenos, o bien se han detectado sólo en cantidades muy pequeñas, en las mismas condiciones experimentales.

A continuación se midió, por medio de un radioinmunoensayo (siglas inglesas RIA) la fijación del AcMo BW SCLC-1 marcado con I-125 a dos líneas, cultivadas in vitro, de células de melanoma y de células de neuroblastoma, respectivamente. Se ha comprobado que a 37°C el AcMo se fijó muy rápidamente (1 - 5 minutos) a líneas celulares positivas en cuanto a epítope, pero también fue liberado de nuevo de manera relativamente rápida (> 10 minutos a 37°C). A 4°C, el AcMo estuvo más tiempo fijado a las células tumorales. Este hallazgo, y la presencia de las 5 glicoproteínas (iso-formas de N-CAM) antes descritas en el sobrenadante de líneas celulares de carcinoma pulmonar microcístico, apuntan a una activa liberación de los antígenos por parte de tumores de origen neuroecto-
dérmico.

Tras la biotinilización del AcMo BW SCLC-1, se pudo demostrar además, por medio de un ensayo de doble determinante, que la glicoproteína N-CAM porta al menos 2 epítopes para estos AcMos.

Estudios de competición con AcMo BW SCLC-2 han indicado que ambos AcMo reconocen distintos epítopes sobre los mismos antígenos.

Ejemplo 4 Inmunoensayo para determinar en fluidos corporales humanos el antígeno asociado a tumor

Según procedimientos conocidos para el técnico se efectuó la fijación del AcMo 735 por adsorción a la superficie de poliestireno de pocillos de placas de microvaloración, y también la copulacióncovalente de los AcMo BW SCLC-1 y BW SCLC-2 a la enzima peroxidasa. Para determinar la concentración del antígeno asociado a tumor antes descrito, en cada una de los pocillos de las placas de microvaloración (Nunc) revestidos con AcMo 735 se añadieron mediante pipeta 10 \mul de material de muestra y 100 \mul de tampón para muestra (OSND, Behringwerke), y se incubaron durante 2 horas a 37°C.

Después de lavar tres veces con el tampón de lavado Enzygnost (OSEW, BW) diluido, se añadieron a cada uno de los pocillos individuales 100 \mul del conjugado AcMo BW SCLC-1-POD o del BW SCLC-2-POD, respectivamente. El siguiente paso de incubación a 37°C durante dos horas se finalizó con un ciclo de lavado triple.

Para el tercer paso de incubación a temperatura ambiente se añadieron luego mediante, pipeta a cada una de los pocillos, 100 \mul de una solución de tampón/sustrato y cromógeno (H_{2}O_{2}/TMB; OUVG/OUVF, BW), y al cabo de 30 minutos se detuvo la reacción enzimática con solución de parada Enzygnost (OSFA, BW). Se determinó la extinción de las muestras a 450 nm.

Resultado: Los valores de extinción determinados con este inmunoensayo corresponden en su magnitud a la concentración del antígeno o antígenos asociados a tumor en las muestras. Se evidenció que frecuentemente la concentración del antígeno o antígenos asociados a tumor en el suero de pacientes con un carcinoma pulmonar microcístico o con un neuroblastoma se encuentra incrementada, en comparación con donantes de sangre sanos (Figura 2).

También con otras combinaciones de ensayo (por ejemplo anticuerpos en fase sólida: AcMo BW SCLC-1, conjugado: aglutinina de germen de trigo-POD = WGA-POD; anticuerpo de fase sólida: AcMo BW SCLC-2, conjugado: AcMo BW SCLC-1-POD) se pudieron observar niveles elevados de antígeno en sueros cancerosos. Sin embargo, la diferencia entre las muestras de suero o plasma de personas sanas y las de pacientes con tumores malignos no era tan marcada con en el caso de la variante de ensayo antes descrita.

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TABLA 1 Especificidad inmunohistoquímica del AcMo BW SCLC-1 respecto a tumores humanos crioconservados

	Número de tumores
Tipo de tumor	total	negativo	positivo	Tipo de reacción
Carcinomas bronquiales
C. microcístico	43	8	35	TZ - / +++ MC
C. macrocístico	22	20	2	eTA (+)/+
C. de epitelio pavimentoso	67	59	8	ewTA (+)/+
Adenocarcinoma	61	53	8	ligeramente positivo +
C. de ovario	6	0	6	Bg (-)/-
C. de mama	12	6	6	eTZ (+)/-MC, eBgfas +
C. de estómago	7	3	4	TZ (+)/++
C. de colon	12	4	8	eTA +, Schl. +/++
C. de páncreas	6	4	2	eA -
C. de riñón	15	8	7	TZ (+)/++, Bg+/++
C. de testículo	1	1	0
C. de vejiga	2	2	0
C. de próstata	6	2	4	eA +
Tumores cerebrales	13	0	13	TZ +++ MC
Neuroblastoma	62	0	62	fibras musculares ++, TZ ++ M
Melanomas	11	4	7	eTA -/++

TABLA 1 (continuación)

	Número de tumores
Tipo de tumor	total	negativo	positivo	Tipo de reacción
Ganglioneuroblastomas	11	1	10
Ganglioneuromas	6	6	0
Sarcomas de Ewing	4	4	0

Explicación de los signos: \begin{minipage}[t]{120mm}TZ = células tumorales; M = membrana, C = citoplasma, eTA = algunas áreas de tumor, ewTA = muy pocas áreas de tumor, Bg = tejido conjuntivo, eTZ = algunas células tumorales, eBgfas = algunas fibras de tejido conjuntivo, Schl = mucosa, eA = algunas zonas\end{minipage}

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TABLA 2 Especificidad inmunohistoquímica del AcMo BW SCLC-1 respecto a tejidos humanos normales crioconservados

	Número de tejidos
Tipo de tejido	ensayados	negativo	positivo	Tipo de reacción
Tejidos normales:
Pulmón	4	2	2	(+) eZ ++
Riñón	3	0	3	eGef. y Bgfas +/++
Hígado	3	0	3	Bgfas +, eGef. y conductos +/++
Estómago	2	0	2	Bgfas +/++, Gef. ++
Intestino	3	0	3	músculo (+)/+, Bgfas y Gef. ++
Páncreas	3	0	3	islotes +, Bgfas y Gef.++
Próstata	2	0	2	músculo +, homogen. +
Mama	3	1	2	epitelio ++, +/++ dif.
Cerebro	9	0	9	++/+++
Nodo linfático	2	0	2	eZ + MC
Médula ósea	5	3	2	ewZ + MC
Bazo	2	0	2	(+), Gef. (+)/+
Testículo	1	0	1	algunos conductos (+)/++
Vejiga	1	0	1	algunas fibras musculares +/++
Nervios	1	0	1	fibras nerviosas +++
Amígdalas	1	0	1	eBgfas+, algunas fibras musculares +, ewZ +/++
Ovario	1	0	1	epitelio ++, eZ Bg ++
Timo	1	0	1	eZ +, corpúsculos de Hassal ++
Análisis fluorocitométrico de células sanguíneas periféricas
linfocitos	2	* 2,8%	0
monocitos	2	* 2,5%	0
granulocitos	2	* 0,8%	0
eritrocitos	2	* 0,2%	0
trombocitos	2	* 0,5%	0


Explicación de los signos: \begin{minipage}[t]{120mm} Explicación de los signos: eZ = algunas células, e Gef.: algunos vasos, Bgfas = fibras de tejido conjuntivo; ewZ: muy pocas células M = membrana, C = citoplasma,\end{minipage}

* Fracción de células fluorescentes por debajo del fondo

Claims

1. Uso de la línea celular de hibridoma con número de depósito ECACC 90 022 110 para producir anticuerpos monoclonales.

2. Uso in vitro del anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma con número de depósito ECACC 90 022 110, como agente de diagnóstico.

3. Uso del anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma con número de depósito ECACC 90 022 110, para preparar un medicamento para ser empleado como agente terapéutico.