JPH0222067B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 この発明は、新規デスモシン誘導体および人工
抗原調製用試薬に関する。 〔従来の技術〕 肺内ではタンパク分解酵素の１つであるエラス
ターゼと抗エラスターゼの均衡が保たれている。
すなわち、肺の弾性繊維のネツトワークは、抗エ
ラスターゼの作用で伸展による障害から保護され
ていると言える。この均衡が何らかの原因で崩れ
た時に肺実質の主要成分であるエラスチン（弾性
繊維）が無制御な分解を受け、肺胞が破壊されて
慢性閉塞性肺疾患（Chronic obstructive
pulmoary disease；COPD）と総称される病気
を発生させると言われている。生体内におけるエ
ラスチン分解の様子を測定できる高感度な化学分
析法があれば、肺等さまざまな組織や器管の病態
の変化を早期に検出するのに有効である。エラス
チンは分解されるとエラスチンにだけ見い出され
ているユニークなデスモシン等の架橋アミノ酸を
含むペプチドとして尿中に排出される。従つて、
尿中のデスモシン排出量を分析することによつて
肺の病気の発生を知ることができる。 最近、ハーレル（Harel）ら〔アメリカン・レ
ビユー・レスパイラトリー・デイズイーズ（Am.
Rev.Respir.Dis.）第122巻、第769頁（1980）〕お
よびキング（King）ら〔コネクテイブ・テイシ
ユー・リサーチ（Connect.Tissue Res.）第７
巻、第263頁（1980）〕は、ラジオイムノアツセイ
（RIA、放射免疫測定法）による尿中のデスモシ
ンの分析法を発表している。しかし、RIAによる
方法は、放射性同位元素を使用するため、人体に
対する危険性のみならず、環境汚染、廃棄物の問
題、使用に伴う特別な施設の必要性、半減器によ
る使用期限の問題など一般的測定法として多くの
問題をかかえており、その急速な普及を阻害する
一因となつていると考えられる。さらに彼らの使
用したデスモシン人工抗原はデスモシンとタンン
パク質とを１―エチル―３―（３―ジメチルアミ
ノプロピル）カーボジイミド塩酸塩を用いて非選
択的にランダムに結合したものである。そのため
抗体価の極めて低い抗体しか得られておらず、彼
らの分析法では抗血清を200〜250倍に稀釈するの
が限界となつている。ここにもこの分析法を一般
に普及させる上で大きな問題がある。 そこで臨床化学検査の立場からRIAに比較して
人体に対する危険もなく、環境汚染廃棄物の問題
や使用に伴う施設の必要性もなく、使用する試薬
類も長期間安定した状態で保存でき、一般に普及
しやすいエンザイムイムノアツセイ（EIA、酵素
免疫測定法）によるデスモシンの分析法開発が必
要となつている。 〔発明が解決しようとする問題点〕 しかし、EIAは一般的に検出感度がRIAに比較
して１桁低いと言われている。従つてEIAに用い
る抗血清は抗体価の極めて高いものが必要とされ
る。 したがつて、この発明の目的は、抗体価の極め
て高い抗デスモシン抗血清を誘導することができ
る人工抗原を調製するために用いられる新規物質
を提供することである。 〔問題点を解決するための手段〕 上記問題点は、この発明によれば、一般式 で示されるデスモシン誘導体を提供することによ
つて解決される。ただし、式（）において、Ｒ
は電子吸引性有機基、Ｘ は陰イオン、およびｎ
は１ないし６の整数である。 この発明のデスモシン誘導体は、式（）で示
されるように、ピリジニウム環の３位または５位
の側鎖に活性ジスルフイド基が結合した化合物で
ある。式（）において、Ｒは電子吸引性有機基
であればよいが、好ましくは芳香族のものであ
る。Ｒの具体例としては、ピリジル基、アジドフ
エニル基およびフエニル基がある。 式（）において、Ｘ は、例えば酢酸イオ
ン、ギ酸イオン、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ
素イオンなどの適宜の陰イオンを意味する。この
発明のデスモシン誘導体を抗デスモシン抗体を誘
導するための人工抗原の調製用試薬として用いる
場合に抗原決定基として作用するのは陽イオンの
部分であつて、Ｘ は何ら免疫応答反応に寄与し
ないので、Ｘ は上記した例に限られるものでは
なく、適当ないずれの陰イオンであつてよい。 式（）において、ｎは１ないし６の整数であ
り、好ましくは２ないし４である。 この発明のデスモシン誘導体は、デスモシンま
たはその塩と式 Ａ−OC―（CH₂―）_oＳ−Ｓ−Ｒ （） （ここで、ｎは式（）と同じ、Ａはエトキシ
基、

【式】または

〔実施例〕

実施例 １ ４―（４―アミノ―４―カルボキシブチル）―
１―（５―アミノ―５―カルボキシペンチル）
―５―（３―アミノ―３―カルボキシプロピ
ル）―３―〔３―カルボキシ―３―｛３―（２
―ピリジルジチオプロピオニル｝アミノ〕プロ
ピルピリジニウムアセテートの製造 デスモシン39mgを50mlの三角コルベン中で25ml
の0.1M NaClを含むリン酸バツフア（0.05M，PH
5.9）に溶解した。別にＮ―サクシンイミジル―
３―（２―ピリジルジチオ）プロピオネート23mg
を３mlのエタノールに溶解し、これを上記デスモ
シン溶液にゆつくりと滴下しながら３時間室温で
かきまぜた。反応後、ロータリーエバポレーター
で溶媒を除去した後、セフアデツクスＧ−25スー
パーフアイン（フアルマシア・フアイン・ケミカ
ルズ社製商品名）のカラム（直径1.5cm、高さ90
cm）に添加して酢酸バツフア（0.1M、PH4.5）に
より流速0.1ml／分で溶出し、３mlずつ試験管に
分取して反応生成物を分離した。まず、未反応の
デスモシン（26〜29本目）、次にこの発明のデス
モシン誘導体（33〜35本目）、そして最後に副反
応生成物（37〜40本目）の順に溶出した。この発
明のデスモシン誘導体が含まれる画分からロータ
リーエバポレーターで溶媒を除去した後、バイオ
ゲルＰ−２（−400メツシユ）（バイオ・ラツド・
ラバラトリーズ社製商品名）のカラム（直径2.5
cm、高さ91cm）に添加し、0.1M酢酸で溶出して
脱塩を行なつた。凍結乾燥後、淡黄色固体15.6mg
（収率30％）を得た。 得られた淡黄色固体を¹H NMR（溶媒D₂O、内
部標準DSS）、質量スペクトル（MS）、紫外線吸
収スペクトル（UV）で調べた結果、純度97％以
上の所望デスモシン誘導体であることが認められ
た。得られた分析データは次のとおりである。 ¹H NMR（溶媒D₂O、内部標準DSS）（ppm） 1.40（ｍ，1H），1.47（ｍ，1H），1.59（ｍ，1H），
1.67（ｍ，1H），1.89（ｍ，2H），2.06（ｓ，3H），
1.96〜2.11（ｍ，4H），2.17（ｍ，4H），2.78（ｍ，
2H），2.90（ｍ，4H），3.02（ｍ，2H），3.12（ｔ，
2H），3.73（ｔ，1H），3.79（ｍ，1H），3.88（ｍ，
2H），4.48（ｔ，2H），7.30（ｔ，1H），7.84（ｍ，
2H），8.39（ｄ，1H），8.46（ｓ，1H），8.52（ｓ，
1H） MS（ｍ／ｚ）：723 UV（溶媒0.1N酢酸）：λ（max）； 236nm，276nm，（肩，270nm） 実施例 ２ ４―（４―アミノ―４―カルボキシブチル）―
１―（５―アミノ―５―カルボキシペンチル）
―５―（３―アミノ―３―カルボキシプロピ
ル）―３―〔３―カルボキシ―３―｛３―（４
―アジドフエニルジチオ）プロピオニル｝アミ
ノ〕プロピルピリジニウムアセテートの製造 デスモシンテトラアセテート塩38mg（65μモ
ル）を50mlの三角コルベン中で25mlの0.1M
NaClを含むリン酸バツフア（0.05M，PH5.9）に
溶解した。別にＮ−サクシンイミジル―３―（４
―アジドフエニルジチオ）プロピオネート21mgを
３mlのジメチルホルムアミドに溶解し、これを上
記デスモシン溶液にゆつくりと滴下しながら３時
間室温でかきまぜた。反応後、ロータリーエバポ
レーターで溶媒を除去した後、バイオゲルＰ−２
（−400メツシユ）のカラム（直径2.5cm、高さ91
cm）に添加し、0.1M酢酸で10mlずつ分取し、分
離および脱塩をおこなつた。23〜25本目を凍結乾
燥後、所望のデスモシン誘導体を淡黄色固体とし
て得た。収量25mg。 分析結果； UV（溶媒0.1N酢酸）：λ_nax 226nm，269nm， （肩，238nm，276nm） 実施例 ３ 抗デスモシン抗体誘導用人工抗原の調製 「アナリテイカル・バイオケミストリー」第94
巻253〜258頁（1979）に記載の方法によりウシガ
ンマグロブリン（BGG）の分子内ジスルフイド
結合をジチオスレイトールで還元してチオール化
した。このチオール化BGG20mgを0.1M NaCl及
び6M尿素を含むリン酸バツフア（PH7.5，0.1M）
10mlに溶解し、これに実施例１のデスモシン誘導
体4.67mgを加えて室温で45分間かきまぜ反応させ
た。この反応溶液に15mlの10％トリクロル酢酸を
加え、3000rpm、10分間遠心分離をおこなつた。
上清を除き、この白色沈殿に１mlの水を加えて遠
心分離して洗浄した。得られた白色沈殿は凍結乾
燥し、17mgの白色粉末を得た。このデスモシン人
工抗原のデスモシンとBGGとの結合比を、上記
反応溶液の343nmにおける紫外吸光度を測定して
チオール−ジスルフイド交換反応により遊離した
ピリジン―２―チオンを定量し、チオール化
BGGの分子量を150000として計算で求めた結果、
デスモシン／BGG（モル比）は10であつた。 実施例 ４ 抗デスモシン抗血清の誘導 実施例３で得られたデスモシン人工抗原1.45mg
に0.3mlの8M尿素を加え溶解し、さらに0.5mlの
生理食塩水（0.9％）を加えて混合し、これを当
量のフロインドの完全アジユバントと良く混合し
て乳化させ、ウサギ（ニユージーランドホワイト
種雄、体重3.5Kg）の指掌部６カ所に注射した。
２回目の免疫化は、デスモシン人工抗原1.53mgに
0.1mlの8M尿素を加えて完全に溶解させ、さらに
0.6mlの生理食塩水（0.9％）を加えて混合し、こ
れを等量のフロインドの不完全アジユバントと良
く混合して乳化させ、背部皮下10カ所に注射する
ことによつて、９日後におこなつた。以後追加免
疫は２週間ごとに本化合物0.1mgを100μlの生理食
塩水に乳化したものを耳の静脈に注射することに
よつて計５回おこなつた。免疫に用いた３羽のウ
サギ全例に抗体価の上昇を認め、用量曲線も描か
れ、本発明のデスモシン誘導体から調製された人
工抗原によつて得られた抗体がデスモシンに特異
的なものであることが証明された。全採血は最終
注射後11日目（初回免疫後91日目）に前日から絶
食させたウサギのケイ動脈からおこなつた。 実施例 ５ デスモシンの酵素免疫測定 実施例４で得られた抗デスモシン抗血清を用い
て、デスモシンを酵素免疫測定した。 常法によりカーボジイミド法で調製したデスモ
シンとキーホールリンペツトヘモシアニンの複合
体一定量を96穴のEIA用マイクロプレートのウエ
ルにコーテイングし、デスモシンをウエル壁に結
合させた。さらに、そのウエルに分析対象試料と
して各種濃度のデスモシン（遊離型）の溶液を加
え、さらに上記方法で得られた抗血清を最終的に
30000倍の稀釈となるように加えて抗原抗体反応
をおこなわせた。反応後、遊離型デスモシンを分
離して結合型デスモシンと反応した抗デスモシン
抗体とアルカリフオスフアターゼ標識ヤギ（抗ウ
サギIgG）抗体とを結合させ、その酵素活性を測
定した。この方法では、抗デスモシン抗体と結合
型デスモシンとの抗原抗体反応に対する遊離型デ
スモシンの拮抗阻害を測定することにより遊離型
デスモシンの濃度を測定している。この結果、添
付の図に示ように30000倍に稀釈した血清を用い
て10^-9ｇ／mlの微量のデスモシンの測定が可能で
あつた。なお、図中の「結合型デスモシンと抗デ
スモシン抗体の反応の阻害率（％）」は、次のよ
うにして求められる。 阻害率（％）＝Ａ−Ｂ／Ａ×100 （ただし、Ａはデスモシンを含んでいない試料
による対照の酵素活性を示し、Ｂはデスモシンを
含んでいる試料による酵素活性を示す） この実験結果から、この発明のデスモシン誘導
体を結合した人工抗原によつて誘導された抗デス
モシン抗血清は、従来技術の抗血清と比較してさ
らに100倍以上に稀釈して分析に用いることがで
き、極めて抗体価の高いものであることがわか
る。 〔発明の効果〕 この発明は以上述べた通りの新規デスモシン誘
導体を提供するものであり、このデスモシン誘導
体は酵素免疫測定法によるデスモシンの分析に有
用な抗体価の高い抗デスモシン抗体を誘導する人
工抗原を調製するための試薬として優れている。

【図面の簡単な説明】

図はこの発明のデスモシン誘導体を結合した人
工抗原を用いて誘導した抗デスモシン抗血清を用
いておこなつたデスモシンの酵素免疫測定の結果
を示すグラフ図。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式 （ここで、Ｒは電子吸引性有機基、Ｘ は陰イ
   オン、およびｎは１ないし６の整数） で示されるデスモシン誘導体。 ２ Ｒがピリジル基であり、ｎが２である特許請
   求の範囲第１項記載のデスモシン誘導体。 ３ Ｒがアジドフエニル基であり、ｎが２である
   特許請求の範囲第１項記載のデスモシン誘導体。 ４ 一般式 （ここで、Ｒは電子吸引性有機基、Ｘ は陰イ
   オン、およびｎは１ないし６の整数） で示されるデスモシン誘導体からなる、抗デスモ
   シン抗体を誘導するための人工抗原調製用試薬。 ５ Ｒがピリジル基であり、ｎが２である特許請
   求の範囲第４項記載の試薬。 ６ Ｒがアジドフエニル基であり、ｎが２である
   特許請求の範囲第４項記載の試薬。