JPH0222234A - 多糖類‐タンパク質複合体 - Google Patents
多糖類‐タンパク質複合体Info
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- JPH0222234A JPH0222234A JP63110292A JP11029288A JPH0222234A JP H0222234 A JPH0222234 A JP H0222234A JP 63110292 A JP63110292 A JP 63110292A JP 11029288 A JP11029288 A JP 11029288A JP H0222234 A JPH0222234 A JP H0222234A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、免疫予防及びワクチンに関し、より詳細には
本発明は宿主内に血清抗体を産生ずることにより免疫応
答を顕在化させるために用いることのできるＶｉ莢膜多
糖類−タンパク質複合体に関する。
本発明は宿主内に血清抗体を産生ずることにより免疫応
答を顕在化させるために用いることのできるＶｉ莢膜多
糖類−タンパク質複合体に関する。
発明の背景
腸熱は下水処理及び飲料水の汚染のコントロールを未だ
達成していない国々において相当な罹病率及び死亡率を
引起こし続けている。これらの国々においては、腸熱の
最も頻繁且つ深刻な原因はサルモネラ・タイフイ（Ｓａ
ｌｍｏｎｃｌｌａ ｔｙｐｈｉ） （腸チフス）であ
る。世界的基準での腸チフスに対する免疫予防は二つの
現在利用可能なワクチンが限界を有するために試みられ
ていない。細胞チフスワクチンは限られた免疫を誘発す
るに過ぎず、又それらの広範囲の容認を断念させるのに
十分に頻繁で且つ深刻である副反応を顕在化する。経口
投与されるＳ、タイフィ、Ｔｙ−２１ａの弱毒化菌株は
約６５％の保護を誘発するために３〜４回の投与を必要
とする。このワクチンは高価であり、その保護様式は同
定されておらず、それがワクチンの正確な標準化を妨げ
てきた。
達成していない国々において相当な罹病率及び死亡率を
引起こし続けている。これらの国々においては、腸熱の
最も頻繁且つ深刻な原因はサルモネラ・タイフイ（Ｓａ
ｌｍｏｎｃｌｌａ ｔｙｐｈｉ） （腸チフス）であ
る。世界的基準での腸チフスに対する免疫予防は二つの
現在利用可能なワクチンが限界を有するために試みられ
ていない。細胞チフスワクチンは限られた免疫を誘発す
るに過ぎず、又それらの広範囲の容認を断念させるのに
十分に頻繁で且つ深刻である副反応を顕在化する。経口
投与されるＳ、タイフィ、Ｔｙ−２１ａの弱毒化菌株は
約６５％の保護を誘発するために３〜４回の投与を必要
とする。このワクチンは高価であり、その保護様式は同
定されておらず、それがワクチンの正確な標準化を妨げ
てきた。
最近、高割合のチフス熱（約１％／年）の人口において
二つの臨床評価がＳ、タイフイの莢膜多糖類（Ｖｉ）に
よる免疫化がチフス熱に対して免疫を与えるという証拠
を提供した〔クルグマン等（Ｋｌｕｇａａｎ ｏｔ ａ
ｌ、） ％ Ａｂｓｔｒａｃｔ ２７ｔｈ ＩＣＡＡＣ
、ニューヨーク、ニューヨーク、１９８１年、及びアカ
−リヤ等（Ａｃｈａｒｙａ ｃｔ ａｌ、）ネパールに
おけるサルモネラ・タイフィのＶｉ莢膜多糖類によるチ
フス熱の予防、印刷中、１９８７年〕。その構造を変化
させない条件下に調製されたＶｉワクチンはネパールに
おける約７５％の子供及び大人及び南アフリカ共和国の
イースタントランスバールにおける学校児童において４
倍以上の血清抗体の上昇を顕在化させた。これらの二つ
の試みにおける保護効率は約７０％であった。これに対
して、フランス及び米国における青年の９７％において
同一のＶｉは４倍以上の抗体上昇を顕在化させた。
二つの臨床評価がＳ、タイフイの莢膜多糖類（Ｖｉ）に
よる免疫化がチフス熱に対して免疫を与えるという証拠
を提供した〔クルグマン等（Ｋｌｕｇａａｎ ｏｔ ａ
ｌ、） ％ Ａｂｓｔｒａｃｔ ２７ｔｈ ＩＣＡＡＣ
、ニューヨーク、ニューヨーク、１９８１年、及びアカ
−リヤ等（Ａｃｈａｒｙａ ｃｔ ａｌ、）ネパールに
おけるサルモネラ・タイフィのＶｉ莢膜多糖類によるチ
フス熱の予防、印刷中、１９８７年〕。その構造を変化
させない条件下に調製されたＶｉワクチンはネパールに
おける約７５％の子供及び大人及び南アフリカ共和国の
イースタントランスバールにおける学校児童において４
倍以上の血清抗体の上昇を顕在化させた。これらの二つ
の試みにおける保護効率は約７０％であった。これに対
して、フランス及び米国における青年の９７％において
同一のＶｉは４倍以上の抗体上昇を顕在化させた。
その他の莢膜多糖類例えば髄膜炎菌性ワクチンの血清変
換速度及び効率も又フィンランド或いは米国よりもアフ
リカにおいてより低かった。この髄膜炎菌性ワクチンの
より少ない免疫原性及び効率はアフリカの人口における
マラリアを含む高い感染負担に帰せられた。莢膜多糖類
ワクチンにより顕在化された保護応答は血清抗体である
ので、より免疫原性の多いＶｉが高リスク人口における
チフス熱に対してより保護的であることを予測すること
が可能である。
換速度及び効率も又フィンランド或いは米国よりもアフ
リカにおいてより低かった。この髄膜炎菌性ワクチンの
より少ない免疫原性及び効率はアフリカの人口における
マラリアを含む高い感染負担に帰せられた。莢膜多糖類
ワクチンにより顕在化された保護応答は血清抗体である
ので、より免疫原性の多いＶｉが高リスク人口における
チフス熱に対してより保護的であることを予測すること
が可能である。
初めに、アプリ−及びゴーベル〔＾ｖｅｒｙ ａｎｄＧ
ｏｅｂｅ ｌ、Ｊ、 Ｅｘｐ、 Ｍｅｄ、 ５０：５３
１ （１９２９））及びゴーベル（Ｇｏｅｂｅ ｌ、Ｊ
、 Ｅｘｐ、 Ｍｅｄ、 ５０：４６９−５２０ （１
９２９））は肺炎球菌３型多糖類の免疫原性がそれを担
体タンパク質に化学的に結合することによって増大され
得ることを示した。この原理はその他の病原菌の莢膜多
糖類の免疫原性を増大するために首尾よく適用されてい
る。
ｏｅｂｅ ｌ、Ｊ、 Ｅｘｐ、 Ｍｅｄ、 ５０：５３
１ （１９２９））及びゴーベル（Ｇｏｅｂｅ ｌ、Ｊ
、 Ｅｘｐ、 Ｍｅｄ、 ５０：４６９−５２０ （１
９２９））は肺炎球菌３型多糖類の免疫原性がそれを担
体タンパク質に化学的に結合することによって増大され
得ることを示した。この原理はその他の病原菌の莢膜多
糖類の免疫原性を増大するために首尾よく適用されてい
る。
ロビンス等（Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ、 Ｊ、 Ｉ
ｎｆｅｃｔ、 Ｄｌｓ。
ｎｆｅｃｔ、 Ｄｌｓ。
１５０．３４３Ｂ−４４９（１９８４））は、Ｓ、タイ
フイによる実験的攻撃に対してヒトを免疫化するために
用いられたＶｉ多糖類はチフス熱を予防することに失敗
したことを開示している。このワクチンを調製するため
に用いられた条件がおそらくそれを変性させその免疫原
性を減少させたものと思われる。
フイによる実験的攻撃に対してヒトを免疫化するために
用いられたＶｉ多糖類はチフス熱を予防することに失敗
したことを開示している。このワクチンを調製するため
に用いられた条件がおそらくそれを変性させその免疫原
性を減少させたものと思われる。
この多糖類がその他のタンパク質にカップリングさせ得
るか否かについて何等の開示もない。
るか否かについて何等の開示もない。
タケット等（Ｔａｃｋｏｔ ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、 Ｉ
ｎｆｅｃｔ、 Ｄｉｓ。
ｎｆｅｃｔ、 Ｄｉｓ。
１５４２３４２−３４５ （１９８Ｂ）］はサルモネラ
・タイフィのＶｉ莢膜多糖類から作られたワクチンを開
示しているが、しかし、このワクチンはタンパク質に複
合化されていない。
・タイフィのＶｉ莢膜多糖類から作られたワクチンを開
示しているが、しかし、このワクチンはタンパク質に複
合化されていない。
ミウアザケ等（Ｍｉｕａｚａｋｅ ｅｔ ａｌ、、 Ｇ
ａｎｎ ７１８７８６−７７４ （１９８０））はスル
フヒドリル基をＲＡＭＩｇＧ中に導入し、次いでこの変
性抗体をリジンへ−鎖と反応させることにより抗体−リ
シンへ−鎖複合体を調製する方法を開示している。
ａｎｎ ７１８７８６−７７４ （１９８０））はスル
フヒドリル基をＲＡＭＩｇＧ中に導入し、次いでこの変
性抗体をリジンへ−鎖と反応させることにより抗体−リ
シンへ−鎖複合体を調製する方法を開示している。
この複合体は細胞毒性を有すると言われている。
メリマン等［Ｍａｒｒｙ＊ａｎ ｅＬ ａｌ、、 Ｂｌ
ｏｃｈｅｌ。
ｏｃｈｅｌ。
Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、 ２８１５２２９７−２３０２
（１９７９） ）はヒトリンパ球の増殖的応答がスルフ
ヒドリル剤り−ペニシラミン及び５−チオピリドキシン
により変更され得ることを開示している。
（１９７９） ）はヒトリンパ球の増殖的応答がスルフ
ヒドリル剤り−ペニシラミン及び５−チオピリドキシン
により変更され得ることを開示している。
フラン等（Ｎｏｌａｎ ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、 Ｃｌ１
ｎ、 Ｍｌｃｒｏｂｉｏｌ。
ｎ、 Ｍｌｃｒｏｂｉｏｌ。
１２２２−２６ （１９８０） ）はサルモネラ・タイ
フィの莢膜多糖類に対する血清抗体のアッセイを開示し
ている。この抗体がタンパク質に複合化され得るかにつ
いての開示はない。
フィの莢膜多糖類に対する血清抗体のアッセイを開示し
ている。この抗体がタンパク質に複合化され得るかにつ
いての開示はない。
発明の概要
本発明は上記の如き従来技術の欠点を克服することであ
る。
る。
更に、本発明の目的は宿主の抗体応答を高めるＶｉ莢膜
多糖類タンパク質複合体を製造することである。
多糖類タンパク質複合体を製造することである。
本発明のもう一つの目的はチフス熱に対する保護のため
の改良されたワクチンを提供することである。
の改良されたワクチンを提供することである。
更に本発明のもう一つの目的はサルモネラ参タイフィに
対するヒトの免疫を増大することである。
対するヒトの免疫を増大することである。
更に本発明の目的はＶｉ莢膜多糖類にＴ−依存性特性を
与えるＶｉ莢膜多糖類タンパク質複合体を製造すること
である。
与えるＶｉ莢膜多糖類タンパク質複合体を製造すること
である。
本発明に従えば、抗体応答を高めるために及びＶｉ莢膜
多糖類へのＴ−依存性特性を与えるためにＶｉ莢膜多糖
類−タンパク質複合体を合成する方法が提供される。
多糖類へのＴ−依存性特性を与えるためにＶｉ莢膜多糖
類−タンパク質複合体を合成する方法が提供される。
本発明に従えば、Ｖｉ莢膜多糖類のチオール誘導体をタ
ンパク質に結合するためにヘテロ二官能性架橋剤が用い
られ、Ｖｉ−タンパク質複合体を得る。この方法はジフ
テリア、コレラ及びテタヌス・トキソイド類などのタン
パク質に用いることができる。本発明の方法は又カルボ
キシル官能基を有するその他の多糖類とのタンパク質複
合体を合成するためにも用いることができる。
ンパク質に結合するためにヘテロ二官能性架橋剤が用い
られ、Ｖｉ−タンパク質複合体を得る。この方法はジフ
テリア、コレラ及びテタヌス・トキソイド類などのタン
パク質に用いることができる。本発明の方法は又カルボ
キシル官能基を有するその他の多糖類とのタンパク質複
合体を合成するためにも用いることができる。
本発明に従えば、Ｖｉ−タンパク質複合体は抗体応答を
高めるため及びサルモネラ・タイフィＶｉにＴ−依存性
特性を与えるために及びチフス熱に対して高リスクの人
口においてその保護作用を増大するために合成すること
ができる。
高めるため及びサルモネラ・タイフィＶｉにＴ−依存性
特性を与えるために及びチフス熱に対して高リスクの人
口においてその保護作用を増大するために合成すること
ができる。
本発明に従えば、Ｖｉのチオール誘導体をタンパク質に
結合するためにヘテロ二官能性架橋剤を用いることがで
きる。
結合するためにヘテロ二官能性架橋剤を用いることがで
きる。
発明の詳細な説明
本発明はカルボキシル基を有する莢膜多糖類をタンパク
質に複合化する方法を提供するものである。多糖類のチ
オール誘導体が形成され、このチオール誘導体が次いで
Ｎ−スクシニミジル３−（−２−ピリジルジチオ）プロ
ピオネートなどのへテロ二官能性架橋剤を用いてタンパ
ク質に結合される。莢膜多糖類はｖ１莢膜多糖類であり
得る。
質に複合化する方法を提供するものである。多糖類のチ
オール誘導体が形成され、このチオール誘導体が次いで
Ｎ−スクシニミジル３−（−２−ピリジルジチオ）プロ
ピオネートなどのへテロ二官能性架橋剤を用いてタンパ
ク質に結合される。莢膜多糖類はｖ１莢膜多糖類であり
得る。
その様に複合化されることのできるタンパク質の中には
、テタヌストキソイド、ジフテリアトキソイド、コレラ
トキシン、ヘモフィリスインフルエンザｂｘタンパク質
、及びＩｇＧなどがある。
、テタヌストキソイド、ジフテリアトキソイド、コレラ
トキシン、ヘモフィリスインフルエンザｂｘタンパク質
、及びＩｇＧなどがある。
この複合化莢膜タンパク質から宿主の抗体応答を高める
ために用いることのできる薬学的に許容可能な担体中に
組成物を製造することができる。
ために用いることのできる薬学的に許容可能な担体中に
組成物を製造することができる。
好ましくは、宿主は２週間間隔で少なくとも２回この組
成物を注射される。
成物を注射される。
本発明に従ってＶｉとタンパク質の間に共有結合を合成
するために、Ｖｉ。
するために、Ｖｉ。
−４−ＤφａφＮａｃにａｌＡ−１の線状ホモポリマー
を０３において９０％までＯ−アセチル化した。これら
の複合体を調製するために用いた反応式はＮａｃＧａｌ
Ａのカルボキシル官能基を用いてチオール誘導体を形成
した。このチオール誘導体をチオール−活性化合物、Ｎ
−スクシニミジル−３−（−２−ピリジルジチオ）プロ
ゼオネート（以下５ＰＤＰ）により誘導したタンパク質
と合一した。
を０３において９０％までＯ−アセチル化した。これら
の複合体を調製するために用いた反応式はＮａｃＧａｌ
Ａのカルボキシル官能基を用いてチオール誘導体を形成
した。このチオール誘導体をチオール−活性化合物、Ｎ
−スクシニミジル−３−（−２−ピリジルジチオ）プロ
ゼオネート（以下５ＰＤＰ）により誘導したタンパク質
と合一した。
Ｖｉ莢膜多糖類
複合体に用いられたＶｉはシトロバクタ−・フロインデ
イ（Ｃ１ｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｒｒｅｕｎｄｌｌ） 、
菌株ＷＲ７−１１から調製された。Ｃ９Ｆｒｅｕｎｄ１
１はホーニック等（Ｈｏｒｎｌｃｋ ｅｔ ａｌ、、
Ｔｒａｎｓ、＾−ｅｒ、 ＣｌＩｎ。
イ（Ｃ１ｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｒｒｅｕｎｄｌｌ） 、
菌株ＷＲ７−１１から調製された。Ｃ９Ｆｒｅｕｎｄ１
１はホーニック等（Ｈｏｒｎｌｃｋ ｅｔ ａｌ、、
Ｔｒａｎｓ、＾−ｅｒ、 ＣｌＩｎ。
ＣｌｌｗａＬ、 Ａｓｓ、 ７８ニア０ （１９６Ｂ）
）により説明されるような酵母抽出物透析液を含有す
る培地内で培養された。Ｖｉは培養上澄液から１％ヘキ
サデシルトリメチルアンモニウムブロマイドで沈澱され
、逐次ＤＮａ ｓ ｅ、ＲＮａｓ ｅ及び次いでプロナ
ーゼで処理された。
）により説明されるような酵母抽出物透析液を含有す
る培地内で培養された。Ｖｉは培養上澄液から１％ヘキ
サデシルトリメチルアンモニウムブロマイドで沈澱され
、逐次ＤＮａ ｓ ｅ、ＲＮａｓ ｅ及び次いでプロナ
ーゼで処理された。
この酸素処理された生成物を冷フェノールで精製し、リ
ポポリサッカライドを３５．０００．１０℃の遠心分離
により５時間に互って除去した。
ポポリサッカライドを３５．０００．１０℃の遠心分離
により５時間に互って除去した。
Ｖｊを発熱物質のない水に対して徹底的に透析し、凍結
乾燥した。
乾燥した。
Ｓ、タイフィからのＶｉはこの方法の修正により調製し
た。最終生成物はＳＤＳ −ＰＡＧＥにより測定して１
％未満のタンパク質或いは核酸及び０．０１％未満のり
ボボリサツカライドを含有した。Ｖｉ調製物の分子径は
不均一であった。主ピークは０．２Ｍ ＮａＣ１内で
平衡化された５ｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ −１０００によ
るゲル＞ｐ過ニヨリ推定された５Ｘ１０３ｋｄより大き
い分子径を有した。約６５，０００のより小さい分子径
Ｖｉは超音波照射により調製された。
た。最終生成物はＳＤＳ −ＰＡＧＥにより測定して１
％未満のタンパク質或いは核酸及び０．０１％未満のり
ボボリサツカライドを含有した。Ｖｉ調製物の分子径は
不均一であった。主ピークは０．２Ｍ ＮａＣ１内で
平衡化された５ｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ −１０００によ
るゲル＞ｐ過ニヨリ推定された５Ｘ１０３ｋｄより大き
い分子径を有した。約６５，０００のより小さい分子径
Ｖｉは超音波照射により調製された。
タンパク質
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びコレラトキシンを更
に精製することなしに用いた。テタヌストキソイド及び
ジフテリアトキソイドは更に５ｃｐｈａｃｒｙｌ Ｓ
−３００によるゲル濾過により精製された。これらの二
つのトキソイドの分子量に対応する画分を限外ン濾過に
より濃縮し、０．４５μフイルターを通過させた。コレ
ラトキシンはＣＨＯ細胞アッセイ及び陵内ウサギ皮膚試
験により毒性を特性化した。
に精製することなしに用いた。テタヌストキソイド及び
ジフテリアトキソイドは更に５ｃｐｈａｃｒｙｌ Ｓ
−３００によるゲル濾過により精製された。これらの二
つのトキソイドの分子量に対応する画分を限外ン濾過に
より濃縮し、０．４５μフイルターを通過させた。コレ
ラトキシンはＣＨＯ細胞アッセイ及び陵内ウサギ皮膚試
験により毒性を特性化した。
Ｖｉのタンパク質への直接結合
Ｖｉをボーベリー等（Ｂｅｕｖｅｒｙ ｅｔ ａｌ、、
Ｉｎｆｅｃｔ。
Ｉｎｆｅｃｔ。
Ｉｓ＋ｓｕｎ、 ３７：１５ ［１９ｇ２） ）の方法
によりジフテリアトキソイドに結合した。各々１０ ｍ
ｇ／ ｍｌを含有する等容量のＶｉ及びジフテリアトキ
ソイドを混合し、ｐＨを０．ＩＮ ＨＣＩで５．０に
調整し、ＥＤＡＣとも称される１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを０．１Ｍの
最終濃度まで添加した。
によりジフテリアトキソイドに結合した。各々１０ ｍ
ｇ／ ｍｌを含有する等容量のＶｉ及びジフテリアトキ
ソイドを混合し、ｐＨを０．ＩＮ ＨＣＩで５．０に
調整し、ＥＤＡＣとも称される１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを０．１Ｍの
最終濃度まで添加した。
ｐｎを０．１Ｎ ＨＣＩを添加することにより５．０
に室温において３時間保った。反応液を更に２４時間３
〜８℃で攪拌し、０．２ＭＮａＣ１に対して４８時間透
析し、次いで１０、ｏｏｏｇで３〜８℃において２時間
遠心分離した。
に室温において３時間保った。反応液を更に２４時間３
〜８℃で攪拌し、０．２ＭＮａＣ１に対して４８時間透
析し、次いで１０、ｏｏｏｇで３〜８℃において２時間
遠心分離した。
上澄液を０．２Ｍ ＮａＣ１中に平衡化された４ ３
−３６ｐｈａｒｏｓｅを通してゲルトン濾過にか（少た
。これらの両分を屈折率測定及び２８０ＯＡにおける吸
収により追跡した。Ｖ ｉ −Ｄ Ｔ ＋複合体を含有
する空隙画分を集め、チメロザール中で０．０１％にし
て３〜８℃で貯蔵した。
−３６ｐｈａｒｏｓｅを通してゲルトン濾過にか（少た
。これらの両分を屈折率測定及び２８０ＯＡにおける吸
収により追跡した。Ｖ ｉ −Ｄ Ｔ ＋複合体を含有
する空隙画分を集め、チメロザール中で０．０１％にし
て３〜８℃で貯蔵した。
Ｖｉ−タンパク質複合体の合成
Ｖｉを０．２ＭＮａＣ１中に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で３
〜８℃で一晩溶解させた。次いでＶｉの２倍重量のシス
タミン及びシステアミンを粉末としてＶｉ溶液に添加し
た。反応液のｐＨをｐＨが安定化するまで０．ｌＮＨＣ
ｌを添加することにより４．９に調整した。反応液を次
いで３〜８℃において蒸留水に対して徹底的に透析して
凍結乾燥した。チオール化の程度はシスタミンを標準と
して用いたヨードブラチネートアッセイにより推定した
。チオールエステル含量はＶｉ誘導体のＤＴＴによる還
元及び反応液のＢｌｏ−Ｇｅ１を通して通過させて低分
子量物質を除去後定量した。
〜８℃で一晩溶解させた。次いでＶｉの２倍重量のシス
タミン及びシステアミンを粉末としてＶｉ溶液に添加し
た。反応液のｐＨをｐＨが安定化するまで０．ｌＮＨＣ
ｌを添加することにより４．９に調整した。反応液を次
いで３〜８℃において蒸留水に対して徹底的に透析して
凍結乾燥した。チオール化の程度はシスタミンを標準と
して用いたヨードブラチネートアッセイにより推定した
。チオールエステル含量はＶｉ誘導体のＤＴＴによる還
元及び反応液のＢｌｏ−Ｇｅ１を通して通過させて低分
子量物質を除去後定量した。
空隙中に溶出した物質を次いでシステアミンを標準とし
て用いてそのＳＲ含量を分析した。
て用いてそのＳＲ含量を分析した。
これらのタンパク質を次いで５ＰＤＰ、Ｎ−スクシニミ
ジル３− （２−ピリジルジチオ）プロピオネートを用
いて誘導化した。５〜２０■ｇ／ｍｌの範囲内のタンパ
ク質溶液を作製した。遊離ＳＲ基を０．０１Ｍヨード酢
酸による処理により保護した。ヨード酢酸及びタンパク
質を含む反応液を室温で１時間インキュベートし、次い
で３〜８℃における一晩の透析により０．１５Ｍ Ｈ
ＥＰＥＳ。
ジル３− （２−ピリジルジチオ）プロピオネートを用
いて誘導化した。５〜２０■ｇ／ｍｌの範囲内のタンパ
ク質溶液を作製した。遊離ＳＲ基を０．０１Ｍヨード酢
酸による処理により保護した。ヨード酢酸及びタンパク
質を含む反応液を室温で１時間インキュベートし、次い
で３〜８℃における一晩の透析により０．１５Ｍ Ｈ
ＥＰＥＳ。
５ｍＭ ＥＤＴＡＳｐＨ７，５５（ＨＥ緩衝液）に対
して平衡化させた。９９．５％エタノール中２０ｍＭの
量の５ＰＤＰを攪拌しながらタンパク質溶液に添加した
。５ＰＤＰ対タンパク質の最終モル比は所望の誘導化程
度に応じて５〜２４の範囲であった。反応は室温で１時
間行われた。過剰試薬は３〜８℃における一晩のＨＥ緩
衝液に対する透析後、ＨＥ緩衝液内のＢｉｏ−ＧｅｔＰ
ｌｏを通過させるゲル濾過により除去された。
して平衡化させた。９９．５％エタノール中２０ｍＭの
量の５ＰＤＰを攪拌しながらタンパク質溶液に添加した
。５ＰＤＰ対タンパク質の最終モル比は所望の誘導化程
度に応じて５〜２４の範囲であった。反応は室温で１時
間行われた。過剰試薬は３〜８℃における一晩のＨＥ緩
衝液に対する透析後、ＨＥ緩衝液内のＢｉｏ−ＧｅｔＰ
ｌｏを通過させるゲル濾過により除去された。
空隙画分を集め、５〜１０１１ｇ／ｍｌに濃縮し、３〜
８℃で貯蔵した。誘導化タンパク質内の２−ピリジルジ
スルフィドのモル比は５０ｍＭジチオスレイトール内で
ジスルフィド結合を還元し、及び３４３ＯＡにおける９
、 ０８ ｘ １０３／ｍｏｌ ／ｃＩｍのピリジン
の消光係数を用いて放出されたピリジン−２−チオンの
量を計算することにより求めた。
８℃で貯蔵した。誘導化タンパク質内の２−ピリジルジ
スルフィドのモル比は５０ｍＭジチオスレイトール内で
ジスルフィド結合を還元し、及び３４３ＯＡにおける９
、 ０８ ｘ １０３／ｍｏｌ ／ｃＩｍのピリジン
の消光係数を用いて放出されたピリジン−２−チオンの
量を計算することにより求めた。
Ｖｉ−タンパク質複合体の合成
Ｖｉ−タンパク質複合体を合成するために、Ｖｉのシス
タミン誘導体をＨＥ緩衝液中に５〜１０■／ｍｌで溶解
した。ジチオスレイトールを１００ｍＭの最終濃度まで
添加し、室温で１時間攪拌した。ＨＥ緩衝液に対して２
時間透析後、反応液を次いでＢｌｏ−Ｇｅ１ ＰＩＯ
カラムに通し、ＨＥ緩衝液で平衡化させ、空隙ピークを
Ｎ２圧力下に限外か過により濃縮した。５ＰＤＰ−誘導
化タンパク質を還元ｖｌ誘導体に添加して等モル比のＮ
−ピリジルジスルフィド基及びＳＲ基を達成した。反応
液を窒素で掃射し、室温で１時間、次いで３〜８℃で２
４時間インキュベートした。
タミン誘導体をＨＥ緩衝液中に５〜１０■／ｍｌで溶解
した。ジチオスレイトールを１００ｍＭの最終濃度まで
添加し、室温で１時間攪拌した。ＨＥ緩衝液に対して２
時間透析後、反応液を次いでＢｌｏ−Ｇｅ１ ＰＩＯ
カラムに通し、ＨＥ緩衝液で平衡化させ、空隙ピークを
Ｎ２圧力下に限外か過により濃縮した。５ＰＤＰ−誘導
化タンパク質を還元ｖｌ誘導体に添加して等モル比のＮ
−ピリジルジスルフィド基及びＳＲ基を達成した。反応
液を窒素で掃射し、室温で１時間、次いで３〜８℃で２
４時間インキュベートした。
反応時のピリジンの放出は３４３０Ａにおける光学密度
の変化により測定した。
の変化により測定した。
反応液を上記の如く限外を濾過により濃縮して室温にお
いて０．２Ｍ ＮａＣ１中で５ｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ
−１０００によるゲル濾過にかけた。空隙画分を集め、
限外濾過により濃縮し、０．１５ＭＮａＣ１，０，０１
％チメロザール、１ｍＭＥＤＴＡ％ｐＨ７，０に対して
透析し、３〜８℃で貯蔵した。この複合体のタンパク質
濃度は５ＰＤＰ−誘導化タンパク質を標準として用いる
Ｂｉｏ−Ｒａｄクーマシーブルーにより求めた。
いて０．２Ｍ ＮａＣ１中で５ｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ
−１０００によるゲル濾過にかけた。空隙画分を集め、
限外濾過により濃縮し、０．１５ＭＮａＣ１，０，０１
％チメロザール、１ｍＭＥＤＴＡ％ｐＨ７，０に対して
透析し、３〜８℃で貯蔵した。この複合体のタンパク質
濃度は５ＰＤＰ−誘導化タンパク質を標準として用いる
Ｂｉｏ−Ｒａｄクーマシーブルーにより求めた。
複合体内のタンパク質及びＶｉの濃度も又フーリエ変換
赤外分光光度法（ＦＴＩＲ）及びアクリジンオレンジに
よる分光光度滴定により求めた。
赤外分光光度法（ＦＴＩＲ）及びアクリジンオレンジに
よる分光光度滴定により求めた。
肺炎球菌６ｆｌｌ−テタヌストキソイド複合体（１’ｎ
６Ｂ−ＴＴ） 肺炎球菌６Ｂ莢膜多糖類はチュ等（Ｃｈｕ ｅｔ ａｔ
、。
６Ｂ−ＴＴ） 肺炎球菌６Ｂ莢膜多糖類はチュ等（Ｃｈｕ ｅｔ ａｔ
、。
Ｉｎ［’ｅｃｔ、 ｌ５ｓｕｎ、 ４０：２４５ （１
９ｇ２）） 、シュニアソン等（Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎ
ｎ ｅｔ ａｌ、、 ｏｐ、 ｃｌｔ、 ４５：５ｇ２
（１９８４））及びシュニアソン等（Ｓｃｈｎｅｅｒｓ
ｏｎｎ ｅｔａｔ、＋ ０９． ｃｉｔ、 ５２：５Ｑ
ｌ （１９８Ｂ） ］により記載されたようにアジピン
酸ジヒドラジドで誘導化され、テタヌストキソイドに結
合された。この調製物のタンパク’Ｅｔ／多糖類は２．
８であった。
９ｇ２）） 、シュニアソン等（Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎ
ｎ ｅｔ ａｌ、、 ｏｐ、 ｃｌｔ、 ４５：５ｇ２
（１９８４））及びシュニアソン等（Ｓｃｈｎｅｅｒｓ
ｏｎｎ ｅｔａｔ、＋ ０９． ｃｉｔ、 ５２：５Ｑ
ｌ （１９８Ｂ） ］により記載されたようにアジピン
酸ジヒドラジドで誘導化され、テタヌストキソイドに結
合された。この調製物のタンパク’Ｅｔ／多糖類は２．
８であった。
マウスの免疫化
１．６〜２０ｔｒの体止のメス離乳ＢＡＬＢ／ｃマウス
に２週間に１．２或いは３回０．１ｍｌのＶｉ。
に２週間に１．２或いは３回０．１ｍｌのＶｉ。
ＶｉｌＪ合体或いは塩水のいづれかを皮下注射した。
各実験群からのマウスを各注射後１０日後に放血させた
。明言−吸着ｖ ｉ −ＣＴ Ｘ Ｉ ＋を＾Ｉ ｈｙ
ｄ ｒｏｇｅ ｌを用いて調製した。このＡｔｈｙｄｒ
ｏｇｅｌを遠心分離し、Ｖ ｉ −ＣＴｘ、、をペレッ
トに添加して０．５−ｇアルミニウム／ｍｌ及び５．０
ＭｇのＶｉの最終濃度を懸濁液として達成した。この混
合物を室温にて一晩転倒させた後、３〜８℃で貯蔵した
。
。明言−吸着ｖ ｉ −ＣＴ Ｘ Ｉ ＋を＾Ｉ ｈｙ
ｄ ｒｏｇｅ ｌを用いて調製した。このＡｔｈｙｄｒ
ｏｇｅｌを遠心分離し、Ｖ ｉ −ＣＴｘ、、をペレッ
トに添加して０．５−ｇアルミニウム／ｍｌ及び５．０
ＭｇのＶｉの最終濃度を懸濁液として達成した。この混
合物を室温にて一晩転倒させた後、３〜８℃で貯蔵した
。
霊長類の免疫化
若いアカゲザルに０．５ｍｌのＶｉ或いは２５μｇのＶ
ｉを含有すルＶ ｉ −Ｃ”ｒＸ、、を１ケ月離して２
回皮下注射した。対照には１５μｇの莢膜多糖類を含有
するＰｎ６Ｂ−ＴＴを注射した。サルは各注射の前及び
３週間後に採血した。
ｉを含有すルＶ ｉ −Ｃ”ｒＸ、、を１ケ月離して２
回皮下注射した。対照には１５μｇの莢膜多糖類を含有
するＰｎ６Ｂ−ＴＴを注射した。サルは各注射の前及び
３週間後に採血した。
免疫学的方法
血清Ｖｉ抗体はラジオイムノアッセイにより測定し、μ
ｇ Ａ ｂ ／ ｍｌとして表わした。実験群内の抗体
の濃度間の相違はフィッシャーの精密Ｔ−テストにより
計算した。結果を幾何学的平均及び８０％信頼性限界と
して表に示した。コレラトキシンに対する抗体はＥＬ
Ｉ ＳＡにより７ＴＰｊ定した。
ｇ Ａ ｂ ／ ｍｌとして表わした。実験群内の抗体
の濃度間の相違はフィッシャーの精密Ｔ−テストにより
計算した。結果を幾何学的平均及び８０％信頼性限界と
して表に示した。コレラトキシンに対する抗体はＥＬ
Ｉ ＳＡにより７ＴＰｊ定した。
ウサギ抗−ＢＳＡ血清はＣａｐｐｅｌ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ（ペンシルバニア州、コクランビル）から得
られた。６６０μｇ／ｖｉ Ａｂ／ｍｌを含有する超
免疫ロバ抗血清（Ｂ−２６０）はフラン等（Ｎｏｌａｎ
ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、 ＣｌＩｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ、 １２：２２ （１９８０））により説明されるよ
うにしてホルマリン−固定Ｓ。
ｏｒｉｅｓ（ペンシルバニア州、コクランビル）から得
られた。６６０μｇ／ｖｉ Ａｂ／ｍｌを含有する超
免疫ロバ抗血清（Ｂ−２６０）はフラン等（Ｎｏｌａｎ
ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、 ＣｌＩｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ、 １２：２２ （１９８０））により説明されるよ
うにしてホルマリン−固定Ｓ。
タイフィの多数回静脈内注射により調製された。
１６．５■Ａｂ／ｍｌを含有するロバ２４１、超免疫コ
レラトキシン抗血清の調製及び特性化はダフ二等（Ｄａ
ｒｎｉ ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、 ｌｎｌ’ｅｃｔ、 Ｄ
ｉｓ、 １３３：５１３８（１９７Ｂ））により報告さ
れた。ロケット免疫電気泳動及び免疫拡散は上記スツウ
等（Ｓｚｕ ｅＬ ａｌ、）により説明された様に行な
われた。
レラトキシン抗血清の調製及び特性化はダフ二等（Ｄａ
ｒｎｉ ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、 ｌｎｌ’ｅｃｔ、 Ｄ
ｉｓ、 １３３：５１３８（１９７Ｂ））により報告さ
れた。ロケット免疫電気泳動及び免疫拡散は上記スツウ
等（Ｓｚｕ ｅＬ ａｌ、）により説明された様に行な
われた。
ＦＴＩＲ分光光度法
複合体の組成物はＶｉ及びタンパク質を標準として用い
て求めた。１−ｇの■ｉ、担体タンパク質、或いはＶｉ
複合体を１００ｍｇのＫＢｒに添加し、２、Ｏｍｌの蒸
留水に溶解した。この試料を凍結乾燥し、ペレットにプ
レス成型した。ＦＴＩＲスペクトルをＮ１ｃｏｌｅｔ
７１９９分光光度計に記録し、タケット等（Ｔａｃｋｅ
ｔ ｅｔ ａｌ、 Ｊ、 Ｉｎｆｅｃｔ、 Ｄｌｓ。
て求めた。１−ｇの■ｉ、担体タンパク質、或いはＶｉ
複合体を１００ｍｇのＫＢｒに添加し、２、Ｏｍｌの蒸
留水に溶解した。この試料を凍結乾燥し、ペレットにプ
レス成型した。ＦＴＩＲスペクトルをＮ１ｃｏｌｅｔ
７１９９分光光度計に記録し、タケット等（Ｔａｃｋｅ
ｔ ｅｔ ａｌ、 Ｊ、 Ｉｎｆｅｃｔ、 Ｄｌｓ。
１５４：３４２ （１９８Ｂ））により説明されるよう
にして分析した。
にして分析した。
１３ｃ核磁気共鳴
Ｖｉ （２０ｍｇ／ａ＋ＩＤ２）（７）’ＣＮＭＲス
ペクトルを６０℃でＮｌｅｏｌｃｔ分光光度社中に記録
した。
ペクトルを６０℃でＮｌｅｏｌｃｔ分光光度社中に記録
した。
５．０龍試料細胞を用い分光光度計を完全プロトン脱カ
ップリング及び直角位相検出でのパルスフーリエ変換モ
ードにおいて６７．９ＭＨｚで操作した。４−Ｈｚ線拡
大をフーリエ変換前に信号にかけ信号対騒音比を高めた
。
ップリング及び直角位相検出でのパルスフーリエ変換モ
ードにおいて６７．９ＭＨｚで操作した。４−Ｈｚ線拡
大をフーリエ変換前に信号にかけ信号対騒音比を高めた
。
５ＤＳ−ＰＡＣ；Ｅ
タンパク質及びそれらの複合体の分子量を７．５％ポリ
アクリルアミドゲル内で測定した。
アクリルアミドゲル内で測定した。
５〜１０μｇの２−ＭＥを有する或いは有さないタンパ
ク質をタンパク質標準と共に同時に電気泳動させた。ゲ
ルはクーマシーブルーで染色した。
ク質をタンパク質標準と共に同時に電気泳動させた。ゲ
ルはクーマシーブルーで染色した。
結果
Ｓ、タイフィ及びＣ，フロインデイのある菌株からのＶ
ｉはＮａｃＧａｌＡ酸の線形ホモポリマーであり、０３
位において色々０−アセチル化されている。ＦＴＩＲ及
び１３ＣＮＭＲ分光光度法は用いられたＣ、フロインデ
イの菌株及びＳ、タイフィのＴｙ２菌株からのＶｉの構
造は特別不可能であることを示した。免疫拡散分析は、
Ｂ２６０抗ｖｉ抗血清と反応させられた場合のＣ。
ｉはＮａｃＧａｌＡ酸の線形ホモポリマーであり、０３
位において色々０−アセチル化されている。ＦＴＩＲ及
び１３ＣＮＭＲ分光光度法は用いられたＣ、フロインデ
イの菌株及びＳ、タイフィのＴｙ２菌株からのＶｉの構
造は特別不可能であることを示した。免疫拡散分析は、
Ｂ２６０抗ｖｉ抗血清と反応させられた場合のＣ。
フロインデイ及びＳ、タイフィからのＶｉ多糖類間の同
一の反応を示した。本発明において説明される具体例に
おける免疫化及び複合体の合成に用いられるＶｉは第２
図に示されるように１３ＯＮＭＨにより測定された約８
０％のＯ−アセチル／ｓｏｌ繰返し単位を含んだ。Ｖｉ
はビシナルヒドロキシル基を有しないので、複合化反応
においてはカルボキシル基が活性化部位として働いた。
一の反応を示した。本発明において説明される具体例に
おける免疫化及び複合体の合成に用いられるＶｉは第２
図に示されるように１３ＯＮＭＨにより測定された約８
０％のＯ−アセチル／ｓｏｌ繰返し単位を含んだ。Ｖｉ
はビシナルヒドロキシル基を有しないので、複合化反応
においてはカルボキシル基が活性化部位として働いた。
第一のＶｉ複合体はＶｉのカルボキシル基とジフテリア
トキソイドのアミノ基の間の直接複合化を触媒するＥＤ
ＡＣを用いて調製された。代表的生成物Ｖ ｉ−Ｄ Ｔ
＋により例示されるこの反応からの収率は出発物質の
約３％であった。この複合体及び二つの対照Ｖｉ及び塩
水によりマウス内に顕在化されたＶｉ抗体濃度を表１に
示す。
トキソイドのアミノ基の間の直接複合化を触媒するＥＤ
ＡＣを用いて調製された。代表的生成物Ｖ ｉ−Ｄ Ｔ
＋により例示されるこの反応からの収率は出発物質の
約３％であった。この複合体及び二つの対照Ｖｉ及び塩
水によりマウス内に顕在化されたＶｉ抗体濃度を表１に
示す。
前免疫血清内に或いはこの実験及び引続く実験における
塩水（対照）で注射されたマウスからはＶｉ抗体は存在
しなかった。Ｖｉの０．５．５．０或いは５０．０μｇ
の投与量は１回目、２回目及び３回目の注射後に同様な
濃度の抗体を顕在化させた（３回目の注射後の５． ０
μｇのＶｉを注射された群における僅かにより高い濃度
の抗体は統計的に異るものではなかった）。５．０或い
は５０．０μｇのＶｉ−ＤＴ、＜７３２回目及び３回目
の注射後の抗体濃度はＶｉ単独により顕在化されるもの
よりも約７倍高かった（ｐ −０，００１） −Ｖ ｉ
−Ｄ Ｔ ｒ （’） 三つ（Ｆ） 投与量”） 各々
は２回目の注射後にブースタ一応答を顕在化させた。Ｖ
ｉ−Ｄ Ｔ ＋ （Ｄ ５ 、 Ｏ及び５０．０ｕｔ
（Ｄ投与量によっては顕在化された抗体濃度の相違は見
られず、これらの投与量の両者は１回目の注射のみの後
の０．５μｇのこの複合体よりもより免疫原性であった
（ｐ＝０．００１）。
塩水（対照）で注射されたマウスからはＶｉ抗体は存在
しなかった。Ｖｉの０．５．５．０或いは５０．０μｇ
の投与量は１回目、２回目及び３回目の注射後に同様な
濃度の抗体を顕在化させた（３回目の注射後の５． ０
μｇのＶｉを注射された群における僅かにより高い濃度
の抗体は統計的に異るものではなかった）。５．０或い
は５０．０μｇのＶｉ−ＤＴ、＜７３２回目及び３回目
の注射後の抗体濃度はＶｉ単独により顕在化されるもの
よりも約７倍高かった（ｐ −０，００１） −Ｖ ｉ
−Ｄ Ｔ ｒ （’） 三つ（Ｆ） 投与量”） 各々
は２回目の注射後にブースタ一応答を顕在化させた。Ｖ
ｉ−Ｄ Ｔ ＋ （Ｄ ５ 、 Ｏ及び５０．０ｕｔ
（Ｄ投与量によっては顕在化された抗体濃度の相違は見
られず、これらの投与量の両者は１回目の注射のみの後
の０．５μｇのこの複合体よりもより免疫原性であった
（ｐ＝０．００１）。
５ＰＤＰとのＶｉタンパク質複合体
Ｖｉ複合体の収率及び免疫原性を増大させるために別の
複合化操作、Ｖｉの共有結合チオール化誘導体と５ＰＤ
Ｐ−誘導化タンパク質の方法を研究した。
複合化操作、Ｖｉの共有結合チオール化誘導体と５ＰＤ
Ｐ−誘導化タンパク質の方法を研究した。
Ｖｉ上へのチオール基の導入はシステアミン（第１ｂ図
）のアミノ基とＶｉのカルボキシル基の間にＥＤＡＣの
存在下にアミド結合を形成することにより試みられた。
）のアミノ基とＶｉのカルボキシル基の間にＥＤＡＣの
存在下にアミド結合を形成することにより試みられた。
この方式によりＶｉに添加されたチオールの収率は１％
ｗ ／ ｗ未満であり、これはおそらくシステアミンの
ＳＨ基が酸化されたためと思われる。この可能性を避け
るためにシスタミンを用いた。シスタミンのチオールは
ジスルフィド結合により結合されており、従って酸化か
ら保護される（第１ｃ図）。アミド結合形成を触媒する
ためにＥＤＡＣを用いて、約６％ｗ ／ ｗのシスタミ
ンがＶｉに結合した。ジスルフィド結合をジチオスレイ
トールで還元後、チオールエステルの収率は繰返し単糖
類の０． ５〜２％であった。Ｖｉの凍結乾燥されたシ
スタミン誘導体は一２０℃で安定であった。
ｗ ／ ｗ未満であり、これはおそらくシステアミンの
ＳＨ基が酸化されたためと思われる。この可能性を避け
るためにシスタミンを用いた。シスタミンのチオールは
ジスルフィド結合により結合されており、従って酸化か
ら保護される（第１ｃ図）。アミド結合形成を触媒する
ためにＥＤＡＣを用いて、約６％ｗ ／ ｗのシスタミ
ンがＶｉに結合した。ジスルフィド結合をジチオスレイ
トールで還元後、チオールエステルの収率は繰返し単糖
類の０． ５〜２％であった。Ｖｉの凍結乾燥されたシ
スタミン誘導体は一２０℃で安定であった。
マウスは０．１ｍｌの各ワクチン或いは塩水を２週間層
して皮下注射した。各実験群に対して８匹のマウス、各
注射後１０日後にマウスを放血し、それらの血清のＶｉ
抗体をＲＩＡ（９）により測定した。結果を幾何学的平
均及び８０％信頼性限界として表わす。
して皮下注射した。各実験群に対して８匹のマウス、各
注射後１０日後にマウスを放血し、それらの血清のＶｉ
抗体をＲＩＡ（９）により測定した。結果を幾何学的平
均及び８０％信頼性限界として表わす。
Ｖｉ莢膜多糖類複合体の物理化学的特性化Ｖｉ莢膜多糖
類−シスタミン誘導体のジスルフィド結合を複合化反応
に先立ちジチオスレイトールで還元した。代表的複合体
Ｖ ｌ −ＣＴ ｖ ＋ ＋ ＋の分子径（Ｋｄ＜０．
１）は第３図のゲル濾過プロフィールにより図示される
ようにタンパク１（Ｋｄ−０，６４）或いはｖｉ莢膜多
糖類（Ｋｄ−０，３６）のそれより大きかった。
類−シスタミン誘導体のジスルフィド結合を複合化反応
に先立ちジチオスレイトールで還元した。代表的複合体
Ｖ ｌ −ＣＴ ｖ ＋ ＋ ＋の分子径（Ｋｄ＜０．
１）は第３図のゲル濾過プロフィールにより図示される
ようにタンパク１（Ｋｄ−０，６４）或いはｖｉ莢膜多
糖類（Ｋｄ−０，３６）のそれより大きかった。
これらの研究において用いられたチオール化Ｖｉ莢膜多
糖類、５ＰＤＰ−タンパク質誘導体及び複合体の組成を
表２に掲げる。
糖類、５ＰＤＰ−タンパク質誘導体及び複合体の組成を
表２に掲げる。
複合化反応の中間及び最終生成物の分子径の変化を更に
第４図に示される如（，５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し
た。ＢＳＡ−８ＰＤＰ誘導体は生来のＢＳＡのそれと同
様なパターンを示し、５ＰＤＰの反応中に凝集が起こら
なかったことを示している。Ｖｉ−ＢＳＡ、■は全ての
Ｖｉ莢膜多糖類複合体と同様におそらくその大きな径の
ためにゲルに入ることができなかった。２−Ｍｅで還元
されたＶｉ−ＢＳＡ、■は生来のＢＳＡと同様なバンド
を示し、ｖｔＡ膜多糖類はこのタンパク質にジスルフィ
ド結合により結合していることを示した。
第４図に示される如（，５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し
た。ＢＳＡ−８ＰＤＰ誘導体は生来のＢＳＡのそれと同
様なパターンを示し、５ＰＤＰの反応中に凝集が起こら
なかったことを示している。Ｖｉ−ＢＳＡ、■は全ての
Ｖｉ莢膜多糖類複合体と同様におそらくその大きな径の
ためにゲルに入ることができなかった。２−Ｍｅで還元
されたＶｉ−ＢＳＡ、■は生来のＢＳＡと同様なバンド
を示し、ｖｔＡ膜多糖類はこのタンパク質にジスルフィ
ド結合により結合していることを示した。
抗原分析
Ｖｉ莢膜多糖類複合体をその成分の各々に対する抗血清
を用いた免疫拡散により分析した。抗−Ｖｉ及び抗−Ｂ
ＳＡ血清は複合体と部分的同一反応生成物を形成し、ｖ
ｉ莢膜多糖類及びＢＳＡが共有的に結合していることを
示した。Ｖｉ莢膜多糖類抗血清はＶｉ莢膜多糖類と反応
し、Ｖｉ−Ｂ Ｓ Ａ ＋ ｖは部分的同一反応物と反
応した。沈澱の刺戟はＶｉ莢膜多糖類系統を抗血清とＶ
ｉＢＳＡ （図示せず）との反応よりも優先させた。
を用いた免疫拡散により分析した。抗−Ｖｉ及び抗−Ｂ
ＳＡ血清は複合体と部分的同一反応生成物を形成し、ｖ
ｉ莢膜多糖類及びＢＳＡが共有的に結合していることを
示した。Ｖｉ莢膜多糖類抗血清はＶｉ莢膜多糖類と反応
し、Ｖｉ−Ｂ Ｓ Ａ ＋ ｖは部分的同一反応物と反
応した。沈澱の刺戟はＶｉ莢膜多糖類系統を抗血清とＶ
ｉＢＳＡ （図示せず）との反応よりも優先させた。
ジフテリアトキソイド、テタヌストキソイド、及びコレ
ラトキシンを用いて調製された複合体は免疫拡散による
それらの同−源の抗−タンパク質抗血清と反応しなかっ
たがこれらの抗血清によりロケット免疫電気泳動（図示
せず）により沈澱した。
ラトキシンを用いて調製された複合体は免疫拡散による
それらの同−源の抗−タンパク質抗血清と反応しなかっ
たがこれらの抗血清によりロケット免疫電気泳動（図示
せず）により沈澱した。
Ｖｌ −ＣＴｘｕｔ複合体の残存毒性
コレラトキシンの毒性はそのＶｉ莢膜多糖類への複合化
により減少した。ＣＨＯ細胞アッセイにおいて１０４倍
の減少が観察された。しかしながら、ウサギにおける皮
膚試験は１０３倍の毒性の減少を示したに過ぎなかった
。０．５ｍｌのＶｉ−ＣＴｘ＋ｔ（１ヒト投与ｊｌ）の
注射はマウスには何等の効果も有さなかったが、５．０
ｍｌのＶｉ−”Ｘｌｌの腹腔的注射の結果３匹のモルモ
ットのうち２匹が死亡した。従って、この複合体は実験
室動物における免疫原性 表３はマウスの免疫原性を示す。
により減少した。ＣＨＯ細胞アッセイにおいて１０４倍
の減少が観察された。しかしながら、ウサギにおける皮
膚試験は１０３倍の毒性の減少を示したに過ぎなかった
。０．５ｍｌのＶｉ−ＣＴｘ＋ｔ（１ヒト投与ｊｌ）の
注射はマウスには何等の効果も有さなかったが、５．０
ｍｌのＶｉ−”Ｘｌｌの腹腔的注射の結果３匹のモルモ
ットのうち２匹が死亡した。従って、この複合体は実験
室動物における免疫原性 表３はマウスの免疫原性を示す。
ＣＦ１６００ ：１６の安定要請を合格しなかった。
メスの１６〜２０．のＢ Ａ Ｌ Ｂ ／ ｃ マウス
に２週間離して２，５μｇＶｉ単独或いはＶｉ複合体を
含む０，２ｍｌを皮下注射した。各群のマウスを最終注
射後１０１」後に放血し、Ｖｉ抗体をＲＩＡにより測定
した〔５９〕。
に２週間離して２，５μｇＶｉ単独或いはＶｉ複合体を
含む０，２ｍｌを皮下注射した。各群のマウスを最終注
射後１０１」後に放血し、Ｖｉ抗体をＲＩＡにより測定
した〔５９〕。
ａＮ、Ｄ、はなされなかったことを表わす。
ｂ 水酸化アルミニウム上に吸着、０．５■ＡＩ
／ｍｌ。
／ｍｌ。
ｃ Ｖｉの分子径が超音波照射により６５．０００に
減少された〔５７〕。
減少された〔５７〕。
ｄ対ｅ、 ｇ、 ｉ、 ｊ、 ｋ、 １ ： ｐ＝０．
００１、ｄ対ｆ ： ｐ−０，００２、ｄ対ｈ：ｐ−０
，０４、ｍ対ｇ：ｐ−ｏ、０００３、ｎ対ｇ：ｐ−０、
００３ 免疫前血清或いは塩水で注射されたマウスのいづれも検
出可能な濃度のＶｉ莢膜多糖類抗体を有さなかった。全
ての複合体はＶｉ莢膜多糖類単独よりも高い濃度の抗体
を顕在化した（ｐ＝０．００１）。第１回目の注射後の
最も高い濃度の抗体は超音波照射により解重合されたＶ
ｉ莢膜多糖類から調製されたＶｉ−ＣＴにより顕在化さ
れたが、これらの相違は統計学的に有意ではなかった。
００１、ｄ対ｆ ： ｐ−０，００２、ｄ対ｈ：ｐ−０
，０４、ｍ対ｇ：ｐ−ｏ、０００３、ｎ対ｇ：ｐ−０、
００３ 免疫前血清或いは塩水で注射されたマウスのいづれも検
出可能な濃度のＶｉ莢膜多糖類抗体を有さなかった。全
ての複合体はＶｉ莢膜多糖類単独よりも高い濃度の抗体
を顕在化した（ｐ＝０．００１）。第１回目の注射後の
最も高い濃度の抗体は超音波照射により解重合されたＶ
ｉ莢膜多糖類から調製されたＶｉ−ＣＴにより顕在化さ
れたが、これらの相違は統計学的に有意ではなかった。
幾何学的平均抗体レベルにおける４倍以上の増大により
規定された第２回目の注射後のブースタ一応答は吸着さ
れたＶｉ−ＣＴを除いて全ての複合体で注射された動物
に観察された。Ｖｉ−ＴＴｘｘｖも又第３回目の注射後
に抗体の増大を顕在化した。しかしながら、この群にお
ける濃度は２回目の注射後のその他の複合体に見られた
ものと同様であった。最も貧弱な応答は吸着されたＶ
１− ＣＴｘｕにより顕在化され、この調製物は第１回
目の注射後に最も低い濃度の抗体を顕在化し、第２回及
び第３回目の注射後にブースタ一応答はなかった。
規定された第２回目の注射後のブースタ一応答は吸着さ
れたＶｉ−ＣＴを除いて全ての複合体で注射された動物
に観察された。Ｖｉ−ＴＴｘｘｖも又第３回目の注射後
に抗体の増大を顕在化した。しかしながら、この群にお
ける濃度は２回目の注射後のその他の複合体に見られた
ものと同様であった。最も貧弱な応答は吸着されたＶ
１− ＣＴｘｕにより顕在化され、この調製物は第１回
目の注射後に最も低い濃度の抗体を顕在化し、第２回及
び第３回目の注射後にブースタ一応答はなかった。
同一成分を用いて調製された複合体の免疫原性に相違が
あった。Ｖ ｌ −ＣＴ ｖ ＋ ＋ ＋及びＶｉ−Ｃ
ＴＸｌｌの第１回目の注射はコレラトキシン抗体におい
て約３０倍の増大を誘発し、それは又第２回目及び第３
回目の注射後に４倍に上昇した。
あった。Ｖ ｌ −ＣＴ ｖ ＋ ＋ ＋及びＶｉ−Ｃ
ＴＸｌｌの第１回目の注射はコレラトキシン抗体におい
て約３０倍の増大を誘発し、それは又第２回目及び第３
回目の注射後に４倍に上昇した。
Ｖ ｓ −ＣＴ Ｘ Ｉ ｌはＶ ｉ −ＣＴｖ、、、
よりもより高い濃度のコレラトキシン抗体並びにｖｉ莢
膜多糖類抗体を顕在化した。
よりもより高い濃度のコレラトキシン抗体並びにｖｉ莢
膜多糖類抗体を顕在化した。
表４は若いアカゲザルにおける免疫原性を示す。
サルを３週間間隔で２５μｇのＶｉ或いは１５μｇのＰ
ｎ６Ｂ−ＴＴのいづれかを含有する０、５ａ＋１を皮下
注射した。サルを各注射前及び最終注射後３週間後に採
血した。ＲＩＡ（９）により測定したＶｉ抗体を幾何学
平均及び８０％信頼性限界として表わす。
ｎ６Ｂ−ＴＴのいづれかを含有する０、５ａ＋１を皮下
注射した。サルを各注射前及び最終注射後３週間後に採
血した。ＲＩＡ（９）により測定したＶｉ抗体を幾何学
平均及び８０％信頼性限界として表わす。
Ｖｉ莢膜多糖類の単一注射は試験された６匹のサルの５
匹中にＶｉ莢膜多糖類抗体を顕在化した（ｐ−０，００
４）。全ての６匹のサル内において、Ｖｉ莢膜多糖類抗
体の濃度はＶｉ莢膜多糖類の第２回目の注射後減少した
。Ｖｉ−ＣＴｘ、、を注射した８匹のサルの内７匹は第
１回目の注射後約２０倍の抗体の増大をもって応答した
。１匹の非応答サルは０．３５μｇの抗体／ｍｌの免疫
前濃度を有した。この群における複合体の第２回目の抗
体はＶ ｌ −ＣＴ ｘ＋ ＋のｆｆ１１回目の注射に
より誘発されたそれよりも約３倍の増大（１）−０，０
０２）及び免疫前濃度の約６０倍（ｐ −０，００３）
を顕在化した。Ｖ ｔ −ＣＴＸ、、 （７）第１回目
の注射に応答しなかったサルは第２回目の注射後に２倍
の抗体の増大を示した。Ｐｎ６Ｂ −ＴＴ（対照）の注
射後にはＶｉ莢膜多糖類抗体には何等の変化も見られな
かった。
匹中にＶｉ莢膜多糖類抗体を顕在化した（ｐ−０，００
４）。全ての６匹のサル内において、Ｖｉ莢膜多糖類抗
体の濃度はＶｉ莢膜多糖類の第２回目の注射後減少した
。Ｖｉ−ＣＴｘ、、を注射した８匹のサルの内７匹は第
１回目の注射後約２０倍の抗体の増大をもって応答した
。１匹の非応答サルは０．３５μｇの抗体／ｍｌの免疫
前濃度を有した。この群における複合体の第２回目の抗
体はＶ ｌ −ＣＴ ｘ＋ ＋のｆｆ１１回目の注射に
より誘発されたそれよりも約３倍の増大（１）−０，０
０２）及び免疫前濃度の約６０倍（ｐ −０，００３）
を顕在化した。Ｖ ｔ −ＣＴＸ、、 （７）第１回目
の注射に応答しなかったサルは第２回目の注射後に２倍
の抗体の増大を示した。Ｐｎ６Ｂ −ＴＴ（対照）の注
射後にはＶｉ莢膜多糖類抗体には何等の変化も見られな
かった。
上記証拠はＶｉ莢膜多糖類により顕在化された抗体はチ
フス熱に対して免疫を与えることを示す。
フス熱に対して免疫を与えることを示す。
Ｖｉの病原的及び保護的役割は従ってチフス熱における
Ｖｉ莢膜多糖類の病原的及び保護的役割についての論争
にも拘らず他のカプセル化された細菌病原体の莢膜多糖
類と同様である。
Ｖｉ莢膜多糖類の病原的及び保護的役割についての論争
にも拘らず他のカプセル化された細菌病原体の莢膜多糖
類と同様である。
本発明に従って莢膜多糖類により顕在化される主たる保
護免疫応答は血清抗体である。莢膜多糖類により誘発さ
れた血清変換速度及び後免疫化水準はそれらの保護的作
用と関連付けられた。
護免疫応答は血清抗体である。莢膜多糖類により誘発さ
れた血清変換速度及び後免疫化水準はそれらの保護的作
用と関連付けられた。
チフス熱が風土病であり、又高割合の栄養不良及びその
他の急性及び慢性感染病のある領域の住人におけるＶＬ
莢膜多糖類により誘発される血清抗体応答は最適よりも
少ないものである。従って、Ｖｉ莢膜多糖類はその免疫
原性を増大し、且つその上にＴ−依存性の特性を与える
ためにトキシン−依存性タンパク質に共有結合された。
他の急性及び慢性感染病のある領域の住人におけるＶＬ
莢膜多糖類により誘発される血清抗体応答は最適よりも
少ないものである。従って、Ｖｉ莢膜多糖類はその免疫
原性を増大し、且つその上にＴ−依存性の特性を与える
ためにトキシン−依存性タンパク質に共有結合された。
この合成は次のいくつかの利点を与える：
１、 いづれの成分の架橋がない。
２、 反応はｐＨにおいて水溶液中で行われる。
３、 合成はカルボキシル官能基を有するその他の多糖
類に適用可能である。
類に適用可能である。
４、 担体タンパク質は僅かに変成されているのみであ
り、抗体を生来のタンパク質に顕在化することができる
。
り、抗体を生来のタンパク質に顕在化することができる
。
得られた複合体はＶｉ莢膜多糖類単独よりもより＾濃度
の抗体を顕在化させ、離乳マウス及び若い霊長類にブー
スタ一応答を誘発させた。ヘモフィルスΦインフルエン
ザｂＪＪ１タンパク質複合体の同様な研究もそれらのヒ
トにおける高められた抗体応答を予測するものであった
。
の抗体を顕在化させ、離乳マウス及び若い霊長類にブー
スタ一応答を誘発させた。ヘモフィルスΦインフルエン
ザｂＪＪ１タンパク質複合体の同様な研究もそれらのヒ
トにおける高められた抗体応答を予測するものであった
。
ＩｇＧ Ｖｉ莢膜多糖類抗体はＳ、タイフィで攻撃さ
れたマウスを保護した。Ｖｉ莢膜多糖類がヒトにおいて
ＩｇＧ抗体を顕在化したという間接的な証拠が提供され
た。Ｈ，インフルエンザｂ型タンパク質複合体はＩｇＧ
ＣＰＳ抗体を顕在化するのでＶｉ複合体も又ＩｇＧ
抗体を顕在化するようである。
れたマウスを保護した。Ｖｉ莢膜多糖類がヒトにおいて
ＩｇＧ抗体を顕在化したという間接的な証拠が提供され
た。Ｈ，インフルエンザｂ型タンパク質複合体はＩｇＧ
ＣＰＳ抗体を顕在化するのでＶｉ複合体も又ＩｇＧ
抗体を顕在化するようである。
チフス熱からの回復は常にＳ、タイフィに対する免疫を
与えるものではない。ツァング等（Ｔｓａｎｇ ａｔ
ａｌ、、 Ｊ、 ＣｌＩｎ、 Ｍｉｅｒｏｂｌｏｌ、
２５：５３１（１９８７））はＶｉ莢膜多糖類単独がＳ
、タイフィ菌株５６０Ｔｙよりもマウスにおけるより良
い免疫原であると報告した。増加する証拠はある種の状
況において同−源の細菌のそれに対比して莢膜多糖類−
タンパク質複合体のより優れた免疫原性を指摘する。即
ち： １、Ｈ，インフルエンザｂ型の複合体は全身感染症より
も幼児及び若い子供においてより高濃度の莢膜多糖類抗
体を顕在化する。
与えるものではない。ツァング等（Ｔｓａｎｇ ａｔ
ａｌ、、 Ｊ、 ＣｌＩｎ、 Ｍｉｅｒｏｂｌｏｌ、
２５：５３１（１９８７））はＶｉ莢膜多糖類単独がＳ
、タイフィ菌株５６０Ｔｙよりもマウスにおけるより良
い免疫原であると報告した。増加する証拠はある種の状
況において同−源の細菌のそれに対比して莢膜多糖類−
タンパク質複合体のより優れた免疫原性を指摘する。即
ち： １、Ｈ，インフルエンザｂ型の複合体は全身感染症より
も幼児及び若い子供においてより高濃度の莢膜多糖類抗
体を顕在化する。
２、 これらの複合体の１〜３０の注射は同−源の細
菌により顕在化されたものよりマウスにおいてより高濃
度の抗体を顕在化させた。
菌により顕在化されたものよりマウスにおいてより高濃
度の抗体を顕在化させた。
多くのカプセル化細菌病原体の莢膜多糖類と異り、Ｖｉ
莢膜多糖類は血清抗体を誘発し、及びマウスにおけるＳ
、タイフィによる致死的攻撃に対して保護を与えた。Ｖ
ｉ莢膜多糖類の再注射はマウスにブースター効果を誘発
しなか・つた。アカゲザルにおいては、再注射はＶｉ莢
膜多糖類抗体の濃度を減少させた。免疫化されたチンパ
ンジーは検出可能なＶｉ莢膜多糖類抗体を有さず、Ｓ、
タイフィによる攻撃に対して保護されなかった。
莢膜多糖類は血清抗体を誘発し、及びマウスにおけるＳ
、タイフィによる致死的攻撃に対して保護を与えた。Ｖ
ｉ莢膜多糖類の再注射はマウスにブースター効果を誘発
しなか・つた。アカゲザルにおいては、再注射はＶｉ莢
膜多糖類抗体の濃度を減少させた。免疫化されたチンパ
ンジーは検出可能なＶｉ莢膜多糖類抗体を有さず、Ｓ、
タイフィによる攻撃に対して保護されなかった。
５ＰＤＰを用いて調製された複合体により顕在化される
血清抗体応答はＥＤＡＣとの直接結合により調製された
ものよりもより高かった。この知見に対する説明は５Ｐ
ＤＰのような架橋試薬が二つの九分子の間に「スペーサ
ー」で複合体を形成することである。この性質は担体タ
ンパク質とヘルパーＴ−リンパ球の間により有効な相互
作用を可能にするのかもしれない。
血清抗体応答はＥＤＡＣとの直接結合により調製された
ものよりもより高かった。この知見に対する説明は５Ｐ
ＤＰのような架橋試薬が二つの九分子の間に「スペーサ
ー」で複合体を形成することである。この性質は担体タ
ンパク質とヘルパーＴ−リンパ球の間により有効な相互
作用を可能にするのかもしれない。
Ｖｉ−ＣＴ複合体により顕在化されたより高濃度のＶｉ
莢膜多糖類抗体はコレラトキシンの残存活性（ｉ性）に
より及ぼされたアジュバント効果により説明することが
可能である。Ｖｉ１Ａ！ｌ多糖類との複合体の形成はコ
レラトキシンの特性を約１．０ＸＩＯ３〜１．０ＸＩＯ
’倍減少させた。
莢膜多糖類抗体はコレラトキシンの残存活性（ｉ性）に
より及ぼされたアジュバント効果により説明することが
可能である。Ｖｉ１Ａ！ｌ多糖類との複合体の形成はコ
レラトキシンの特性を約１．０ＸＩＯ３〜１．０ＸＩＯ
’倍減少させた。
得られた毒性はモルモットに対しては致死的であったが
、マウス及びサルに対しては致死的ではなかった。残存
毒性は連邦規制法規（Ｃｏｄｅ ｏｌ’Ｆｅｄｅｒａｌ
Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ ）に記載される細菌ワクチ
ンに対する一般的安全試験には合格しなかった。
、マウス及びサルに対しては致死的ではなかった。残存
毒性は連邦規制法規（Ｃｏｄｅ ｏｌ’Ｆｅｄｅｒａｌ
Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ ）に記載される細菌ワクチ
ンに対する一般的安全試験には合格しなかった。
これはおそら（モルモットのコレラトキシンの致死効果
に対する大きい感受性によるものと思われる。
に対する大きい感受性によるものと思われる。
Ｓ、タイフィはヒトのみの生息生物及び病原体であり、
末だｖｉ莢膜多糖類−複合体の保護活性を予測するため
に用いることのできる動物モデル或いはｉｎ ｖｌｔｒ
ｏの免疫関連性がない。マウスのムシン−＾揚致死感染
症のみが細胞チフスワクチンの臨床的有効性と関連する
ことが示された。このマウス保護モデルは能動的に誘発
されても或いは受動的に投与されてもＶｉ莢膜多糖類抗
体の目安であることが示された。本発明においてＶｉ莢
膜多糖類抗体応答はこのバイオアッセイよりもむしろラ
ジオイムノアッセイにより実験室動物内の複合体により
誘発された応答により測定された。
末だｖｉ莢膜多糖類−複合体の保護活性を予測するため
に用いることのできる動物モデル或いはｉｎ ｖｌｔｒ
ｏの免疫関連性がない。マウスのムシン−＾揚致死感染
症のみが細胞チフスワクチンの臨床的有効性と関連する
ことが示された。このマウス保護モデルは能動的に誘発
されても或いは受動的に投与されてもＶｉ莢膜多糖類抗
体の目安であることが示された。本発明においてＶｉ莢
膜多糖類抗体応答はこのバイオアッセイよりもむしろラ
ジオイムノアッセイにより実験室動物内の複合体により
誘発された応答により測定された。
Ｖｉ莢膜多糖類は高率のチフス熱（約１％／年）を有す
る領域における二つの二重基礎、調節臨床試験において
保護的抗原であることが証明された。
る領域における二つの二重基礎、調節臨床試験において
保護的抗原であることが証明された。
両研究において、Ｖｉ莢膜多糖類の保護効率は約７０％
であった。これらの領域における患者の約７５％は４倍
以上の血清Ｖｉ莢膜多糖類抗体の上昇をもって応答した
。これに対して、Ｖｉ莢膜多糖類はフランス及び米国に
おける若い大人の９５〜１００％において４倍以上の上
昇を顕在化した。
であった。これらの領域における患者の約７５％は４倍
以上の血清Ｖｉ莢膜多糖類抗体の上昇をもって応答した
。これに対して、Ｖｉ莢膜多糖類はフランス及び米国に
おける若い大人の９５〜１００％において４倍以上の上
昇を顕在化した。
本発明は抗体応答を高め且つＴ−依存性特性をＶｉ莢膜
多糖類に与えるためにＶｉ莢膜多糖類−タンパク質複合
体を合成する方法を提供する。本発明に従えば、Ｎ−ス
クシニミジル３− （・２−ピリジルジチオ）プロピオ
ネート（ＳＰＤＰ）などのへテロニ官能性架橋試薬を用
いてＶｉ莢膜多糖類のチオール誘導体をタンパク質に結
合する。
多糖類に与えるためにＶｉ莢膜多糖類−タンパク質複合
体を合成する方法を提供する。本発明に従えば、Ｎ−ス
クシニミジル３− （・２−ピリジルジチオ）プロピオ
ネート（ＳＰＤＰ）などのへテロニ官能性架橋試薬を用
いてＶｉ莢膜多糖類のチオール誘導体をタンパク質に結
合する。
この合成は再現可能であり、高収率のｖｌ−タンパク質
複合体を与え、又ジフテリア及びテタヌストキソイド類
などの幾つかの医学的に関連したタンパク質に適用可能
であった。得られた複合体はＶｉ単独よりもマウスおよ
び若いアカゲザルにおいてより免疫原性があった。本発
明の方法は又カルボキシル官能基を有するその他の多糖
類とのタンパク質複合体の合成にも用いることができる
。
複合体を与え、又ジフテリア及びテタヌストキソイド類
などの幾つかの医学的に関連したタンパク質に適用可能
であった。得られた複合体はＶｉ単独よりもマウスおよ
び若いアカゲザルにおいてより免疫原性があった。本発
明の方法は又カルボキシル官能基を有するその他の多糖
類とのタンパク質複合体の合成にも用いることができる
。
ワクチンは本発明のタンパク質複合体からタンパク質複
合体を塩水などの薬学的に許容可能な担体に添加するこ
とにより製造することができる。
合体を塩水などの薬学的に許容可能な担体に添加するこ
とにより製造することができる。
免疫化は２週間に１回、２回或いは３回宿主に注射する
ことにより行われる。十分なタンパク質複合体の投与量
は一体型当り約１μに’＝ｋＫ体重当り約１０００μｇ
の範囲である。
ことにより行われる。十分なタンパク質複合体の投与量
は一体型当り約１μに’＝ｋＫ体重当り約１０００μｇ
の範囲である。
以上本発明をある特定の実施態様に関連して説明したが
、多（の変化が可能であり、本発明から離れることなく
代替的材料及び試薬が用いられ得ることが了解されるで
あろう。場合によっては、その様な変化及び置換は何等
かの実験を必要とするかもしれないが、しかし場合によ
り日常的な試験が含まれるに過ぎない。
、多（の変化が可能であり、本発明から離れることなく
代替的材料及び試薬が用いられ得ることが了解されるで
あろう。場合によっては、その様な変化及び置換は何等
かの実験を必要とするかもしれないが、しかし場合によ
り日常的な試験が含まれるに過ぎない。
前記特定の実施態様の説明は本発明の一般的な性質を十
分に示すので、他のものは現在の知識を適用することに
よりその様な特定の実施態様を一般的概念から離れるこ
となく各種応用に修正及び／又は適用することができ、
従ってその様な適用及び修正は開示された実施態様の等
価物の意味及び範囲内に含まれるものである。又、本発
明において用いられた語句及び用語は説明を目的とした
ものであり、限定を目的としたものではない。
分に示すので、他のものは現在の知識を適用することに
よりその様な特定の実施態様を一般的概念から離れるこ
となく各種応用に修正及び／又は適用することができ、
従ってその様な適用及び修正は開示された実施態様の等
価物の意味及び範囲内に含まれるものである。又、本発
明において用いられた語句及び用語は説明を目的とした
ものであり、限定を目的としたものではない。
第１ａ図はサルモネラ・タイフィのＶｉ莢膜多糖類の組
返し単位の構造を示す。 第１ｂ図はシステアミンの構造を示す。 第１ｃ図はシスタミンの構造を示す。 第２図は超音波照射により解重合されたＶｉ（分子量６
５，０００、濃度２０ ｓａｇ／ ｍｌ ）の１３ＯＮ
ＭＲ化学シフトを示し、１３ｃ−富化アセトニトリルか
らのダウンフィールドが内部標準として使用された。ス
ペクトルはパルスフーリエ変換モードで６７．８９ＭＨ
ｚで操作されるＮ１ｃｏｌｅｔ２７０分光光度二Ｆによ
り５ｍｍ管内でＤ２０溶液に対して記録された。 第３図はＶ Ｌ −ＣＴＸ、、及びその成分Ｖｉ及びＣ
Ｔの０．２Ｍ ＮａＣ１中に平衡化されたｓ １００
０５ｅｐｈａｃｒｙｌを通してのゲル濾過プロフィール
を示す。チャートＡにおいて複合体が・−・、屈折率は
０−ｏを示し、０． Ｄ、は２８０ＯＡである。チャー
トＢにおいてＶｉ−シスタミンはムームであり、屈折率
及びＣＴはΔ−Δであり、０．Ｄ、は２８０ＯＡである
。 第４図はウシ血清アルブミン及びそれのＶｉとの複合体
のポリアクリルアミドゲル（７，５％）電気泳動パター
ンを示す写真である。レーン１〜４は２−ＭＥにより還
元された試料の移動パターンを示し、レーン５〜８は２
−ＭＥにより処理されなかった試料を表わす。レーン２
及び５はＶｉ−Ｂ Ｓ Ａ ＋ ｖを示し、レーン３及
び６はＢＳＡ−ＳＰＤＰを示し、レーン４及び７はＢＳ
Ａを示し、及び１及び８はタンパク質標準を示す。 第５図は１％アガロースゲル中で各種抗血清と反応する
Ｖｉ−ＢＳＡＩｖ複合体の免疫拡散パターンを示す写真
である。中心ウェルは１５μｌのＶ Ｌ −Ｂ Ｓ Ａ
＋ｖ （０、５ｔｕｇ／ ｍｌ）を含有した。ウェル
１及び４はＢｕｒｒｏ ２６０抗−８，タイフィＴＶ２
抗血清であり、ウェル２及び３はウサギ抗−ＢＳＡ抗血
清である。
返し単位の構造を示す。 第１ｂ図はシステアミンの構造を示す。 第１ｃ図はシスタミンの構造を示す。 第２図は超音波照射により解重合されたＶｉ（分子量６
５，０００、濃度２０ ｓａｇ／ ｍｌ ）の１３ＯＮ
ＭＲ化学シフトを示し、１３ｃ−富化アセトニトリルか
らのダウンフィールドが内部標準として使用された。ス
ペクトルはパルスフーリエ変換モードで６７．８９ＭＨ
ｚで操作されるＮ１ｃｏｌｅｔ２７０分光光度二Ｆによ
り５ｍｍ管内でＤ２０溶液に対して記録された。 第３図はＶ Ｌ −ＣＴＸ、、及びその成分Ｖｉ及びＣ
Ｔの０．２Ｍ ＮａＣ１中に平衡化されたｓ １００
０５ｅｐｈａｃｒｙｌを通してのゲル濾過プロフィール
を示す。チャートＡにおいて複合体が・−・、屈折率は
０−ｏを示し、０． Ｄ、は２８０ＯＡである。チャー
トＢにおいてＶｉ−シスタミンはムームであり、屈折率
及びＣＴはΔ−Δであり、０．Ｄ、は２８０ＯＡである
。 第４図はウシ血清アルブミン及びそれのＶｉとの複合体
のポリアクリルアミドゲル（７，５％）電気泳動パター
ンを示す写真である。レーン１〜４は２−ＭＥにより還
元された試料の移動パターンを示し、レーン５〜８は２
−ＭＥにより処理されなかった試料を表わす。レーン２
及び５はＶｉ−Ｂ Ｓ Ａ ＋ ｖを示し、レーン３及
び６はＢＳＡ−ＳＰＤＰを示し、レーン４及び７はＢＳ
Ａを示し、及び１及び８はタンパク質標準を示す。 第５図は１％アガロースゲル中で各種抗血清と反応する
Ｖｉ−ＢＳＡＩｖ複合体の免疫拡散パターンを示す写真
である。中心ウェルは１５μｌのＶ Ｌ −Ｂ Ｓ Ａ
＋ｖ （０、５ｔｕｇ／ ｍｌ）を含有した。ウェル
１及び４はＢｕｒｒｏ ２６０抗−８，タイフィＴＶ２
抗血清であり、ウェル２及び３はウサギ抗−ＢＳＡ抗血
清である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、カルボキシル基を有する莢膜多糖類をタンパク質に
複合化する方法において、多糖類のチオール誘導体を形
成し、該チオール誘導体をヘテロ二官能性架橋剤を用い
てタンパク質に結合させることを特徴とする方法。 ２、架橋剤がＮ−スクシニミジル３−（２−ピリジルジ
チオ）プロピオネートである請求項１に記載の方法。 ３、莢膜多糖類がＶｉ莢膜多糖類である請求項１に記載
の方法。 ４、タンパク質がテタヌストキソイドである請求項３に
記載の方法。 ５、タンパク質がジフテリアトキソイドである請求項３
に記載の方法。 ６、タンパク質がコレラトキシン及びコレラトキシンの
β−サブユニットからなる群から選ばれる請求項３に記
載の方法。 ７、タンパク質がヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａ
ｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型タン
パク質である請求項３に記載の方法。 ８、タンパク質がＩｇＧである請求項３に記載の方法。 ９、タンパク質とのカルボキシル基を有する莢膜多糖類
の複合体を生理学的に許容可能な担体中に含んでなるこ
とを特徴とする宿主の抗体応答を高めるための組成物。 １０、宿主の抗体応答を高める方法において、該宿主に
請求項９に記載の組成物を注射することを特徴とする方
法。 １１、宿主が２週間間隔で少なくとも２回注射される請
求項１０に記載の方法。 １２、莢膜多糖類がＶｉ莢膜多糖類である請求項９に記
載の組成物。 １３、タンパク質がテタヌストキソイドである請求項１
２に記載の組成物。 １４、タンパク質がジフテリアトキソイドである請求項
１２に記載の組成物。 １５、タンパク質がトキシン及びコレラトキシンのβ−
サブユニットよりなる群から選ばれる請求項１２に記載
の組成物。 １６、タンパク質がヘモフィルス・インフルエンザｂ型
タンパク質である請求項１２に記載の組成物。 １７、タンパク質がＩｇＧである請求項１２に記載の組
成物。
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