JPS60248622A - 細菌性多糖類と免疫原性タンパク質との二価スペーサーによる安定な、共有結合された多糖―タンパク質結合体、該結合体の製造方法並びに該結合体を含む医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、共有結合的に変性された細菌性多糖類及び免
疫原性蛋白質に関し、並びに、共有結合の確認を可能と
し、かつ精製及び生物学的に望ましい実体の濃縮を容易
化する二価スペーサーにより免疫原性細菌膜もしくは他
の蛋白質と結合されており、複合体が細菌性ワクチンの
有用成分である該多糖類の共有結合複合体に関する。本
発明はまた、かかる多糖類、蛋白質及び複合体の製造方
法、並びに多糖類及び蛋白質問における複合体の共有結
合を確認する方法にも関する。

細菌の精製されだ莢膜多糖類はそれと同種の細菌に対す
るワクチンを調製するだめに用いられてきたが、しかし
得られる免疫応答はしばしば望んだほどには満足できる
ものとならず、特に年少の小児又は未熟もしくは不完全
免疫系を有する個体においてはそうであった。例えばヘ
モフィラス・インフルエンザ（ＨａｅｍｏｐｈＮｕｓ　
１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ　）　ｂ型莢膜多糖は、乳児にお
いては免疫応答を誘発することができず、このためＨ，
インフルエンザｂ型細菌に起因する重大な小児医学の問
題にだいする防護においてこの多糖単独では無効とされ
ている。これらの多糖類の免疫原性の増強け、しばしば
それらを蛋白質と結合させることによって達成すること
ができる〔例えば、シュニールソンら、′ヘモフィラス
・インフルエンザｂ型多糖−蛋白質複合体：莢膜多糖ワ
クチンの新世代のモデル“、ニューダブ・ウィズ・ハム
・アンド・ベト・ワクチン、７７−９４頁、１９８０年
（５ｃｈｎｅｅｒｓｏｎｅｔ　ａｌ、、　’Ｈａｅｍｏ
ｐｈｉｌｕｓ　Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ　Ｔｙｐｅｂ　ｐ
ｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｏｎ
ｊｕｇａｔｅｓ：Ｍｏｄｅｌｆｏｒ　ａ　Ｎｅｗ　Ｇｅ
ｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣａｐｓｕｌａｒＰｏｌｙｓ
ａｃｃｈａｒｉｄｅ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ、Ｎｅｗ　Ｄｅ
ｖ、　ｗｉｔｈＨｕｍ、　＆　Ｖｅｔ、　Ｖａｃｃｉｎ
ｅｓ、　７７−９４　（１９８０）　）；シュニールソ
ンら、ジエイ・エクスプトル・メト、１５２巻、３６１
頁、１９８０年（５ｃｈｎｅｅｒｓｏｎ、＠ｔ　ａｌ、
、　Ｊ、　Ｅｘｐｔｌ、　Ｍｅｄ、。

１５２　、３６１　（１９８０）　）：及びアンダーソ
ン、感染と免疫、３９巻、２３３頁、１９８３年（Ａｎ
ｄｅｒｓｏｎ、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕ
ｎｉｔｙ、　３９゜２３３　（１９８３）　）参照〕。

しかしながら、これらの多糖類と結合させる蛋白質の選
択に注意がはられれなければならない。或種の蛋白質（
例えばベルタスシノーゲン（ｐｅｒｔｕｓｓｉｎｏｇｅ
ｎ　）　）は乳児における免疫系の非特異的賦活剤であ
る。これらの蛋白質はある程度まで多糖抗原への免疫応
答性を高めることができるが、あいに゛（この工うな非
特異的活性化は不必要な生物学的効果（即ち副作用（ｒ
ｅａｃｔｏｇｅｎｉｃｉｔｙ　）　）　を引き起こす。

これらの多糖抗原に対する非常に好ましく特異的に高め
られた免疫応答は、最初にダブリュー・エフ・ゲベル及
びオー・チー・アベリイ（Ｗ、　Ｆ、　Ｇｏｅｂｅｌ　
ａｎｄ　Ｏ，Ｔ。

Ａｖｅｒｙ　）によって１９２９年に報告〔ジエイ・エ
クスプトル・メデイシン、５０巻、５２１−５３１頁、
１９２９年（土Ｅｘｐｔ１．　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　５０
．　５２１−５３１　（１９２９）　）　〕されたよう
に、適切な蛋白質にこれらの多糖類をゝ複合“させるこ
とにより、・乳児において達成される。

多糖と蛋白質を結合する手段も慎重に考慮しなければな
らない。もし、考えられているように、多糖の決定基（
ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ　）が蛋白質の１１　担体“決
定基と分子的に近接しているため免疫学的賦活が生じる
とすれば、これらの基は生体系内ておいて容易に分離す
るようなものであってはならない。多糖類の多価陰イオ
ン特性と１１担体“蛋白質の多価陽イオン特性に基づい
て得られる非共有結合複合体は免疫応答性を賦活するで
あろうが、しかしこれらの複合体は化学的に不安定であ
り、生じる免疫応答もＴ細胞非依存性を示すよ、うであ
る。逆に、多糖類と蛋白質との共有結合複合体はより大
きな化学的安定性を有しており、Ｔ細胞依存性免疫応答
を示すであろう。

共有結合した多糖−蛋白質複合体については文献で述べ
られてはいるが、共有結合の分析法がただ生体内での活
性のみであつ−Ｃ１シかも文献に開示された方法が再現
性に乏しかったため、共有結合の正確な本質は証明又は
定量化されていなかった。ヘモフィラス・インフルエン
サｂ型及びストレプトコッカス・ニューモニア（５ｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　）６Ａ
型多糖類は、臭化シアン、次いでアジピン酸ジヒドラジ
ドと反応せしめ、しかる後破傷風トキソイド又はカブト
ガニのヘモシアニン蛋白質とカプリングさせられた〔シ
ュニールソンら、ジエイ・エクスプトル・メト、１５２
巻、３６１頁、１９８０年 （５ｃｈｎｅｅｒｓｏｎ　ｅｔ　３．　Ｌ狂肚１．　Ｍ
ｅｄ、、１５２゜３６１　（１９８０）　）、　及び感
染と免疫、４０巻、２４５頁、１９８３年［Ｉｎｆｅｃ
ｔｉｏｎ　ａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ、　４０．２４５　
（１９８３）　］。肺炎球菌１９Ｆ型の多糖は、この多
糖類の還元性末端と蛋白質のペンダント状アミン基（即
ち、リジン類）からイミン（シッフ塩基）を形成し次い
でこれらのイミンを水素化シアン化ホウ素ナトリウムで
還元することにエリ、直接に牛血清アルブミンとカプリ
ングせしめられた〔リンら、免疫学、４６巻、３３３頁
、４６、　３３３（１９８２））］。

更に、シアン化された芳香族アミンと結合した多糖類は
蛋白質のチロシン類と結合せしめられ〔ケイ・ケイ・エ
ックスドルフら、免疫学、２９巻、８７頁、１９７５年
（Ｋ、Ｋ。

Ｎ１ｘｄｏｒｆｆ　ｅｔ　ａｌ、、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ、　２９．８７（１９７５）　）　）　、芳香族アミ
ンと結合した多糖類はイソチオシアネートに変え、しか
る後蛋白質のリジンのペンダント状アミノ基に結合せし
められた〔ニス・ビー・スベンソン及びニー・ニー・リ
ンドバーグ、ジエイ・イムノログ・メソッド、２５巻、
３２３頁、 １９７９年（Ｓ、　Ｂ、　５ｖｅｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ａ
、　Ａ。

Ｌｉｎｄｂｅｒｇ、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ、　Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　２５．３２３（１９７９）　）　〕。　し
かしながら、それぞれの場合において、得られる複合体
の特性は、ゲル・パーミェーション・クロマトグラフィ
ーによって示されたのみである。更に別の例として〔ニ
ス・ヌタニら、感染と免疫、３６巻、９７１頁、１９８
２年（Ｓ、　Ｎｕｔａｎｉ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｒｎｕｎｉｔｙ　３
６．　９７１　（１９８２）　）］、多糖、即ちプルラ
ンは、塩化シアヌルで活性化され、次いで破傷風トキソ
イドと反応せしめられた。この場合、複合体は電気泳動
での特性が示され、出発物質とは異なるということが示
されただけであった。

これらのいずれの場合にも、総分子量 （’ａｇｇｒｅｇａｔｅｄ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅ
ｉｇｈｔ　）によって示唆される以外には共有結合の証
明がされなかったが、多価陰イオンおよび多価陽イオン
の複合体においても総分子量が得られるため共有結合を
分子状複合体における多価陰イオン及び多商陽イオンの
相互作用と区別できなかった。

したがって、本発明の目的は、多糖の決定基を蛋白質の
１担体“決定基に、生体系においてこれらの基の分子的
近接が維持できるように結合させることである。本発明
の他の目的は、莢膜多糖類を担体蛋白質と共有結合的に
結合せしめ、更に該結合の共有性を証明及び定量化でき
る方法を開発することである。

本発明のさらに他の目的は、Ｔ細胞依存性を示し、かつ
ある種の細菌特に用いられる多糖類の細菌と同種の細菌
に対する保護血清抗体を誘発するためのワクチン成分と
して有用な化学的に安定な多糖−蛋白質複合体を得るこ
とである。本発明の更なる目的は、多糖類、特に多価陰
イオン性多糖類を可溶化するだめの方法、および多糖−
蛋白質複合体を調製するためにこれらの多糖類を共有結
合的に変性する方法を提供することである。本発明のも
う一つの目的は、未複合化高分子及び過剰の反応物を除
去することによる共有結合多糖−蛋白質複合体の精製及
び濃縮方法を提供開発することである。本発明の更に他
の目的は、例えば髄膜炎及び中耳炎に対して使用される
免疫学的に有効なワクチンにこれらの複合体を用いる治
療方法を開発することである。

本発明は共有結合的に変性された細菌性多糖類に関し、
更にかかる多糖類と共有結合的に変性された免疫原性膜
蛋白質、ウィルス蛋白質サブユニット、合成ポリペプチ
ド、細菌性トキソイド又は他の適切な免疫原性蛋白質と
からなり、免疫原性細菌ワクチンの有用成分である化学
的に安定な複合体に関する。本発明の多糖−蛋白質複合
体は共有結合チオエーテル基を含有する二価スペーサー
を介して結合されており、この二価スペーサーは高分子
（例えば、多糖類及び蛋白質）を結合する原子鎖であっ
て、該スペーサーの一端は一つの変性された高分子（例
えば共有結合的に変性された多糖）から始まり、その他
端はもう一つの変性された高分子（例えば官能化された
蛋白質）から始まっている。

本発明の方法において、多糖は、ペンダント状求電子中
心又はペンダント状チオール基を有する多糖を製造する
だめの一以上の工程で共有結合的に官能化される。好ま
しくは多糖は、まず水酸基を有しない有機酵媒中に可溶
化され、次いで二求核剤（ｂｉｓ−ｎｕｃｌｅｓｊｈｉ
ｌｅ）と反応させる前に二官能性活性化剤によって誘導
体にされる請求核的に官能化された多糖は、次に、ペン
ダント状求電子部位を生じさせる試薬と反応させるか、
あるいはペンダント状チオール基を生じさせる試薬と反
応せしめられる。二求核剤、即ち活性化多糖と反応して
、ペンダント状求電子部位又はチオール基を有する共有
結合的に変性された多糖とする二求核剤を適切に選択す
るか、あるいは適切な核剤を選択することに↓す請求核
的に官能化された多糖が更に官能化されることを回避す
ることができる。

多糖を共有結合的に変性することとは別に、−もしくは
二工程の方法で、適切な細菌性“担体“蛋白質を、ペン
ダント状チオール基生成試薬又はペンダント状求電子中
心生成試薬と反応させる。適切に共有結合的に変性され
た多糖類及び蛋白質が次いで反応せしめられて、共有結
合した多糖−蛋白質複合体が製造され、しかる後精製し
て未結合の高分子及び過剰の試薬を除去し、免疫原の投
与量を共有結合された多糖について決定する。

共有結合性は、多糖をそのペンダント状求電子基又はチ
オール基から（加水分解などで）開裂し、更に蛋白質を
その側鎖状チオール基又は電子基から開裂し、次いで蛋
白質の指標アミノ酸（リジン）Ｋだいするスペーサーの
相対濃度を測定して共有結合性を確認するようにしてチ
オエーテル含有二価スペーサー分子を分析することＫよ
り絶対的如証明確認することができる。

多糖−蛋白質複合体又はそれらの誘導体を免疫学的有効
量含む免疫原性ワクチンは、その上で製造することがで
きる。

本発明の複合体は多糖−蛋白質複合体であって該複合体
は、チオエーテル基と一級アミンを有し多糖と蛋白質と
の間に加水分解に不安定な共有結合を形成する二価スペ
ーサーを介してカプリングされている。本発明における
好捷しい複合体は、しかしながら、式Ｐｓ　−Ａ　−Ｅ
　−Ｓ　−Ｂ　−Ｐｒｏ又はＰｓ　−Ａ’−３−Ｅ’−
Ｂ’−Ｐｒｏ　で表わされる複合体であり、ことでＰｓ
　は多糖を表わし；Ｐｒｏは細菌性蛋白質を表わし；更
にＡ−ｚ−８−Ｂ及びＡ’　−８−Ｅ’　７Ｂ’は加水
分解に安定なチオエーテル共有結合を有し、高分子ｐｒ
ｏ及びｐｓ　と共有結合（例えば、加水分解に不安定な
エステルもしくはアミド結合）を形成する二価スペーサ
ーである。スペーサーＡ−Ｅ−８−Ｂにおいて、Ｓはイ
オウ原子であり；Ｅは、チオール基と反応せしめられた
親チオ基（ｔｈｉｏｐｈｉｌｉｃ　ｇｒｏｕｐ　）　の
変性生成物であって、式： （式中、ＲはＨ又はＣＨ３、ｐは１〜３である）で表わ
され；Ａは Ｈ １ｌ −ＣＮ（ＣＨ２）　Ｙ（ＣＨ２）　−ＮＨ−（式中、Ｗ
は０又はＮ）ｌ　、　ｍは０〜４、ｎは０〜３、ＹはＣ
Ｈ，，０、Ｓ、　ＮＲ’　又はＣＨ，Ｃ０２Ｈであり、
Ｒ′はＨ又はＣ１もしくはＣ２のアルキルであり、Ｙが
ＣＨ２の場合はｍとｎが同時に０になることはなく、Ｙ
が０又はＳのときにはｍは１よりも大きくｎはＩＪ：り
も太きく　； 更に、Ｂは ■ −（ＣＨ２）　ＣＨ（ＣＨ２）　Ｄ− ｐ　ｑ　。

１ 〔式中、ｑはＯ〜２．２はＮＨ２、ＮＨＣＲ’、又は ＨＯＯ である。また、スペーサーＡ’　−８−Ｅ’　−Ｂ′に
おいて、Ｓはイオウ原子であり；Ａ′は １ −ＣＮＨ（ＣＨ２）　Ｒ”　− 〔式中、ａは１〜４、Ｂ　／／はＣＨ２又はＨＯＹ’ １１１ ＮＣＣＨ（ＣＨ２）　（ここで、Ｙ′はＮＨ，又はＮＩ
（ＣＯＲ’である）であシ、ｗ、ｐ及びＲ′は上記定義
のとおりである〕 Ｂ′は　ｏ　（ｐは１〜３である）で １ −（ＣＨ２）　Ｃ− ある。更に、二価スペーサーＡ−Ｅ−８−Ｂ及びＡ’　
−８−Ｅ’−Ｂ’におけるＥ−８−Ｂ及びＡ’　−８−
Ｅ’酸成分確認定量が可能であり、この同定にエリ、共
有結合的に変性された多糖を起点とするチオエーテルイ
オウ原子側を、官能化された蛋白質を起点とするスペー
サー側と結合している複合体の結合の共有結合性が示さ
れる。

本発明の多糖類は酸基を有するいかなる細菌性多糖類で
あっても工く、特定のタイプに限定されるものでのない
。このような細菌性多糖類の具体例としては、ストレプ
トコッカス・ニューモニア（肺炎球菌）６Ａ、６Ｂ。

１０　Ａ、１１　Ａ、１８　Ｃ，１９Ａ、１９　Ｆ。

２０．２２Ｆ及び２３Ｆ型多糖類；Ｂ属ストレプトコッ
カスｉａ、Ｉｂ、ＩＩ及び■型多糖類：ヘモフイラス・
インフルエンザ（Ｈ。

ｆｌｕ　）　ｂ型多糖類：ナイセリア・メニンギチジス
（Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ　、
髄膜炎菌）Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｘ、ＹＸＷ１３５及び２９Ｅ型
多糖類；エシエ１ノヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａｃｏｌｉ）Ｋｌ、Ｋ１２、Ｋ１３、Ｋ９２及びに１０
０多糖類が挙げられる。特に好ましい多糖類は、しかし
ながら、ローゼンベルグら、ジエイ・パイオル・ダム１
２３６巻１．２８４５−２８４９頁、１９６１年［Ｒｏ
ｓｅｎｂｅｒｇ　ａｔ工、：！：担３．旦肋り、、μす
、’　２８４５−２８４９（１９６１）　）　及びシア
ーメンホフら、シエイ・パイオル・ケム、２０３巻、６
９５−７０４頁、１９５３年［Ｚａｍｅｎｈｏｆ　ｅｔ
　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　、　２０３．６９５−７０４　（１９５３
）　］　に記載されたようなヘモワイラス・インフルエ
ンザｂ型多糖；ロビンスら、感染と免疫、２６巻、３号
、１１１６−１１２２頁、１９７９年１２月［Ｒｏｂｂ
ｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ
Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、　２６．　Ａ、　３．　１１１６−
１１２２　（Ｄｅｃ、。

１９７９）　］に記載されたようなストレプトコッカス
・ニューモニア（肺炎球菌）６Ｂ型もしくは６Ａ型多糖
；シー・ジエイ・ソーら、伝染病の概観、３巻、２号、
３２３−３３１頁；１９８１年［Ｃ，Ｊ、Ｌｅｅ　ｅｔ
　ａｌ、、　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｕ
ｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ、　３．　Ａ２．３２３−３３１
（１９８１）　）　に記載されたような肺炎球菌１９Ｆ
型多糖；及びオー・ラームら、アドブ・力−ポハイド・
ケム・アンド・バイオケム、３３巻、２９５−３２１頁
［０，Ｌａｒｍ　ｅｔ　ａｌ、。

Ａｄｖ、　Ｃａｒｂｏｈｙｄ　Ｃｈｅｍ、ａｎｄ　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、、　３３゜２９５−３２１　）及びアール
・ニス・テイプソンら、アカデミツクブレス社出版、１
９７６年［ＩＲ。

Ｓ、　Ｔｉｐｓｏｎ　ａｔ　ａｌ、、　ｃｄ、、　Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ、Ｐｒｅｓｓ。

１９７６　、ｌ］　に記載されているような肺炎球菌２
３Ｆ型多糖からなる群より選ばれるそれらの莢膜多糖類
である。

本発明の蛋白質は、実証された安全性と実証可能な免疫
原性を有する蛋白質であり、特定のタイプのものには限
定されない。適切な蛋白質としては、細菌の膜蛋白質；
エデスチン又は大豆トリプシン阻害剤の工うな各種の植
物蛋白質；ＡもしくはＢ型肺炎、ｇＤもしくはｇＣ型ヘ
ルペス（庖疹）、エプスタイン−バール（Ｅｐｓｔｅｉ
ｎ−Ｂａｒｒ　）　もしくは水痘性帯状庖疹のサブユニ
ットのようなウィルス性蛋白質サブユニット；合成ポリ
ペプチド；ジフテリアトキソイド；又は破傷風トキソイ
ドが挙げられるが、好ましくはＴ細胞賦活剤であるナイ
セリア・メニンギチジス（髄膜炎菌）Ｂ血清型の外膜蛋
白質である。これらの血清型の蛋白質の具体例は、ヘル
テイングら、晴ナイセリア・メニンギチジスの血清型決
定蛋白質“、アクタパス・ミクロパイオル・スヵンド・
０部、８９巻、６９−．７８頁、１９８１年［Ｈｅｌｔ
ｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、’ＳｅｒｏｔｙｐｅＤｅｔｅｒ
ｍｉｎａｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｎｅｉｓｓｅ
ｒｉａＭｅｎｉｎｇｉｔｉｄｊｓ　’、　Ａｃｔａｐａ
ｔｈ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

Ｓ　ｃ　ａ　ｎ　ｄ−Ｓ　ｅ　ｃ　ｔ−Ｃ、呂６９−７
８　（１９８１）　］及びフラッシュら、ジエイ・バク
ト、１２７巻、９７３−９８１頁、１９７６年［Ｆｒａ
ｓｃｈｅｔ　３１．、　Ｊ、　Ｂａｃｔ、、１２７　９
７３−９８１（１９７６）　］に記載されている１゜ 本発明における複合体ｐｓ−Ａ−Ｅ−８−Ｂ　−ｐｒｏ
はスペーサーを有しており、その成分ニハ、特に、二酸
化炭素、１，４−ブタンジアミン及びＳ−カルボキシメ
チルーＮ−アセチルホモシスティン；二酸化炭素、’１
．５−ベノタンジアミン及びＳ−カルボキシメチル−Ｎ
−アセチルホモシスティン；二酸化炭素、３−オキサ−
１，５−ペンタンジアミン及びＳ−カルボキシメチル−
Ｎ−アセチルホモシスティン；二酸化炭素、１，４−ブ
タンジアミン及びＳ−カルボ壬ジメチルーＮ−アセチル
システイノ；二酸化炭素、１，３−プロパンジアミン及
びＳ−カルボキシメチル−Ｎ−ペンソイルホモシスティ
ン；二酸化炭素、３−アザ−１，５−ペンクンジアミン
及びＳ−カルボキシ″メチルーＮ−アセチルシスティン
；並びに、二酸化炭素、１，２−エタンジアミン、グリ
シン及びｓ−（スクシン−２−イル）−Ｎ−アセチルホ
モシスティンの誘導体がある。本発明における複合体Ｐ
ｓ　−Ａ’−８−Ｅ’　−Ｂ’−Ｐｒ。

はスペーサーを有しており、その成分には、特に、二酸
化炭素及びＳ−カルボ千ジメチルシステアミン；二酸化
炭素及びＳ−（α−カルボキシエチル）システアミン；
二酸化炭素及びＳ−カルボキシメチルホモシステアミン
；二酸化炭素、Ｓ−（スクシン−２−イル）システアミ
ン及びグリシン；並びに、二酸化炭素及びＳ−カルボキ
シメチルシスティンの誘導体がある。

本発明の方法において、多糖は、（ａ）それを水酸基の
ない有機溶媒中に可溶化し、次いで（ｂ）それを二官能
性試薬で活性化し、（Ｃ）この活性化多糖を二求核剤（
ｂｉｓｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅ　）　と反応させ、最後
に、必要であれば、更に（ｄ）この変性された多糖を請
求電子（例えば親チオ性）部位を生成する試薬、又は（
１１）チオール基を生成する試薬とのいずれかの反応に
よって官能化することにより共有結合的に変性される。

蛋白質は、これに対し、、（ｉ）チオール基を生成する
試薬、又は（１１）親チオ性部位を生成する試薬のいず
れかと反応させ、次いで共有結合的に変性された多糖及
び官能化された蛋白質を互いに反応せしめて共有結合し
た安定な複合体を形成し、最終混合物を精製して未反応
の多糖類及び蛋白質を除去する。

本発明の工程には、また活性化された多糖と反応して、
ペンダント状求電子部位又はペンダント状チオール基を
有する共有結合的に変性された多糖を生成せしめる核剤 （ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅ　）又は二求核剤を選択する
ことが含まれており、これによって共有結合的に変性さ
れた多糖を共有結合的に変性された蛋白質と反応させる
前に、さらに二求核剤で変性された多糖を更に官能化す
る必要性を除いている。捷た、蛋白質をいずれかの形の
基に官能化することは、これらの工程における反応物の
選択により、２以上の工程にて行なわれる。

Ａ、多糖の調製 多糖を共有結合的に変性するだめの第一工程では、固体
状多糖を可溶化する必要がある。

多糖の核的アルコール性水酸基は請求電子剤に対して、
水溶液における水の水酸基と化学的に競合してはならな
いため、多糖は非水性（非水酸基性）溶媒に溶解される
べきである。適切な溶媒としては、ジメチルホルムアミ
ド、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、ホ
ルムアミド、Ｎ、Ｎ’　−ジメ“チルイミダゾリジノン
及び他の類似した極性の非プロトン性溶媒、が挙げられ
、ジメチルホルムアミドが好ましい。

これらの溶媒の使用に加えて、リン酸モノエステルもし
くはジエステルのような酸性水素原子を有する本発明の
多糖類（例えば、リポース−リビトールリン酸エステル
ポリマーであるＨ、インフルエンザｂ型の莢膜多糖類並
びに肺炎球菌６Ｂ、１９Ｆ及び２３Ｆの莢膜多糖類）を
適切な塩の形に変えると、これらの多糖類は上記溶媒に
易溶性になることを本出願人は見出した。これらの高分
子における酸性水素原子は、トリーもしくはテトラ−Ｃ
Ｃ＋　〜Ｃ５’−）アルキルアンモニウム、１−アザビ
シクロ［２，２，２］オクタン、１，８−ジアザビシク
ロ［５，４，０）ウンデカ−７−エン又は類似のカチオ
ン、特にトリーもしくはテトラ−ＣＣ＋〜Ｃ６−）アル
キルアンモニウムのような大疎水性陽イオンと置換する
ことができ、得られるリン酸化多糖類のトリーもしくは
テトラアルキルアンモニウム又は類似の塩は、１分間か
ら１時間攪拌すると、約１７〜５０℃にて上記溶媒と容
易に溶解する。

部分的に加水分解されたＨ、インフルエンザｂ型多糖は
テトラブチルアンモニウム塩に変えられてジメチルスル
ホキシドに溶解させられたが〔エガンら、ジエイ・アメ
ル・ケム・ツク、１０４巻、２８９８頁、１９８２年（
Ｅｇａｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、　Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅｍ
、Ｓｏｃ、、１０４゜２８９８　（１９８２）　）　、
１、この生成物はもはや抗原性を有しておらず、このた
めワクチンを製造するには役立たない。これに反して、
本出願人は、多糖を強酸陽イオン交換樹脂に通してテト
ラアルキルアンモニウム型とするか、あルイハ多糖を水
酸化テトラアルキルアンモニウムにて注意深く中性化し
、好ましくは前者の操作によって、未変性で未加水分解
の多糖を可溶化せしめることにより、免疫原性ワクチン
用としての多糖の有効性を保存せしめた。

その後の工程では、結合化が望捷れるユニットの官能化
のために一般的に又は実用的に用いられる試薬と十分な
反応性を有する水酸基以外の官能基が多糖類には存在し
ていないという多糖類を結合せしめる上での他の重要な
物理化学的な制約の克服が行なわれる。多糖を活性化し
て活性化多糖を得、次いで二求核剤と反応させて核性官
能化多糖を得、しかる後、求電子部位もしくはチオール
基を生成する試薬にて官能化することは、すべて、多糖
を共有結合的に変性し、複合化をなす上で多糖に官能基
を付加せしめるためである。

次の工程では、可溶化された多糖が、１：５〜１；１２
の範囲内の活性化剤：多糖の厳守すべき重量比にて、１
０分間〜１時間攪拌しながら二官能性試薬と約０〜５０
℃で反応せしめることにより活性化される。従来、この
活性化は、多糖を臭化シアンと反応させることにエリ行
なわれてきた。しかしながら、臭化シアンで活性化され
、隣接ジオール的な１′＠質“を有する誘導体は、リン
酸緩衝液に対して透析している間、一時的な安定性を示
したにしかすぎない。したがって、臭化シアンによる活
性化が本発明においてもなお可能でおったとしても、こ
の試薬は多糖類の活性化にほとんど利用することができ
ず、好ましいものではない。これに代り、多糖の活性化
にライド；又はｐ−ニトロフェニルもしくはポリハロフ
ェニルのようなフェニルエステル）が挙げられる。

特に好ましい試薬であるカルボニルジイミダゾールは水
酸基と反応して多糖のイミダゾリルウレタンを生成し、
例えばクロルギ酸ニトロフェニルなどのクロロギ酸アリ
ールエステルは多糖の混合炭酸エステルを生成する。

各場合において、得られる活性化多糖は、アミンの工つ
な核剤に対して極めて反応性が高く、このためそれぞれ
のウレタンに変換される。

次の段階では、活性化多糖は、アミン、特に例えば式： ％式％ 〔式中、ｍは０〜４、ｎは０〜３、ＹはＣＨ２，０，５
ＳＮＲ’、ＣＨＣＯ２Ｈ（ここで、Ｒ′はＨ又はＣ１も
しくはＣ３のアルキルである）であり、ＹがＣＨ２の場
合はｍ及び口がともに０であってはならず、Ｙが０又は
Ｓの場合はｍが１以上でｎが１以上である〕 のジアミン類のような核剤と、アミン大過剰で（即ち、
例えば使用される活性化剤に対し５０〜１００倍モル過
剰のアミン）反応せしめられる。反応は、水浴上で１５
分間〜１時間継続され、次いで１５分間〜１時間約１７
〜４０℃にて継続される。

活性化された多糖は、例えば１，４−ブタンジアミン等
のジアミンと反応させると、ペンダント状アミンを有す
るウレタン型の多糖となるが、更にアシル化して官能化
させてもよい。混合炭酸エステルも容易にジアミン類と
反応して、ペンダント状アミン類となる。

あるいは、活性化された多糖は、例えば４−ブロムアセ
トアミドブチルアミン等のジアミノアルカンのモノハロ
アセトアミドのような核剤と反応させて〔ダブリュー・
ビー・ローソンら、ホッパ・セイラーズ・ゼット・フィ
シオル・ケム、３４９巻、２５１頁、１９６８年（Ｈｏ
ｐｐｅ　５ｅｙｌｅｒ’　ｓ　Ｚ、　ｐｈｙｓｉｏｌＣ
ｈｅｍ、、３４９．　２５１　（１９６８））　朗報］
、ペンダント状求電子部位を有する共有結合的に変性さ
れた多糖を生成させてもよい。又は、活性化された多糖
は、システアミン（アミノエタノチオール）又はシステ
ィンのようなアミノチオール（その誘導体の具体例はペ
プチド合成技術において周知である）と反応させ、ペン
ダント状チオール基を有する多糖を生成ｌ〜でもよい。

いずれの場合でも、共有結合的に変性された多糖を、変
性された細菌性Ｘ１担体〃蛋白質に結合させる前に、更
に官能化することは必要ではない。

多糖を調製する最後の工程では、多糖のそれ以上の官能
化がもし必要であれば請求電子部位を生成する試薬又は
チオール基を生成する試薬と核性官能化多糖を反応せし
めてもよい。

求電子部位を生成させる上で使用するのに好ましい試薬
としては、例えばα−ハロアセチル又はα−ハロプロピ
オニルにアシル化する試薬、即ち 　Ｒ １１ Ｘ’　ＣＣＨＸ （式中、ＲはＨ又はＣＨ３；Ｘはα、Ｂｒ　又はＩ；Ｘ
’はニトロフェノ壬シ、ジニトロフェノキシ、ペンタク
ロロフェノキシ、ペンタフルオロフェノキシ、ハライド
、〇−（Ｎ−ヒドロ壬シスクシンイミジル）又はアジド
である） のような誘導体、特にクロル酢酸又はα−ブロムプロピ
オン酸のような誘導体が挙げられ、その反応はｐ）Ｉ　
８〜１１（必要であれば塩基を加えてこの範囲内に維持
する）、温度約０〜３５℃にて１０分間〜１時間行なわ
れる。アミン誘導体化された多糖は、マレイミドアミノ
酸でアシル化して〔オー・ケラ−ら、ヘルプ・キム・ア
クタ、５８巻、５３１頁、Ａｃｔａ、　、　５８．５３
１　（１，９７５）参照〕、マレイミド基、即ち、 （式中、ｐは１〜３である〕 とするか；ブロモ酢酸ｐ−ニトロフェニルの工うな２−
ハロアセチル化剤でアシル化するか；あるいは、チオ置
換が可能で適切に官能化された多糖類を得るために、α
−ハロケトンカルボン酸誘導体、例えば 〔ベル、６７巻、１２０４頁、１９３４年（Ｂｅｒ、、
　６７、１２０４．　（１９３４）　）　）でアシル化
してもよい。

チオール基を生成するために使用される適切な試薬とし
ては、例えば、次式 （式中、Ｒ４はＣ７〜Ｃ４のアルキル又はＣ，Ｒ５もし
くはＣ４゜Ｒ１３等の−もしくは二環式アリールであり
、ｐは１〜３である）の工うなチオラクトン； ＮＨＣＯＲ’ ０３５ＳＣＨｔ　（ＣＨ２）　ＣＨ，−ＣＯＸ’（式中
、ｍは０〜４、Ｒ５はＣ１〜Ｃ２のアルキル又はＣ６Ｈ
いＸ′は上記定義のとおりであり、次いでＴ（ＳＣＨ，
ＣＨ２０Ｈで処理される）；又は ＮＨＣＯＲ’ ； ＣｇＨａ　−８−８−ＣＨ２ＱＣＨ２）　ＣＨＣＯＸ’
（式中、ｍ、Ｒ’及びＸ′は上記定義のとおりであり、
次いでジチオスレイトールで処理される） のようなアシル化剤が挙げられる。このような反応は、
窒素雰囲気下、約Ｏ〜３５℃でｐＨ８〜ＩＩＫで（必要
に応じ、この範囲内にｐＨを維持するために塩基が加え
られる）、１〜２４時間行なわれる。例えば、アミノ誘
導体化された多糖は、次式： ％式％ の化合物と反応して、適切に官能化された多糖とされて
もよい。

これらの工程によって、Ｐ８−ＡＥ　又は＊ Ｐｓ　−Ａ’　−８Ｈ（ここで、Ｅ　はＡ、Ａ’、Ｒ，
Ｘ及びｐは上記定義のとおりである）の形の共有結合的
に変性された多糖類が得られる。

Ｂ、蛋白質の調製 多糖と結合される蛋白質の別途の官能化はチオール基を
生成するだめの一以上の試薬との蛋白質の反応、又は電
子（即ち、族チオ性）中心を生成するだめの一以上の試
薬との蛋白質の反応からなる。

求電子的に官能化された多糖との複合体を製造するため
に、蛋白質は、−もしくは二の工程において、前記第３
１〜３４頁にて説明した、多糖にチオール基を生成せし
めるだめに使用されるそれらのアシル化剤のような一以
上のチオール基生成試薬と反応せしめられる。チオール
化蛋白質は、寸だ、アタックら、バイオケム・エト・バ
イオフイズ・アクタ、６７０巻、３００貞、１９８１年
（Ａｔａｓｓｉｅｔ　ａｌ６．　Ｂｉｏｃｈｅｍ　ｅｔ
　７．　Ａｃｔａ、　６７０゜３００　（１９８１）　
）　で示されているように力ルホキシ活性化蛋白質を、
チオール化蛋白質を得るためにアミノチオールにてアミ
ノ化するととにより製造してもよい。この製造工程にお
ける好ましい態様は、約０〜３５℃、ｐＨ８〜１１で５
分間〜２時間、当量の反応物を用い、蛋白質のペンダン
ト状アミノ基（即ち、リジル基）をＮ−アセチルホモシ
スティンチオラクトンにて直接アシル化することである
。

能代された蛋白質の製造条件及び方法は、活性化マレイ
ミド酸と反応させて対応する多糖を製造せしめる前記第
３１〜３４頁の説明と同様である。

ペンダント状チオール基を有する共有結合的に変性され
た細菌性多糖と複合化させる場合は、蛋白質は、例えば ０　ＣＨ３０ １ｌ　ＩＩ ＸＣＨ２Ｃ−Ｘ’　及びＸＣＨ−ＣＸ’　（Ｘ及びＸ′
は前記定義のとおりである）；並びに おりである）などのアシル化剤の工うな電子中心をも有
する適切な蛋白質こしては、例えば、式 の如き活性化されたマレイミド酸のような試薬を用いて
ペンダント状リジルアミノ基をアシル化するか、あるい
はジアミンのモノハロアセチル誘導体とカルボキシ活性
化蛋白質を反応せしめることにより得られるものが挙げ
られる。いずれの製造反応においても、温度は５分間〜
１時間の間、０〜３５℃であり、ｐＨは８〜１１である
。

Ｃ１複合体の製造 複合体の製造は、ペンダント状求電子中ノｂを有する共
有結合的に変性されたいずれかの多糖類とペンダント状
チオール基を有するいずれかの蛋白質とを、ｐＨ＋７〜
９、はぼ当量比で、窒素雰囲気中、６〜２４時間約１７
〜４０℃で反応させるだけでよく、これによって共有結
合した複合体が得られる。このような反応の具体例とし
ては； ＯＨＮＨＣＯＣＨ３ ＩＩ　Ｉ　１１ Ｐ　ｓ　−ＣＮＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＣＨ２
Ｂ　ｒ　−１−Ｈ８ＣＨ２ＣＨ，ＣＨＣＯ−Ｐ　ｒ　ｏ
　−→ＮＨＣＯＣＨ１ １（Ｉ ＰｓＣＮＣＨ２ＣＨ２ＣＨ，ＣＨ２ＮＨＣＣＨ２ＳＣＨ
２ＣＨ２ＣＨＣＯＰｒ　。

４−ブロムアセトアミドブチルアミンと反応させて活性
化せしめられた多糖を、Ｎ−アセチルホモシスティンチ
オラクトンと反応させた蛋白質と反応せしめて複合体を
得る反応：及び （式中、Ｙ″はＣ３〜Ｃ８アルキレン基である） 活性化マレイミド酸と反応させてアミノ誘導化された多
糖を、アミノチオールにてアミノ化されたカルボキシ活
性化蛋白質と反応せしめて複合体を得る反応が挙げられ
る。

同様に、側鎖状チオール基を有する共有結合的に変性さ
れたいずれかの多糖類を、側鎖状求電子中心を有するい
ずれかの蛋白質と反応せしめて、共有結合した複合体を
得てもよい。この、Ｌうな反応の具体例としては、Ｏ０
Ｈ ＩＩ　ｌｉ　ＩＩ　Ｉ ＰＳＣＮＨＣＨ，ＣＨ，ＳＨ＋Ｐｒ０ＣＣＨ，ＣＨ，Ｃ
−Ｎ（Ｃ匹）４ＮＨＣＯＣＨ２Ｂｒ　−一→ＯＨＯＨＯ
０ Ｉｌｌ　Ｉｌｌ　ＩＩ　１１ ＰＳＣＮＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ，ＣＮ（ＣＨ，）４ＮＨＣ
ＣＨ２ＣＨ，ＣＰｒ０アミノチオールと反応させて活性
化された多糖をシアミンのモノハロアセチル誘導体と反
応させたカルボキシ活性化蛋白質と反応せしめて複合体
を得る反応がある。

ハロアセチル基の過剰な電子活性を下げる必要がある場
合は、ｎ−アセチルシステアミンのような低分子量チオ
ールを用いて複合体の反応を行なうことにエリ、この目
的が達成サレル。この試薬、即ちｎ−アセチルシステア
ミンを使用すると、形成されるＳ−カルボキシメナルシ
ステアミンがスパックマン（Ｓｐａｃｋｍａｎ　）、ム
ーア（Ｍｏｏｒｅ　）　及びスタイン（５ｔｅｉｎ　）
の方法によって特有的に検出できるため、使用したへロ
アセチル基に基づき確認することができる（Ｄ項参照）
。

これらの複合体は、次いで、約２時間、約１〜２０℃に
て固定角ローターを用い、約１００、　ＯＯＯｘｇ　で
遠心分離するか、あるいはゲル浸透、イオン排除クロマ
トグラフィー、勾配遠ノし分離（ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｃ
ｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ　）又は他の差異吸着（ｄ
ｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）クロ
マトグラフィーを初めとするその他の各種の精製方法に
伺され、望ましい生物学的活性に基づく方法である二価
スペーサーの共有結合分析（下記参照）を利用して共有
結合していない多糖類及び蛋白質が除去される。

試薬を更に分離するには、サイズ排除クロマトグラフィ
ーでも行なうことができ、あるいはＮ、メニンギチジス
Ｂ血清型の外膜蛋白質のように非常に大きな不溶性蛋白
質の場合には、この分離を超遠心分離にて行なうことが
できる。

Ｄ、共有結合の確認分析 共有結合を確認するための複合体の分析、および複合体
の安定性分析は、本出願人により、複合体を加水分解し
く好ましくは、１１０℃で２０時間、６ＮＨαにて）、
次いでチオエーテル結合を有し加水分解に安定なスペー
サーのアミノ酸及び蛋白質の構成アミノ酸を定量分析す
ることに工り、成し遂げられる。蛋白質のアミノ酸の寄
与は、必要であれば、含有される蛋白質の適切なアミノ
酸標準と比較することにより補正することができ、残留
アミノ酸がこれにより複合体の共有結合性を反映する。

あるいはまたスペーサーのアミノ酸が、分析上、蛋白質
のアミノ酸標準の外側にあられれるようにデザインする
こともできる。共有結合性の分析は精製操作を監視する
上でも有用であり、生物学的活性成分の濃度の増加を把
握することができる。上記の具体例としては、 を加水分解するとＳ−カルボキシメチルホモシステイン Ｈ２ ＨＯ，ＣＣＨ，５ＣＨ２ＣＨ２ＣＨＣＯ２Ｈが遊離し； が加水分解すると７ミノジカルボン酸 ＨＯ，ＣＣＨ，ＣＨ３ＣＨ，ＣＨ２ＮＨ。

■ Ｏ２Ｃ が１随し；また ＰｓＣＮ（ＪｉＣｌ（２ＳＣＨ２ＣＮ（ＣＨ２）４．Ｎ
ＨＣＣＨ２ＣＨ２ＣＰｒ。

を加水分解するとＳ−カルボキシメチルシステアミンＨ
，ＮＣＨ，ＣＨ，５ＣＨ２ＣＯ，Ｈが遊離し、Ｐｇ−Ａ
−Ｅ−３−Ｂ−Ｐｒｏ　分子におけるペプチド結合と他
の加水分解に不安定な結合とが開裂する。

スペックマン、モーア及びスタインの方法のようなりロ
フトグラフィー法が次いで好都合に適用することができ
、アミノ酸成分比が決定される。

−Ｊ−一 本発明の一以上の複合体は、本発明の好ましい態様にて
、ヘモフィラス・インフルエンサｂ型又はストレプトコ
ッカス・ニューモニア６Ｂ、１９Ｆ’もしくは２３Ｆ型
細菌のような同種の細菌に起因する菌血症から予法上又
は治療上能動的もしくは受動的に保護するために哺乳動
物種において使用することができる。能動的保護は、−
回当りに投与される各複合体における複合体の形での有
効量（測定可能な抗体量を産生じ得る量、例えば２〜５
０μ２　）の多糖、予め複合体（類）が投与された動物
から得られた全抗血清、又は該抗血清のグロブリンもし
くは他の抗体含有画分を、無菌食塩溶液のような薬学上
許容される担体とともに、もしくは該担体を用いないで
注射することにより行なうことができる。このようなグ
ロブリンは、クロマトグラフィー、塩もしくはアルコー
ル分別又は電気泳動により全抗血清から得られる。受動
的保護は、標準的モノクローナル抗体法又は適切な哺乳
動物宿主を免疫することにより行なわれる。アジュバン
ト〔例えばアラム（ミョウバン）〕の使用も、本発明の
範囲内に含捷れる。

本発明の好ましい態様においては、複合体はヒト（特に
、乳児及び小児）の能動免疫用ワクチン化のために使用
される。更に安定化させるために、これらの複合体は、
使用に先立ち、ラクトースの存在下（例えば、Ｈ，イン
フルエンザの多糖２０μ７／−及びラクトース４Ｔｎｇ
／ｍ７！、あるいは肺炎球菌の多糖５０μＰ／ｄ及びラ
クトース１０■／ｍｌ）で凍結乾燥してもよい。

好ｉｔ〜い投与量は、−回の投与で投与すべき複合体又
はその誘導体がそれぞれ、肺炎球菌多糖類の複合体とし
ての複合体型多糖２５１ｔｆ　に相当し、更にＨ，イン
フルエンザｂ型多糖の複合体としての複合体型多糖１０
μ２に相当する量である。必要であれば、Ｈ，インフル
エンザｂ型多糖の複合体又はその誘導体を、複合体型の
多糖１０μ２　に相当する量で、更に−もしくは二回投
与してもよい。

本発明を以下の実施例に基づき更に明らかにするが、該
実施例は説明するためのものであって、限定させるだめ
のものではない。

実施例１ 段階Ａ：ヘモフィラス・インフルエンザｂ型の凍結乾燥
管（ロツス（Ｒｏｓｓ　）　７６８　がら培養、ニュー
ヨーク州立大学から入毛）を無菌へモフィラス属細菌接
種培地（下記参照）１ｍｌに懸濁し、この懸濁液を１９
のチョコレート寒天プレート（ＢＢＬ）に広げた。ロー
ソクビン中、３７℃で２０時間培養した後、各プレート
での培養物を１〜２−のへモフィラス属細菌接種培地に
再懸濁し、貯蔵した。

大豆ペプトン　１ｏ　グ／ｌ Ｎａα　５２／ｌ Ｎ　ａ　Ｈ４Ｆ　０４　３．１　？　／ｌＮａ２ＨＰＯ
４１３，７Ｓ’／Ａ Ｋｐ　ＨＰ　０４　２．５　９　／Ｌ 蒸留水　全量 ＊溶液（７）　ｐＨは目標値７．２±０．１　（Ａ　常
置１ｄ、　ｐＨ７，２３）に調整され、溶液を１２１℃
で２５分間オートクレーブにて処理して滅菌した。

段階Ｂ：バッフルのない２ｔのエルレンマイ゛１段階Ａ
“（上記）の再懸濁された細菌の１７３を、完全へモフ
ィラス種産生培地（下記参照）約１．Ｏｔがそれぞれ入
れられた３つの２ｔフラスコに接種するために使用した
。次いで、フラスコを３７℃で約５時間２００ｒｐｍの
ロータリーシェーカーにて培養した。

培養時間の最後における典型的な０Ｄｅｅｏ　値は０．
３７であった。

ＮａＨ２ＰＯ４、３，１ｆ／ｌ Ｎａ２ＨＰ０．　１３．７　グ／を 大豆ペプトン　１０　９／を 酵母抽出物の透析沢過液（１）　１０　ｍｌ／１Ｋ２Ｈ
Ｐ０．　２．５　？／ｌ Ｎａα　５．Ｏｆ／ｌ グルコース（２）　５．０　？／ｌ ニコチンアミドアデニン ジヌクレオチド（ＮＡＤ）（３）　２　■／ｌヘミン（
４）５　キ／を 塩類及び大豆ペプトンを発熱物質のない少量の熱水に溶
解し、更に発熱物質のない熱水を加えて最終容積補正し
た。発酵槽又はフラスコを次いで１２１℃で約２５分間
滅菌し、冷却後、接種するに先立ち、酵母抽出物の透析
沢過液（１）、グルコース（２）、Ｎ　Ａ　Ｄ　（３）
、及びヘミン（４）をフラスコ又は発酵槽に無菌的に加
えた。

（１）酵母抽出物の透析沢過液：１００Ｓ’のプル″　
−ア酵母抽出物（黄色）を１ｔの蒸留水に溶解し、Ｈ１
０Ｘ５０カートリッジを備えたアミコン（Ａｍ１ｃｏｎ
　）　ＤＣ−３０中空繊維にて限外濾過し、分子量５０
．０００の分子を除去した。濾過液を集め、０．２２μ
膜に通して無菌生成物とした。

（２）ガラス蒸留水の無菌２５％溶液としてグルコース
を調製した。

（３）　Ｎ　Ａ　Ｄ　２０■／ｄ含有貯蔵溶液をミリポ
ア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　）フィルター（０，２２μ）
に通して沢過することにより無菌化し、接種するに先立
ち無菌的に加えた。

（４）へミン（、Ｈｅｍ１ｎ　）　３　Ｘの貯蔵溶液を
０．１ＭＮａＯＨ１０−に２００．ｍ？溶解して調製し
、容量を蒸留無菌水で１００　ｍｌに調整した。

このＧ液を１２１℃で２０分間滅菌し、接種前の最終培
地に無菌的に加えた。

段階Ｃニア０Ａの種発酵槽 Ｂ段階の生成物３ｔを用い、完全へモフイラス種産生培
地（前述のように調製）４１４を及びＵＣＯＮ　Ｂ　６
２５泡止剤１７ｒｎｌが入れられた７０ｔの発酵槽内１
（接種した。ｐ＋＋を７．４から開始した。

発酵を１０　Ｏｒｐｍで攪拌しながら３７℃に絹持し、
典型的な０，３９の光学濃度（０゜Ｄ、）に到達するま
で（約５．５時間後）、０、Ｄ、及びｐｌ＋測定によっ
て監視した。

段階Ｄ：８００ｔの産生発酵槽 Ｃ段階の生成物４０１を用い、必要な容量であると定め
られた産生培地（前述のように調製）５７０を及びＵＣ
ＯＮ　ＬＢ　６２５泡止剤７２ｒｎ１．が入れられた８
００Ｌの発酵槽内に接種し、友。

発酵を１０　Ｏｒｐｍで攪拌しながら３７℃に維持し、
０．Ｄ、が２時間の間一定になり、発酵が終了するまで
（典型的な最終０．Ｄ。

は１２時間後の０．５４である）、約２時間毎ＶｃＯ，
Ｄ、及びｐｕｆｆ直を検査した。

採取及び不活性化 バッチ約６００ｔを、１％チメロサール１２７が入った
５殺タンク“（ｋｉｌｌ　ｔａｎｋ　）内に採取して不
活付化した。

清澄化 ４℃で１８時間不活性化した後、４インチ（約１．０　
ｃｍ　）・ポール・（６０蛇）・シャープレス（５ｈａ
ｒ’ｏｌｅｓ　）　遠心機にて、生成物を透明に維持す
るために流速を調節しながら（１，３〜３．Ｏｔ／ｍｌ
ｎの間で変えられる）遠心分離した。遠心分離（１５，
０００ｒｐｍ）後に得られた上δを生成物の回収のだめ
（て用いた。

限外沢過にょる単離及び濃縮 二つの生成発酵物からの上澄液を貯蔵し、１０個の（５
０，０００タルトン分離）中空繊維カートリッジを備え
たロミコン（Ｒｏｍｉｃｏｎ）限外沢過ユニットにて２
〜８℃で濃縮した（膜面積４．５７７２２：空気流速２
．　ＯＬｐｍで約１．４に９／ｃｒｌ　（２０ｐｓｉ　
）　：約４．５時間後Ｋ　１２００ｔが３２５１に濃縮
されるように濃縮）。ｒ液を廃棄した。

４８％及び６１係のエタノール沈殿物 ロミコン残留物３２．５　ｔに、４８容量係工タノール
最終濃度となるまで、４℃にて攪拌しながら１時間に亘
り９５チエタノール３０ｔを滴下した。混合物を、完全
な沈殿物が得られるように更ＶＣ２時間４℃にて攪拌し
、上澄液を単一の４インチ・シャープレス遠心機）ｌて
通し、１５．００　Ｏｒｐｍで集めた（流速０．２７　
Ｌ／　ｍｉｎ　）。不溶性ペレットを廃棄し、１時間に
亘９９５％エタノールを更に２０．８を加えて、清澄化
された液体を６１％エタノールとした。完全な沈殿物が
得られるように混合物を更［３時間攪拌した。

第二ペレットの回収 得られた４８％エタノールに可溶で６１％エタノールに
は不溶の沈殿物を４インチ・シャープレス遠心機にて１
５．００　Ｏｒｐｍ　（流速０．６２１７　ｍｉｎ　）
で遠心分離することにより集め、６１％エタノール上澄
液を廃棄した。

粗生成物の収量は、湿潤したペーストとＬ−で０、３７
７　Ｋｙであった。

塩化カルシウム抽出 ６１％エタノール不溶性物質３７７２を、ディマックス
（ｐａｙ　ｍａｘ　）分散器内で、２〜８℃にて、冷ガ
ラス蒸留水６．５４と混合し′ｋ。

この混合物に冷２　Ｍ　Ｃａα２　’２Ｈ２０６，５ｔ
を加え、混合物（最終濃度１．０　Ｍ　ＣａＣ４）　を
４℃で１５分間抽出した。容器を次いで１ＭＣａＣ４・
２Ｈ，０２Ｌで洗浄し、１５ｔの最終容量とした。

２３％エタノール沈殿物 上記ＣａＣｌ！２　抽出液１５７に、攪拌（−ながら４
℃にて３０分間に亘り９５％エタノール４４８ｔを滴下
して２３チエタノールとした。

更に１７時間攪拌後、混合物をに２限外ｒ過機に通し、
４℃で６５時間、２５．００　Ｏｒｐｍ（流速１６５　
ｍｌ／　ｍｉｎ　）で遠心分離した。上澄液をチーズ布
（Ｃｈｅｅｓｅ’ｃｌｏｔｈ　）　に通し傾瀉して脂質
様浮遊物質を除去し、不溶性ペレットを廃棄し／ね。

３７％エタノール沈殿物と粗生成物ペーストの収集 ２３チエタノール可溶性上澄液に、攪拌しながら３０分
間に亘り９５％エタノール４、３３１を滴下して、３７
％エタノールとした。次いで、完全な沈殿物を得るため
に、攪拌しながら混合物を１時間放置し、しかる後攪拌
せずに１４時間放置した。得られた混合物を次いで、４
インチ・シャープレスユニットを用い１５．００　Ｏｒ
ｐｍ　（流速０．２１　／　ｍ１ｎ）で遠ノし分離し、
ペレット状粗多糖を集めた。

摩砕 遠心分離されたペレットを無水アルコール１　を含有的
３．８　ｔ　（］ガロン）ワーリングブレンダー（Ｗａ
ｒｉｎｇ　Ｂｌｅｎｄｅｒ　）　に移し、最高速度で３
０秒間混合した。混合は、固い白色粉末が得られるまで
、３０秒間作動・３０秒間休止を継続した。テフロンフ
ィルター板を備えたブラフネル漏斗にて粉末を集め、そ
の場で、無水エタノール１ｔで二回、更にアセトン２ｔ
で二回連続的に洗浄した。この物質を次いで、４℃で２
４時間真空乾燥し、生成物６８グ（乾燥重量）を得た。

摩砕工程で得た乾燥物質６８ｆを、ディマックス分散器
を用い、ｐＨ６，９の０．４８８　Ｍ酢酸ナトリウム１
２７に再懸濁した。酢酸ナトリウム溶液を、下記のよう
にして調製される新しいフェノール水溶液４．４８　ｔ
で直ちに抽出した：２０を加圧容器内で、ｐ＋＋　６．
９の０、４８８　Ｍ酢酸ナトリウム９００Ｉｎｌを約２
　Ｋｐ（５ポンド）容器のフェノール〔マリンクロット
（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ　）　結晶〕に加え、完全
な溶液が得られるまで混合した。各フェノール抽出液を
、乳濁液の分離のために、Ｋ２超遠心機（エレクトロヌ
クレオニクス）にて４℃で２．５時間３０．　ＯＯＯｒ
ｐｍで遠心分離した。

水性溶出液を新たなフェノール水溶液３．２１で同様の
方法にて更に三回抽出した。フェノール相は廃棄した。

透析ｒ過 上記フェノール抽出液からの水相（１７，６ｔ）を冷ガ
ラス蒸留水３００ｔで希釈し、３つのＨ１，ＯＰ　１．
０カートリツジを使用したアミコンＤ　Ｃ−３０限外１
過装置で４℃にて透析汐１過しだ。アミコンユニットを
洗浄し、最終容量が１７５ｔとなる工うにこの洗浄液を
残留液に加えた。限外沢過液は廃棄した。

６７％エタノ一旦ＩＬ ２、０．　Ｍ　ＣａＣ１４０，４３８Ｌを前工程からの
透析液１７．５　ｔに加え（最終ＣａＣ４濃度は０、０
５　Ｍ　）、激しく攪拌しているこの酢液に９５％エタ
ノール３５．８８　ｔを１時間に亘り滴下して、溶液を
６７チエタノールとした。

４時間攪拌し、次いで４℃で更に１２時間放置した後、
透明な上澄液をサイフオン式に除去し、沈殿物を４イン
チ・シャープレス遠心機（１５，００Ｏｒｐｍ）にて４
℃で４５分間遠心分離することにより集めた。得られた
多糖ペレットを、約３．８１　（１カＯン）（ｉ’）’
７−＝ングブレンダー中、３０秒間作動・３０秒間休止
法にて、無水エタノール２ｔを用いて摩砕し、テフロン
フィルター板を備えたブラフネル漏斗−ヒに集め、その
場で、無水エタノール１ｔで四回続いてアセトン１ｔで
二回洗浄した。試料を、次いで４℃で２０時間、風袋を
はかった皿の中で真空乾燥した。収量は、乾燥粉末とし
て３９２であった。

２０％エタノールの超遠心分離及び最終生成物の収集 」二記乾燥粉末３９２を蒸留水１５．２１１に溶解し、
この溶液に０．０５　Ｍ　ＣａＣＪ　２　’２Ｈ２０の
０３９ｔを加えて、０．０５’　Ｍ　ＣａＣ４であり且
つ総容量を１５．６　ｔ　（，２，，５〜多糖／ｄ）と
した。この混合物に３０分間に亘って９５％エタノール
４．９３　ｔを滴下し、この混合物を２４チエタノール
とした。この混合物を、Ｋ３チタニウムポール（ｂｏｗ
’ｌ　）　及びＫｌｌノリル（Ｎｏ？ｙｌ　）コアを備
えたに２超速メｂ機（３０，００Ｏｒｐｍ及び１００献
／ｍ１ｎ）にて４℃で３．５時間遠心分離することにエ
リ、直ちに清澄化した。ペレットを廃棄し、透明な」二
澄液（容量］、　９．８　ｔ　）を、３０分間に亘り攪
拌しながら９５％エタノール４．２３　ｔを加えて３７
％エタノールとした。更に３０分間攪拌した後、混合物
を攪拌せずに４℃で１７時間放置し、次いで１５．００
０　、ｒｐｍで４インチ・シャープレス遠心機に通して
集めた（４５分間を要する）。

得られたペーストを無水エタノール２ｔが入れられた約
３．８　ｔ　（１ガロン）のワーニングブレンダーに移
し、固い白色粉末が形成されるまで最高速度で、３０秒
間作動・３０秒間休止サイクルを４又は５回繰返して混
合した。この粉末を、ジテックス（Ｚｉｔｅｘ　）テフ
ロン板を備えたブラフネル漏斗上に集め、その場で新し
い無水エタノール５ｔで二回、無水エタノール１ｔで一
回、続いてアセトンｌｔで二回連続的に洗浄した。生成
物を漏斗から取り除き、４℃で（２５５時間の間〕真空
乾燥するために風袋をはかった皿に移した。

生成物の最終収量は３７２の乾燥重量であり、その性状
は下記のとおりである： 表１−１ Ｈｌｈ　多糖化学分析値 分析　結果 水分（ＴＧ）　１３．５％ 蛋白質　０．０係 核酸　１３％ リポース（ペントース）　：３５．１％リン　７．８％ ＫＤ（ｔ７７０−、２４　Ｂ　）　０．０５　０．３５
ＫＤ（ｔ’７７０−ス２Ｂ）　０．４３　０．６０以下
の方法が分析を実施するために用いられた。

】１至−パーキン−エルマー・サーモバランスＴ　Ｓ　
Ｇ　−１（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒｔｈｅｒｍｏｂａ
ｌａｎｃｅ　ＴＳＧ−１）を用いた標準熱重量分析（１
００℃までの重量損失） ２、蛋白質−ローリ−（Ｌｏｗｒｙ　）法；ローリ−（
Ｌｏｗｒｙ　）ら、ジエイ・パイオル・ケム、１９３巻
、２６５頁、１９５１年 （Ｌｏｗｒｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈ
ｅｒｎ、、　１９３　二２６５　（１９５１）、１ ３、核酸＝ＵＶ法；ワールフルグ及びクリスチャン、バ
イオケム・セット、３１０巻、３８４頁、１９４２年［
Ｗａｒｂｕｒｇ　ａｎｄＣｈｒｉｓｔｉａｎ、　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ　Ｚ、、　３］０　：３８４　（１９４２）　
） ４、　リボースービアル（Ｂｉａｌ　）　法；デイツシ
エ及びシュワルツ、ミクＯキム・アクタ、２巻、１３頁
、１９３７年［Ｄｉｓｃｈｅ　ａｎｄＳｃｈｗａｒｔｚ
、　Ｍｉｃｋｏｒｏｃｈｉｍ　Ａｃｔａ　２　：　１３
（１９３７）　：１ ５、　リンーモリフデート法；チェンら、アナル・ケム
、２８巻、１７５６頁、１９５６年［Ｃｈｅｎ　ｅｔ　
ａｌ、、　Ａｎａｌ、　Ｃｈｅｍ、　２８゜１７５６　
（１９５６）　：］ ６、ＫＤ　−屈折率を利用したセファロース４８に、ｌ
：る測定 表１−２ ０．１（多糖）　’　０．２，０．２，０．１＊１．０
ゴ／Ｋｇ　投与量 多糖を下記の寒天ゲル拡散にエリ更に同定した：寒天」
二での二重拡散（Ｑｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ　）は、ハイ
ランド（Ｈｙｌａｎｄ　）　Ｄ型プレートを用いて実施
された。Ｈ，インフルエンザのロス（Ｒｏｓｓ）７６８
株に対して調製された抗血清を中心ウェル（ｗ’ｅｌｌ
　）　に採取し、一方濃度が５０．２５．１２５．６．
２及び３１μ２／蔵のそれぞれの多糖をサテライトウェ
ルに採取した。プレートを湿気室内で２４時間、２０〜
２５℃にで培養した。多糖濃度５０．２５及び１．２．
５１ｔ９　／　ｍｌにおいて、多糖と特定の抗血清との
間に沈降バンドが観察された。

実施例２ ナイセリア・メニンギチジス（Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａＡ３
発酵 ナイセリア・メニンギチジスの凍結乾燥培養菌〔ドクタ
ー・エム・アルテンレユタイン（Ｄｒ、　Ｋ　Ａｒｔｅ
ｎｓｔｅｉｎ　）、ウオルター・リード・アーミー・イ
ンステイテユート・オブ・リサーチ（Ｗａｉｔｅｒ　Ｒ
ｅｅｄＡｒｍｙ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ、　ＷＲＡＩＲ）、ワシントンＤ、Ｃ，，！：
り入手〕が入った管を開き、コーゴン（Ｅｕｇｏｎ　）
肉汁（ＢＢＬ）を加えた。培養菌をチョコレート寒天プ
レート（ＢＢＬ）上に線条に接種し、３７℃で５係ＣＯ
，存在下３６時間培養し、その後増殖菌を１０チスキム
ミルク培地（Ｄｉｒｃｏ　）に移し、等分割して、−７
０℃で凍結した。ＷＲＡｊＲからの特定の抗血清とＤｉ
ｆｃＯにより得た典型的な血清とを用いた凝集反応によ
り、細菌を明確に同定した。

この第一継代培養菌をチョコレート寒天プレート上に線
条に接種し、３７℃で５１　Ｃｏ。

存在下１８時間培養し、その後増殖菌を１０係スキムミ
ルク培地に移し、１艷に等分割して、−７０℃で凍結し
た。細菌は、ＷＲＡＩＲからの特定の抗血清とＤｉｆｃ
ｏにより得た典型的な血清とを用いた凝集反応により明
確に同定された。

第二継代からの培養菌が入ったバイアル（ｖｉａｌ　）
　を解凍し、１０個のコロンビア羊血液（Ｃｏｌｕｍｂ
ｉａ　５ｈｅｅｐ　Ｂｌｏｏｄ　）　寒天プレート（Ｃ
ＢＡＢ−ＢＢＬ）上に線条に接種した。

プレートを３７℃で５１　ＣＯ２存在下１８時間培養し
、その後増殖菌を１０係スキムミルク培地１００　ｍｌ
に移し、０．５　ｍｌに等分割して、−７０℃で凍結し
た。細菌は、特定の抗血清との凝集反応糖発酵及びダラ
ム染色により明確に同定された。

この継代からの培養菌が入ったバイアルを解凍し、ミュ
ラー−ヒントン肉汁（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈ４ｎｔｏｎ　
Ｂｒｏｔｈ　）で希釈し、４０個のミュラー−ヒントン
寒天プレートに線条に接種した。

プレートを３７℃で６％Ｃ０２存在下１８時間培養し、
その後増殖菌を１０係スキムミルク培地１７ｍに移し、
０．３ｍ７！に等分割して一７０℃で凍結した。細菌は
、ダラム染色、特定の抗血清との凝集反応及びオキシダ
ーゼ試験により明確に同定された。

ナイセリア・メニンギチジスＢ属Ｂ− １１の二つの０．５　ｍｌ凍結バイアルから接種菌が増
殖した。４つのミュラー−ヒントン寒天ブレーク（Ｂｌ
ａｋｅ　）瓶を接種し、約１８時間後に移し変え、ｐＨ
７，２９のゴツシュリツヒ（Ｇｏｔｓｃｈｌｉｃｈ　）
　酵母透析培地５ｔの接種菌として使用した。Ｏ，Ｄ。

を６６０　ｎｍ　で００６５に調整した（パーキン−エ
ルマー）。細菌を、振盪機を用い、３７℃で５つの２ｔ
エルレンマイヤーフラスコ（それぞれ１ｔの培地を含む
；下記参照）内で増殖させた。０．Ｄ。

を４５．７５及び１２０分間隔で監視した。ｏ−ｒ）−
ｅｅｏ　が０．８１（スペクトロニック２０）の約４ｔ
の肉汁培地が得られた。

３　ｍｌの試料を、グラム染色；　ＣＢ　Ａ　Ｂ。

ミュラー、ヒントノ及び酵母抽出デキストロースプレー
トへの分離線条接種；並びして凝集検査のため（（取り
出した。全ての反応が満足すべきものであった。

ｂ、７０ｔの種発酵槽　約３６００ｍｅの種培養物を、
完全産生培地（下記参照）４２６ｔが入った無菌の７０
を発酵槽に接種するために用いた。

７０ｔの発酵条件は、５．５時間に亘り３７℃で１０７
／ｍｉｎの空気導入下 １、８５　ｒｐｍにて、ｐＨ７，０にｐｌ＋を一定にコ
ントロールすることである。

培養物を、３７℃で、ミュラー−ヒン トン寒天プレート、酵母抽出デキストロース及びウサギ
血液寒天プレート（メルク社製）上に接種し、Ｎ−メニ
ンゲチジスＢ属抗血清との凝集試験に供した。ミュラー
−ヒントン寒天プレート、酵母抽出デキストロースブレ
ート及びウサギ血液寒天プレートにおける増殖菌は正常
であって、凝集反応は陽性であった。このバッチについ
ての最終０．Ｄ、は５，５時間後に６６０μで０．８４
０であった。

ｃ、８００１の産生発酵槽 約４２．２ｔの種培養物を用いて、５６８２ｔの完全産
生培地（下記参照）が入った無菌の８００４発酵槽に接
種した。ハツチを、３７℃で、６０ｔ／ｍｉｎの空気導
入下１０１００ｒｐで、ｐｌ＋　７．　Ｏｆ’こｐＨを
一定にコントロールして培養した。

ハツチを不活性化する前に、３７℃で、ミュラー−ヒン
トン寒天プレート、酵母抽出デキストロースブレート及
びウサギ血液寒天プレート上ＩＣ培養物を接種し、Ｎ・
メニンゲチジスＢ属抗血清との凝集試験に供した。ミュ
ラー−ヒントン寒天プレート、酵母抽出デ千ストロース
及びウサギ血液寒天プレートにおける増殖菌は正常であ
って、凝集反応は陽性であった。このハツチについて、
最終０．Ｄ。

ｄ［接種１；３時間で２．２４であった。

３　比濁計フラスコ並びに７０１及び８００Ｌ−グルタ
ミン酸　１．５グ／ｌ Ｎａα　６．Ｏｆ／を 無水Ｎａ、ＨＰｏ、　２．５　ｆ　／　ＬＮＨ４α　１
．２５’ｊ／ｌ Ｋα　０．０’９？／ｌ Ｌ−システィンＨＣＩ　０．０２９／ｌフラクシヨンＢ
（ゴツシュリツヒの酵母透析液） Ｄｉｆｃｍ酵母抽出１１２８Ｌ？を蒸留水６，４ｔＶＣ
溶解した。この溶液を、３つのＨＩＯ８Ｍカートリッジ
を備えた２つのアミコンＤＣ−３０中空繊維透析ユニツ
トで透析した。透析液、ＭｇＳＯ４・７Ｈ７０の３８４
２及びデ壬ストロースの３２００１ｉ’をこの透析液に
溶解し、総容量を蒸留水で１５ｔとした。ｐＨをＮａＯ
Ｈで７，４（で調整し、ミリポア（０，２２μうに通し
てｆ遇することにより無菌化し、フラクションＡが入っ
た発酵槽に加えた。

比濁計フラスコ用：　フラクションＡの１７及びフラク
ションＢの２５　ｒｄを加え、ｐ）ＩをＮａＯＨで７．
０〜７．２に調整した。

７０ｔの発酵槽用：　フラクションＡの４１．８を及び
フラクショνＢの９００−を加え、ｐＨをＮａＯＨで７
．０〜７．２に調整した。

８００ｔの発酵槽用：　フラクションＡの５５３１及び
フラクションＢの１５０６を加え、ｐＨをＮａＯＨで７
．０〜７．２に調整した。

ｄ、採取及び不活性化 発酵が完結した後、フェノール（０，５％ｖ　／　ｖ最
終濃度）を各容器に加え、次いでこれに細胞肉汁を移し
た。培養菌がもはや存在しｈくなるまで（約２４時間）
物質を静かに攪拌しなからｉ温で保持した。

ｅ・　遠ノｂ・分離 ４℃にて約２４時間経過した後、不活性化された培養液
６１４．４　ｔをシャープレス遠心機によって遠心分離
した。フェノール添加後の細胞ペースト重量は３．８７
５に９であった。

Ｂ、単離 工程１．細菌細胞の洗浄 各々の単離のために、上記０．５％フェノール不活性化
ペーストの２００ｆ等分割物を滅菌蒸留水８００ｒｎｌ
に懸濁し、粒状懸濁液となるまで磁気的に攪拌した。懸
濁した細胞を２０，０００ｘｇ　で６０分間、５℃にて
ペレット化した（ベックマン１９　Ｔｉ　ローター、１
４．５０　Ｏｒｐｍ　）。

工程２　抽　出 この洗浄された細胞を、６０秒間で３回に調節されたツ
ルポール（５ｏｒｖａｌｌ　）約１．８ｔ（２クオーツ
）のオムニミキサー（ｏｍｎｉｍ］ｘｅｒ　）にて、、
０．５％デオキシコール酸ナトリウムを含有したｐｌ＋
　８．５の０．１Ｍトリス（Ｔｒｉｓ　）−０，０１Ｍ
ＥＤＴＡ緩衝液（ＴＦ：、Ｄ緩衝液）２０００−中に懸
濁した。５６℃で振盪水浴中にて１５分間で抽出するた
めに（加温）、均一な懸濁液を］６個の５００ｍ１．の
エルレンマイヤーフラスコに移しだ。

抽出液を２０，０００ｘｇ　で６０分間、５℃にて遠心
分離した（ベックマン１９Ｔ１０−ター、１４．５０　
Ｏｒｐｍ　）。次いで粘稠な上澄液を傾瀉しく総容量１
９８０成）、４℃で貯蔵した。

抽出された細胞ベレットを上記のようにＴＥＤ緩衝液２
０００ｒｔに再懸濁した。懸濁液を５６℃で１５分間抽
出し、上記のように遠心分離した。上澄液を傾瀉しく容
量２１００ｗｄ２）、４℃で貯蔵した。

工程３．　限外ｒ過による濃縮 工程２の抽出上澄液をプールした（総容量４００５ゴ）
。プール液２ｔを、２つのＱ、　４５　μデュラポア（
ｄｕｒａｐｏｒｅ　）　膜［１／２平方フイート（約１
５平方ｃｒｎ）の表面積〕を備えたミリポア・ペリコン
フィルター装置に装填された２ｔのニューブラシスウイ
ツク（Ｎｅｗ　Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ　）発酵容器の中に
入れた。抽出上澄液を、９０分間の濃縮操作中に亘って
、発酵容器の内部で２５℃に保持した。試料を約１．９
ＫＬｉ／ｃＪ　（２７，５ｐｓｉ）の平均伝播膜圧（ａ
ｖｅｒａｇｅ　ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｅｓｓ
ｕｒｅ　）　で１０倍に濃縮した。

工程４．　血清型蛋白質の収集と洗浄 工程３からの残留物（２０５Ｉｎｌ）を遠心分離し、１
６０，０００ｘｇ　で２時間、５℃にて血清型蛋白質を
ペレット化した（ベックマン４５　Ｔｉ　ローター、３
７，０００ｒｐｍ）。

上澄液を傾瀉し廃棄した。蛋白質ぺ１ノツトの重量を測
定しく８．１２ｆ）、次いでこれをカラスロンドとドウ
アンス（Ｄｏｕｎｃｅ　）ホモゲナイザーにて、手作業
でＴＥＤ緩衝液（１９０ｒｎ！、緩衝液；　２０　ｍｌ
／　ｙペレット）中に懸濁した。懸濁液を５６℃で１５
分間（加温）振盪しながら５００　ｍｌエルレシンマイ
ヤーフラスコ中抽出した。懸濁液を１６０．０００ｘｇ
　で２時間、５℃にて遠心分離した（ベックマン４５Ｔ
］　ローター、３７、００　Ｏｒｐｍ　）。上澄液を傾
瀉し、廃棄した（容量１９０ｒｎ１．）。ペレットを上
記のようにＴＥＤ緩衝液１９０　ｍｌ、で二回洗浄した
。

■程４の洗浄された蛋白質ペレットをガラスロッドとド
ウアンス・ホモゲナイザーにて蒸留水１００ゴに懸濁し
、完全な懸濁液を得た。１７．０〜／ｄのローリ−蛋白
質価がこの懸濁液について得られた。この時点において
、懸濁液２００■を実験的使用のために保存した。残っ
た懸濁液（９１ｍ）をガラス蒸留水１０２．４ｒｎｌに
て８．０　ｍｇ　／　ｍｌに希釈した。水性懸濁液を１
２．０００　ｘｇで１５分間遠心分離し、それを凝集物
から清澄化した（ベックマン４５　Ｔｉ　ローター、１
０、００　Ｏｒｐｍ　）。

上澄の生成物を、軟かな凝集ペレットから分けるために
、ビレットで注意深く回収した。生成物をラベルしく容
量１８２．５　＃＋７り、一部を無菌性と発熱物質につ
いて分析した（無菌生成物；無発熱物質）。生成物を、
分析的に特徴付けられ複合化（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ
　）に使用されるまで、無菌原料として４℃で貯蔵した
。収量は、元の細胞ペースト１１に対し９．５グローリ
ー蛋白質であった。

蛋白質　４．１■／ゴ ローリー 核　酸１ ＲＮＡ　（ビアル）１．８係 ＤＮ、ＡＣジフェニルアミン）０．６チ中性糖８ アンスロン　Ｊ、０５ シアル、酸＊３．０％ 分子量 ５ＤＳ−ＰＡＧＥ　４０，０００ｄ ＊　口−り一蛋白質のチとして計算 以下の方法が分析を行なう上で使用された：ｌ、　蛋白
質　−実施例１と同様 ２、　核酸　−オルシノール（ｏｒｃｉｎｏｌ　）反応
〔ビアル（Ｂｉａｌ））における呈色を観察しだが、そ
れが蛋白質濃度のチとして計算される１、８％ＲＮＡに
相当した。ＤＮＡに関するジフェニルアミン試験では、
原溶液中での蛋白質の係として計算された０、６チＤＮ
Ａ量を示した。

３　中性糖　−蛋白質のチとして計算される中性糖の含
有量は、アンスロン比色試験にて判明した〔スコツト及
びメルビノ、アナル・ケム、２５巻、１６５６頁； １９５３年（５ｃｏｔｔ　ａｎｄ　Ｍｅｌｕｉｎ、　Ａ
ｎａｌ。

Ｃｈｅｍ、　２５　、　１６５６　（１９５３）　）　
：］。

４　シアル酸　−シアル酸含有量’ｄ−、レソルシノー
ルーＨα法にて判明した〔スベンナーホルム、バイオケ
ム・バイオフイズ・アクタ、２４巻、６０４頁、１９５
７年（Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　
Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、。

ム、６０４　（１９５７）　）　’Ｊ。

５、　分子量　−ＳＤＡポリアクリルアミドゲル電気泳
動により測定できるようにメルカプトエタノール変性さ
れた蛋白質の分子量〔ネイチャー、２２７巻、６８０頁
、１９７０年（Ｎａｔｕｒｅ　２２７　、６８０　（１
９７０）　）、ＬＫＢ出願番号３０６〕。

実施例３ Ｈ・インフルエンザｂ型多糖−Ｎ・メニンギチジスＢ血
清型外膜蛋白質複合体の製造し　テトラ−ｎ−ブチルア
ンモニウム型ダウエックス（Ｄｏｗｅｘ　）　５０　Ｘ
　８　（２００−４００メツシユ）の調製 新しいＤｏｗｅｘ　５０Ｘ８　（２００−４００メツシ
ユ）強酸陽イオン交換樹脂（バイオ−ラッド、Ｂｉｏ−
Ｒａｄ　）　３６０　ｍｌ！を無菌クロマトグラフィー
用カラムに充填し、無菌蒸留（ｓｄ）水１５００ｍで洗
浄し、ｓｄ　水８００ｍ１に一夜浸漬した。樹脂を、次
いで、６０：４０のｓｄ　水：メタノール１ｔ、４０：
６０のｓｄ水：メタノール１を及びｓｄ　水１ｔで連続
的に洗浄した。樹脂を、次いで３Ｎ塩酸６５０ｍ１　（
２００ｍｌＨα、水で８００ｒｎｅに希釈）に浸漬して
滅菌した。この酸型樹脂を１９，５時間熟成し、しかる
後、過剰の酸をＨ２Ｏで洗い流した。

とのカラムに次いで水：４０％水酸化テトラブチルアン
モニウムの１：１混合物７００ｍ１．を加え、溶出液が
塩基性（ｐＨ−１０）となるまで樹脂に浸透させた。樹
脂を水約２ｔで洗浄して過剰の塩基を除き、しかる後、
無菌ジャーに移した。最終の溶出液は無菌で発熱物質も
なかった。

Ｉｆ　Ｈ・インフルエンザｂ型多糖（ＨＩｂ）のテトラ
−ｎ−ブチルアンモニウム塩の調製 マグネチツクスクーラーを備えた２５０ｍｇの丸底フラ
スコにＨＩｂ３．２９Ｓ’及び水８４−を入れた。混合
物を２０分間攪拌Ｌ／　、次いで水１５ゴを追加した。

攪拌を全てのＨＩｂが溶解するまで更に３０分間続けた
。次いで、Ｈ，Ｉｂ溶液を４５咽×２７０論カラム内の
Ｄｏｗｅｘ　５０　Ｘ　８　（２００−４００メツシユ
、テトラブチルアンモニウム型）１５ｏｙに供した。水
１０ｒｎＩＶをすすぎ液として用いた。カラムの上部に
水を加え、手動ポンプにて加圧した〔ミレツクス（Ｍｉ
ｌｌｅｘ　）　ＦＧ　Ｏ，２２ｐフィルターを通過させ
る〕。

５０ｍ７！の画分を無菌ナルゲン（Ｎａｌｇｅｎｅ　）
遠心管（５０ｍ１．）に集め、各管について、無菌融点
毛管を用いて約１０μを分をシリカゲルプレートに移し
、有機物質を分析した。プレートにＣｅ　ｌｌＳＯ４）
２／Ｈ２Ｓｏ、と溶液［１０係硫酸水溶液中の１　％　
ＣｅｒＶ　（ＳＯ４）２　］を噴霧し、熱プレート上で
加熱し、パ有機“分を黒点として検出した。管２．３．
４及び５からの総量１９０ゴを無菌の２５０　ｍｌ遠心
管に集め、混合し、しかる後６つの既知重量の（ｔａｒ
、ｅｄ）２５０ｄ丸底フラスコに等分割してＡｒＦの標
識を付した。分割液を試験し、無菌で発熱物質のないこ
とが判明した。

６つのフラスコ内容物をドライアイス−アセトンで凍結
し、２つの持運び可能な三ツロ真空多岐管に接続して凍
結乾燥した。真空多岐管を層流フード内に移し、フラス
コを外して無菌紙袋で密封した。これらをデシケータ−
内でＰ２Ｏ５により高真空下−２０℃で貯蔵した。乾燥
試料は出発ＨＩｂと同様のＫｄ　を有していた。

ｒｎ、　多糖−ブタンジアミン付加物（ＨＩｂｌ、４−
ブタンジアミン付加物塩１．４６　ｆ　ヲ１００ｒｎｌ
の丸底フラスコに入れ、水５８ゴに溶解した。２．５Ｎ
ＮａＯＨ５，０ｒｎｌを加え、ｐｌ＋１０３５に調整し
た。溶液を０．２２μシブロンーナルジ（、Ｓｙｂｒｏ
ｎ−Ｎａｌｇｅ　）　Ｖ　イルター　１１Ｃ通して１過
し、保存した。

■程Ｂ：ＨＩｂの活性化と１，４−ブタンジアミンとの
反応 ＰＲＰのテトラ−ｎ−ブチルアンモニウム塩０６４９が
入った（■部で得た）フラスコＡＪマグネチック攪拌棒
とジメチルホルムアミド１７．５ｄとを入れた。混合物
を室温で２５分間攪拌すると、はとんど全ての物質が溶
解したようであった。

カルポニルジイミタソール８０■を無菌の６ｄ血清バイ
アル中に秤り取り、次いでＤＭＦ溶液へ一度に加えた。

フラスコに栓をつけ、溶液を室温で３５分間攪拌した。

この間に、Ａで調製したブタンジアミン３２ｍをマグネ
チック撹拌棒が入ったＩＱＯｍｅの丸底フラスコに入れ
、水浴上で約５分間攪拌した。

３５分間の攪拌時間終了後、ＤＭＦ溶液をピペットで冷
１，４−ブタンジアミン溶液に加えた。水浴上での攪拌
を１５分間続け、その後、水浴を除いて更に１７分間攪
拌し続けた。

■程Ｃ：透析及び凍結乾燥 溶液を、オートクレーブ化されたスペクトロ−パー（５
ｐｅｃｔｒｏｐｏｒ　）　２透析管〔シリンダー容積０
．２１　ｍｌ／ｌａｎ　；　１　フインチ（約４３ｃｒ
ｎ）〕に移し、４℃の室内で透析した。まず、溶液をｐ
ｎ　７．０の０．０１　Ｍリン酸緩衝液８ｔに対して５
時間透析し、次いで新しいリン酸緩衝液８ｔに対し５時
間、しかる後１１時間の二回透析した。最後に、溶液を
水１８１に対して６時間透析した。無菌性及び発熱物質
の試験用に一部を分取した後（結果：無菌で発熱物質は
なかった）、透析液（約１２５ｍ）を２つの；５０ｍの
丸底フラスコに分けた。

これらのフラスコの内容物をドライアイス−アセトンで
凍結し、上記■部の方法によって凍結乾燥した。総量４
８０〜が得られた。

フルオレサミン分析によるとＮＨ２が４６８ｎｍｏｌ　
／■　であった。

■、多糖−ブタンジアミンブロモアセトアミド（ＨＩ　
ｂ　−ＢｕＡ２．−ＢｒＡｃ　）の製造工程Ａ：ｐニル
−ニトロフェニルブロモアセテート造 ブロモ酢酸６．３０９　（４５ｍｍｏｔ）　及びｐ−ニ
トロフェノール６、２５　Ｌ（４５ｍｒｎｏｔ）を２５
０　ｍｌの丸底フラスコに入れ、塩化メチレン（ＣＨｔ
　（＆　）　５０−に溶解した。この溶液を水浴上で１
０分間攪拌し、次いでＣＨ２Ｃｌ。

１０ｒｎｌに溶解されたジシクロへ壬ジルカルボジイミ
ド１０．３　ｆ／　（５０ｍｍｏｔ）　をそれに加えた
。次いで、反応混合物を４℃で１７２５時間攪拌した。

次に、沈殿したジシクロヘキシル尿素を濾過し、ｒ液を
濃縮して真空乾燥した。黄色残渣を１−クロロブタン３
５ゴに加え、次いで再結晶するとｍ、　ｐ、　８５〜８
７℃の生成物６．５２が得られ、この生成物をシクロへ
壬サン１００−に加え、しかる後再結晶するとｍ、　ｐ
。

８６〜８７℃のｐ−ニトロフェニルブロモアセテート４
５９りが得られた。

計算値（Ｃｓ　Ｈｅ　ＮＯ４Ｂｒ　）　：Ｃ，３６，９
２；Ｈ，２，３０；Ｎ、　５．３８　；Ｂｒ、　３０．
７７実測値：　Ｃ，３７，６６；Ｈ，２，４８；Ｎ、　
５．２８；Ｂｒ、　３０．５７’）ＩＮＭＲは一致した
。

工程Ｂ：ＨＩｂ−ＢｕＡ２　の反応 上記■部で得た（２つのフラスコからの）ＨＩ　ｂ−Ｂ
ｕＡ２　３８０〜を、マグネチック攪拌棒を備えた２５
０ゴの丸底フラスコ内のｐＨ９１５の緩衝液３７ｒｎｌ
に溶解した。この溶液にアセトニトリル９ゴ中の（上記
工程Ａからの〕ｐ−ニトロフェニルブロモアセテート３
４６　ｍｇを加え、混合物を４℃にて２４時間攪拌し、
次いで１８インチ（約４５（７））透析管（スペクトロ
−パー２、■部参照）に移した。しかる後、この溶液を
水１８ｔに対し５２５時間、続いて新しい水１８７に対
して１７、２５時間（いずれも４℃にて）透析した。

透析液１００−を、’　ｏ：　４５μシブロン・ナルゲ
フィルター及び０．２０μフイルターに連続的に通過さ
せて濾過した。次いで、それを６つの１００−丸底フラ
スコに等量に分け、しかる後凍結し、■部と同様に凍結
乾燥した。

総量０．２８　？のＨＩ　ｂ　−ＢｕＡ２−ＢｒＡｃが
得られた。フルオレサミン分析によるとＮＨ，が１２８
　ｎｍｏ／：／■であって、その差からブロモアセチル
基が３４　Ｏｎｍｏｌ／ｌｎｇ　となる。比濁計分析で
は出発多糖と同様の抗原性が示された。

Ｖ、ＨＩ　ｂ　−ＢｕＡ２−ＢｒＡｃと官能化Ｎ−メニ
ンギチジス膜蛋白質（ＮＭＰ）との複合化工程Ａ：Ｎ−
アセチルホモシスティンチオラクトンによるＮＭＰの官
能化 エチレンジアミン四酢酸４２η及びジチオスレイトール
８■を含む６　ｍｌの血清バイアルに、ｐｌｌｌｌ、３
のホウ酸緩衝液５ゴを加えた。

この溶液３．８ｍｌを５０ゴの丸底フラスコに入れ、ナ
イセリア・メニンギチジス外膜蛋白質（ＮＭＰ　）の溶
液１１．５ｒｎｌを加えた。得られた混合物のｐＨを２
．５　ＮＮａＯＨ４０〜５０　ｔｔＬにて１１．３９に
調整した。フラスコをマツシュルーム型シーラムストッ
パーで栓をし、ファイヤーストーン（Ｆｉｒｅｓｔｏｎ
ｅ　）バルブ（ＡＣ’Ｅガラス社製）を用いて空気を窒
素に置換した。Ｎ＝ニアセチルホモシスティンチオラク
トン５３を窒素ボックス内で加え、得られた溶液をＮ２
雰囲気中、室温で１６，７時間熟成した。次いで、この
溶液をセファデックス（５ｅｐｈａｄｅｘ　）　Ｇ　２
５　（細粒）１２０ｍｌが人つたカラムに供し、それを
窒素ボックス内で処理した。溶出はｐＨ８のリン酸緩衝
液で行ない、５ｄの画分を集め、エルマン（Ｅｌｌｍａ
ｎ　）試験によってチオールを分析した。低分子量物質
から高分子量（即ち、蛋白質）チオールのベースライン
分離を行なった。

工程Ｂ；複合化 高分子量画分を集め、ＨＩ　ｂ　−Ｂｏ３−ＢｒＡｃ（
ｉｖ部）　０．０６　Ｆが入った５０ｍのフラスコの一
つに加えた。この溶、液をＮ２ボックス内で室温にて６
時間熟成し、無菌スペクトロ−パー透析管に仕込み、４
℃で水１．８　ｔに対し１５時間、続いて新しい水１８
ｔに対して２４時間透析した。

■程Ｃ：遠心分離 透析液（約３２ゴ）をピペットで２つのポリカーボネー
ト製遠心管に２５ｍと７ｄとの両分に分けて移し、ベッ
クマンＴｉ６０ローターにて、４℃で２時間、３７．０
０　Ｏｒｐｍ（１００，０００ｘｇ）　で遠心分離した
。上澄液を傾瀉し、ペレットを水約８ｄとともにドウア
ンス（Ｄｏｕｎｃｅ　）　ホモゲナイザーに移し、均質
化し、遠心管の一つに戻した。この管を水で２５蔵に満
たし、完全な再懸濁液とし、管を４℃で２時間、３７．
００　Ｏｒｐｍ（１００，０００ｘｇ）　で再遠心分離
した。

第二の上澄液を傾瀉し、ペレットを水８ｒｎｌとともに
ドウアンスで均質化した。ホモゲネートを無菌の１５ｄ
ナルジ遠心管に移し、水で１５ｒｎｌＫまで希釈した。

４℃で一夜熟成した後、少量の凝集物が現れた。これを
臨床遠心機にて約２５０　Ｏｒｐｍで短時間（５分間）
回転させて除去した。

上記の活性化、複合化及び遠心分離の操作を同様の方法
で二回繰返した。それらを、蛋白質、多糖含量、Ｓ−カ
ルボキシメチルホモシスティン（ＳＣＭＨＣ，）、リジ
ン比、無菌性及び発熱物質性について分析した。

全ての試料は無菌で発熱物質が存在していなかった。そ
の他の結果を下記に掲載した。

１　１０５　１２１０　０．０９　０．０１１２　１５
４　１７００　０．０９　０．０１９３　１６６　１８
００　０．０９　０．０２７複合体を特徴づける多糖／
蛋白質比の一致は操作の再現性を確約するものであり、
Ｓ−カルボキシメチルホモシスティン／リジン比は反応
効率の指標であって、０を超える結果は共有結合的に変
換された多糖類及び蛋白質の間に共有結合が存在するこ
とを証明する。

臨床用ロフトとして供するために溶液を集め；ラクトー
スの存在下（多糖２０μｆ／ｍｌ、ラクトース４ｍｙ／
ｍ）で凍結乾燥した。

実施例４ Ｎ−アセチルシステアミンに一キャップ化〃されたＨ・
イノフルエノザｂ型多糖−Ｎ、メニンギチジスＢ血清型
外膜蛋白質複合体の製４告 官能化された多糖ＨＩｂ−ＢｕＡ２−ＢｒＡｃ　の製造
法は実施例３（Ｉ〜■部）と同様である。

官能化されたＮＭＰの製造法は、実施例８のＩＶ、Ａ部
（工程３３（ＩＩＪ’）−ＮＭＰ複合体の製造）と同様
である。

チオール化蛋白質（エルマン分析で５．６μｍｏＬ　の
ＳＨ）４ｍ／が入ったフラスコにＨＩｂ−ＢｕＡ２−Ｂ
ｒＡｃ　（差から、ブロモアセチルが３００　ｎｍｏｌ
　である）５９■を加えた。

フラスコを隔膜（ｓｅｐｔｕｍｅ　）で密封し、脱気し
て空気を窒素で置換し、溶液を１８．５時間熟成した。

水６ｒｎｌを加え、溶液を１０ゴのポリカーボネート製
遠心管に移し、ベックマン７５　Ｔｉ　ローグーにおい
て４℃で、４３．００Ｏｒｐｍにて２時間遠心分離した
。上澄を除去し、ペレットをドウアンスホモゲナイザー
によって、Ｎ−アセチルシステアミン１０６　ｍＷを含
有したｐＨｓの０．１　Ｍリン酸緩衝液１０ｒｎｌに再
懸濁し、溶液を脱気して室温で１９．５時間熟成した。

次いで、上記のように遠心分離した４　３，０００ｒｐ
ｍ、’４℃、２時間、７５Ｔ１０−ター）。

ペレットを水９．７コに（ホモゲナイズせずに）懸濁し
、上記と同様に再遠心分離した。得られたペレットをホ
モゲナイズしながら水２５ｄに再懸濁し、次いで水で３
０　ｍｌに希釈し、−）キャンプ化〃生成物の水性懸濁
液を得た。

複合体の分析結果は以下のとおりである：多糖濃度　蛋
白質濃度　ＨＩｂ４白質比１８８μＦ／７　１２００μ
ｒ／ｍ　０．１５７（Ｓｐｉｎｃｏ）：　ＳＣＭＨＣ／
リジンー０．０９６Ｓ−カルボキシメチルシステアミン
／リジン−０２０実施例５ Ｈ，インフルエンザｂ型多糖−Ｎ・メニンギチジスＢ血
清型外膜蛋白質複合体の動物に実施例３の操作で凍結乾
燥して得られたＨ。

インフルエンザｂ型多糖−Ｎ、メニンギチジスＢ血清型
外膜蛋白質複合体を様々な年令のＩＣＲ／）Ｔａ　マウ
ス及び赤毛猿（Ｒｈｅｓｕｓｍｏｎｋｅｙ）　にて免疫
原応答性に関し試験し、その結果を表２及び３にまとめ
た。

複合体の分析結果は以下のとおりである：多糖濃度　蛋
白質濃度　Ｐｓ／蛋白質比　収率Ｐｓ２７６μｒ／ｍ　
２．３８〜／ｒｎｌＯ，１２６，１ｑｂ表５−１ Ｈ，インフルエンザｂ型多糖−蛋白質複合体で免疫され
た様々な年令のＩＣＲ／Ｈａマウスの血清抗体応答性 ＊＊ Ｈ，ｆｌｕ多糖−２８２２１１１８６４５１５８６０蛋
白質複合体　。。□＊＊ ＊１回目の注射時点における年令；０．１４日に２μｆ
／　０．１ｒｎＩ！、が皮下注射されたマウス；２１日
月日採血 ＊＊別個の同産群；各群７〜８匹のマウスＨ，インフル
エンザｂ型多糖複合体の効力をマウスで試験し、結果を
表５−２に示した。

複合体は高度な免疫原性を有していることが証明された
。

表５−２ Ｈ，インフルエンザｂ型多糖−蛋白質複合体で免疫され
たヌード（無胸腺）マウスにおけＲＩＡ力価（ＧＭＴ）
絶対ｎυ鼠 試料　Ｎｕ／Ｎｕ　Ｎｕ／＋ Ｈ，ｆｌｕ多糖　（１）　２．５　１，８０２　１１．
３６２蛋白質複合体　（２）　１，３０４　８．７１２
食塩水コントロール （１）　５０ （２）　’　５５ ＊　１．、１．４日日に皮下注射されたマウス；２１０
日に浮面 Ｎｕ／Ｎｕ　（胸腺のない）マウスの応答性はＮｕ／＋
　（胸腺のある）マウスの応答性に対して平均約１５％
であり、複合体が胸腺依存性抗原であることが証明され
た。

表５−３ Ｈ，インフルエンザｂ型多糖−蛋白質複合体で免疫され
た赤毛猿の血清抗体応答性 赤毛猿　ＲＩＡ力価（ＧＭＴ　）絶対ｎか鵞年令１　日
数 ２−３か月　２０　μＳ＋　５０　１１６　１９５　３
０３６４か日　２０　μｒ　５０　４１４　４３７　１
５４８１８か月　２０　ｔｔｆ　１２４　５８５８　４
７８５　７４４７表２に示しだように、Ｈ，インフルエ
ンザｂ型多糖複合体は様々な年令の赤毛猿においても高
い免疫原応答性を誘起した。

実施例６ 肺炎球菌１．９Ｆ型多糖とナイセリア・メニンギチジス
外膜蛋白質との複合体 １、肺炎球菌１９Ｆ型多糖のテトラ−ｎ−ブチルアンモ
ニウム塩の製造 マグネチック攪拌装置を備えた２５ゴの丸底フラスコに
多糖１９Ｆ型（メルク社製）５０■及びＨ，０５ｄを入
れ、混合物を２０分間攪拌した。次いで、この溶液をダ
ウエックス５０Ｘ８（２００〜４００メツシユ、テトラ
ブチルアンモニウム型）が充填された３ｄのカラムに供
し、水で溶出し、２５ゴのエルレンマイヤーフラスコに
集めた。

この溶液について、Ｃｅ　ＩＶ　（ＳＯ４）２／Ｈ４、
Ｓ　０４　溶液を噴霧し次いで熱プレート上で加熱した
レリカゲルプレートにより多糖含有物を分析した。その
結果、黒点として検出可能な多糖が分取液中に含有され
ていたことが判明した。多糖１９Ｆ含有溶液を凍結乾燥
し５２■を回収した。

ｎ、肺炎球菌１９Ｆ型テトラブチルアンモニウム塩のカ
ルボニルジイミダゾールとの反応、及びその後の１，４
−ブタンジアミ１．４−ブタンジアミンニ塩酸塩４０〜
をＨｙ　０　１．　Ｏｍｊ！に溶解し、２．．５　Ｎ　
ＮａＯＨでｐＨ９，１５に調整した。

工程Ｂ：１９Ｆ型多糖の活性化及び１，４−ブタンジア
ミンとの反応 テトラブチルアンモニウム型の１９Ｆ多糖２０ｍｇが入
った２５ゴの丸底フラスコに、マクネチック攪拌棒とジ
メチルスルホ壬シト（ＤＭＳＯ）４ｄとを入れた。この
混合物を室温で２０分間攪拌して、全ての物質を溶解し
た。カルボニルジイミダゾール５■を加え、反応系を室
温で３０分間攪拌した。この間に工程Ａで得だ１，４−
ブタンジアミン溶液を、マグネチック撹拌棒を備えた２
５−の丸底フラスコに加え、水浴上で約５分間攪拌した
。

３０分間攪拌した後、ＤＭＳＯ溶液をピペットで冷１．
４−ブタンジアミン溶液に加えた。

水浴上での攪拌を１５分間続けた後、水浴を除いたが、
更に１５分間室温で攪拌を続けた。

工程Ｃ：透析及び凍結乾燥 次いで、溶液をスペクトロ−パー２透析管に移し、４℃
の室内で攪拌しながら透析した。

溶液をまず、ｐＨ７，０の０．０１．Ｍリン酸緩衝液４
ｔに対して８時間透析し、しかる後ｐＨ７，０の０．０
１Ｍリン酸緩衝液４ｔに対して８時間透析した。最後に
、溶液を水４ｔに対し６時間透析した。＠液を次いで凍
結乾燥し、１９Ｆ型多糖のブタンジアミン誘４Ｋ（１９
Ｆ−ＢｕＡ２）　１９■を回収した。フルオレサミン分
析では物質１　ｍｇについて１００　ｎｍｏＬ　のＮＨ
２が示された。

ｍ、１９　Ｆ　−ＢｕＡ２　のｐ−ニトロフェニルブ上
記１１で得た１　９　Ｆ　−Ｂｏ３　１５”Ｆを、マグ
ネチック撹拌棒を備えた２５ｍ１の丸底フラスコ内のｐ
Ｈ９，１５の緩衝液２ｍｌに懸濁し、全ての物質が溶解
するまで１０分間攪拌した。

この溶液に、アセトニトリル０．２−に溶解されたｐ−
ニトロフェニルブロモアセテート１５■を加えた。混合
物を４℃で２４時間攪拌し、スペクトロ−パー２透析管
に移した。

これを水４ｔに対して二回透析した。試料を凍結乾燥し
、１９　Ｆ　−ＢｕＡ、のＮ−ブロモアセチル化誘導体
（１９Ｆ　−ＢｕＡ２−ＢｒＡＣ）９■を得た。

フルオレサミン分析ではＮＨ２が５７　ｎｍｏｔ／■で
あって、その差エリブロモアセチルが４３　ｎｍｏｔ／
■となる。

■、ナイセリア・メニンギチジスの官能化された外膜蛋
白質（ＮＭＰ）への１９Ｆ−ＢｕＡ、−ＢｒＡｃの複合
化 工程Ａ　：　ＮＭＰのＮ−アセチルホモシスティンチオ
ラクトンによる官能化 エチレンジアミノ四酢酸４３１η′及びジチオスレイト
ール８■をｐｌ＋　１１．３０の飽和ホウ酸緩衝液５ゴ
（（溶解した。上記溶液０．４　ｄを１５ｒｎＩ！、の
遠心管に入れ、ナイセリア・メニノギチジス外膜蛋白質
（ＮＭＰ）の溶液１ｄ（１３７■）を加えた。この溶液
を脱気し、室温で１６時間Ｎ２雰囲気下においた。次い
でこの溶液に、ｐｌ＋　８．０のリン酸緩衝液１．１　
ｍｌを加えて認容５１２．５　ｍに希釈した。次いで、
この溶液をＮ２下でｐａｌ　ｓ、　Ｏのリン酸緩衝液に
より予め平衡化されたＰＤＩＯカラム（セファデックス
Ｇ２５Ｍ）に供した。試料をｐＨ８０のリン酸緩衝液３
．５　ｍｌで溶出した。チオール含量をエルマン分析に
て測定すると、１８９μｍｏ７　／試料であった。試料
２．５ｄをｐＨ８，０のリン酸緩衝液で予め平衡化され
た第二のＰＤＩ　Ｏカラムに供した。それをｐ）１８．
０のリン酸緩衝液３５ゴで溶出した。エルマン分析によ
るチオール含量は０．４４μｍｏｌ　／試料であった。

工程Ｂ：複合化 蛋白質溶液が入った１５ｍ６のパイレックス（ｐｙｒｅ
ｘ　）遠心管に、上記■からの１９Ｆ−Ｂｕ４−ＢｒＡ
ｃ　９　Ｔｑを入れた。この溶液をＮ２グローブボック
ス内で室温にて６時間熟成した。次いで、それをスペク
トロ−パー２透析管に供し、４℃でＨ，０４ｔに対し８
時間、続いて再びＨ２Ｏ４ｔに対して８時間透析した。

一部をアミノ酸分析用に凍結乾燥した。

実測値： リジン０．１４　］μｍｏｌ　／　７ｎ？Ｓ　ＣＭ　Ｈ
ＣＯ，ＯＯ６２ｐｍｏｔ　／　”？　（との０を超える
値は共有結合性を示す） ■程Ｃ：遠心分離 透析液（約１０　ｍｌ、　）をピペットでポリカーボネ
ート製遠心管に移（〜、４℃で２時間、ヘツクマン’］
’ｉ６０ローターによって３７．００Ｏｒｐｍ　（１０
０，０００ｘｇ　）で遠心分離した。

上澄を傾瀉し、ペレットをＮ２０　約２ゴとともにホモ
ゲナイザーに移し、そこでホモケナイズして、遠心管の
一つに戻した。これをＮ２０　で１０ｍ１に１で満たし
、４℃にて２時間、３７．０００　ｒｐｍ　（１００，
０００ｘｇ　）　で遠心分離した。第二の上澄を傾瀉し
、ペレットをＨ，０８蔵とともにホモゲナイズした。

ホモゲネートをプラスチック製の１５ｒｎｌ遠心管にて
貯蔵し、免疫原性について試験した。

表６−１ 肺炎球菌１９Ｆ−髄膜炎菌Ｂ血清型外膜蛋白質複合体で
免疫されたＩＣＲ／Ｈａマウスの血清抗体応答性 用量μｇ 試　料　多　糖　ＲＩＡカ価（ＧＭＴ）絶対ｎ　？／ｒ
ｒｌ’Ｐｓ１９Ｆ−Ｐｒ。

複合体　０．５　１．７，３３８ ＊０．７．２８日日日腹腔内注射されたマウス；３５日
日日採血 表６−１に示したように、複合体は高い免疫原性を有し
ていることが証明された。

実施例７ 肺炎球菌１９Ｆ型多糖と五目精製された犬■、肺炎球菌
１９Ｆ型多糖のテトラ−ｎ−ブチルアンモニウム塩の調
整 マグネチック撹拌棒を備えた５０ｍ１の丸底フラスコに
多糖１９Ｆ型（メルク社製）１０５Ｔｑ及び水６ゴを入
れた。混合物を２０分間攪拌し、溶液をダウエックス５
ｏ×８（２００〜４００メツシユ、テトラ−ｎ−ブチル
アンモニウム型）が充填された６ｍｌのカラムに供した
。カラムを水で溶出し、溶出液を５０ｍ１のエルレンマ
イヤーフラスコに集めた。溶出液について、Ｃｅ　ＩＶ
　（ＳＯ４）ｔ　／Ｈ２ＳＯ４溶液を噴霧し、次いで熱
プレート上で加熱して、シリカゲルプレートにより多糖
成分を分析した。多糖を含有する分取液は黒点として検
出された。多糖１９Ｆ含有溶液を凍結乾燥し、１９Ｆの
テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム塩１１２■を回収した
。

■１．多糖１９Ｆ型のテトラ−ｎ−ブチルアンモニウム
塩のカルポニルジイミダソールとの反応、及びそれに続
＜１，４−ブタン１．４−フタンジアミンニ塩酸塩１７
５ｍｇをＨ２０７ｍｌ、　ＶＣ＠解し、２．５　Ｎ　Ｎ
ａＯＨでｐｌ＋　９．５に調整した。

工程Ｂ：１９Ｆ型多糖の活性化および１，４−ブタンジ
アミンとの反応 テトラブチルアンモニウム型の１９Ｆ型多糖１．１２　
ｍｑが入った５０ｍ１．の丸底フラスコにマグネチック
撹拌棒とジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）５ｄとを加
えた。混合物を室温で１０分間攪拌し、全ての物質を溶
解させた。

カルポニルジイミダソール１３■を加え、反応系を３５
分間室温で攪拌した。この間に、上記工程Ａで得た１、
４−ブタンシアミン溶液を、マグネチック撹拌棒が備え
られ、かつ水浴中におかれ″に５０−の丸底フラスコに
入れ、溶液を約５分間攪拌した。３５分間攪拌した後、
ＤＭＳＯ溶液をピペットで冷１．４−ブタンシアミン溶
液に加えた。攪拌を１５分間続け、しかる後水浴を除い
て、更に１５分間室温で溶液の攪拌を再開した。

■程Ｃ°透析と凍結乾燥 次いで、溶液を４℃にて攪拌しながらスペクトロ−パー
２透析管で透析した。まず、溶液をｌ）Ｈ７，Ｏの０．
０１Ｍリン酸緩衝液４ｔに対して８時間透析し、しかる
後、ｐＨ７，Ｑの００１Ｍリン酸緩衝＠ｑｔに対し８時
間透析した。最後に、溶液を水４ｔに対して４時間透析
した。溶液を次いで凍結乾燥（〜、１９Ｆ型多糖のブタ
ンジアミン誘Ｌ％体Ｃｔ　９　Ｆ　−ＢｕＡ２）８０■
を回収した。フルオレサミン分析によるとＮＨ２が７７
　ｎｍｏｌ　／　”？であった。

ＦＩＴ、１９　Ｆ　ＢｕＡ２　のｐ−ニトロフェニルブ
ロモアセテートとの反応 工程Ａ：１９Ｆ−ＢｕＡ２　の反応 」二記１１部で得た１９Ｆ−ＢｕＡ２５０ｍｇを、マグ
ネチック撹拌棒を備えた２５ｒｎｌの丸底フラスコ内の
ｐＨ９，１５の緩衝液４ｒｎｌに懸濁し、全ての物質が
溶解するまで１０分間攪拌した。

この溶゛液に、アセトニトリル０５ｒｎ！、に溶解され
たｐ−ニトロフェニルブロモアセテート５０ｍｑを加え
た。混合物を４℃で２４時間攪拌し、しかる後スペクト
ロ−パー２透析管に移した。これを水４ｔに対して二回
透析した。

試料を次いで凍結乾燥し、１９　Ｆ　−’Ｂｔ＋Ａ２　
ＯＮ−ブロムアセチル誘導体（１，９Ｆ−ＢｕＡ２−Ｂ
ｒＡｃ）　４４Ｔｎｇヲ得た。フルオレサミン分析では
ＮＨ３が７．５　ｎｍｏ７　／　ｍＶ　で゛あり、その
差からフロムアセチル基が６９．５　ｎｍｏＬ　／■　
となる。

■、１９　Ｆ　−ＢＩ３　の官能化され精製された大麻
種子グロブリン（エデスチン）への複合化 工程Ａ：高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に
よるエデスチンの精 製 大麻種子から二回結晶化されたエデスチン（シグマ社製
）２４０ｍｇをｐｎ　７．０の３Ｍグアニジン４ゴに溶
解した。試料を激しく振盪し、メルカプトエタノール０
．１　ｎｔを加えた。振盪によって、大量の泡を形成し
た。

試料を室温で１時間放置し、小型（ｔａｂ’１ｅｔｏｐ
　）遠心機で遠心分離して泡を除去し、ミレツクス（Ｍ
ｉｌｌｅｘ　）−ＧＶ　０．２２　ｐフィルター（ミリ
ポア）に通してｆ過した。次いで、試料ノ半分（２ｍ、
１２（Ｍ＠）を、次の条件：流速１　ｍｌ　／　ｍｉｎ
　；λ　２８０　ｎｍ　；溶媒３ＭグａＸ アユジン：ＵＶ範囲２０；チャート速度０、２５　ｏｎ
　／　ｍｉｎで準備サイス（ｐｒｅｐ　５ｉｚｅ　）の
ＴＳＫ３０００モレキュラーシーブのカラムに注入した
。

ＵＶにより検出される適切な画分を集め、スペクトロ−
パー２透析管によって水３０　ｔに対し１６時間透析し
た。透析中に３Ｍグアニシンを水で置換すると、精製さ
れたエデスチンの沈殿物が生じた。

全ての試料を透析袋から遠心管に移し、小型遠心機で５
分間遠心分離した。精製されたエデスチノを含むペレッ
トを集め、真空下Ｐ２０．で乾燥した。尿試料の残りの
半分（２〜、１２ｏｍｒ）を次いで注入し、同一の工程
を繰返した。精製されたエデスチン１１０■を単離した
。精製されたエデスチンを次いで３Ｍグアニジン２．０
ｍ１Ｋ溶解し、遠心分離し、濾過し、更に三回目−の操
作にて再度クロマトグラフィーに供した。五目の精製後
、総量１８ｍ７が単離されたが、これは分析用ＢＴＳＫ
３０００カラムでは単一のピークであった。

エチレンジアミン四酢酸３ｍ９及びメルカプトエタノー
ル５μｔ　を３ＭグアニジノＩＦｎｌ中に入れた。この
溶液に、上記工程Ａで得た三日精製されたエデスチン１
４ｍｇを加えた。溶液のｐｌ＋を２．５　Ｍ　ＮａＯＨ
２０ｔｉｔ　で９．５に調整し、溶液を脱気し、Ｎ２下
においた。Ｎ−アセチルホモシスティンチオラクトン１
３■を窒素ボックス内で加え、得られた溶液をＮ２雰囲
気下、室温で１６時間熟成した。

次いで、溶液を３Ｍグアニジン１．４　ｍの添加により
最終容積２，５コに希釈し、Ｎ、下３Ｍグアニジンで予
め平衡化されたＰＤＩＯカラム（５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ
　２５　Ｍ、ファルマシア社製）に供した。試料を３Ｍ
グアニジン３．５コで溶出した。チオール含量をエルマ
ン分析により測定すると、約４．３８μｍｏＡ　／試料
であることが判明した。試料２５ｄを、３Ｍグアニジノ
で予め平衡化された第二のＰＤＩＯカラムに供し、次い
で３Ｍグアニジン３．５　ｒｒｌで溶出した。エルマン
分析によるチオール含量は３．２４μｍｏｔ／試料であ
った。

工程Ｃ：複合化 エデスチン溶液が入った遠心管に、ブロモアセチル化さ
れた１９Ｆ型多糖（１９Ｆ−ＢｕＡ２　ＢｒＡｃ　）　
（ｍ部）７ｍｇを加えた。この溶液をＮ、ボックス内に
て室温で６時間熟成した。次いで、スペクトロ−パー２
透析管に供し、水４ｔに対して三回、それぞれ８時間透
析した。全ての溶液を凍結乾燥し、小量をアミノ酸分析
に供した。

実測値：リジン　０．１０５　ｐｍｏＬ／ｍｌＳ　ＣＭ
　ＨＣ０，００３ｔｔｍｏｌ　／　ｍ９（変換された多
糖類及び蛋白質 の間の共有結合が証明された） 実施例８ ストレプトコッカス・アカラフティア ［：　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌａｃｔｉ
ａｅ　（ストレプトコッカスＢ型ＩＩＩ）　］］多糖−
Ｎ、メニンギチジスＢ血清型外膜蛋白質複合の製造 ■、■程Ｂ　（ＩＩ）のテトラ−ｎ−ブチルアンモニウ
ム塩の調製 工程Ｂ（ＴＩＴ）の多糖カル口（Ｃ’ａｒｌｏ　）らの
米国特許第４，４°１３，０５７号の方法により実質的
に製造される〕１００■を水４ゴに心解し、テトラブチ
ルアンモニウム型のダウエックス５０Ｘ８（２００〜４
００メツシユ）陽イオン交換樹脂が充填された７ｒｎｌ
のカラムに供した。カラムを水で溶出し、両分（３ｒｎ
ｌ）の有機物質にライ”’ＣＣｅ　ＩＶ　（ＳＯ４）２
　／Ｈ２ＳＯ４法により調べた。適切な両分を凍結乾燥
し、■程Ｂ（ＩＴＪ）の多糖のテトラ−ｎ−ブチルアン
モニウム塩ｉ　ｏ　ｏ　ｍｙを得た。

Ｉｌ、多糖−ブタンシアミン付加物（ストレプトコッカ
スＢ型（ＴＭ　）　−ＢｕＡ２）　の製造ストレプトコ
ッカス（５ｔｒｅｐ　）　Ｂ型（ｍ）テトラブチルアン
モニウム塩５０■ヲ乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ
）２．５ｄに懸濁し、完全な溶液ができるまで１０分間
攪拌した。次いで、１，１−カルボニルジイミダソール
５　ｍｇを一度に加え、溶液を室温で３５分間保存した
。次いで、この溶液を、ｐｌ＋が２．５　ＮＮａＯＨで
１０．３に調整されかつ水浴上で冷却された１、４−ブ
タンジアミンニ塩酸塩ｓ　ｏ　ｍｙを含有する溶液３　
ｍｌに加えた。得られた混合物を水浴上で１５分間、室
温で更に１５分間保存した。

次いで、混合物を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）４
ｔに対し、それぞれ５時間、１７時間及び７時間の五目
透析した。水４ｔに対する１８時間の最終透析物を次い
で凍結乾燥すると、ストレプトコッカスＢＷ（ＩＩＩ）
−フ゛タンジアミン付加物、即ちＳｔｒ’ｅｐ　Ｂ　（
ｍ　）　−ＢｕＡ２　が３２ｍ？得られた。フルオレサ
ミン分析ではＮｌ２が２１２　ｎｍｏｔ／　ｍｇ　であ
った。

Ｔ１１−　多糖−ブタンジアミンブロムアセトアミ５ｔ
ｒｅｐ　Ｂ　（Ｉｎ）　−ＢｕＡ２２６．８　”？をｐ
１１９のホウ酸緩衝液２．５　ＩＩＩ２に溶解１−、ア
セトニトリル０、４　ｍｅ　中のｐ−ニトロフェニル　
ブロモアセテート２８　ｍｇをこの溶液に加えた。混合
物を４℃で２３．５時間攪拌し、次いで４℃にて水３０
ｔに対し１７時間、続いて水４ｔに対して６時間透析し
た。凍結乾燥すると、３ｔｒｅｐＢ　（Ｉｎ）　−Ｂｕ
Ａ４−ＢｒＡｃ　２７　”ｆが得られた。フルオレサミ
ン分析ではＮｌ２が３５　ｎｍｏＡ　／ｍＷであって、
その差よりブロモアセチルが１７７　ｎｍｏｔ／ｍｌＦ
となる。この物質は比濁計によると充分に抗原性を有し
ていた。

ＴＶ、５ｔｒｅｐ　Ｂ　（ｍ）　−ＢｕＡ２−ＢｒＡｃ
　の官能化されたＮ、メニンギチジス膜蛋白質 （ＮＭＰ）への複合化 Ａ、’ＮＭＰの官能化：　ＮＭＰ啓液１０ゴ（５■／ｒ
ｎｌ）をポリカーボネート製遠心管に供し、ベックマン
７５Ｔ１０−ターにて４℃で２時間、４３．００　Ｏｒ
ｐｍ　で遠心分離した。

上澄を除去し、ペレットをエチレンジアミン四酢酸二ナ
トリウム塩３３．６　ｍＷ及びジチオスレイトール６４
■が含有されたＩ）１１１１．３のホウ酸緩衝液４　ｍ
ｌに再懸濁した。再懸濁液をドウアンスホモゲナイザー
に入れた。混合物を遠ノし・管に入れ、シーラムキャン
プで栓をし、脱気し、窒素置換し、これにＮ−アセチル
ホモシスティンチオラクトン５５ｍ７を加えた。

得られた混合物をＮ　ｔ゛下で１８時間室温にて熟成し
た。次いで、Ｉ　ＭＫＨ２ｐｏ４２．６ｍｌ及び０．１
　Ｍリン酸緩衝１２．６　ｄでｐＨ７，２５に調整しく
Ｎ２下）、混合物を（Ｎ２下で）遠心管に移した。次い
で、これを上記と同様に遠！し分離した（２時間、４℃
、Ｔ１７５０−ター４３．００　Ｏｒｐｍ　）。上澄を
除去した後、ペレットをｐ１１８の０．１Ｍリン酸緩衝
液１０ｍ１に（上記と同様にドウアンスホモゲナイザー
で）再懸濁した。この懸濁液を（上記のように）再遠心
分離し、続いてｐ１１８の緩衝液４　ｍｌにペレットを
再懸濁すると、チオール価が総量で５、６　ｔｉｍｏｌ
　ＳＨの溶液が得られた。対照実験により、これが純粋
にチオール化された蛋白質のみであって、小さな分子（
例えば加水分解されたチオラクトン）が存在していない
ことが明らかとなった。

Ｂ、複合化及び精製：　再懸濁されたペレット　４　ｒ
ｎｌ　に　５ｔｒｅｐ　Ｂ　（ｍ）　−Ｂ、ｕＡ２　−
ＢｒＡｃ　２　４　ｍｅを（Ｎ２下で）加え、この混合
物をＮ、下で１０ゴのポリカーボネート製遠心管に移し
、水を頂部に注いだ。（上記のよって）遠心分離した後
、水１０蔵に（上記のようにして）再懸濁し、（上記の
ように）再遠心分離した。

最終ペレットを（上記のように）水１５ｍに再懸濁した
ところ、懸濁液は２．７　ｍｇ／　ｍｅの蛋白質含量と
０．２６３ｍｒ／ｍｅの多糖含量とを有していた。

ＳＣＭＨＣ／リジン比は００４４であった。

実施例９ エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　Ｃｏ１
ｔ）エシェリヒア・コリに１種の凍結乾燥バイアル〔ド
クター・ジョン・ロビンス（Ｄｒ。

Ｊｏｈｎ　Ｒｏｂｂｉｎｓ　）　Ｌり人手、ＢＯＢ：］
を解凍し、トリブチカーゼ−ハイソイ（ｈｙｓｏｙ　）
　＝グルコース（ＴＨＧ）培地的１−で希釈した。

しかる後、一つのトリブチカーゼ−大豆寒天斜面に発酵
操作前の日に線条に接種し、３７℃で一夜培養し、斜面
上の増殖菌を採取し、Ｔ　ＨＧ培地１ｔに懸濁した。

トリブチカーゼ−ハイソイ−グルコース（Ｔ　ＨＧ　）
培地は、溶液Ａ　９．５　ｔを１２１℃で９０分間オー
トクレーブにて処理し、次いでそれを冷却し、別個に１
２１℃で３０分間オートクレーブで処理された溶液Ｂ　
５００ｍ／をそれに加えることにエリ調製される。

溶液Ａ ａ、トリブチカーゼ大豆肉汁 （Ｂ　Ｂ　Ｌ　）　３００ｆ ｂ、　ハイソイ（シェフイール ド）　１ｏｏｒ Ｃ，フェノール・レッド　９０■ ｄ、ＵＣＯＮ　ＬＢ−６２５泡止剤　１０ゴ（ユニコン
カーバイド社製） ｅ、蒸留水（全量９，５ｔの容 液となる量） 溶液Ｂ ａ、デキストロース（無水）　５０７ ｂ、蒸留水（全量５００ゴの 溶液となる量） 発酵 寒天斜面から接種された増殖ＴＨＧ培地１ｔを、２ｔの
エルレンマイヤーフラスコ内で３７℃にて２００　ｒｐ
ｎｉで６時間攪拌しながら増殖させた（この時、細胞の
増殖が観察された）。次いで、この１ｔを１’　４　ｔ
のニュー・プラスチック・サイエンティフィック （Ｎｅｗ　Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
　）　発酵槽内のＴＨＧ培地１０ｔに接種し、空気流速
を２Ｌ／ｍｉｎに、攪拌機を２００　ｒｐｍに調節した
。

ｐｎを調整し、１０　％　ＮａＯＨで６．８〜７．４に
６時間維持して、２つの同様な０．Ｄ、値を観察した。

採取及び清澄化 次いで、上記の最終発酵肉汁を、ヘキサデシルトリメチ
ルアンモニウムプロミド（最終濃度０．３係ｗ　／　ｖ
　）が入った５ガロン（約１９ｔ）のプラスチック製容
器に加えた。４℃で４時間、ヘキサデシルトリメチルア
ンモニウムプロミドにより沈殿する多糖を析出すせた後
、肉汁を不活性化するためにサンプリングし、確認後、
実験室用シャープレス遠心機にて約３０．００　Ｏｒｐ
ｍで２０分間遠心分離し、上澄を廃棄した。細胞ペレッ
ト（約６６７）を、単離する目的で保存した。

懸濁及び抽出 ３つの発酵バッチからの３つのペレットをそれぞれ１．
０　ＭＣａＣ／４　４００ｍｌに懸濁し、これらの懸濁
液を、氷水浴に入れられたオムニ（０ｍｎ１　）　ミキ
サーで、２に調節して３０分間抽出し、一つに集めた。

汚染物を除去するための２５％エタノール沈殿 無水エタノール３７３ゴを、前工程の ＣａＣ／、懸濁液１１３０ｍｌに攪拌しながら滴下し、
（２５％エタノール濃度となる）、混合物を４℃で一夜
放置した。得られた沈殿物をベックマンＪ−２１Ｂ遠心
機（でて４℃で３０分間１１．　ＯＯ，Ｏｘｇ　で遠ｌ
し分離することにより分離し、廃棄した。

粗多糖を回収するための７５％エタノール沈殿 無水エタノール２５６０　ｍｌを、前沈殿工程からの透
明な上澄液１２８０ｍに攪拌しながら滴下しく７５％最
終濃度）、混合物を４℃で一夜放置して粗多糖の完全な
沈殿を得た。

粗多糖の回収 不溶性沈殿物を、ベックマン−２１Ｂユニツトにて４℃
で３０分間１１＋　０００　ｘＧ　で遠心分離すること
により回収し、無水エタノール約２００蔵で一回、アセ
トン約２００ｄで一回洗浄し、両洗浄液を廃棄した。不
溶性生成物を次いで無水Ｃａ偽　にて４℃で真空乾燥し
た（収量４．６′？）。

フェノール抽出及び透析 粗多糖４６７を、ドウアンスホモゲナイザーを用いて、
ｐＨ６，９ノ０．４８８　Ｍ酢酸ナトリウム４００　ｍ
ｌに懸濁しく濃度１１．５〜７　／　ｍｌ　）、この溶
液を、ｐＨ６，９の０．４８８酢酸ナトリウム１８０ｒ
ｎｌを完全な溶液が得られるまで約０．５Ｋｇ（１ポン
ド）瓶のマリンクロツツ（Ｍａｌｌｉｎｃｒｏｄｔ　）
結晶フェノールに加えて調製されたフェノール水溶液２
００−でそれぞれ五目抽出した。各フェノール抽出液を
次いで１１．　ＯＯＯｘＧで３０分間、４℃にて遠心分
離して乳濁を破壊し、水相を吸引し、プールし、抽出し
てフェノール相を廃棄した。

プールされた水相を、最終透析比が１＝１００、０００
以上となるようにガラス蒸留水を代えながら４℃で２４
時間透析した。

多糖を回収するための７５％エタノール沈殿２　Ｍ　Ｃ
ａＣ／！２７．６　ｍｌを上記工程の透析液３０５ｍ１
に加えて、最終濃度０．０５　Ｍ　Ｃａ（１４とし、無
水エタノール９３８ｄを急速に攪拌した溶液に滴下した
（７５％エタノール濃度）４℃で一夜放置した後、得ら
れた沈殿物を、ベックマンユニットにて３０分間、１１
，０００ｘＧで４℃にて遠心分離することにより集め、
しかる後、無水エタノール約２００ｄで一回、アセトン
約２００ｄで一回洗浄し、無水ＣａＣ／、で４℃にて真
空乾燥した（収量１．７ｆ）。

超遠心分離 多糖１．７１を０．０５　ＭＣ’ａ（Ａ　１７０ｒｎｌ
ｌに再懸濁し、無水エタノール１８．９ｒｎ１．を攪拌
しながら滴下し、溶液を４℃にて２時間、１．００，０
００　ｘＧで遠心分離した。

生成物の回収 得られた透明な上澄液１８０＃＋７！を傾瀉して除去し
、多糖が沈殿するようにエタノール４６８　ｍ７！を攪
拌しながら滴下した（７５％エタノール濃度まで）。混
合物を４℃で一夜放置して完全に沈殿させ、生成物を１
１，０００ｘｇ　で３０分間、４℃にて遠心分離するこ
とにエリ集め、無水エタノール２００ｒｎｌで一回、ア
セトン２００　ｍｅで一回洗浄し、無水Ｃａ（：４にて
４℃で真空乾燥した（収量１．４６　ｆ　）。

超遠心分離 多糖１．４６　ｆを０．０５　ＭＣａ偽１５０ｍｌ’、
で再懸濁し７、無水エタノール５０蔵を急速に攪拌して
いる溶液に滴下しく２５チ濃度まで）、溶液を１００，
０００ｘＧ、４℃で２時間超遠心分離した。

最終生成物の回収 得られた透明な上澄液１’９０ｍｊ！を傾瀉してペレッ
トから除去し、エタノール１９０−を攪拌しながら滴下
した（５０チ濃度まで）。

混合物を４℃で三日間放置して完全に沈殿させ、最終生
成物をベックマンＪ−２１Ｂ遠心機にて、１１，０００
ｘＧで３０分間、４℃で遠ノし・分離することにエリ回
収した。最後に、生成物をエタノール約２００−で−回
、アセトン約２００　ｍｌで一回洗浄し、無水ＣａＣ４
にて４ｖで真空乾燥した（収量１．２ｆ）。

実施例１０ Ｅ、コリに１莢膜多糖−Ｎ、メニンギチジスＢ血清型外
膜蛋白質複合体の製造 １、Ｅ、コリに１多糖のテトラ−ｎ−ブチルアンモニウ
ム塩の調製 Ｅ、コリに１多糖（実施例９の方法により得た）１０３
ｍｔを水２ｄＫｌｌ解し、溶液をダウエックス５０Ｘ８
（２００〜４００メツシユ、テトラ−ｎ−ブチルアンモ
ニウム型）が充填された４ゴのカラムに供した。カラム
を水で溶出し、両分（３１ｎｌ）の有機物質についてＣ
ｅ　ＩＶ　（８０４）＋！　／Ｈ２８０４法（（エリ調
べた。

適切な両分を凍結乾燥し、生成物をデシケータ−中Ｐ２
０．で乾燥するとテトラブチルアンモニウム塩１３４〜
が得られ、同様の先の製剤を’ＨＮＭＲＶＣｆり分析す
ると、おおよそ化学量論量のテトラ−ｎ−ブチルアンモ
ニウムイオンを有していた。

■、　多糖−ブタンジアミン付加物（Ｅ、コリＫｌ−Ｂ
ｕＡ、）の製造 ■で得た塩１３４■を無水かつ脱気されたジメチルホル
ムアミド３ｒｒｔＫ溶解し、１２分間攪拌した。次いで
、■、１−カルボニルジイミダゾール１２．７■を一度
に加え、溶液を３０分間攪拌した。しかる後、２．５　
Ｎ　ＮａＯＨでｐｌｌが１’０．３５に調整された１、
４−ブタンジアミンニ塩酸塩１４５■を含有する氷冷水
溶液６ｍ１．にこの溶液を加えた。この溶液を水浴上で
１５分間、室温で２０分間攪拌した。次いで、それを、
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）４ｔに対して、それぞ
れ５．５時間、１６時間及び３７５時間の五目透析した
。水４ｔに対する最終透析を４．５時間行なった。凍結
乾燥すると、７３　ｍｇのＥ、コリＫ　１−　ＢｕＡ２
　が得られた。フルオレサミン分析でばＮＨ２が１８０
　ｎｍｏ７／ｒｎｇであった。

■、多糖−ブタンジアミンーブロムアセトアミド（Ｅ、
コリＫ　１−　ＢｕＡ２−ＢｒＡｃ）のＥ、コリＫ　１
−　ＢｕＡ２　６８　”Ｓ’をｐｎ　９のホウ酸緩衝液
６．７　ｒｎＩ！、に溶解し、アセトニトリル１、５　
ｍｌ中のｐ−ニトロフェニルブロモアセテートを加えた
。混合物を４℃で１９時間保存し、次いで水３２を及び
水４ｔに対してそれぞれ８時間及び１３時間透析した。

溶液を凍結乾燥すると７４ｍ７のＥ、コリＫ　１−　Ｂ
ｕＡ２−ＢｒＡｃが得られた。フルオレサミン分析では
ＮＨ２が５０　ｎｍｏｔ／　ｍｑであり、その差からブ
ロモアセチルが１２０　ｎｍｏｔ／　ｍＶとなる。

ｒＶ、Ｅ、コリＫ　１−　ＢｕＡ２−ＢｒＡｃ　の官能
化されだＮ、メニンギチジス膜蛋白質（ＮＭＰ）への複
合化 官能化されたＮＭＰの製造法は実施例８のｒＶ−Ａと同
様である。チオール化されだＮＭＰｉ白質（エルマル分
析では９μモル５Ｈ）４ゴが入った遠心管にＥ、コリＫ
　１−　ＢｕＡ２−ＢｒＡｃ　（１２０ｎｍｏｌブロモ
アセチル／ｒｎｙ）２５■を加えた。管をシーラムキャ
ップで密封し、脱気、窒素置換して、１８５時間熟成し
た。それを次いでｐＨＦ３の緩衝液６ｄで希釈し、Ｔｉ
７５０−ターにて４℃、４３．００　Ｏｒｐｍで２時間
遠ル分離した。−ヒ澄を除去し、ペレットをドウアンス
ホモゲナイザーでｐＨ８の緩衝液１０ｍ１に再懸濁し、
次いで上記のように再遠心分離した。この第二の遠心分
離によるペレットを水１０ｍ１に懸濁し、上記のように
三回目の遠心分離を行なった。ペレットを次いで水２０
ゴに再懸濁した。

複合体の分析結果は下記のとおりである：３３６μｒ／
ｍｅ１０００μｆ／ｒｎｌｏ、ａ　４ＳＣＭＨＣ／リジ
ン：０．Ｏ１５ 手続補正書 昭和６０年　６月２８日 特許庁長官　志賀　学殿 １・事件の表示昭和６０年　特許願第９８１２９　号氏
名 （名称）　メルク　エンド　カムパ＝−インコーボレー
テッド４代理人 ５　補正の対象　「明細書」 ６、補正ノ内容　別紙のとおり

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　チオエーテル結合を含む二価スペーサーを介して
   結合された、酸基含有細菌性多糖類及び免疫原性蛋白質
   からなる安定な、共有結合された多糖−蛋白質複合体で
   あって、該二価スペーサーが、次式：Ａ−Ｅ−８−Ｂで
   あって、ＲはＨ又はＣＨ３であり；ＡはＨ １１ −Ｃ：Ｎ（ＣＨ２）　Ｙ（ＣＨ２）　Ｎ１（−であり；
   ｍはＯ１〜４、ｎはθ〜３、Ｗは０又はＮＨ。 ＹはＣＨ２，Ｏ、Ｓ　、　’ＮＲ’　又はＣＨＣＯ２Ｈ
   であって、Ｒ′はＨ又はＣ７もしくはＣ７のアルキルで
   あり、ＹがＣＨ，の場合にはｍ及びｎがともにＯではｉ
   　＜　、Ｙが０又はＳの場合にはｍがＩＪＩ）犬でｎが
   １．１：り犬であり；更に、Ｂは −（ＣＨ２）　ＣＨＣＣル）Ｄ−であって、ｐは１ｑ へ・３、ｑは０〜２、ＺはＮＨ，、ＮＩ−ＩＣＲ’　。 （１ ０ １ ＣＯ２Ｈ又はＨであシ、ＤばＣ，ＮＲ’　。 Ｎ−Ｃ（ＣＨ２）ｔ　Ｃであって、Ｒ′は上記定義のと
   おりである９ によって表わされる安定な、共有結合された多糖−蛋白
   質複合体。 ２、二価スペーサーが、式： ＣＮＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ’Ｈ２ＮＨＣＣＨ２５ＣＨ２
   ＣＨ，ＣＨＣＯに工って表わされる特許請求の範囲第１
   項に記載の安定な、共有結合された多糖−蛋白質複合体
   。 ３、酸基を有する細菌性莢膜多糖が、ヘモフィラス・イ
   ンフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌ’ｕｇｉｎｆｌｕｅ
   ｎｚａｅ　）　ｂ型多糖並びにストレプトコッカス・ニ
   ューモニア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏ
   ｎｉａｅ　）　６　Ｂ、１９　Ｆ及び２３Ｆ型多糖類か
   らなる群より選ばれる特許請求の範囲第１項に記載の多
   糖−蛋白質複合体。 ４、　免疫原性蛋白質が、髄膜炎菌Ｂ血清型の外膜蛋白
   質又はエデスチン蛋白質である特許請求の範囲第１項に
   記載の多糖−蛋白質複合体。 ５、　酸基を有する細菌性莢膜多糖がへモフイラス・イ
   ンフルエンザｂ型多糖であり、免疫原性蛋白質が髄膜炎
   ・菌Ｂ血清型の外膜蛋白質であり、更に二価スペーサー
   が式：％式％） で表わされる特許請求の範囲第１項に記載の多糖−蛋白
   質複合体。 ６、　酸基を有する細菌性莢膜多糖が肺炎球菌６Ｂ型多
   糖であシ、免疫原性蛋白質が髄膜炎菌Ｂ血清型の外膜蛋
   白質であり、更に二価スペーサーが式： ％式％ で表わされる特許請求の範囲第１項に記載の多糖−蛋白
   質複合体。 ７、　酸基を有する細菌性莢膜多糖が肺炎球菌１９Ｆ型
   多糖であり、免疫原性蛋白質が髄膜炎菌Ｂ血清型の外膜
   蛋白質であり、更に二価スペーサーが、式： ％式％ で表わされる特許請求の範囲第１項に記載の多糖−蛋白
   質複合体。 ８　酸基を有する細菌性莢膜多糖が肺炎球菌２３Ｆ型多
   糖であり、免疫原性蛋白質が髄膜炎菌Ｂ血清型の外膜蛋
   白質であり、更に二価スペーサーが、式： ％式％ で表わされる特許請求の範囲第１項に記載の多糖−蛋白
   質複合体。 ９（ａ）多糖の酸水素原子を大疎水性陽イオンで置換す
   ることにより多糖の塩形を形成せしめ、次いで （ｂ）　多糖の塩形を非水性で極性の非プロトン性溶媒
   に溶解せしめる、 ことからなる、酸基を有する多価陰イオン性多糖類の可
   溶化方法。 １１：０．　大疎水性陽イオンが、トリーもしくはテト
   ラ（ｃ＋　−ｃ”−）アルキルアンモニウム、１−アザ
   ビシクロ［２，２，２）オクタン及び１、８−ジアザビ
   シクロ［５，４，０］ウンデカ−７−エンからなる群よ
   り選ばれる特許請求の範囲第９項に記載の方法。 （１１，！　非水性で極性の非プロトン性溶媒が、ジメ
   チルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルア
   セトアミド、ホルムアミド及びＮ、Ｎ’　−ジメチルイ
   ミダソリジノンからなる群より選ばれる特許請求の範囲
   第９項に記載の方法。 １１２、大疎水性陽イオンがテトラ−ｎ−ブチルアンモ
   ニウムであり、非水性で極性の非プロトン性溶媒がジメ
   チルホルムアミドである特許請求の範囲第９項に記載の
   方法。 １３、（ａ）　多糖を非水性で極性の非プロトン性溶媒
   に可溶化上し７め； （ｂ）　多糖を二官能性試薬で活性化し；次い（ｃ）　
   この活性化多糖を二求核剤と反応せしめる ことからなる、多価陰イオン性多糖の共有結合的変性方
   法。 １４、二求核剤と反応させた活性化多糖を、ペンダント
   状求電子部位を生成する試薬と反応せしめることをも含
   む特許請求の範囲第１３項に記載の方法。 １５、非水性で極性の非プロトン性溶媒が、ジメチルホ
   ルムアミド、ジメチルスルホ壬シト、ジメチルアセトア
   ミド及びＮ、Ｎ’　−ジメチルイミダソリジノンからな
   る群より選ばれる特許請求の範囲第１４項に記載の方法
   。 １６　非水性で極性の非プロトン性溶媒がジメチルホル
   ムアミドである特許請求の範囲第（式中、Ｒ２及びＲ′
   はそれぞれ独立１．てアゾリル；ハライド；又はフェニ
   ルエステルである）からなる群Ｉり選ばれる特許請求の
   範囲第１４項に記載の方法。 １８、二官能性試薬がカルボニルジイミダソールである
   特許請求の範囲第１７項に記載の方法。 １９、二求核剤が、式： ％式％） （式中、ｍはＯ〜４、ｎは０〜３、ＹばＣＨ，、Ｏ，５
   ＸＮＲ’、ＣＨＣＯ□Ｈであって、Ｒ′はＨ又はＣＩ　
   −もしくはＣ７のアル壬ルであり、ＹがＣＲ２の場合は
   ｍ及びｎがともに０であってはならず、Ｙが０又はＳの
   場合はｍが１より犬でｎが１より犬である）のジアミン
   である特許請求の範囲第１４項記載の方法。 ２０、二求核剤が１，４−ブタンジアミンである特許請
   求の範囲第１９項に記載の方法。 ２１、　請求電子部位を生成する試薬が、Ｒ ｌｌ Ｘ’ＣＣＨＸ Ｃ式中、Ｘ’はニトロフェノキシ、ジニトロフェノキシ
   、ペンタクロロフェノキシ、ペンタフルオロフェノキシ
   、ハライド、０−（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル）
   又はアジドであり、ＲはＨ又はＣＨ３であり、Ｘはα、
   Ｂｒ　又は■である）；あるいは活性化されたマレイミ
   ド酸 （式中、ｐは１〜３、Ｘ′は上記定義のとおりである） である特許請求の範囲第１４項に記載の方法。 ２２　請求電子部位を生成する試薬がブロム酢酸ｐ−ニ
   トロフェニルである特許請求の範囲第２１項に記載の方
   法。 ２３、チオエーテル結合を含む二価スペーサーを介して
   結合された酸基含有細菌性莢膜多糖類及び免疫原性蛋白
   質からなる多糖−蛋白質複合体の製造方法であって、 （ａ）　酸基を有する細菌性莢膜多糖を、（１）該多糖
   の酸水素原子を大疎水性陽イオンで置換することＶｒ：
   、Ｊ：り多糖の塩形を形成せしめ、次いで （１１）多糖の塩形を非水性で極性の非プロトン性溶媒
   に溶解せしめる、 ことにエリ可溶化し； （ｂ）　多糖を二官能性試薬で活性化し；（ｃ）　この
   活性化多糖を二求核剤と反応させ；（ｄ）　二求核剤と
   反応させたこの活性化多糖を請求電子部位を生成する試
   薬と反応させて、ペンダント状求電子部位含有多糖を形
   成せしめ、。 （、）　別個に、免疫原性蛋白質を、チオール基を生成
   する試薬と反応させて、ペンダント状チオール基含有蛋
   白質を形成せしめ；次いで （ｆ）　ペンダント状チオール基を有する蛋白質から超
   遠心分離にて低分子量チオール群を除去せしめ；しかる
   後 （ｇ）　ペンダント状求電子部位含有多糖をペンダント
   状チオール基含有蛋白質と反応させて、チオエーテル共
   有結合を介して結合された多糖−蛋白質複合体を形成せ
   しめ；次に （ｈ）　得られた混合物を遠心分離して、未共有結合の
   多糖及び蛋白質を除去する ことからなる多糖−蛋白質複合体の製造方法。 ２４　大疎水性陽イオンがテトラ−ｎ−ブチルアンモニ
   ウム、非水性で極性の非プロトン性溶媒がジメチルホル
   ムアミド、二官能性試薬がカルボニルジイミダゾール、
   二求核剤が１，４−ブタンジアミン、更に電子部位を生
   成する試薬がブロム酢酸エステルである特許請求の範囲
   第２３項に記載の方法。 ２５　チオール基を生成する試薬がＮ−アセチルホモシ
   スティンチオラクトンである特許請求の範囲第２３項又
   は第２４項に記載の方法。 ２６、多糖−蛋白質複合体において、多糖と蛋白質との
   間のチオエーテル結合含有二価スペーサー基における共
   有結合の存在を確認するための方法であって、 （ａ）　複合体を加水分解して、該複合体のペプチド結
   合及び他の加水分解に不安定な結合を開裂せしめ； （ｂ）　加水分解に安定なチオエーテル含有スペーサー
   のアミノ酸を定量分析する、 ことからなる共有結合の存在の確認方法。 ２７、同種の微生物に起因する菌血症から哺乳動物種を
   能動的もしくは受動的に保護するための組成物でちって
   、 特許請求の範囲第１項に記載の安定な共有結合された多
   糖−蛋白質複合体、該複合体由来の抗血清、又は該抗血
   清のｒ−グロブリンもしくは他の抗体含有画分の免疫学
   的有効量、並びに薬学上許容される担体からなる組成物
   。 ２８、更に、アジュバントを含有する特許請求の範囲第
   ２７項記載の組成物。 ２９、多糖−蛋白質複合体が、 ＣＮ　ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＣル５ＣＨ２Ｃ
   Ｈ２ＣＨＣＯの二価スペーサーを介して髄膜炎菌Ｂ血清
   型の外膜蛋白質に結合されたヘモフィラス・インフルエ
   ンザｂ型多糖； の二価スペーサーを介して髄膜炎菌Ｂ血清型の外膜蛋白
   質に結合された肺炎球菌６Ｂ型多糖； 式： ％式％ の二価スペーサーを介して髄膜炎菌Ｂ血清型の外膜蛋白
   質に結合された肺炎球菌１９Ｆ型多糖；及び 式： の二価スペー勺−を介して髄膜炎菌Ｂ血清型の外膜蛋白
   質に結合された肺炎球菌２３Ｆ型多糖 からなる群のうちの一以上の成分工すなる特許請求の範
   囲第２７項又は第２８項記載の組成物。 ３０、免疫学的有効量が、各複合体において複合体の形
   の多糖が２−５０μ２　含まれるような組成物中の各複
   合体量である特許請求の範囲第２９項に記載の組成物。 ３１、哺乳動物種がヒトである特許請求の範囲第２９項
   記載の組成物。 ３２　免疫学的有効量が、各複合体において１、肺炎球
   菌多糖類の複合体としての複合体の形で多糖が２５μ２
   　、並びにヘモフィラス・インフルエンザｂ型多糖の複
   合体としての複合体の形で多糖が１０μ？　含まれるよ
   うな組成物の各複合体量である特許請求の範囲第３０項
   に記載の組成物。 ３３、チオエーテル結合を有する二価スペーサーを介し
   て免疫原性蛋白質に結合された酸基含有細菌性莢膜多糖
   類４・らなる多糖−蛋白質複合体の一種以上、並びに薬
   学上許容される担体、アジュバント及び薬学上許容され
   る担体とアジュバントの組合せからなる群の一成分より
   構成される組成物の免疫学的有効量を哺乳動物種に投与
   せしめること１よりなる、同種の微生物の菌血症に対す
   る哺乳動物種の治療方法。 ３４、多糖−蛋白質複合体が、 式： ％式％（３ の二価スペーサーを介して髄膜炎菌Ｂ血清型の外膜蛋白
   質に結合されたヘモフィラス・インフルエンザｂ　型多
   糖； 式： ％式％（（ の二価スペーサーを介して髄膜炎菌Ｂ血清型の外膜蛋白
   質に結合された肺炎球菌６Ｂ型多糖； 式： ％式％ の二価スペーサーを介して髄膜炎菌Ｂ血清型の外膜蛋白
   質に結合された肺炎球菌１９Ｆ型多糖；及び 式： ％式％ の二価スペーサーを介して髄膜炎菌Ｂ血清型の外膜蛋白
   質に結合された肺炎球菌２３Ｆ型多糖 からなる群のうちの一以上の成分エリなる特許請求の範
   囲第３３項に記載の哺乳動物種の治療方法。 ３５、治療すべき種がヒト乳児及び小児であり、−目量
   における組成物有効量が、投与される肺炎球菌多糖類の
   複合体としての複合体としての複合体の形で多糖１０μ
   Ｖ　に相当する量である特許請求の範囲第３３項に記載
   の哺乳動物種の治療方法。 ３６、式： ％式％ の二価スペーサーを介して髄膜炎菌Ｂ血清型の外膜蛋白
   質に結合されたヘモフィラス・インフルエンザｂ型多糖
   からなる多糖−蛋白質複合体を複合体の形で１０μ７　
   の多糖に相当する量含有するーもしくは二回の追加ブー
   スター用組成物がヒト乳児及び小児に投与される特許請
   求の範囲第３５項に記載の哺乳動物種の治療方法。 ３７、酸基を有する細菌性莢膜多糖がＢ属ストレプトコ
   ッカスＩａ、Ｉｂ、Ｉｆもしくは■型多糖であり、免疫
   原性蛋白質が髄膜炎菌Ｂ血清型の外膜蛋白質であり、二
   価スペーサーが、次式： ％式％ で表わされる特許請求の範囲第１項に記載の多糖−蛋白
   質複合体。 ３８　酸基を有する細菌性莢膜多糖がエシェリヒア・コ
   リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｅｈｉａ　ｃｏｌｉ　）　Ｋ　１多
   糖であり、免疫原性蛋白質が髄膜炎菌Ｂ血清型の外膜蛋
   白質であり、二価スペーサーが、 で表わされる特許請求の範囲第１項に記載の多糖−蛋白
   質複合体。 ３９、多糖−蛋白質複合体が、該複合体における過剰の
   電子活性を減少させるために、低分子量チオールと反応
   せしめられる特許請求の範囲第２３項に記載の方法。 ４０、低分子量チオールがｎ−アセチルシステアミンで
   ある特許請求の範囲第３８項に記載の方法。