JPH02222682A - 胎盤タンパク質１１をコードするｃＤＮＡ、その単離および使用 - Google Patents
胎盤タンパク質１１をコードするｃＤＮＡ、その単離および使用Info
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- JPH02222682A JPH02222682A JP1334652A JP33465289A JPH02222682A JP H02222682 A JPH02222682 A JP H02222682A JP 1334652 A JP1334652 A JP 1334652A JP 33465289 A JP33465289 A JP 33465289A JP H02222682 A JPH02222682 A JP H02222682A
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- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、胎盤−特異性タンパク質１１（ＰＰ１１）を
コードする遺伝子の単離および遺伝子操作によるＰＰ１
１の調製のためのその使用、に関する。
コードする遺伝子の単離および遺伝子操作によるＰＰ１
１の調製のためのその使用、に関する。
ＰＰ１１は、ＥＰ−Ｂ第１０，０２９，１９１号明細書
の記載によると、次の性質を有する。
の記載によると、次の性質を有する。
ａ） 炭水化物含有量は３．９±０．９％（構成：ヘキ
ソース２．６±０．５％、ヘキソサミン１．０±０．３
％、フコース０．０５±０．０３％、ノイラミ’／ｊｌ
ｏ、２６＋０．０７％） ｂ） 沈降係数Ｓ： ３．５±０６２ＳＣ） 超遠心
分離法で決定された分子Ｍ：４４．３００±６，０００ ｄ） ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含むポリア
クリルアミドゲルで決定された分子量：６２．０００±
３．ＱＯＯ ｅ） 吸光係数（ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉ
ｃｉｅｎｔ） Ｅ（２Ｂ ０ｎｎ＋）： １３．４±
１．０、およびｆ） 電気泳動移動度：α、グロブリン
領域また、アミノ酸組成は表１に示す通りである。
ソース２．６±０．５％、ヘキソサミン１．０±０．３
％、フコース０．０５±０．０３％、ノイラミ’／ｊｌ
ｏ、２６＋０．０７％） ｂ） 沈降係数Ｓ： ３．５±０６２ＳＣ） 超遠心
分離法で決定された分子Ｍ：４４．３００±６，０００ ｄ） ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含むポリア
クリルアミドゲルで決定された分子量：６２．０００±
３．ＱＯＯ ｅ） 吸光係数（ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉ
ｃｉｅｎｔ） Ｅ（２Ｂ ０ｎｎ＋）： １３．４±
１．０、およびｆ） 電気泳動移動度：α、グロブリン
領域また、アミノ酸組成は表１に示す通りである。
表Ｉ ＰＰ１１のアミノ酸組成（１００残基当りの残
基数（モル％）） ＣＶ％（変動係数） リジン ヒスチジン アルギニン アスパラギン酸 トレオニン セリン グルタミン酸 プロリン グリシン アラニン シスチン １／２ バリン メチオニン イソロイシン ロイシン チロシン フェニルアラニン トリブトファン ６．２６ ３．３４ ３．３１ １０．７５ ３．３１ ９．６３ １３．８１ ４．１０ ６．２３ ６．３０ ３．３７ ４．５３ １．００ ３．６０ ６．７４ ５．９０ ６．０６ １．６６ ７．００ １．７２ ５．６０ ２．４３ １０．４９ １．８４ ２．０９ ４．６８ ６．２６ １．８２ ４．５３ ５．４０ ２６．２２ ２．２４ １．０５ ３．０２ ２．５２ ２０．８７ 上記の特許明細書に記載のＰＰ１１の従来の単離は著し
く手間がかかることから、目的は、したがって、遺伝子
操作によってＰＰ１１を調製することを可能にするため
の、ＰＰ１１をコードする遺伝子の単離であった。
基数（モル％）） ＣＶ％（変動係数） リジン ヒスチジン アルギニン アスパラギン酸 トレオニン セリン グルタミン酸 プロリン グリシン アラニン シスチン １／２ バリン メチオニン イソロイシン ロイシン チロシン フェニルアラニン トリブトファン ６．２６ ３．３４ ３．３１ １０．７５ ３．３１ ９．６３ １３．８１ ４．１０ ６．２３ ６．３０ ３．３７ ４．５３ １．００ ３．６０ ６．７４ ５．９０ ６．０６ １．６６ ７．００ １．７２ ５．６０ ２．４３ １０．４９ １．８４ ２．０９ ４．６８ ６．２６ １．８２ ４．５３ ５．４０ ２６．２２ ２．２４ １．０５ ３．０２ ２．５２ ２０．８７ 上記の特許明細書に記載のＰＰ１１の従来の単離は著し
く手間がかかることから、目的は、したがって、遺伝子
操作によってＰＰ１１を調製することを可能にするため
の、ＰＰ１１をコードする遺伝子の単離であった。
初めに、上記のように従来のように精製したＰＰ１１を
用いてポリクローナル抗体を作出して、ヒト胎盤の市販
のｃＤＮＡ発現バンク（Ｇｅｎｏｆ ｉ ｔＧａ＋ｂＨ
，ＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇＳＨＬ １００ Ｂヒト胎盤ｇ
ｔｌｌ胎盤朝織、３４週令）における陽性クローンの探
索に用いた。１２０万個の組換えクローンのうちの１個
のクローンが抗血清と反応する。
用いてポリクローナル抗体を作出して、ヒト胎盤の市販
のｃＤＮＡ発現バンク（Ｇｅｎｏｆ ｉ ｔＧａ＋ｂＨ
，ＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇＳＨＬ １００ Ｂヒト胎盤ｇ
ｔｌｌ胎盤朝織、３４週令）における陽性クローンの探
索に用いた。１２０万個の組換えクローンのうちの１個
のクローンが抗血清と反応する。
これはＰＰ１ｌ−９３と呼ばれ、約１，８００塩基対（
ｂρ）の挿入物を含んでいた。この挿入物は、約８６０
ｂｐの転写解読枠（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａ
ｍｅ）を有したが、開始メチオニンを有しなかった。次
いで、ＰＰｌｌ−９３の挿入物を標識して、本発明者ら
によって調製されたλｇｔｌＯにおける胎盤ＣＤＮＡバ
ンク中のプローブとして用いた。
ｂρ）の挿入物を含んでいた。この挿入物は、約８６０
ｂｐの転写解読枠（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａ
ｍｅ）を有したが、開始メチオニンを有しなかった。次
いで、ＰＰｌｌ−９３の挿入物を標識して、本発明者ら
によって調製されたλｇｔｌＯにおける胎盤ＣＤＮＡバ
ンク中のプローブとして用いた。
ＰＰｌｌ−９３とオーバーラツプする二つの更なるクロ
ーンを見出して（ＰＰ１１−１６６およびＰＰｌｌ−１
６９）、それらの配列を決定した。クローンＰＰ １１
−１６９はクローンＰＰ１１９３よりも短いが、これは
後者と５′末端で約２７０ｂρによってオーバーラツプ
して、開始メチオニンに違いないメチオニンを有してい
る。クローンＰＰ１ｌ−１６９の５′末端の４６ｍｅｒ
オリゴヌクレオチド（５’ ＣＴＣＣＡＡＣＴＧＧＧＣ
ＡＣＣＡＴＧＡＧＧＧＣＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＣＴＧＧ
ＴＡＴＴＧＧＣＣＧ）を用いて、最終的に全５′非翻訳
配列をクローンＰＰｌｌ−３１８に見出した。これは、
上記の推定される開始メチオニンの前には今や停止コド
ンしがなく、他のメチオニンは現れないことを示す。こ
のように、ＰＰ１１の完全なｃＤＮＡは、ポリ（Ａ）配
列を含む２３９９ ｂｐの長さであって、４２，１２０
Ｄのタンパク質に相当する３６９個のアミノ酸のための
転写解読枠を有する。５′末端の１５４ｂｐは翻訳され
ず、３１末端では１１３８ｂｐが翻訳されず、１１０７
ｂｐのコード配列がそれらに囲まれている。完全なｃＤ
ＮＡ配列は表２に示される通りであり、第１図はｃＤＮ
Ａおよびコード領域の個々のクローンの位置を示す。こ
こで、「Ｎ」はＮ末端を表し、「Ｃ」はコード領域にお
けるＣ末端を表し、「Ａ」はポリ（Ａ）配列を表す。
ーンを見出して（ＰＰ１１−１６６およびＰＰｌｌ−１
６９）、それらの配列を決定した。クローンＰＰ １１
−１６９はクローンＰＰ１１９３よりも短いが、これは
後者と５′末端で約２７０ｂρによってオーバーラツプ
して、開始メチオニンに違いないメチオニンを有してい
る。クローンＰＰ１ｌ−１６９の５′末端の４６ｍｅｒ
オリゴヌクレオチド（５’ ＣＴＣＣＡＡＣＴＧＧＧＣ
ＡＣＣＡＴＧＡＧＧＧＣＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＣＴＧＧ
ＴＡＴＴＧＧＣＣＧ）を用いて、最終的に全５′非翻訳
配列をクローンＰＰｌｌ−３１８に見出した。これは、
上記の推定される開始メチオニンの前には今や停止コド
ンしがなく、他のメチオニンは現れないことを示す。こ
のように、ＰＰ１１の完全なｃＤＮＡは、ポリ（Ａ）配
列を含む２３９９ ｂｐの長さであって、４２，１２０
Ｄのタンパク質に相当する３６９個のアミノ酸のための
転写解読枠を有する。５′末端の１５４ｂｐは翻訳され
ず、３１末端では１１３８ｂｐが翻訳されず、１１０７
ｂｐのコード配列がそれらに囲まれている。完全なｃＤ
ＮＡ配列は表２に示される通りであり、第１図はｃＤＮ
Ａおよびコード領域の個々のクローンの位置を示す。こ
こで、「Ｎ」はＮ末端を表し、「Ｃ」はコード領域にお
けるＣ末端を表し、「Ａ」はポリ（Ａ）配列を表す。
本発明によれば、適当な発現系を利用してコードｃＤＮ
Ａを用いてＰＰ１１を発現させることが可能である。ざ
らに、宿主の選択によってＰＰ１１の修飾のタイプに影
響を及ぼすことができる。例えば、細菌中ではグリコジ
ル化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）は起きず、酵母細
胞で起きるグリコジル化は高等真核細胞におけるものと
は異なる。ＰＰ１１の発現は、発現ベクターｐＴｒｃ９
９ＡまたはｐＴｒｃ９９Ｃ（例１１を参照されたい）を
有する大腸菌内で特に有利に行われる。
Ａを用いてＰＰ１１を発現させることが可能である。ざ
らに、宿主の選択によってＰＰ１１の修飾のタイプに影
響を及ぼすことができる。例えば、細菌中ではグリコジ
ル化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）は起きず、酵母細
胞で起きるグリコジル化は高等真核細胞におけるものと
は異なる。ＰＰ１１の発現は、発現ベクターｐＴｒｃ９
９ＡまたはｐＴｒｃ９９Ｃ（例１１を参照されたい）を
有する大腸菌内で特に有利に行われる。
さらに、ＰＰ１１、好ましくは上記のように大腸菌また
は酵母中での遺伝子操作によって調製されるＰＰ１１は
、それがアミド分解（ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ）活性を有
するために、凝固障害、補体系（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ
ｓｙｓｔｅｍ）の障害の治療のために、またはフィブ
リン溶解の障害に関連して、用いることができる。
は酵母中での遺伝子操作によって調製されるＰＰ１１は
、それがアミド分解（ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ）活性を有
するために、凝固障害、補体系（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ
ｓｙｓｔｅｍ）の障害の治療のために、またはフィブ
リン溶解の障害に関連して、用いることができる。
ＰＰ１１のアミノ酸配列が解ると、ポリクローナルまた
はモノクローナル抗体の製造のための抗原として作用す
るアミノ酸部分配列物を遺伝子操作法の従来法によって
調製することができる。これらの型の抗体は、診断的用
途だけでなく、抗体カラムの調製にも用いることができ
る。このようにして、ＰＰ１１を他のタンパク質ととも
に含む溶°液からＰＰ１１を除去することが可能である
。
はモノクローナル抗体の製造のための抗原として作用す
るアミノ酸部分配列物を遺伝子操作法の従来法によって
調製することができる。これらの型の抗体は、診断的用
途だけでなく、抗体カラムの調製にも用いることができ
る。このようにして、ＰＰ１１を他のタンパク質ととも
に含む溶°液からＰＰ１１を除去することが可能である
。
また、ＰＰ１１をコードし、真核細胞中での発現を促進
し、さらには診断的結論をも導くことができるようなゲ
ノムクローンを、ｃＤＮＡまたはその部分を用いてゲノ
ムバンクから簡単な方法で単離することも可能である。
し、さらには診断的結論をも導くことができるようなゲ
ノムクローンを、ｃＤＮＡまたはその部分を用いてゲノ
ムバンクから簡単な方法で単離することも可能である。
本発明は、さらに、特許請求の範囲に定義され、以下の
諸例に詳細に説明される通りである。
諸例に詳細に説明される通りである。
本文で説明のないものについては、次の略語を用いる。
ＥＤＴＡ＝エチレンジアミン四酢酸ナトリウム５ＤＳ＝
ドデシル硫酸ナトリウム ＤＴＴ＝ジチオスレイトール ＢＳＡ＝ウシ血清アルブミン 例： １、ヒト胎盤からのＲＮＡの単離 ＲＮＡを成熟ヒト胎盤から得た（ＣｈｉｒＨｗｉｎらの
方法： Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８ （１９７９
） ５２９４−５２９９）。約１０ｇの胎盤ｍ織を乳鉢
で液体窒素下で破砕して、０．１Ｍメルカプトエタノー
ルを含む８０ｍ１の４Ｍグアニジンチオシアネート（ｇ
ｕａｎ ｉｄ ｉ ｎ ｉｕｍｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ
）中に懸濁させて、次いでホモジナイザー（Ｕｌｔｒａ
ｔｕｒｒａｉ）で２０．ＯＯＯｒｐｍで９０秒間処理し
た。溶解質（、Ｉｙｓａｔｅ）を７，０００ｒｐｍで１
５分間遠心分離（Ｓｏｒｖａｌ ｌ ＧＳＡローター）
して、上溝を２１の１Ｍ酢酸および６０ｍ１の無水エタ
ノールで一２０℃で一晩で沈澱させた。６．０００ｒｐ
ｍで一１０℃にて１０分間で沈澱させた後、核酸を４０
ｍ１の７．５Ｍグアニジン塩酸（ｐＨ７，０）に完全に
溶解して、１ｍｌの１Ｍ酢酸と２０ｍ１の無水エタノー
ルとの混合液で沈澱させた。ＤＮＡを除去するために、
各容量を半分にして沈澱処理をもう−度繰り返した。Ｒ
ＮＡを１２ｍ１の８２０に溶解して、１．２ｍｌの４Ｍ
酢酸カリウムと２４ｍ１の無水エタノールとの混合液で
沈澱させて、最後にこの沈澱を再び１０ｍ１のＨ２Ｏに
入れた（組ｆｉｌ！ｉｇ重量当り１ｍ１）。
ドデシル硫酸ナトリウム ＤＴＴ＝ジチオスレイトール ＢＳＡ＝ウシ血清アルブミン 例： １、ヒト胎盤からのＲＮＡの単離 ＲＮＡを成熟ヒト胎盤から得た（ＣｈｉｒＨｗｉｎらの
方法： Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８ （１９７９
） ５２９４−５２９９）。約１０ｇの胎盤ｍ織を乳鉢
で液体窒素下で破砕して、０．１Ｍメルカプトエタノー
ルを含む８０ｍ１の４Ｍグアニジンチオシアネート（ｇ
ｕａｎ ｉｄ ｉ ｎ ｉｕｍｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ
）中に懸濁させて、次いでホモジナイザー（Ｕｌｔｒａ
ｔｕｒｒａｉ）で２０．ＯＯＯｒｐｍで９０秒間処理し
た。溶解質（、Ｉｙｓａｔｅ）を７，０００ｒｐｍで１
５分間遠心分離（Ｓｏｒｖａｌ ｌ ＧＳＡローター）
して、上溝を２１の１Ｍ酢酸および６０ｍ１の無水エタ
ノールで一２０℃で一晩で沈澱させた。６．０００ｒｐ
ｍで一１０℃にて１０分間で沈澱させた後、核酸を４０
ｍ１の７．５Ｍグアニジン塩酸（ｐＨ７，０）に完全に
溶解して、１ｍｌの１Ｍ酢酸と２０ｍ１の無水エタノー
ルとの混合液で沈澱させた。ＤＮＡを除去するために、
各容量を半分にして沈澱処理をもう−度繰り返した。Ｒ
ＮＡを１２ｍ１の８２０に溶解して、１．２ｍｌの４Ｍ
酢酸カリウムと２４ｍ１の無水エタノールとの混合液で
沈澱させて、最後にこの沈澱を再び１０ｍ１のＨ２Ｏに
入れた（組ｆｉｌ！ｉｇ重量当り１ｍ１）。
２、ポリ（Ａ）を含む胎盤ｍ ＲＮ Ａの取得ポリ（Ａ
）を含むｍ ＲＮ Ａを得るために、胎盤ＲＮＡを２ｍ
ｌのパスツールピペット中のオリゴ（ｄＴ）−セルロー
スクロマトグラフィー［ＡｖｉｖおよびＬｅｄｅｒ：
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳ
Ａ ６９（１９７３） １４０Ｂ−１４１２コでＬｉＣ
１にて分画した。緩衝液１ ［５００ｍＭ、Ｌ ｉＣｌ
、２０ｍＭ）リス（ｐＨ７，５）、ＩｍＭＥＤＴＡ、０
．１％ＳＤＳコの約５ｍｇの胎盤ＲＮＡをカラムにかけ
た。ボ゛す（Ａ）”−ＲＮＡはオリゴ（ｄＴ）−セルロ
ースに結合したが、ポリ（Ａ ）−ＲＮ Ａを再び溶出
することができた。緩衝液２ ［１００ｍＭ Ｌ ｉｃ
Ｌ ２９ｍＭ）リス（ｐＨ７，５）、ＩｍＭＥＤＴ
Ａ、０．１％ＳＤＳ］で洗浄処理した後に、ポリ（Ａ）
＋−ＲＮＡ（胎盤ｍ ＲＮ Ａ ）を緩衝液３［５ｍＭ
）リス（ｐＨ７，５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％
ＳＤＳ］にてカラムから溶出させた。
）を含むｍ ＲＮ Ａを得るために、胎盤ＲＮＡを２ｍ
ｌのパスツールピペット中のオリゴ（ｄＴ）−セルロー
スクロマトグラフィー［ＡｖｉｖおよびＬｅｄｅｒ：
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳ
Ａ ６９（１９７３） １４０Ｂ−１４１２コでＬｉＣ
１にて分画した。緩衝液１ ［５００ｍＭ、Ｌ ｉＣｌ
、２０ｍＭ）リス（ｐＨ７，５）、ＩｍＭＥＤＴＡ、０
．１％ＳＤＳコの約５ｍｇの胎盤ＲＮＡをカラムにかけ
た。ボ゛す（Ａ）”−ＲＮＡはオリゴ（ｄＴ）−セルロ
ースに結合したが、ポリ（Ａ ）−ＲＮ Ａを再び溶出
することができた。緩衝液２ ［１００ｍＭ Ｌ ｉｃ
Ｌ ２９ｍＭ）リス（ｐＨ７，５）、ＩｍＭＥＤＴ
Ａ、０．１％ＳＤＳ］で洗浄処理した後に、ポリ（Ａ）
＋−ＲＮＡ（胎盤ｍ ＲＮ Ａ ）を緩衝液３［５ｍＭ
）リス（ｐＨ７，５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％
ＳＤＳ］にてカラムから溶出させた。
さらに精製するために、ポリ（Ａ）＋−ＲＮＡを緩衝液
ｌに調整して、再びオリゴ（ｄ Ｔ）−セルロースクロ
マトグラフに供した。この第二精製工程の後の胎盤ポリ
（Ａ＞＋−ＲＮＡの収率は、用いたＲＮＡの約４％だっ
た。
ｌに調整して、再びオリゴ（ｄ Ｔ）−セルロースクロ
マトグラフに供した。この第二精製工程の後の胎盤ポリ
（Ａ＞＋−ＲＮＡの収率は、用いたＲＮＡの約４％だっ
た。
３、ヒト胎盤からのｃＤＮＡ（胎盤ｃＤＮＡ）および二
本鎖ｃＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の合成ｃＤＮＡ合成の前に
、ポリ（Ａ）を含む胎盤ｍ ＲＮ Ａが完全で・あるか
どうかを１．５％アガロースゲルで調べた。
本鎖ｃＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の合成ｃＤＮＡ合成の前に
、ポリ（Ａ）を含む胎盤ｍ ＲＮ Ａが完全で・あるか
どうかを１．５％アガロースゲルで調べた。
次いで、４μ８の胎盤ｍ ＲＮ Ａを６５．５μｌのＨ
２Ｏに溶解して、７０℃にて１０分間変性させて、氷上
で冷却した。
２Ｏに溶解して、７０℃にて１０分間変性させて、氷上
で冷却した。
これに、２０μｍのＲＴ、緩衝液［２５０ｍＭ）リス（
ｐＨ８，２，４２℃）、２５０ｍＭＫＣｌ、３０ｍＭＭ
ｇＣ１２コ 、 ２．ｉ５ μ ＋ の ２０１１
ＴＭｄＮＴＰ （全４種類のデオキシヌクレオシド三燐
酸）、１μｍの１ｄｇ／ｍｌのオリゴ（ｄＴ）、１μｍ
のＩＭ ＤＴＴ、２μｍのＲＮＡ５ｉｎおよび８μｍの
逆転写酵素（２４Ｕ／μｌ）を加えて１００μ）の混合
液にして、その後、４２℃で９０分間でｃＤＮＡを合成
した。二本鎖ｃＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）をＧｕｂｌｅｒお
よびＨｏｆｆｍａｎｎの方法（Ｇｅｎｅ ２５ （１９
８３） ２６３−２６９）にて合成した。合成は、ｃＤ
ＮＡ合成の直後に、３０５．５７１１のＨ２Ｏ，８０μ
ｍのＲＴ２緩衝液［１００ｍＭ）リス（ｐＨ７，５）、
２５ｍＭＭ ｇ ＣＩ ２．５００ ｍＭＫＣＩ、５０
ｍＭＤＴＴ、２５０ μ３／ｍｌＢ ＳＡ］、２μｍの
ＲＮａ５ｅＨ’（２Ｕ／ ｕ Ｉ）、２．５μ＋の大腸
菌ＤＮＡリガーゼ（５Ｕ／μｌ）、５１１１の１５ｍＭ
β−ＮＡＤ、および５μｍのＤＮＡポリメラーゼＩ（５
Ｕ／μｍ）を添加して、１５℃で５時間インキュベート
して行った。反応を加熱不活化（７０℃、３０分間）に
よって終結させた。
ｐＨ８，２，４２℃）、２５０ｍＭＫＣｌ、３０ｍＭＭ
ｇＣ１２コ 、 ２．ｉ５ μ ＋ の ２０１１
ＴＭｄＮＴＰ （全４種類のデオキシヌクレオシド三燐
酸）、１μｍの１ｄｇ／ｍｌのオリゴ（ｄＴ）、１μｍ
のＩＭ ＤＴＴ、２μｍのＲＮＡ５ｉｎおよび８μｍの
逆転写酵素（２４Ｕ／μｌ）を加えて１００μ）の混合
液にして、その後、４２℃で９０分間でｃＤＮＡを合成
した。二本鎖ｃＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）をＧｕｂｌｅｒお
よびＨｏｆｆｍａｎｎの方法（Ｇｅｎｅ ２５ （１９
８３） ２６３−２６９）にて合成した。合成は、ｃＤ
ＮＡ合成の直後に、３０５．５７１１のＨ２Ｏ，８０μ
ｍのＲＴ２緩衝液［１００ｍＭ）リス（ｐＨ７，５）、
２５ｍＭＭ ｇ ＣＩ ２．５００ ｍＭＫＣＩ、５０
ｍＭＤＴＴ、２５０ μ３／ｍｌＢ ＳＡ］、２μｍの
ＲＮａ５ｅＨ’（２Ｕ／ ｕ Ｉ）、２．５μ＋の大腸
菌ＤＮＡリガーゼ（５Ｕ／μｌ）、５１１１の１５ｍＭ
β−ＮＡＤ、および５μｍのＤＮＡポリメラーゼＩ（５
Ｕ／μｍ）を添加して、１５℃で５時間インキュベート
して行った。反応を加熱不活化（７０℃、３０分間）に
よって終結させた。
５５μｍの２５０μＭ ｄＮＴＰ、５５７１１の１０ｍ
Ｍトリス（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ ＭｇＣ１２，１０
℃ｇ／ｍ１ＢｓＡ、３μｍの７４ＤＮＡポリメラーゼＩ
（ＩＵ／μｍ）、２μｍのＲＮａｓｅＨ（２Ｕ／μｍ）
および２１１１のＲＮａ５ｅＡ （２μｇ／ｍｌ）を反
応混合液に添加した後、３７℃でさらに３０分間インキ
ュベートして二本口のＤＮＡ鎖の合成が完全であるよう
にした（修復反応）。
Ｍトリス（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ ＭｇＣ１２，１０
℃ｇ／ｍ１ＢｓＡ、３μｍの７４ＤＮＡポリメラーゼＩ
（ＩＵ／μｍ）、２μｍのＲＮａｓｅＨ（２Ｕ／μｍ）
および２１１１のＲＮａ５ｅＡ （２μｇ／ｍｌ）を反
応混合液に添加した後、３７℃でさらに３０分間インキ
ュベートして二本口のＤＮＡ鎖の合成が完全であるよう
にした（修復反応）。
４、ｄｓＤＮＡへのＥｃｏＲＩリンカ−の連結、および
リンカ−の開裂 胎盤ｃＤＮＡバンクを作出するために、ｄｓＤＮＡにＥ
ｃｏＲＩ末端を付して、ファージベクター人ｇｔｌｏの
ＥｃｏＲＩ切断部位にこれを連結できるようにした［Ｔ
、 Ｍａｎｉａｔｉｓら：（１９８２）、 Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ’ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙＭａｎｕａ ｌ、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒコ。この目的のために、ｄｓＤＮＡを、 ａ）ｄｓＤ Ｎ Ａの内部ＥｃｏＲＩ切断部位を保護す
るためにＥｃｏＲＩメチラーゼで処理し、ｂ）Ｅ ｃ
ｏ ＲＩリンカ−を付して、Ｃ）次いで、これらリンカ
−をＥｃｏＲＴで開裂した。
リンカ−の開裂 胎盤ｃＤＮＡバンクを作出するために、ｄｓＤＮＡにＥ
ｃｏＲＩ末端を付して、ファージベクター人ｇｔｌｏの
ＥｃｏＲＩ切断部位にこれを連結できるようにした［Ｔ
、 Ｍａｎｉａｔｉｓら：（１９８２）、 Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ’ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙＭａｎｕａ ｌ、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒコ。この目的のために、ｄｓＤＮＡを、 ａ）ｄｓＤ Ｎ Ａの内部ＥｃｏＲＩ切断部位を保護す
るためにＥｃｏＲＩメチラーゼで処理し、ｂ）Ｅ ｃ
ｏ ＲＩリンカ−を付して、Ｃ）次いで、これらリンカ
−をＥｃｏＲＴで開裂した。
ａ）に間して：
ｄｓＤＮＡのメチラーゼ反応を、修復反応に続いテａ
チｃ；：、２５μｌ（７）５００ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐ
Ｈ８，０）、６０μｍのメチラーゼ緩衝ｔ＆（１００ｍ
ＭＮａＯＡｃ （ＰＨ５−２）、２ｍｇのＳ−７デノシ
ルーし一メチオニン）および２μｍのＥｃｏＲＩメチラ
ーゼ（２０Ｕ／μｌ）を加えた後、３７℃で３０分間イ
ンキュベートして行った。反応混合物をフェノールで抽
出して、ｄｓＤＮＡを６０μ＋の４ＭＮ ａ ＯＡ ｃ
および１３００μｍのエタノールで沈澱させた。ｄｓＤ
ＮＡを７０％エタノールで２回洗浄して、エーテルと１
＠振盪して抽出して、乾燥させた。
チｃ；：、２５μｌ（７）５００ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐ
Ｈ８，０）、６０μｍのメチラーゼ緩衝ｔ＆（１００ｍ
ＭＮａＯＡｃ （ＰＨ５−２）、２ｍｇのＳ−７デノシ
ルーし一メチオニン）および２μｍのＥｃｏＲＩメチラ
ーゼ（２０Ｕ／μｌ）を加えた後、３７℃で３０分間イ
ンキュベートして行った。反応混合物をフェノールで抽
出して、ｄｓＤＮＡを６０μ＋の４ＭＮ ａ ＯＡ ｃ
および１３００μｍのエタノールで沈澱させた。ｄｓＤ
ＮＡを７０％エタノールで２回洗浄して、エーテルと１
＠振盪して抽出して、乾燥させた。
ｂ）に関して：
ＥｃｏＲＩメチル化ｄｓＤＮＡを、８８μｍのＨ２Ｏに
溶解して、１０μｍのリガーゼ緩衝液［５００ｍＭ）’
）ス（ｐＨ７，４）、１００ｍＭＭｇＣＩ 、、１００
ｍＭ ＤＴＴ、 １０ｍＭスペルミジン、Ｉ ＯｍＭ
Ａ Ｔ Ｐ、 １ ｍｇ／ｍｌＢ Ｓ Ａ］および
１μ＋（７）Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＩＯＵ／／１１）を
加えた後に、ｌμｌのＥｃｏＲＩリンカ−（０，５μｇ
／μｌ） （ｐｃｃＡＡ’ｒ’ｒｃｃおよびｐＡＣ；
ＡＡＴＴＣＴ）と１５℃にて一晩で連結させた。
溶解して、１０μｍのリガーゼ緩衝液［５００ｍＭ）’
）ス（ｐＨ７，４）、１００ｍＭＭｇＣＩ 、、１００
ｍＭ ＤＴＴ、 １０ｍＭスペルミジン、Ｉ ＯｍＭ
Ａ Ｔ Ｐ、 １ ｍｇ／ｍｌＢ Ｓ Ａ］および
１μ＋（７）Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＩＯＵ／／１１）を
加えた後に、ｌμｌのＥｃｏＲＩリンカ−（０，５μｇ
／μｌ） （ｐｃｃＡＡ’ｒ’ｒｃｃおよびｐＡＣ；
ＡＡＴＴＣＴ）と１５℃にて一晩で連結させた。
Ｃ）に間して：
リガーゼ混合物の容量を、６μｍのＨ２Ｏ，１２／！ｌ
の１０ＸＥｃｏＲＩ緩衝液および２７１ＩのＥｃｏＲＩ
（１２０Ｕ／μｌ）で１２０ ）ｔ ｌに調整した。
の１０ＸＥｃｏＲＩ緩衝液および２７１ＩのＥｃｏＲＩ
（１２０Ｕ／μｌ）で１２０ ）ｔ ｌに調整した。
ＥｃｏＲＩ消化を３７℃にて２時閏で行った。
５、酢酸カリウム勾配による非結合リンカ−の除去、お
よびｄｓＤＮＡの大きざによる選択すべての非結合−Ｅ
ｃ ｏ ＲＩリンカ−をｄｓＤＮＡから除去しするた
めに、ＥｃｏＲＩ反応混合物を酢酸カリウム勾配（５〜
２０％ＫＡ ｃ、 １ ｍＭＥＤＴＡ、１μｍ／１臭
化エチジウム）にかけて、５０．０００ｒｐｍで２０”
Ｃにて３時間遠心分離した（ベックマン５Ｗ６５コータ
ー）。
よびｄｓＤＮＡの大きざによる選択すべての非結合−Ｅ
ｃ ｏ ＲＩリンカ−をｄｓＤＮＡから除去しするた
めに、ＥｃｏＲＩ反応混合物を酢酸カリウム勾配（５〜
２０％ＫＡ ｃ、 １ ｍＭＥＤＴＡ、１μｍ／１臭
化エチジウム）にかけて、５０．０００ｒｐｍで２０”
Ｃにて３時間遠心分離した（ベックマン５Ｗ６５コータ
ー）。
勾配を、最初の５画分の容量を５００μｍ％残りのもの
の容量を１００μｍにして下から分画した。画分を０．
０１容量のアクリルアミド（２ｍｇ／ｍｌ）および２，
５容量のエタノールで沈澱させて、７０％強度のエタノ
ールで１回洗浄・乾燥して、それぞれを５μｍの８２０
に入れた。
の容量を１００μｍにして下から分画した。画分を０．
０１容量のアクリルアミド（２ｍｇ／ｍｌ）および２，
５容量のエタノールで沈澱させて、７０％強度のエタノ
ールで１回洗浄・乾燥して、それぞれを５μｍの８２０
に入れた。
ｄｓＤＮＡの大きさを決めるために、各画分の１μｍを
１．５％のアガロースゲル中で分析した。
１．５％のアガロースゲル中で分析した。
さらに、ｄｓＤＮＡの量を各両分の１μｍを用いて決定
した。
した。
１０００ｂｐ以上のｄｓＤＮＡを有する両分を合わすて
、その試料を最終濃度２７μｇ／ｍｌになるまで濃縮し
た。
、その試料を最終濃度２７μｇ／ｍｌになるまで濃縮し
た。
６、ファージベクターλｇｔ１０へのｄｓＤＮＡの組み
入れ、およびインビトロパッケージング（ｐａｃｋａｇ
団８）反応 ｄｓＤＮＡを４μｌのリガーゼ混合物中でファージベク
ターλｇ ｔ １０ （Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、 ＣＡ）の
ＥｃｏＲＩ切断部位に紺み入れた。リガーゼ混合物は２
μｌのｄｓＤＮＡ、 １μｌの入ｇｔｌＯＸＥｃｏＲ
Ｉ （１μｇ／ｍｌ）、０．４ μ＋（７）リガーゼ緩
衝液、０．５７１１（７）Ｈ２０，０，１μｍのＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼからなる。混合物を１５”Ｃで４時間イン
キュベートした。
入れ、およびインビトロパッケージング（ｐａｃｋａｇ
団８）反応 ｄｓＤＮＡを４μｌのリガーゼ混合物中でファージベク
ターλｇ ｔ １０ （Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、 ＣＡ）の
ＥｃｏＲＩ切断部位に紺み入れた。リガーゼ混合物は２
μｌのｄｓＤＮＡ、 １μｌの入ｇｔｌＯＸＥｃｏＲ
Ｉ （１μｇ／ｍｌ）、０．４ μ＋（７）リガーゼ緩
衝液、０．５７１１（７）Ｈ２０，０，１μｍのＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼからなる。混合物を１５”Ｃで４時間イン
キュベートした。
ファージベクターλｇｔ １０中に胎盤ｃＤＮＡバンク
を確立するために、次いでリガーゼ混合物の、入洛原性
細胞抽出物大腸菌Ｎ５４２ＢおよびＮ５４３３ との
インビトロパッケージング反応を室温で２時間行った（
Ｖｅｃｔｏｒ ＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ、、Ｓａ
ｎ Ｄｉｅｇｏ、 ＣＡ、 ＥｎｑｕｉｓｔおよびＳｔ
ｅｒｎｂｅｒｇ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ ６８ （１９７９）２８１−２９８）。反
応を５００μｍの懸濁培地［ＳＭ：０ 、 Ｉ Ｍ
Ｎ ａ Ｃｌ −８ｍＭ Ｍ ｇ Ｓ Ｏａ、 ５０ｍ
Ｍ） リス（ｐＨ７，５）、０．Ｏ１％ゼラチン］およ
び２滴のクロロホルムで終結させた。
を確立するために、次いでリガーゼ混合物の、入洛原性
細胞抽出物大腸菌Ｎ５４２ＢおよびＮ５４３３ との
インビトロパッケージング反応を室温で２時間行った（
Ｖｅｃｔｏｒ ＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ、、Ｓａ
ｎ Ｄｉｅｇｏ、 ＣＡ、 ＥｎｑｕｉｓｔおよびＳｔ
ｅｒｎｂｅｒｇ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ ６８ （１９７９）２８１−２９８）。反
応を５００μｍの懸濁培地［ＳＭ：０ 、 Ｉ Ｍ
Ｎ ａ Ｃｌ −８ｍＭ Ｍ ｇ Ｓ Ｏａ、 ５０ｍ
Ｍ） リス（ｐＨ７，５）、０．Ｏ１％ゼラチン］およ
び２滴のクロロホルムで終結させた。
７、力価決定および胎盤ｃＤＮＡバンクの分析大腸菌に
１２Ｃ６００ＨＦＬ株のコンピテントな細胞を用いて決
定した胎盤ｃＤＮＡバンクのプラーク形成ユニット（Ｐ
ＦＬＩ）の数は、Ｉ Ｘ １０６ＰＦｔＪであった。全
ファージの約８０％が１０００ｂｐより大きいＤＮＡ挿
入物を含んでいた。
１２Ｃ６００ＨＦＬ株のコンピテントな細胞を用いて決
定した胎盤ｃＤＮＡバンクのプラーク形成ユニット（Ｐ
ＦＬＩ）の数は、Ｉ Ｘ １０６ＰＦｔＪであった。全
ファージの約８０％が１０００ｂｐより大きいＤＮＡ挿
入物を含んでいた。
８、抗−ＰＰ１１抗体を用いる、ヒト胎盤からの発現ｃ
ＤＮＡバンクのスクリーニング Ｇｅｎｏｆｉｔ （前出）からのファージλｇｔｌｌ中
の発現ｃＤＮＡバンクを、寒天プレート（直径１３．６
ｃｍ）当り約３０，０ＯＯＰＦ（Ｊの密度でプレートし
た。このために、コンピテントな大腸菌Ｖ６Ｏ１３株（
ＡＴＣＣ３７１９７、Ｒ，Ａ、 ＹｏｕｎｇおよびＲ，
Ｗ、 Ｄａｖｉｓ： ５ｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ、 ２２
２．７７Ｂ−７８２，１９８３）の細胞を３７℃で３０
分間ファージで感染させて、次いで、Ｌブロスプレート
の寒天表面にプレートした。プレートを４２℃で４時間
インキュベートして、次いで、それぞれを乾燥したニト
ロセルロースフィルターで覆った（ ５ｃｈｌｅｉｃｔ
１ｅｒ ＆５ｃｈｕｅｌｌ、ＢＡ ８５、Ｒｅｆ、 Ｎ
ｏ、 ４０１１２４）。フィルターは、予め１０ｍＭＩ
ＰＴＯ水溶液で飽和させておいた。プレートをフィルタ
ーとともに３７℃で４時間あらためてインキュベートに
供した。フィルターを再び除去する前に、フィルターと
プレートとを同時にカーボンブラックに漬けた針を用い
て印付けした。次いで、フィルターをＴＢＳＴ （１０
ｍＭ）リス塩酸、ｐＨ８，０，１５０ｍＭＮａＣ１゜０
．０５％Ｔｗｅｅｎ２０および５％脱脂粉乳）中で４℃
で一晩インキユベートした。続いて、フィルターをＴＢ
ＳＴ中で室温でざらに３回洗浄してから、フィルター当
り１５ｍ１のウサギ抗−ＰＰ１１抗体ＴＢＳＴ溶液とと
もに室温で１時間インキュベートした。（抗体の溶液は
、１：２００に希釈して、非線換えλｇｔｌｌ溶解大腸
Ｎ細胞で二）Ｏセルロースフィルター上で１時間飽和さ
せておいた。）フィルターを一次（ｐｒｉｍａｒｙ）抗
体とともにインキュベートした後、それらをＴＢＳＴで
４×１０分間洗浄した。次いで、アルカリフォスファタ
ーゼ（ＵＳＡ Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ａｔｌａｎｔａ社
、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、により販売）に抱合させたＪ
Ｔ Ｂ Ｓ Ｔで予め１ ：５，０００に希釈しておい
た、二次（５ｅｃｏｎｄａｒｙ）抗−ウサギ抗体ととも
に、フィルターを振盪しながら１時間インキュベートシ
た。最後に、−次および二次抗体の両方が結合したＰ
Ｐ １１ ＦＮ性クローンを、アルカリフォスファター
ゼと呈色剤との反応（ＰｒｏｔｏＢｌｏｔシスアム、Ｐ
ｒｏｔｏｇｅｎ社）によって可視化するために、呈色反
応を行った。それぞれの呈色反応のために、一つのニト
ロセルロースフィルターに、１５ｍ１のＡＰ緩衝Ｗ （
１００ｍＭ）リス塩酸、ｐＨ９，５，１００ｍＭＮａＣ
１，５ｍＭＭｇＣｌ２）を９９μｍのＮＢＴ にトロブ
ルーテトラゾリウム）基質（５０ｍｇ／ｍ１７０％ジメ
チルフォルムアミド）および４９．５μｍのＢ（、ＩＰ
（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェー
ト）基質（５０ｍｇ／ｍ１７０％ジメチルフォルムアミ
ド溶液）と混合した。フィルターを、染色溶液中で約２
０分間から１時間陽性プラークが適度な青色を呈するま
で暗所で振盪した。フィルターを終結溶液（２０ｍＭ）
リス塩酸、ｐＨ８，０，５ｍＭＥ Ｄ Ｔ Ａ ）に浸
して呈色反応を終結させた。
ＤＮＡバンクのスクリーニング Ｇｅｎｏｆｉｔ （前出）からのファージλｇｔｌｌ中
の発現ｃＤＮＡバンクを、寒天プレート（直径１３．６
ｃｍ）当り約３０，０ＯＯＰＦ（Ｊの密度でプレートし
た。このために、コンピテントな大腸菌Ｖ６Ｏ１３株（
ＡＴＣＣ３７１９７、Ｒ，Ａ、 ＹｏｕｎｇおよびＲ，
Ｗ、 Ｄａｖｉｓ： ５ｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ、 ２２
２．７７Ｂ−７８２，１９８３）の細胞を３７℃で３０
分間ファージで感染させて、次いで、Ｌブロスプレート
の寒天表面にプレートした。プレートを４２℃で４時間
インキュベートして、次いで、それぞれを乾燥したニト
ロセルロースフィルターで覆った（ ５ｃｈｌｅｉｃｔ
１ｅｒ ＆５ｃｈｕｅｌｌ、ＢＡ ８５、Ｒｅｆ、 Ｎ
ｏ、 ４０１１２４）。フィルターは、予め１０ｍＭＩ
ＰＴＯ水溶液で飽和させておいた。プレートをフィルタ
ーとともに３７℃で４時間あらためてインキュベートに
供した。フィルターを再び除去する前に、フィルターと
プレートとを同時にカーボンブラックに漬けた針を用い
て印付けした。次いで、フィルターをＴＢＳＴ （１０
ｍＭ）リス塩酸、ｐＨ８，０，１５０ｍＭＮａＣ１゜０
．０５％Ｔｗｅｅｎ２０および５％脱脂粉乳）中で４℃
で一晩インキユベートした。続いて、フィルターをＴＢ
ＳＴ中で室温でざらに３回洗浄してから、フィルター当
り１５ｍ１のウサギ抗−ＰＰ１１抗体ＴＢＳＴ溶液とと
もに室温で１時間インキュベートした。（抗体の溶液は
、１：２００に希釈して、非線換えλｇｔｌｌ溶解大腸
Ｎ細胞で二）Ｏセルロースフィルター上で１時間飽和さ
せておいた。）フィルターを一次（ｐｒｉｍａｒｙ）抗
体とともにインキュベートした後、それらをＴＢＳＴで
４×１０分間洗浄した。次いで、アルカリフォスファタ
ーゼ（ＵＳＡ Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ａｔｌａｎｔａ社
、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、により販売）に抱合させたＪ
Ｔ Ｂ Ｓ Ｔで予め１ ：５，０００に希釈しておい
た、二次（５ｅｃｏｎｄａｒｙ）抗−ウサギ抗体ととも
に、フィルターを振盪しながら１時間インキュベートシ
た。最後に、−次および二次抗体の両方が結合したＰ
Ｐ １１ ＦＮ性クローンを、アルカリフォスファター
ゼと呈色剤との反応（ＰｒｏｔｏＢｌｏｔシスアム、Ｐ
ｒｏｔｏｇｅｎ社）によって可視化するために、呈色反
応を行った。それぞれの呈色反応のために、一つのニト
ロセルロースフィルターに、１５ｍ１のＡＰ緩衝Ｗ （
１００ｍＭ）リス塩酸、ｐＨ９，５，１００ｍＭＮａＣ
１，５ｍＭＭｇＣｌ２）を９９μｍのＮＢＴ にトロブ
ルーテトラゾリウム）基質（５０ｍｇ／ｍ１７０％ジメ
チルフォルムアミド）および４９．５μｍのＢ（、ＩＰ
（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェー
ト）基質（５０ｍｇ／ｍ１７０％ジメチルフォルムアミ
ド溶液）と混合した。フィルターを、染色溶液中で約２
０分間から１時間陽性プラークが適度な青色を呈するま
で暗所で振盪した。フィルターを終結溶液（２０ｍＭ）
リス塩酸、ｐＨ８，０，５ｍＭＥ Ｄ Ｔ Ａ ）に浸
して呈色反応を終結させた。
陽性シグナルを対応する寒天プレート上のプラークと照
合した。プラークをパスツールピペットで突いて取り出
して、１ｍｌの９Ｍ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ
７，５，１０１ＭｇＣｌ ２）に再懸濁させて、単一陽
性プラークを得るために選び出した。ここで用いる発現
遺伝子バンクから、完全な遺伝子は含まないが、挿入の
全長が約１８００ｂｐであるクローン（ＰＰ１１−９３
）を見出した。
合した。プラークをパスツールピペットで突いて取り出
して、１ｍｌの９Ｍ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ
７，５，１０１ＭｇＣｌ ２）に再懸濁させて、単一陽
性プラークを得るために選び出した。ここで用いる発現
遺伝子バンクから、完全な遺伝子は含まないが、挿入の
全長が約１８００ｂｐであるクローン（ＰＰ１１−９３
）を見出した。
このクローンは、開始メチオニンを含まない８６０ｂｐ
の転写解読枠を有した。
の転写解読枠を有した。
９ａ）ＰＰ１１−特異性プローブの調製ｃＤＮＡをＰＰ
ｌｌ−９３クローンから既知（７） 方法によフて単離
して、次のようにして３２ ｐで標識した。
ｌｌ−９３クローンから既知（７） 方法によフて単離
して、次のようにして３２ ｐで標識した。
１０ｎｇのＤＮＡを、ＭｕｌｔｉｐｒｉｍｅＤ Ｎ Ａ
標識システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、Ｂｒａｕｎｓｃｈ
ｗｅｉｇ）を用いてクレノウボリメラーゼを用いてα−
３２Ｐ−ｄＣＴＰ（３５μＣｉ／ ２５μｍ反応反応液
を使用した）の存在下で標識した。ＤＮＡプローブの特
異活性は、３３０ ＭＢｑ／ｐｍｏｌであった。
標識システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、Ｂｒａｕｎｓｃｈ
ｗｅｉｇ）を用いてクレノウボリメラーゼを用いてα−
３２Ｐ−ｄＣＴＰ（３５μＣｉ／ ２５μｍ反応反応液
を使用した）の存在下で標識した。ＤＮＡプローブの特
異活性は、３３０ ＭＢｑ／ｐｍｏｌであった。
９ｂ）１〜７のようにして本発明者によって調製される
胎盤ｃＤＮＡバンクの、ＰＰｌｌ−特異性プローブによ
るスクリーニング このために、３ Ｘ １０’ＰＦＵを、軟寒天中の大腸
菌Ｋ １２ Ｃ６００ＨＦ Ｌ株の細胞とともに１３．
５ｃｍのペトリ皿上にプレートして、３７℃で６時間イ
ンキュベートした。この時、溶菌はまだ完全ではなかっ
た。プレートを一晩冷蔵庫にてインキュベートして、フ
ァージをニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃ
ｈｅｒ ＆ ５ｃｈｕｅｌｌ、ＢＡ ８５、Ｒｅｆ、
Ｎｏ。
胎盤ｃＤＮＡバンクの、ＰＰｌｌ−特異性プローブによ
るスクリーニング このために、３ Ｘ １０’ＰＦＵを、軟寒天中の大腸
菌Ｋ １２ Ｃ６００ＨＦ Ｌ株の細胞とともに１３．
５ｃｍのペトリ皿上にプレートして、３７℃で６時間イ
ンキュベートした。この時、溶菌はまだ完全ではなかっ
た。プレートを一晩冷蔵庫にてインキュベートして、フ
ァージをニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃ
ｈｅｒ ＆ ５ｃｈｕｅｌｌ、ＢＡ ８５、Ｒｅｆ、
Ｎｏ。
４０１１２４）に移した（デユープリケード）。ニトロ
セルロースフィルターおよびペトリ皿には、注射針を用
いて後の照合のために印を付した。ニトロセルロースフ
ィルターを処理している間に、ペトリ皿を冷蔵庫に保存
した。ニトロセルロースフィルター上のＤＮＡを１．５
ＭＮａＣ１および０．５ＭＮａＯＨに浸した濾紙（ファ
ツトマンＭ３）上にフィルターを５分間置くことによっ
て変性させた。続いてフィルターを同様にして１．５Ｍ
ＮａＣ１，０，５Ｍ、）リス（ｐ）１８．０）を用いて
もとに戻して、２ＸＳＳＰＥ （０，３６ＭＮａＣＬ
１６＋ｎＭ ＮａＯＨ，２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４，２
ｍＭＥＤＴＡ）で洗浄した。次いでフィルターを８０℃
にて２時間真空中で乾燥した。フィルターを６５℃にて
４時間プレハイブリダイゼーションさせた［ブレハイブ
リダイゼーション溶液：０．６ＭＮａＣ１，０，０６Ｍ
）リス（ｐＨ８，３）、６ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％非
イオン性合成シュークロースポリマー（ＲＦｉｃｏｌｌ
）、０．２％ポリビニルピロリドン４０．０．２％ＢＳ
Ａ、０．１％Ｓ Ｄ Ｓ、 ５０ μｇ／ｍｌ変性ニシ
ン精子ＤＮＡ］。最後に、フィルターに１ｍｌのハイブ
リダイゼーション溶液にシン精子ＤＮＡを含まないプレ
ハイブリダイゼーション溶液）当り１００．０００〜２
００，０ＯＯＢｑのラベルしたオリゴヌクレオチドを加
えて、これらをビーカーまたは封をしたポリエチレンフ
ィルム中で静かに振盪しながら一晩インキユベートした
。ハイブリダイゼーションの温度は６５℃であった。ニ
トロセルロースフィルターを６ＸＳＳＣ，０，０５Ｍピ
ロ燐酸ナトリウムで室温で１時間、個々のハイブリダイ
ゼーション温度でさらに１時間洗浄した。フィルターを
乾燥させて、−晩オートラジオグラフに供した。両デユ
ープリケードに現れたＸ線フィルムシグナルをベトリ皿
に照合して、その領域（約５０プラーク）をパスツール
ピペットの広い先端で突いて切り出して、ファージを１
１のＳＭ緩衝液に再懸濁させた。陽性のファージを３回
のサイクルで選び出して、単一のクローンを得た。
セルロースフィルターおよびペトリ皿には、注射針を用
いて後の照合のために印を付した。ニトロセルロースフ
ィルターを処理している間に、ペトリ皿を冷蔵庫に保存
した。ニトロセルロースフィルター上のＤＮＡを１．５
ＭＮａＣ１および０．５ＭＮａＯＨに浸した濾紙（ファ
ツトマンＭ３）上にフィルターを５分間置くことによっ
て変性させた。続いてフィルターを同様にして１．５Ｍ
ＮａＣ１，０，５Ｍ、）リス（ｐ）１８．０）を用いて
もとに戻して、２ＸＳＳＰＥ （０，３６ＭＮａＣＬ
１６＋ｎＭ ＮａＯＨ，２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４，２
ｍＭＥＤＴＡ）で洗浄した。次いでフィルターを８０℃
にて２時間真空中で乾燥した。フィルターを６５℃にて
４時間プレハイブリダイゼーションさせた［ブレハイブ
リダイゼーション溶液：０．６ＭＮａＣ１，０，０６Ｍ
）リス（ｐＨ８，３）、６ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％非
イオン性合成シュークロースポリマー（ＲＦｉｃｏｌｌ
）、０．２％ポリビニルピロリドン４０．０．２％ＢＳ
Ａ、０．１％Ｓ Ｄ Ｓ、 ５０ μｇ／ｍｌ変性ニシ
ン精子ＤＮＡ］。最後に、フィルターに１ｍｌのハイブ
リダイゼーション溶液にシン精子ＤＮＡを含まないプレ
ハイブリダイゼーション溶液）当り１００．０００〜２
００，０ＯＯＢｑのラベルしたオリゴヌクレオチドを加
えて、これらをビーカーまたは封をしたポリエチレンフ
ィルム中で静かに振盪しながら一晩インキユベートした
。ハイブリダイゼーションの温度は６５℃であった。ニ
トロセルロースフィルターを６ＸＳＳＣ，０，０５Ｍピ
ロ燐酸ナトリウムで室温で１時間、個々のハイブリダイ
ゼーション温度でさらに１時間洗浄した。フィルターを
乾燥させて、−晩オートラジオグラフに供した。両デユ
ープリケードに現れたＸ線フィルムシグナルをベトリ皿
に照合して、その領域（約５０プラーク）をパスツール
ピペットの広い先端で突いて切り出して、ファージを１
１のＳＭ緩衝液に再懸濁させた。陽性のファージを３回
のサイクルで選び出して、単一のクローンを得た。
全部で、Ｉ Ｘ １０６ＰＦＵの胎盤ｃＤＮＡバンクを
調べた。２個のさらなるシグナルをアユブリケートフィ
ルター上で同定した（クローンＰＰ１１１６６およびＰ
Ｐｌｌ−１６９）。最後に、上記（７頁）に記載のよう
なＰＰｌｌ−１６９からの４６ｍｅｒを用いて、ＰＰ
１１ ｃＤＮＡの全５′末端をカバーするクローンＰＰ
ｌｌ−３１８を見出した。
調べた。２個のさらなるシグナルをアユブリケートフィ
ルター上で同定した（クローンＰＰ１１１６６およびＰ
Ｐｌｌ−１６９）。最後に、上記（７頁）に記載のよう
なＰＰｌｌ−１６９からの４６ｍｅｒを用いて、ＰＰ
１１ ｃＤＮＡの全５′末端をカバーするクローンＰＰ
ｌｌ−３１８を見出した。
これらの四つのクローンは、表２および第１図に示され
るようにともにＰＰｌｌ−コード配列を有している。
るようにともにＰＰｌｌ−コード配列を有している。
１０、ＤＮＡ配列分析
ファージクローン（クローンＰＰｌｌ−９３、ＰＰ１ｌ
−１６６、ＰＰｌｌ−１６９およびＰＰｌｌ−３１８）
を増やして、それぞれのＤＮＡを抽出した。 関連した
ＥｃｏＲＩ断片を単離して、ＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔＭ
１３ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、Ｓａｎ Ｄｉ
ｅｇｏ、 ＣＡ、 ＵＳＡ）のＥｃｏＲ１部位に連結し
て、Ｓａｎｇｅｒの酵素的ジデオキシ法を用いて制限酵
素分析および配列分析を行った。配列は、転写解読枠を
有し最大３６９個のアミノ酸を有するタンパク質をコー
ドしている。このように、５′末端に翻訳されない１５
４ｂｐがあり、これらに続いて１１０７ｂρのコード配
列および最後に３′末端に１１３８ｂｐの非翻訳配列が
ある。
−１６６、ＰＰｌｌ−１６９およびＰＰｌｌ−３１８）
を増やして、それぞれのＤＮＡを抽出した。 関連した
ＥｃｏＲＩ断片を単離して、ＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔＭ
１３ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、Ｓａｎ Ｄｉ
ｅｇｏ、 ＣＡ、 ＵＳＡ）のＥｃｏＲ１部位に連結し
て、Ｓａｎｇｅｒの酵素的ジデオキシ法を用いて制限酵
素分析および配列分析を行った。配列は、転写解読枠を
有し最大３６９個のアミノ酸を有するタンパク質をコー
ドしている。このように、５′末端に翻訳されない１５
４ｂｐがあり、これらに続いて１１０７ｂρのコード配
列および最後に３′末端に１１３８ｂｐの非翻訳配列が
ある。
１１、ＰＰ１１の細菌細胞における発現ａ）ＰＰ１１融
合タンパク質の発現 ｐ Ｔ ｒ ｃ ９９Ｃ（Ｅ、 Ａｍａｎｎら： Ｇｅ
ｎｅ ６９（１９８Ｂ） ３０１−３１５）をＥｃｏＲ
ＩおよびＸｂａ Ｉで完全に消化して、４１４９塩基対
の大きさのフラグメントをゲル電機泳動によって単離し
た。
合タンパク質の発現 ｐ Ｔ ｒ ｃ ９９Ｃ（Ｅ、 Ａｍａｎｎら： Ｇｅ
ｎｅ ６９（１９８Ｂ） ３０１−３１５）をＥｃｏＲ
ＩおよびＸｂａ Ｉで完全に消化して、４１４９塩基対
の大きさのフラグメントをゲル電機泳動によって単離し
た。
ＰＰ１１クローンλｇｔｌｌ−１６９をＥｃｏＲＩで消
化して、リンカ一部分を含む１７８５塩基対の大きざの
ＥｃｏＲＩ挿入物を同様に単離した。
化して、リンカ一部分を含む１７８５塩基対の大きざの
ＥｃｏＲＩ挿入物を同様に単離した。
クローンλｇｔｌｌ−１６９のＰＰ １１ ｃＤＮＡは
、第１図に示すように位置１４０で開始する。得られる
フラグメントを次いでＸｂａｌで切断して、１３３９塩
基対の大きさのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメントを単
離して、上記のｐＴｒｃ９９Ｃベクターフラグメントに
連結させた。このようにして得られた５４８８ｂｐのプ
ラスミド ｐＴ ｒ ｃ９９ｃｍＰＰ １１は、大腸菌細胞におい
て約４２ｋＤのタンパク質の合成を誘導することができ
る。このタンパク質は、ヒト胎盤から単離されたＰＰ１
１による免疫によって作られた単一特異性（ｍｏｎｏ−
ｓｐｅｃｉｆｉｃ）ウサギ抗−ＰＰ１１抗血清を用いて
特異的に免疫沈降させることができる。大腸菌細胞にお
けるＰＰ１１発現は、さらに、上記の血清を用いるウェ
スタンプロット分析によって検出される。この実験にお
いて、ｐＴｒｃ９９Ｃ−ＰＰ１１ブラスミ・ドを含むｔ
ｐ’ｒｃ−誘導細胞からの抽出物のみが反応して、ここ
でも約４２ｋＤのタンパク質バンドが特異的に認められ
た。プラスミドを含まない大腸菌対照抽出物および ｐＴｒｃ９９Ｃ−ＰＰＩ １は含むがＩＰＴＯで誘導さ
れない抽出物は、上記の抗−ＰＰ１１抗血清と反応しな
かった。上記のようにして行うプラスミド構築によるＰ
Ｐ１１融合タンパク質は、次のようなＮ−末端アミノ酸
配列を有し、次のようなヌクレオチド配列で定義される
。
、第１図に示すように位置１４０で開始する。得られる
フラグメントを次いでＸｂａｌで切断して、１３３９塩
基対の大きさのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメントを単
離して、上記のｐＴｒｃ９９Ｃベクターフラグメントに
連結させた。このようにして得られた５４８８ｂｐのプ
ラスミド ｐＴ ｒ ｃ９９ｃｍＰＰ １１は、大腸菌細胞におい
て約４２ｋＤのタンパク質の合成を誘導することができ
る。このタンパク質は、ヒト胎盤から単離されたＰＰ１
１による免疫によって作られた単一特異性（ｍｏｎｏ−
ｓｐｅｃｉｆｉｃ）ウサギ抗−ＰＰ１１抗血清を用いて
特異的に免疫沈降させることができる。大腸菌細胞にお
けるＰＰ１１発現は、さらに、上記の血清を用いるウェ
スタンプロット分析によって検出される。この実験にお
いて、ｐＴｒｃ９９Ｃ−ＰＰ１１ブラスミ・ドを含むｔ
ｐ’ｒｃ−誘導細胞からの抽出物のみが反応して、ここ
でも約４２ｋＤのタンパク質バンドが特異的に認められ
た。プラスミドを含まない大腸菌対照抽出物および ｐＴｒｃ９９Ｃ−ＰＰＩ １は含むがＩＰＴＯで誘導さ
れない抽出物は、上記の抗−ＰＰ１１抗血清と反応しな
かった。上記のようにして行うプラスミド構築によるＰ
Ｐ１１融合タンパク質は、次のようなＮ−末端アミノ酸
配列を有し、次のようなヌクレオチド配列で定義される
。
ベクター／リンカ−／ ５’ＵＴ領域 ／
ＰＰｉ１Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇ
ｉｎ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ａｒｇ Ａｌ
ａ、、ＣＣＫ笈ＧＧＧ ＭＴ ’１’ＣＴ ＣＴＣ母Ｃ
ＴＧ ＧＧＣＡＣＣＫ工ＡＧＣズＣ０，。
ＰＰｉ１Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇ
ｉｎ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ａｒｇ Ａｌ
ａ、、ＣＣＫ笈ＧＧＧ ＭＴ ’１’ＣＴ ＣＴＣ母Ｃ
ＴＧ ＧＧＣＡＣＣＫ工ＡＧＣズＣ０，。
この構築によって定義されるＰＰ１１融合タンパク質は
、ＰＰ１１ｃＤＮＡによってコードされる完全なＰＰ１
１アミノ酸配列定配列て、Ｎ−末端の前方に９個のアミ
ノ酸を有している。すなわち、４個のベクターによって
コードされたアミノ酸およびＰＰ１１ｃＤＮＡにおいて
現れる５′非翻訳領域によって特定される５個のアミノ
酸である。確認のために、上記の構築を同様に発現ベク
ターｐＴｒｃ９９ＡおよびｐＴｒｃ９９Ｂ （独国特許
出願第Ｐ ３８１９４６３．５号明細書およびＡｍａｎ
ｎら＝（１９８Ｂ） Ｇｅｎｅ ６９．３０１−３１５
）を用いて行った。これらベクターは、ｐＴｒｃ９９ｃ
とは２塩基対（ｐＴｒｃ９９Ａ）および１塩基対 （ｐＴｒｃ９９Ｂ）が異なるのみである。これによって
翻訳解読枠にシフトが生じる。期待されるように、ｐＴ
ｒｃ９９Ａ−ＰＰ１１およびｐＴｒｃ９９Ｂ−ＰＰＩ
１のいずれも、抗−ＰＰ１１抗血清と反応するＰＰ１１
タンパク貿の合成を誘導することはできなかった。
、ＰＰ１１ｃＤＮＡによってコードされる完全なＰＰ１
１アミノ酸配列定配列て、Ｎ−末端の前方に９個のアミ
ノ酸を有している。すなわち、４個のベクターによって
コードされたアミノ酸およびＰＰ１１ｃＤＮＡにおいて
現れる５′非翻訳領域によって特定される５個のアミノ
酸である。確認のために、上記の構築を同様に発現ベク
ターｐＴｒｃ９９ＡおよびｐＴｒｃ９９Ｂ （独国特許
出願第Ｐ ３８１９４６３．５号明細書およびＡｍａｎ
ｎら＝（１９８Ｂ） Ｇｅｎｅ ６９．３０１−３１５
）を用いて行った。これらベクターは、ｐＴｒｃ９９ｃ
とは２塩基対（ｐＴｒｃ９９Ａ）および１塩基対 （ｐＴｒｃ９９Ｂ）が異なるのみである。これによって
翻訳解読枠にシフトが生じる。期待されるように、ｐＴ
ｒｃ９９Ａ−ＰＰ１１およびｐＴｒｃ９９Ｂ−ＰＰＩ
１のいずれも、抗−ＰＰ１１抗血清と反応するＰＰ１１
タンパク貿の合成を誘導することはできなかった。
驚いたことに、プラスミドｐＴｒｃ９９ＣＰＰ１１によ
って誘導されるＰＰ１１タンパク質が大腸菌中でプロセ
シングされることが見出された。天然では成熟ＰＰ１１
タンパク質に先行するシグナル配列（リーダー配列とも
呼ばれる）は、大腸菌細胞によって認識されて、シグナ
ルペプチダーゼによって切断される。これは、次のよう
な知見から結論づけられる。すなわち、細胞抽出物の分
画後にペリプラズム画分（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃｆ
ｒａｃｔ ｉ ｏｎ）から検出されるＰＰ１１タンパク
質は膜結合性画分のものよりも小さく、観察される分子
量の相違はシグナル配列除去後の期待される相違に相当
する。
って誘導されるＰＰ１１タンパク質が大腸菌中でプロセ
シングされることが見出された。天然では成熟ＰＰ１１
タンパク質に先行するシグナル配列（リーダー配列とも
呼ばれる）は、大腸菌細胞によって認識されて、シグナ
ルペプチダーゼによって切断される。これは、次のよう
な知見から結論づけられる。すなわち、細胞抽出物の分
画後にペリプラズム画分（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃｆ
ｒａｃｔ ｉ ｏｎ）から検出されるＰＰ１１タンパク
質は膜結合性画分のものよりも小さく、観察される分子
量の相違はシグナル配列除去後の期待される相違に相当
する。
ｂ）成熟非融合タンパク質の発現
天然のシグナル配列を欠いている成熟ＰＰ１１タンパク
質を発現させるために、１３３９塩基対の長さの上述し
たＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメントを、同じ制限酵素
で消化しておいた突然変異誘発（ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉ
ｓ）ベクターｐＭａ５−８に連結させた。
質を発現させるために、１３３９塩基対の長さの上述し
たＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメントを、同じ制限酵素
で消化しておいた突然変異誘発（ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉ
ｓ）ベクターｐＭａ５−８に連結させた。
突然変異誘発ベクターｐＭａ５−８は、細菌の複製開始
点および抗生物質耐性マーカーの他にクローニングポリ
リンカー領域および一本鎖バクテリオファージＦ１の複
製開始点を有している。得られるプラスミドｐＭａ５−
８−ＰＰ １１を一本鎖の調製に用いた。このようにし
て得られた一本鎖のクローン化ＰＰ１１ｃＤＮＡを次い
で既知の方法で単離して、次のようなオリゴデオキシヌ
クレオチドを用いる公知のｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ
ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｐｒｏｔｏｃｏｌ （Ｋｒ
ａｍｅｒら： （１９８４） Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅｓ。
点および抗生物質耐性マーカーの他にクローニングポリ
リンカー領域および一本鎖バクテリオファージＦ１の複
製開始点を有している。得られるプラスミドｐＭａ５−
８−ＰＰ １１を一本鎖の調製に用いた。このようにし
て得られた一本鎖のクローン化ＰＰ１１ｃＤＮＡを次い
で既知の方法で単離して、次のようなオリゴデオキシヌ
クレオチドを用いる公知のｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ
ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｐｒｏｔｏｃｏｌ （Ｋｒ
ａｍｅｒら： （１９８４） Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅｓ。
１２．９４４１−９４５６）に供した。
５’ ＴＴＴＧＴＧＧＴＣＣＴＣＣＡＴＧＧＡＧＧＣ
ＣＡＧＧＣＣＡＣＡ ３′目的のＮｃｏ Ｉ突然変異（
元の単離されたｃＤＮＡには存在しなかったＮｃｏＩ切
断部位を、成熟ＰＰ１１タンパク貿のコード配列の直前
に新たに作出する）を有するクローンを適当な制限酵素
分析で同定して、ｐＭａ ５−８−Ｐ Ｐ １１−Ｎｃ
ｏＩと命名した。部分的Ｎｃｏｒ消化および完全Ｘｂａ
Ｉ消化に続いて、このプラスミドから１２６８ｂｐの
大きさのＮｃｏＩ−ＸｂａＩ断片を単離して、同様に切
断しておいたベクターｐＴｒｃ９９Ａに連結させた。得
られるプラスミドは５４１２ｂρを含んでおり、 ｔｒｃプロモーターをＩＰＴＧで誘導した後、約４２ｋ
Ｏの分子量の成熟非融合ＰＰ１１タンパク質を発現する
。これは、既に上記したように抗−ＰＰ１１抗血清と特
異的に反応する。
ＣＡＧＧＣＣＡＣＡ ３′目的のＮｃｏ Ｉ突然変異（
元の単離されたｃＤＮＡには存在しなかったＮｃｏＩ切
断部位を、成熟ＰＰ１１タンパク貿のコード配列の直前
に新たに作出する）を有するクローンを適当な制限酵素
分析で同定して、ｐＭａ ５−８−Ｐ Ｐ １１−Ｎｃ
ｏＩと命名した。部分的Ｎｃｏｒ消化および完全Ｘｂａ
Ｉ消化に続いて、このプラスミドから１２６８ｂｐの
大きさのＮｃｏＩ−ＸｂａＩ断片を単離して、同様に切
断しておいたベクターｐＴｒｃ９９Ａに連結させた。得
られるプラスミドは５４１２ｂρを含んでおり、 ｔｒｃプロモーターをＩＰＴＧで誘導した後、約４２ｋ
Ｏの分子量の成熟非融合ＰＰ１１タンパク質を発現する
。これは、既に上記したように抗−ＰＰ１１抗血清と特
異的に反応する。
１２、ＰＰ１１のアミド分解活性
ＰＰ１１は、次のような比色定量分析混合液中でプロテ
アーゼ活性を有することが示された。
アーゼ活性を有することが示された。
ｐＴｒｃ９９ＣまたはｐＴｒｃ９９Ｃ−ＰＰＩ １によ
って形質転換された大腸菌Ｒ８７９１株（Ｒ。
って形質転換された大腸菌Ｒ８７９１株（Ｒ。
ＢｒｅｎｔおよびＭ、Ｐｔａｓｈｎｅ： （１９８１）
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ ７８．４２０４−４２０
８）のペリプラズムまたは細胞質画分を発色基質（ｃｔ
＋ｒｏｍｏｇｅｎ １ｃｓｕｂｓｔｒａｔｅ）であるＣ
ｈｒｏｍｏｚｙｍ” Ｔ）ｌ （ベーリンガーマンハイ
ムＧｍｂＨ）を用いて光学分析で測定した。
８）のペリプラズムまたは細胞質画分を発色基質（ｃｔ
＋ｒｏｍｏｇｅｎ １ｃｓｕｂｓｔｒａｔｅ）であるＣ
ｈｒｏｍｏｚｙｍ” Ｔ）ｌ （ベーリンガーマンハイ
ムＧｍｂＨ）を用いて光学分析で測定した。
４００μｍのトリエタノールアミン緩衝液および１００
μｍの基質を、予めタンパク質濃度１６ｍｇ／ｍｌに希
釈しておいた各大腸菌抽出物の３００μｍと混合した。
μｍの基質を、予めタンパク質濃度１６ｍｇ／ｍｌに希
釈しておいた各大腸菌抽出物の３００μｍと混合した。
反応キューペットを３７℃でインキュベートして、４０
５ｎｍにおける１分間当りの吸光度の変化を記録した。
５ｎｍにおける１分間当りの吸光度の変化を記録した。
いくつかの実験において大腸菌抽出物および対照抽出物
をウサギ抗−ＰＰ１１−抗血清と予めインキュベートし
て、抽出物のアミド分解活性の計算において抗血清のア
ミド分解活性を差し引いた。同じ総タンパク質濃度にお
いて、ＰＰ１１を含んでいる大腸菌抽出物の吸光度の増
加（ΔＡ＝０．０４／分）は、対照の場合（Δ＝０．０
２４／分）よりも大きく、それぞれ３２ｍＵ／ｍｌおよ
び１９ 、２ ｍｕ／ｍｌに相当した。ＰＰ１１のアミ
ド分解活性は、抗−ＰＰ１１抗血清とのブレインキュベ
ーションによってほぼ完全に阻害された。さらに、細胞
質のプロセシングされない分子量 ４５ｋＤのＰＰ１１
は、このアミド分解活性を有しなかった。
をウサギ抗−ＰＰ１１−抗血清と予めインキュベートし
て、抽出物のアミド分解活性の計算において抗血清のア
ミド分解活性を差し引いた。同じ総タンパク質濃度にお
いて、ＰＰ１１を含んでいる大腸菌抽出物の吸光度の増
加（ΔＡ＝０．０４／分）は、対照の場合（Δ＝０．０
２４／分）よりも大きく、それぞれ３２ｍＵ／ｍｌおよ
び１９ 、２ ｍｕ／ｍｌに相当した。ＰＰ１１のアミ
ド分解活性は、抗−ＰＰ１１抗血清とのブレインキュベ
ーションによってほぼ完全に阻害された。さらに、細胞
質のプロセシングされない分子量 ４５ｋＤのＰＰ１１
は、このアミド分解活性を有しなかった。
アミド分解活性がジイソプロピルフッ化燐酸塩にょって
阻害されることから、ＰＰ１１はおそらくセリンプロテ
アーゼである。
阻害されることから、ＰＰ１１はおそらくセリンプロテ
アーゼである。
←
べ
υ
第１図は、本発明に係るＰＰ１１をコードするｃＤＮＡ
配列の制限酵素地図および関連クローンを示す、説明図
である。
配列の制限酵素地図および関連クローンを示す、説明図
である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、表２に示されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配
列、その対立因子（ａｌｌｅｌｅｓ）および変異体。 ２、表２に示されたコード鎖を含む、胎盤−特異性タン
パク質ＰＰ１１をコードするＤＮＡ配列。 ３、請求項１に記載のＤＮＡと緊縮条件 （ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）下でハ
イブリダイズする、ＤＮＡまたはＲＮＡ。 ４、請求項１〜３のいずれか１項に記載の ＤＮＡまたはＲＮＡを含む、遺伝子構造物。 ５、請求項１〜４のいずれか１項に記載の ＤＮＡまたはＲＮＡを含む、ベクター。 ６、請求項１〜５のいずれか１項に記載の ＤＮＡまたはＲＮＡを含む、形質転換細胞。 ７、表２に示されたアミノ酸配列を有する、遺伝子操作
によって得ることができる胎盤−特異性タンパク質１１
。 ８、請求項２に記載のＤＮＡ配列の発現によって大腸菌
において遺伝子操作によって調製される胎盤−特異性タ
ンパク質１１。 ９、請求項２に記載のＤＮＡ配列の発現によって酵母に
おいて遺伝子操作によって調製される胎盤−特異性タン
パク質１１。 １０、請求項１〜４のいずれか１項に記載のｃＤＮＡま
たはＲＮＡを発現系へ導入すること、およびそこで発現
させること、を含む、胎盤−特異性タンパク質１１の製
造法。 １１、胎盤−特異性タンパク質１１に特異的であって、
遺伝子操作によって調製される胎盤−特異性タンパク質
１１、または抗原活性を有するその部分、から得られる
、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体。 １２、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＤＮＡまた
はＲＮＡの全部または部分を含んでなる、診断補助物。 １３、請求項１に記載のＤＮＡと相補的な ＤＮＡまたはＲＮＡの、全部または部分を含んでなる、
診断補助物。 １４、請求項１１に記載の抗体を、含んでなる、診断補
助物。 １５、体液、組織またはそれらから分離した核酸を、請
求項１２〜１４のいずれか１項に記載の診断補助物と接
触させることを含む、診断法。 １６、医薬物としての使用のための、胎盤−特異性タン
パク質１１。 １７、請求項７に記載の方法で調製した胎盤−特異性タ
ンパク質１１を含んでなる、医薬物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3843513.6 | 1988-12-23 | ||
| DE3843513A DE3843513A1 (de) | 1988-12-23 | 1988-12-23 | Fuer das plazentaprotein 11 (pp11) kodierende cdna, ihre isolierung und verwendung |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02222682A true JPH02222682A (ja) | 1990-09-05 |
Family
ID=6370030
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1334652A Pending JPH02222682A (ja) | 1988-12-23 | 1989-12-22 | 胎盤タンパク質１１をコードするｃＤＮＡ、その単離および使用 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0374909A3 (ja) |
| JP (1) | JPH02222682A (ja) |
| KR (1) | KR900009987A (ja) |
| AU (1) | AU628903B2 (ja) |
| CA (1) | CA2006535A1 (ja) |
| DE (1) | DE3843513A1 (ja) |
| DK (1) | DK661389A (ja) |
| PT (1) | PT92660A (ja) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2946458A1 (de) * | 1979-11-17 | 1981-06-11 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Neues protein pp(pfeil abwaerts)11(pfeil abwaerts) |
| JP2660514B2 (ja) * | 1987-02-20 | 1997-10-08 | 興和株式会社 | 抗血液凝固作用を有するポリペプチド |
-
1988
- 1988-12-23 DE DE3843513A patent/DE3843513A1/de not_active Withdrawn
-
1989
- 1989-12-21 KR KR1019890019093A patent/KR900009987A/ko not_active Withdrawn
- 1989-12-21 EP EP19890123617 patent/EP0374909A3/de not_active Withdrawn
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