JPH02242686A - アクロモバクタープロテアーゼｉ類遺伝子及びその遺伝子産物 - Google Patents
アクロモバクタープロテアーゼｉ類遺伝子及びその遺伝子産物Info
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- JPH02242686A JPH02242686A JP1059726A JP5972689A JPH02242686A JP H02242686 A JPH02242686 A JP H02242686A JP 1059726 A JP1059726 A JP 1059726A JP 5972689 A JP5972689 A JP 5972689A JP H02242686 A JPH02242686 A JP H02242686A
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- apis
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
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- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産ｊＪｌΔ利更蔓と訪
本発明はアクロモバク・′−プロテアーゼ■（＾ｃｈｒ
ｏｍｏｂａｃｔｏｒ ｐｒｅｔｅａｓａ １．以下ＡＰ
Ｉと１トドぶ）およびＡＰＩと同様の活性を有するＡＰ
Ｉ類をコードするＤＮＡをクローニングし、それを使用
してＡＰＩ類を遺伝子工学的手法を用いて効率よく生産
する方法に関する。
ｏｍｏｂａｃｔｏｒ ｐｒｅｔｅａｓａ １．以下ＡＰ
Ｉと１トドぶ）およびＡＰＩと同様の活性を有するＡＰ
Ｉ類をコードするＤＮＡをクローニングし、それを使用
してＡＰＩ類を遺伝子工学的手法を用いて効率よく生産
する方法に関する。
従動１胤
ＡＰＩはアクロモバクタ−リティカス（Ａｃｈｒ。
ｍｏｂａｃｔｏｒ １ｙｔｊ、ｃｕｓ）Ｍ２Ｏ３−Ｉ
Ｑから生産されるセリンプロテアーゼで、蛋白質および
ペプチドのリジン残基のカルボニル基側のペプチド結合
（−Ｌｙｓ−Ｘ−）を特異的に切断する酵素であり、リ
シルエンドペプチダーゼ（＋＜Ｃ３，４，Ｚｌ、５０）
とも呼ばれている。本酵素は■、ｙｓ−Ｐｒｏ結合を含
めた全ての［、ｙｓ−Ｘ結合を切断するので、蛋白質や
ペプチドの一次構造解析のための断片化やペプチドマツ
プの作成、−Ｌｙｓ−Ｘ−化合物の合成に極めて有用で
ある。
Ｑから生産されるセリンプロテアーゼで、蛋白質および
ペプチドのリジン残基のカルボニル基側のペプチド結合
（−Ｌｙｓ−Ｘ−）を特異的に切断する酵素であり、リ
シルエンドペプチダーゼ（＋＜Ｃ３，４，Ｚｌ、５０）
とも呼ばれている。本酵素は■、ｙｓ−Ｐｒｏ結合を含
めた全ての［、ｙｓ−Ｘ結合を切断するので、蛋白質や
ペプチドの一次構造解析のための断片化やペプチドマツ
プの作成、−Ｌｙｓ−Ｘ−化合物の合成に極めて有用で
ある。
一方、ある種の細胞が分泌する蛋白質、ポリペプチドの
単離精製は、その操作が煩雑でまた生産斌が少ないよう
な場合には、非常に難かしいのが常であり、この困難性
を解決するために、遺伝子工学的手法を用いることが最
近では行なわれることもある。
単離精製は、その操作が煩雑でまた生産斌が少ないよう
な場合には、非常に難かしいのが常であり、この困難性
を解決するために、遺伝子工学的手法を用いることが最
近では行なわれることもある。
が解決しようとする課題
上記のＡＰＩの取得はアクロモバクタ−リティカスから
の生産に頼っていたが、この天然の生産斌は非常に少な
く、大量に生産し得る方法の開発が望まれていた。そこ
でこの種のものを犬軟に生産し得る遺伝子工学的手法を
適用することが課題となっていた。
の生産に頼っていたが、この天然の生産斌は非常に少な
く、大量に生産し得る方法の開発が望まれていた。そこ
でこの種のものを犬軟に生産し得る遺伝子工学的手法を
適用することが課題となっていた。
課 を解決するための手段
本発明者等はＡＰＩの遺伝子工学的手法による生産を行
う方法を提供すへく研究を１１【ね、Ａ １．） １を
コードするＤＮＡのクローニング、およびこれを用いた
に遺伝子工学的手法によるＡｌ）Ｔの生産に成功したも
のである。
う方法を提供すへく研究を１１【ね、Ａ １．） １を
コードするＤＮＡのクローニング、およびこれを用いた
に遺伝子工学的手法によるＡｌ）Ｔの生産に成功したも
のである。
すなわち本発明は、（ｉ）ＡＰＩ類をコードするｒ）Ｎ
Ａを含有するＤＮＡ、（ｉｉ）該ＤＮＡを発現用ベクタ
ーに、ＡＰＩ類を発現させるように構築した組み換えＤ
ＮＡ、（ｕｉ）該組み換えＤＮＡを保持する形質転換体
、（〜）該形質転換体を培養し、培養物中にＡＰＩ類を
生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＡＰ
Ｉ類の製造法、および（ｖ ）Ａ Ｐ Ｉ Ｍ蛋白質に
関するものである。
Ａを含有するＤＮＡ、（ｉｉ）該ＤＮＡを発現用ベクタ
ーに、ＡＰＩ類を発現させるように構築した組み換えＤ
ＮＡ、（ｕｉ）該組み換えＤＮＡを保持する形質転換体
、（〜）該形質転換体を培養し、培養物中にＡＰＩ類を
生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＡＰ
Ｉ類の製造法、および（ｖ ）Ａ Ｐ Ｉ Ｍ蛋白質に
関するものである。
本発明者はＡＰＩをクローニングするに当って第１図に
示す１〜２４１４位のＤＮＡ配列のものを得たが、この
内、３８７〜２３４８位が蛋白質発現部位（プレプロ体
）、３８７〜４４９イ１”ｔ、 （若しくは３８７〜４
７０位）がシグナル配列、１００２〜１８０５位が成熟
蛋白質部位であり、この成熟蛋白質部位と同様の活性を
有するものとして１００２位〜２３４８位が広義の成熟
蛋白質部位と呼べるものである。そして今回の遺伝子工
学的手法によるＡＰＩ類の生産における発現系の構築に
当っては、３５４〜２４１４位の塩Ｊん配列を組み込ん
でいるが、この塩基配列に包含されるこれより短いもの
であっても、ＡＩ）１類を発現し得るものであれば用い
ることができる。
示す１〜２４１４位のＤＮＡ配列のものを得たが、この
内、３８７〜２３４８位が蛋白質発現部位（プレプロ体
）、３８７〜４４９イ１”ｔ、 （若しくは３８７〜４
７０位）がシグナル配列、１００２〜１８０５位が成熟
蛋白質部位であり、この成熟蛋白質部位と同様の活性を
有するものとして１００２位〜２３４８位が広義の成熟
蛋白質部位と呼べるものである。そして今回の遺伝子工
学的手法によるＡＰＩ類の生産における発現系の構築に
当っては、３５４〜２４１４位の塩Ｊん配列を組み込ん
でいるが、この塩基配列に包含されるこれより短いもの
であっても、ＡＩ）１類を発現し得るものであれば用い
ることができる。
このＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列を第１図に
併せて示しているが、このアミノ酸配列において、１〜
２６８位が成熟蛋白質部位、１〜２６９位ないし４４８
位が同様の活性を有する広義の成熟蛋白質部位の相当し
、また−２０５位から４４８位が蛋白質発現部位（プレ
プロ体）に相当するものである。
併せて示しているが、このアミノ酸配列において、１〜
２６８位が成熟蛋白質部位、１〜２６９位ないし４４８
位が同様の活性を有する広義の成熟蛋白質部位の相当し
、また−２０５位から４４８位が蛋白質発現部位（プレ
プロ体）に相当するものである。
本発明においては、このアミノ酸配列の１〜２６８位の
成熟蛋白質部位（ＡＰＩ）および該成熟蛋白質部位と同
様の活性を有する１〜２６９位ないし４４８位に相当す
る広義の成熟蛋白質部位を含めてＡＰＩ類と総称する。
成熟蛋白質部位（ＡＰＩ）および該成熟蛋白質部位と同
様の活性を有する１〜２６９位ないし４４８位に相当す
る広義の成熟蛋白質部位を含めてＡＰＩ類と総称する。
本発明におけるＡＰＩ類をコードする塩基配列を有する
ＤＮＡを含有する発現型ベクターは、例えば、（ｉ）Ａ
ＰＩ類産生産生細胞１ばアクロモバクタ−リティカス
Ｍ２Ｏ３−１からの全ゲノムＤＮＡを制限酵素で消化し
、（ｉｉ）該１） Ｎ Ａ断片をファージまたはプラス
ミドに組み込み、（ｉｉｉ ）得られた組み換えファー
ジまたはプラスミドで宿主を形質転換し、（ｉｖ ）得
られた形質転換体を培養後、形質転換体から適当な方法
、例えばＡＰＩ類の一部をコートするＤＮＡプローブと
のハイブリダイゼーションにより目的とするＤＮＡを含
有するファージあるいはプラスミドを単離し、（Ｖ）そ
の組み換えＤＮＡから目的とするクローン化ＤＮＡを切
り出し、（ｖｉ）該クローン化１） Ｎ Ａまたはその
一部を発現ベクター中のプロモーターの下流に連結する
。ことにより製造することができる。
ＤＮＡを含有する発現型ベクターは、例えば、（ｉ）Ａ
ＰＩ類産生産生細胞１ばアクロモバクタ−リティカス
Ｍ２Ｏ３−１からの全ゲノムＤＮＡを制限酵素で消化し
、（ｉｉ）該１） Ｎ Ａ断片をファージまたはプラス
ミドに組み込み、（ｉｉｉ ）得られた組み換えファー
ジまたはプラスミドで宿主を形質転換し、（ｉｖ ）得
られた形質転換体を培養後、形質転換体から適当な方法
、例えばＡＰＩ類の一部をコートするＤＮＡプローブと
のハイブリダイゼーションにより目的とするＤＮＡを含
有するファージあるいはプラスミドを単離し、（Ｖ）そ
の組み換えＤＮＡから目的とするクローン化ＤＮＡを切
り出し、（ｖｉ）該クローン化１） Ｎ Ａまたはその
一部を発現ベクター中のプロモーターの下流に連結する
。ことにより製造することができる。
Ａｒ１類をコードするＤＮＡについては、全合成あるい
は半合成によっても製造することができ。
は半合成によっても製造することができ。
この際、第１図に示したような配列に基いて合成するこ
とができる。
とができる。
ＡＦＩＩ類の全ゲノムＤＮＡの制限酵素による消化に当
っては、Ｅｃｏ Ｒ１，Ｓａｔ ｌ、ＢａｍＨＩ等
の制限酵素が用いられる。
っては、Ｅｃｏ Ｒ１，Ｓａｔ ｌ、ＢａｍＨＩ等
の制限酵素が用いられる。
消化されて得られたＤＮＡ断片を組み込むプラスミドと
しては、たとえば大ＩＩ菌由来のｐＡＣＹＣ１７’７．
ｐＡｃＹｃ’１８４．ｐＵｃ８．ｐＵＣ９、ｐ Ｂ Ｒ
３２２、ｐ Ｉ Ｎ ３ Ａ １ 、 ｐ Ｋ Ｋ ２
３３−２などが挙げられるが、その他のものであっても
、宿主内で複製増殖されるものであれば、いずれをも用
いることができる。またＤＮＡ断片を組み込むファージ
ベクターとしては、たとえばＭ１３ファージｍｐ９．Ｍ
１３ファージｍｐ８．λｇｔ１１．λＥ Ｍ Ｂ Ｌ
３ 、 ＣｈＢ ｒ ｏ ｎ ４などが挙げられるが、
その他のものであっても宿主内で増殖できるものであれ
ば用いることができる。
しては、たとえば大ＩＩ菌由来のｐＡＣＹＣ１７’７．
ｐＡｃＹｃ’１８４．ｐＵｃ８．ｐＵＣ９、ｐ Ｂ Ｒ
３２２、ｐ Ｉ Ｎ ３ Ａ １ 、 ｐ Ｋ Ｋ ２
３３−２などが挙げられるが、その他のものであっても
、宿主内で複製増殖されるものであれば、いずれをも用
いることができる。またＤＮＡ断片を組み込むファージ
ベクターとしては、たとえばＭ１３ファージｍｐ９．Ｍ
１３ファージｍｐ８．λｇｔ１１．λＥ Ｍ Ｂ Ｌ
３ 、 ＣｈＢ ｒ ｏ ｎ ４などが挙げられるが、
その他のものであっても宿主内で増殖できるものであれ
ば用いることができる。
ＤＮＡ断片を組み込んだプラスミドまたはファージベク
ターは適当な宿主たとえばエシェリキア（ｌＥｓｃｈｓ
ｒｉｃｈｉａ）［菌（大腸菌）、バチルス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ）属菌（枯草菌）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒ
ｅｐｔＯ膳ｙｃｅｓ）属菌（放線菌）、サツカロマイセ
ス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属菌（酵母菌）、お
よび動物細胞たるｌｌ１ｏｎｋｅｙ ＣＯＳ ｃｅｌｌ
などに導入する。
ターは適当な宿主たとえばエシェリキア（ｌＥｓｃｈｓ
ｒｉｃｈｉａ）［菌（大腸菌）、バチルス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ）属菌（枯草菌）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒ
ｅｐｔＯ膳ｙｃｅｓ）属菌（放線菌）、サツカロマイセ
ス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属菌（酵母菌）、お
よび動物細胞たるｌｌ１ｏｎｋｅｙ ＣＯＳ ｃｅｌｌ
などに導入する。
上記エシェリキア属菌の例としては、Ｅ、ｃ。
１ｉｔＪＴ４８１株、ＪＭ１０３株、ＪＭ８３株。
Ｊ Ｍ Ｌ ０９株、ＮＭ５２２株、ＭＶ１３０４株、
バチルス属菌の例としてはバチルスサティリス（１’１
ａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイ
セス属菌の例としてはストレプトマイセス コエリカラ
ー（Ｓｔｒｅｐｊｏａ＋ｙｃｅｓ ｃｏｅＮ、ｃｏｌｏ
ｒ）、サツカロマイセス属菌の例としてはサツカロマイ
セスセレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）などカ１挙もずられる。
バチルス属菌の例としてはバチルスサティリス（１’１
ａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイ
セス属菌の例としてはストレプトマイセス コエリカラ
ー（Ｓｔｒｅｐｊｏａ＋ｙｃｅｓ ｃｏｅＮ、ｃｏｌｏ
ｒ）、サツカロマイセス属菌の例としてはサツカロマイ
セスセレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）などカ１挙もずられる。
このようにして得られた形質転換体力１ら、目的とする
ＤＮＡを含有するファージあるｂ１１！プラスミドを単
離する方法としては、例え１ｆＡＰＩ類の一部をコード
するオリゴヌクレオチドをプローブとして用いたコロニ
ーノ１イブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼ
ーション等による／％イブリダイゼーションにより行わ
れる。
ＤＮＡを含有するファージあるｂ１１！プラスミドを単
離する方法としては、例え１ｆＡＰＩ類の一部をコード
するオリゴヌクレオチドをプローブとして用いたコロニ
ーノ１イブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼ
ーション等による／％イブリダイゼーションにより行わ
れる。
本発明のＡＰＩ類遺伝子のクローニングの概要は、第２
図のフローチャートに示され、（Ａ） ＡＰＩ類遺伝子
類似配列を有するＤＮＡ断片のクロニングとその塩基配
列の決定〔（１）→（２）〕（ＢｌＡＰＩ類遺伝子のク
ローニングとその塩基配列の決定（３）、（Ｃ）ＡＩ）
１類遺伝子５′領域のクローニングとその塩基配列の決
定〔（４）→（５）〕および（Ｄ）ＡＰＩ類全長全長遺
伝子築、といった経路をたどり、ＡＰＩ類遺伝子をコー
ドする正確な領域を決めたものである。
図のフローチャートに示され、（Ａ） ＡＰＩ類遺伝子
類似配列を有するＤＮＡ断片のクロニングとその塩基配
列の決定〔（１）→（２）〕（ＢｌＡＰＩ類遺伝子のク
ローニングとその塩基配列の決定（３）、（Ｃ）ＡＩ）
１類遺伝子５′領域のクローニングとその塩基配列の決
定〔（４）→（５）〕および（Ｄ）ＡＰＩ類全長全長遺
伝子築、といった経路をたどり、ＡＰＩ類遺伝子をコー
ドする正確な領域を決めたものである。
このようにしてクローン化されたＡＩ’１類をコードす
るＤＮＡの塩基配列を、適当な制限サイトがある場合は
それを利用して、ない場合はＤｎａｓｅ Ｉを用いた
欠除体（ｄｅｌｅｔｉｏｎ体）をｍ１ｌｌシＭ１３ファ
ージを用いたダイデオキシ法によるなどして、決定する
。このダイデオキシ法で決定したＤＮＡの塩基配列と、
その塩基配列から判明したアミノ酸配列を第１図に示す
。
るＤＮＡの塩基配列を、適当な制限サイトがある場合は
それを利用して、ない場合はＤｎａｓｅ Ｉを用いた
欠除体（ｄｅｌｅｔｉｏｎ体）をｍ１ｌｌシＭ１３ファ
ージを用いたダイデオキシ法によるなどして、決定する
。このダイデオキシ法で決定したＤＮＡの塩基配列と、
その塩基配列から判明したアミノ酸配列を第１図に示す
。
上記のようにしてクローン化されたＡｒ１類をコードす
るＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限
酵素で消化して使用することが出来る。
るＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限
酵素で消化して使用することが出来る。
クローン化されたＤＮＡから発現させたい領域を切り出
し、発現に適したビークル（ベクター）中のプロモータ
ーの下流に連結して発現型ベクターを得ることができる
。
し、発現に適したビークル（ベクター）中のプロモータ
ーの下流に連結して発現型ベクターを得ることができる
。
該ＤＮＡはその５′末端に翻訳開始コドンとしてのＡ
Ｔ Ｇを有し、また３′末端には翻訳終止コドンとして
のＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい、こ
れらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合）
Ｑ Ｄ Ｎ Ａアダプターを用いて付加することもでき
る。さらに該ＤＮＡを発現させるにはその上流にプロモ
ーターを接続する。
Ｔ Ｇを有し、また３′末端には翻訳終止コドンとして
のＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい、こ
れらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合）
Ｑ Ｄ Ｎ Ａアダプターを用いて付加することもでき
る。さらに該ＤＮＡを発現させるにはその上流にプロモ
ーターを接続する。
ベクターとしては、上記のエシェリキア属菌；１来のプ
ラスミド（例、ｐＡｃＹｃ１８４．ＰｔＪｃ９、ｐＫＫ
２３３−２．ｐＡｃＹｃ１７７、Ｔ）ＡＣＹＣ１８４，
ｐｔＪｃ８．ｐＢＲ３２２，ｐＩＮ３Ａ１）、バチルス
属菌由来のプラスミドｐ ＨＹ３００ＰＬＫ、サツカロ
マイセスＪｉｉ（菌由来のプラスミドｐ Ｂ Ｔ Ｉ
−１、ストレプトマイセス属菌のプラスミドＰＩＪ６１
．モンキーＣｏＳ細胞のプラスミドｐｓＶＬなどが挙げ
られる。
ラスミド（例、ｐＡｃＹｃ１８４．ＰｔＪｃ９、ｐＫＫ
２３３−２．ｐＡｃＹｃ１７７、Ｔ）ＡＣＹＣ１８４，
ｐｔＪｃ８．ｐＢＲ３２２，ｐＩＮ３Ａ１）、バチルス
属菌由来のプラスミドｐ ＨＹ３００ＰＬＫ、サツカロ
マイセスＪｉｉ（菌由来のプラスミドｐ Ｂ Ｔ Ｉ
−１、ストレプトマイセス属菌のプラスミドＰＩＪ６１
．モンキーＣｏＳ細胞のプラスミドｐｓＶＬなどが挙げ
られる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発
現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであれば
いかなるものでもよい。
現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであれば
いかなるものでもよい。
形質転換する際の宿主がエシェリキア属菌である場合は
ｌ ａ Ｑ ｐ ｔ ａ Ｑ ｔ ｊ ｔ’ Ｐ ＋
’ ｐＰ ＊ Ｐ ｈｏＳ等のプロモーター、バチルス
属菌の場合は５ＰＯ２，αアミラーゼ等のプロモーター
、サツカロマイセス属菌の場合はＰＡＣＤｌ（アルコー
ルデヒドロゲナーゼプロモーター）−Ｐｃｖ。１（チト
クロームＣプロモーター） 、 ｍｏｎｋｅｙ ＣＯＳ
細胞の場合はＳＶ４０アーリーおよびレイトプロモータ
ーなどが、その例として挙げられる。
ｌ ａ Ｑ ｐ ｔ ａ Ｑ ｔ ｊ ｔ’ Ｐ ＋
’ ｐＰ ＊ Ｐ ｈｏＳ等のプロモーター、バチルス
属菌の場合は５ＰＯ２，αアミラーゼ等のプロモーター
、サツカロマイセス属菌の場合はＰＡＣＤｌ（アルコー
ルデヒドロゲナーゼプロモーター）−Ｐｃｖ。１（チト
クロームＣプロモーター） 、 ｍｏｎｋｅｙ ＣＯＳ
細胞の場合はＳＶ４０アーリーおよびレイトプロモータ
ーなどが、その例として挙げられる。
このようにして構築されたＡＰｔをコードするＤＮＡを
含有するベクターを用いて、形質転換体を製造する。
含有するベクターを用いて、形質転換体を製造する。
宿主としては、たとえばエシェリキア属菌、バチルス属
菌、ストレプトマイセス属菌、サツカロマイセス属菌、
ｍｏｎｋｅｙ ＣＯＳ 細胞などが挙げられる。
菌、ストレプトマイセス属菌、サツカロマイセス属菌、
ｍｏｎｋｅｙ ＣＯＳ 細胞などが挙げられる。
上記エシェリキア属菌、バチルス属菌、ストレプトマイ
セス属菌、サツカロマイセス属菌、 ｍｏｎｋｅｙｃＯ
３細胞の具体例としては、前記したものと同様のものが
挙げられる。
セス属菌、サツカロマイセス属菌、 ｍｏｎｋｅｙｃＯ
３細胞の具体例としては、前記したものと同様のものが
挙げられる。
このようにして、ＡＰＩ類をコードするＤＮＡを含有す
る発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる
。
る発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる
。
本発明において形質転換体を培養する際、培養に使用さ
れる培地としては５通常のものでよいが。
れる培地としては５通常のものでよいが。
ＬＢ培地、Ｍ９培地、Ｔ培地などが挙げられる。
培地のｐＨは約６〜９、好ましくは７前後である。
培養時間、温度、培養方法等は適宜選択できるが、振盪
培養、培養温度２５℃前後、好ましくは２５℃より若干
低めがよく、特に好ましい組合せとしては、２５℃、２
４時間、ＩＰＴＯ１ｍＭを含むＬＢ培地（ｐＩＩ７．２
）での揚機培養が挙げられる。
培養、培養温度２５℃前後、好ましくは２５℃より若干
低めがよく、特に好ましい組合せとしては、２５℃、２
４時間、ＩＰＴＯ１ｍＭを含むＬＢ培地（ｐＩＩ７．２
）での揚機培養が挙げられる。
上記培養物からＡＰＩ類を分離精製するには、例えば下
記の方法により行なうことができる。
記の方法により行なうことができる。
ＡＰＩ類を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際して
は、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、こ
れを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、オスモティック
ショック、リゾチームおよび／または凍結融解などによ
って菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過
によりＡＰＩの前駆体たんばくや成熟ペプチドの粗抽出
液を得る方法などが適宜用い得る。緩衝液の中に尿素や
塩酸グアニジンなどのたんばく変性剤や、トリトンＸ−
１００などの界面活性剤が含まれていてもよい。
は、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、こ
れを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、オスモティック
ショック、リゾチームおよび／または凍結融解などによ
って菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過
によりＡＰＩの前駆体たんばくや成熟ペプチドの粗抽出
液を得る方法などが適宜用い得る。緩衝液の中に尿素や
塩酸グアニジンなどのたんばく変性剤や、トリトンＸ−
１００などの界面活性剤が含まれていてもよい。
培養液中に前駆体たんばくや成熟ペプチドが分泌される
場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体ある
いは細胞と上清とを分離し、上γｎを集める。このよう
にして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる
前駆体たんばくや成熟ペプチドは、自体公知の分離・精
製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これら
の公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法など
の溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ
過法、および５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交
換クロマ１〜グラフイーなどの荷電の差を利用する方法
、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和
性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーな
どの疎水性の差を利用する方法１等電点電気泳動法など
の等重点の差を利用する方法などが挙げられる。
場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体ある
いは細胞と上清とを分離し、上γｎを集める。このよう
にして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる
前駆体たんばくや成熟ペプチドは、自体公知の分離・精
製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これら
の公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法など
の溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ
過法、および５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交
換クロマ１〜グラフイーなどの荷電の差を利用する方法
、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和
性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーな
どの疎水性の差を利用する方法１等電点電気泳動法など
の等重点の差を利用する方法などが挙げられる。
作用・効果
本発明のＤＮＡでＤＮＡ感染または形質転換した菌体や
細胞では、人足のＡＰＩ前翻体たんばくや成熟たんばく
を大足に生産、精製することができる。
細胞では、人足のＡＰＩ前翻体たんばくや成熟たんばく
を大足に生産、精製することができる。
ＡＰＩ類は先に述べたように、蛋白質およびペプチドの
りジン残基のカルボニル基側のペプチド結合（−Ｌｙｓ
−Ｘ−）を特異的に切断する酵素であり、Ｌｙｓ−Ｐｒ
ｏ結合を含めた全てのＬｙｓ−Ｘ結合を切断するので、
蛋白質やペプチドの一次構造解析のための断片化やペプ
チドマツプの作成、−Ｌｙｓ−Ｘ−化合物の合成に極め
て有用である。
りジン残基のカルボニル基側のペプチド結合（−Ｌｙｓ
−Ｘ−）を特異的に切断する酵素であり、Ｌｙｓ−Ｐｒ
ｏ結合を含めた全てのＬｙｓ−Ｘ結合を切断するので、
蛋白質やペプチドの一次構造解析のための断片化やペプ
チドマツプの作成、−Ｌｙｓ−Ｘ−化合物の合成に極め
て有用である。
本発明明細書および図面において、塩基やアミノ酸など
を略号で表示する場合、ＩＵｌ）ＡＣ−ＩＵ Ｂ Ｃｏ
ｍｍ１ｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ、１ｃａｌ Ｎ
ｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野に
おける慣用略号に基づくものであり、その例を下記する
。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特
に明示しなければＬ一体を示すものとする。
を略号で表示する場合、ＩＵｌ）ＡＣ−ＩＵ Ｂ Ｃｏ
ｍｍ１ｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ、１ｃａｌ Ｎ
ｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野に
おける慣用略号に基づくものであり、その例を下記する
。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特
に明示しなければＬ一体を示すものとする。
ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ ：アデニン
Ｔ ：チミン
Ｇ ニゲアニン
Ｃ：シトシン
ＲＮＡ ：リボ核酸
ｍＲＮＡ：メツセンジャーリポ核酸
ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸ｄＴＴＰ：デオ
キシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸ｄＣＴＰ：デオ
キシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ａｔｙまたはＧ ニゲリシン ＡｌａまたはＡ ：アラニン ＶａｌまたはＶ ：バリン ＬｅｕまたはＬ ：ロイシン １１ｅまたはＩ ：イソロイシン ＳｅｒまたはＳ ：セリン ＴｈｒまたはＴ ：スレオニン ＣｙｓまたはＣニジスティン ＭｅｔまたはＭ ：メチオニン ＧｌｕまたはＥ ：グルタミン醸 Ａ ｓ ｐまたはＤ ＝アスパラギン酸ＬｙｓまたはＫ
：リジン Ａ ｒ ｇまたはＲ：アルギニン Ｈｉ ｓまたはトＩ ：ヒスチジン ＰｈｅまたはＦ ：フェニールアラニンＴｙｒまたはＹ
：チロシン ＴｒρまたはＷ ニトリブトファン ＰｒｏまたはＰ ニブロリン ＡｓｎまたはＮ ：アスパラギン ＧｌｎまたはＱ ：グルタミン なお１本発明のＡＰＩ類においては、同様の活性がある
限り、そのアミノ酸配列の一部が修飾（付加、除去、そ
の他のアミノ酸への置換など）されていてもよい。
キシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸ｄＣＴＰ：デオ
キシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ａｔｙまたはＧ ニゲリシン ＡｌａまたはＡ ：アラニン ＶａｌまたはＶ ：バリン ＬｅｕまたはＬ ：ロイシン １１ｅまたはＩ ：イソロイシン ＳｅｒまたはＳ ：セリン ＴｈｒまたはＴ ：スレオニン ＣｙｓまたはＣニジスティン ＭｅｔまたはＭ ：メチオニン ＧｌｕまたはＥ ：グルタミン醸 Ａ ｓ ｐまたはＤ ＝アスパラギン酸ＬｙｓまたはＫ
：リジン Ａ ｒ ｇまたはＲ：アルギニン Ｈｉ ｓまたはトＩ ：ヒスチジン ＰｈｅまたはＦ ：フェニールアラニンＴｙｒまたはＹ
：チロシン ＴｒρまたはＷ ニトリブトファン ＰｒｏまたはＰ ニブロリン ＡｓｎまたはＮ ：アスパラギン ＧｌｎまたはＱ ：グルタミン なお１本発明のＡＰＩ類においては、同様の活性がある
限り、そのアミノ酸配列の一部が修飾（付加、除去、そ
の他のアミノ酸への置換など）されていてもよい。
衷展−例一
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが１
本発明はこれらに限定されるものではない。
本発明はこれらに限定されるものではない。
以下の実施例において、用いられた材料、操作は以下の
通りである。
通りである。
（ｉ）制限酵素、修飾酵素及び塩基配列決定キットは宝
酒造製品を、ＤＮａｓｅｌはシグマ製品、ＤＮＡポリメ
ラーゼ１はニューイングランドバイオラボ製品、ニトロ
セルロース１漠はシュライヒャーアンドシュール（Ｓｃ
ｈｌｅｉｃｈａｒ ＆ ５ｃｈｕｅｌｌ）社ＢＡ８５を
３ＮＰ放射性ヌクレオチドはアマーシャムレディオケミ
カルズ製のものを夫々使用した。
酒造製品を、ＤＮａｓｅｌはシグマ製品、ＤＮＡポリメ
ラーゼ１はニューイングランドバイオラボ製品、ニトロ
セルロース１漠はシュライヒャーアンドシュール（Ｓｃ
ｈｌｅｉｃｈａｒ ＆ ５ｃｈｕｅｌｌ）社ＢＡ８５を
３ＮＰ放射性ヌクレオチドはアマーシャムレディオケミ
カルズ製のものを夫々使用した。
（ｊｉ）発現の際、用いたＮｃｏ Ｉリンカ−とｐＫ
Ｋ ２３３−２ベクターはピーエルバイオケミカルズ（
Ｐ、Ｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）社製品を用いた。
Ｋ ２３３−２ベクターはピーエルバイオケミカルズ（
Ｐ、Ｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）社製品を用いた。
又、本実験で用いた大腸菌株のゲッタイブは次に示され
る。
る。
ＵＴ４８１１（通Δ（ｂ駈、釘り肋Ｕ爪胛ｌ」二！／Ｆ
’ ｔｒａＤ３６ 肛１俳肋ｌｈＺΔｌ’ｌ１５ＪＭ１
０３Δ（ｌｏｃ、 艶り ｔｈｉ ５ｔｒＡ ｓ町哩５
ｎｄＡ ｓｂｃ旧５ｈｓｄＲ４／ Ｆ’ ｔｒａＤ：３
６ ｐｒｏ、別１咳」４Δ旧５（ｉｉｉ）ラベリングに
ついては、１５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチド混合物を
１００μＣ１の〔γ−Ｊ２Ｐ）Ａ’ｌ’Ｐ （＞５００
０Ｃｉ／ｍｍｏ ｌ）で１゛。
’ ｔｒａＤ３６ 肛１俳肋ｌｈＺΔｌ’ｌ１５ＪＭ１
０３Δ（ｌｏｃ、 艶り ｔｈｉ ５ｔｒＡ ｓ町哩５
ｎｄＡ ｓｂｃ旧５ｈｓｄＲ４／ Ｆ’ ｔｒａＤ：３
６ ｐｒｏ、別１咳」４Δ旧５（ｉｉｉ）ラベリングに
ついては、１５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチド混合物を
１００μＣ１の〔γ−Ｊ２Ｐ）Ａ’ｌ’Ｐ （＞５００
０Ｃｉ／ｍｍｏ ｌ）で１゛。
ポリヌクレオチドキナーゼを用いてラベルした。
０．５〜１μｇのＤＮＡ断片は５０μＣｉの〔αｊ２Ｐ
）ｄＣＴＰ （＞３０００Ｃｉ／ｍｍｏ ｌ）でニック
トランスレーションによりラベルされた。
）ｄＣＴＰ （＞３０００Ｃｉ／ｍｍｏ ｌ）でニック
トランスレーションによりラベルされた。
（ｉｖ）ハイブリダイゼーション
コロニーハイブリダイゼーション、ブラークツ１イブリ
ダイゼーシヨン、サザンハイプリダイゼーションにおい
て、その過程でニトロセルロース膜に移されたＤＮＡと
プローブとのハイブリダイゼーションは次のようにして
行オ〕れた。
ダイゼーシヨン、サザンハイプリダイゼーションにおい
て、その過程でニトロセルロース膜に移されたＤＮＡと
プローブとのハイブリダイゼーションは次のようにして
行オ〕れた。
本オリゴヌクレオチドを用いた場合
５ｘデンハルツ溶液（Ｄｅｎｈａｒｔ’ｓ ５ｏｌｕｔ
ｉｏｎ）、 ０ 。
ｉｏｎ）、 ０ 。
１％ＳＤＳ、１０％ソジウムデキストランスルフェート
、１９．８ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ ｐＨ８，０，
６，□ｍＭ ＥＤＴＡ、０．９Ｍ ＮａＣ〕Ωを含む溶
液中で４２℃で１時間膜を保った後、同じ溶液中へ標識
プローブを加え、室温下に２４時間保った。膜は６ＸＳ
ＳＣで室温下に１３回、３０分間洗浄し、その後４０℃
で５分間洗浄し、増感紙の存在下−８０℃で２４時間オ
ー１〜ラジオグラフイーを行なった。
、１９．８ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ ｐＨ８，０，
６，□ｍＭ ＥＤＴＡ、０．９Ｍ ＮａＣ〕Ωを含む溶
液中で４２℃で１時間膜を保った後、同じ溶液中へ標識
プローブを加え、室温下に２４時間保った。膜は６ＸＳ
ＳＣで室温下に１３回、３０分間洗浄し、その後４０℃
で５分間洗浄し、増感紙の存在下−８０℃で２４時間オ
ー１〜ラジオグラフイーを行なった。
本ニックトランスレーションで標識されたＤＮＡ断片を
用いた場合 ５ＸＳＳＣ，５０％ホルムアミド、５ｘデンハルツ溶液
、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６，５，１■
／ ｍ Ｑ超音波処理したサケ精子ＤＮＡを含む溶液中
で４２℃で２時間保った後、５ＸＳＳＣ，５０％ホルム
アミド、１ｘデンハルツ溶液、１０％ソジウムデキスト
ランスルフエート。
用いた場合 ５ＸＳＳＣ，５０％ホルムアミド、５ｘデンハルツ溶液
、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６，５，１■
／ ｍ Ｑ超音波処理したサケ精子ＤＮＡを含む溶液中
で４２℃で２時間保った後、５ＸＳＳＣ，５０％ホルム
アミド、１ｘデンハルツ溶液、１０％ソジウムデキスト
ランスルフエート。
２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、１■／ ｍ Ｑ超音
波処理したサケ精子ＤＮＡを含む溶液中へ膜を移し、標
識プローブを加え、４２℃で２４時間保った。膜は２Ｘ
ＳＳＣ，０，１％ＳＤＳの溶液で室温下に３回３０分間
洗い１次に○、ｔｘｓｓｃ。
波処理したサケ精子ＤＮＡを含む溶液中へ膜を移し、標
識プローブを加え、４２℃で２４時間保った。膜は２Ｘ
ＳＳＣ，０，１％ＳＤＳの溶液で室温下に３回３０分間
洗い１次に○、ｔｘｓｓｃ。
０．１％ＳＤＳの溶液で５５℃で３回３０分間洗浄した
。オートラジオグラフィーは上と同様に行なった。
。オートラジオグラフィーは上と同様に行なった。
（Ｖ）スクリーニングについては次のように行なう。
本全ゲノムＤＮＡを用いた場合
クロモゾーマルＤＮＡ２５０μｇを制限酵素で消化した
後、プラスミドへ挿入しこれによる形質転換体をライブ
ラリーとし、コロニーハイブリダイゼーションを行なっ
た。
後、プラスミドへ挿入しこれによる形質転換体をライブ
ラリーとし、コロニーハイブリダイゼーションを行なっ
た。
本ＤＮＡ断片からのサブクローニングの場合ＤＮＡ断片
２０μｇを制限酵素で消化した後。
２０μｇを制限酵素で消化した後。
プラスミド又はファージＤＮＡに挿入し、これによる形
質転換体をライブラリーとし、コロニーハイブリダイゼ
ーション、あるいはプラークハイブリダイゼーションを
行なった。
質転換体をライブラリーとし、コロニーハイブリダイゼ
ーション、あるいはプラークハイブリダイゼーションを
行なった。
木サイズ選択ＤＮＡの場合
クロモゾーマルＤＮＡ２５０μｇを制限ｔＳｌｉで消化
した後、０．８％アガロースゲル電気泳動を行ない、こ
れに対しサザンハイプリダイゼーションを行いポジティ
ブなバンドに相当する領域を同様に泳動したゲルより切
り出し、それよりＤＮＡ断片を溶出する。溶出したＤＮ
Ａをプラスミドに挿入し、これによって得られた形質転
換体をライブラリーとし、コロニーハイブリダイゼーシ
ョンを行なった。
した後、０．８％アガロースゲル電気泳動を行ない、こ
れに対しサザンハイプリダイゼーションを行いポジティ
ブなバンドに相当する領域を同様に泳動したゲルより切
り出し、それよりＤＮＡ断片を溶出する。溶出したＤＮ
Ａをプラスミドに挿入し、これによって得られた形質転
換体をライブラリーとし、コロニーハイブリダイゼーシ
ョンを行なった。
（ｖｉ ） Ｄ Ｎ Ａ塩基配列決定
クローニングされたＤＮＡ断片は適当な制限サイトのあ
る場合はそれを利用して、ない場合は１〕Ｎａ５ｓ［を
用いた欠除体をｔＡ製しＭＬ３ファージを用いたダイデ
オキシ法により決定した。
る場合はそれを利用して、ない場合は１〕Ｎａ５ｓ［を
用いた欠除体をｔＡ製しＭＬ３ファージを用いたダイデ
オキシ法により決定した。
以上、遺伝子操作方法に関してはマニアティス。
ティー（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ）等、モレキュラー ク
ローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）ニ
ア ラボラトリ−マニュアル、コールドスプリングハー
バ−ラボラトリ−、ＮＹに準じて行なった。
ローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）ニ
ア ラボラトリ−マニュアル、コールドスプリングハー
バ−ラボラトリ−、ＮＹに準じて行なった。
実施例１（第２図参照）
（１）ＡＰＩ類似遺伝子８Ｋｂｐ ＥｃｏＲＩ断片の
クローニング アクロモバクタ−リティカス Ｍ４９７−１菌のゲノム
ＤＮＡ２５０μｇをＥｃｏ Ｒ１で消化し、ｐＡｃＹ
ｃ１８４へ挿入し、これにより得られた形質転換体約６
、０００個に対し、下記のオリゴヌクレオチドをプロ
ーブとして、コロニーハイブリダイゼーションによりス
クリーニングした。該プローブはＡＰＩ蛋白質の一次構
造（成熟蛋白な′ｌの７１〜７７位配列をコード）に基
いて合成された次の２１マー をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて５′末端をラ
ベルして得た、Ａ Ｉ：’ Ｉ遺伝子に特異的なプロー
ブである。室温洗浄後オートラジオグラフィーにかけ、
約６００クローンをレプリカ、コロニーハイブリダイゼ
ーションを行った後、４２℃洗浄、オートラジオグラム
上で１個のポジティブクローンが得られ、８Ｋｂｐの断
片が挿入されて４％だ（ｐＡｓ８００）、該約８Ｋｂ
ｐのＥｃｏＲＩ断片の回収を行った。
クローニング アクロモバクタ−リティカス Ｍ４９７−１菌のゲノム
ＤＮＡ２５０μｇをＥｃｏ Ｒ１で消化し、ｐＡｃＹ
ｃ１８４へ挿入し、これにより得られた形質転換体約６
、０００個に対し、下記のオリゴヌクレオチドをプロ
ーブとして、コロニーハイブリダイゼーションによりス
クリーニングした。該プローブはＡＰＩ蛋白質の一次構
造（成熟蛋白な′ｌの７１〜７７位配列をコード）に基
いて合成された次の２１マー をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて５′末端をラ
ベルして得た、Ａ Ｉ：’ Ｉ遺伝子に特異的なプロー
ブである。室温洗浄後オートラジオグラフィーにかけ、
約６００クローンをレプリカ、コロニーハイブリダイゼ
ーションを行った後、４２℃洗浄、オートラジオグラム
上で１個のポジティブクローンが得られ、８Ｋｂｐの断
片が挿入されて４％だ（ｐＡｓ８００）、該約８Ｋｂ
ｐのＥｃｏＲＩ断片の回収を行った。
（２）８Ｋｂｐ ＥｃｏＲＩ断片からの４００ｂｐｓ
ａｕ３Ａｌのサブクローニングと塩Ｊｋ配列決定 ８Ｋｂｐ ＥＯｏ Ｒ１断片をＳ ａｕ ３ Ａ
Ｉで消化しＭＬ３ファージｍ ｐ ９へ挿入し、これを
ハ１６ｔで得られた形質転換プラーク約１０００個に対
し、上記のオリゴヌクレオチドをプローブとして、プラ
ークハイブリダイゼーションによりスクリーニングした
。１２℃で洗浄後のオートラジオグラフィーの結果、ポ
ジティブとなった１３クローンレ３ついてダイデオキシ
法により塩ＪＩＩＧ配列決定を行ない、アミノ酸配列へ
の変換番こより、アミノ酸レベルで約７０％のホモロジ
ーを持つＤＮＡ断片であることが明らかとなった。その
後、この断片１まｍｐ９からＥ ｃ ｏ ＲＩ ／ Ｈ
ｉ ｎ ｄ ｍ消化しこより切１ノ出されｐＵＣ９へ移
された（ｐＡＰｓ４００）。
ａｕ３Ａｌのサブクローニングと塩Ｊｋ配列決定 ８Ｋｂｐ ＥＯｏ Ｒ１断片をＳ ａｕ ３ Ａ
Ｉで消化しＭＬ３ファージｍ ｐ ９へ挿入し、これを
ハ１６ｔで得られた形質転換プラーク約１０００個に対
し、上記のオリゴヌクレオチドをプローブとして、プラ
ークハイブリダイゼーションによりスクリーニングした
。１２℃で洗浄後のオートラジオグラフィーの結果、ポ
ジティブとなった１３クローンレ３ついてダイデオキシ
法により塩ＪＩＩＧ配列決定を行ない、アミノ酸配列へ
の変換番こより、アミノ酸レベルで約７０％のホモロジ
ーを持つＤＮＡ断片であることが明らかとなった。その
後、この断片１まｍｐ９からＥ ｃ ｏ ＲＩ ／ Ｈ
ｉ ｎ ｄ ｍ消化しこより切１ノ出されｐＵＣ９へ移
された（ｐＡＰｓ４００）。
（３）ＡＰＩ遺伝子２．５Ｋｂｐ Ｓａ ］、Ｉ断片
のクローニング （２）で得られたｐＡＰｓ４００をＥｃｏＲ１／Ｐｓｔ
ｌ消化して得られた約４００ｂＰ断片の１μｇを（”Ｐ
）ｄＣＴＰを用いたニックトランスレーションによりラ
ベルしてプローブを調製し、全ゲノムＤＮＡ２５０μｇ
のＳａｌ、ｌ消化物に対し、サザンハイプリダイゼーシ
ョンを行なった。
のクローニング （２）で得られたｐＡＰｓ４００をＥｃｏＲ１／Ｐｓｔ
ｌ消化して得られた約４００ｂＰ断片の１μｇを（”Ｐ
）ｄＣＴＰを用いたニックトランスレーションによりラ
ベルしてプローブを調製し、全ゲノムＤＮＡ２５０μｇ
のＳａｌ、ｌ消化物に対し、サザンハイプリダイゼーシ
ョンを行なった。
オートラジオグラム上に２本のバンドが得られたが、＋
５＋ｊｌイバンドは先にクローニングした類似配列ＤＮ
Ａと考えられるため、２．５Ｋｂｐのうすいバンドに相
当する領域を同様に泳動したゲルより切り出し、ＤＮＡ
断片を回収した。これをｐＵＣ９に挿入し、これによっ
て生じた形質転換体約２０００個をライブラリーとして
、４００ｂｐのＩ〕ＮＡ断片を用いてコロニーハイブリ
ダイゼーションによりスクリーニングを行なった。これ
より約１２個の陽性クローンを得、それぞれのコロニー
よりプラスミドを調製、５ａｌｔ消化し目的の約２．５
Ｋｂｐ断片であることを１１ｉ度同−プローブのサザン
ハイプリダイゼーションで確認した（ｐＡｌ）Ｃ２５０
）、この２．５Ｋｂｐ断片は５ａｌＩで切り出し回収し
た後、Ｍ１３ファージｍｐ９Ｓａｌｔサイトへ挿入した
。このファージ感染体より両方向に挿入されたクローン
をとり、両クローンに対してＤＮａｓｅｌにより欠除体
（ｄ ａ ｌ ｅ ｔ ｉｏｎ体）を作製し、両方向か
らのダイデオキシ法による塩基配列決定を行なった。
５＋ｊｌイバンドは先にクローニングした類似配列ＤＮ
Ａと考えられるため、２．５Ｋｂｐのうすいバンドに相
当する領域を同様に泳動したゲルより切り出し、ＤＮＡ
断片を回収した。これをｐＵＣ９に挿入し、これによっ
て生じた形質転換体約２０００個をライブラリーとして
、４００ｂｐのＩ〕ＮＡ断片を用いてコロニーハイブリ
ダイゼーションによりスクリーニングを行なった。これ
より約１２個の陽性クローンを得、それぞれのコロニー
よりプラスミドを調製、５ａｌｔ消化し目的の約２．５
Ｋｂｐ断片であることを１１ｉ度同−プローブのサザン
ハイプリダイゼーションで確認した（ｐＡｌ）Ｃ２５０
）、この２．５Ｋｂｐ断片は５ａｌＩで切り出し回収し
た後、Ｍ１３ファージｍｐ９Ｓａｌｔサイトへ挿入した
。このファージ感染体より両方向に挿入されたクローン
をとり、両クローンに対してＤＮａｓｅｌにより欠除体
（ｄ ａ ｌ ｅ ｔ ｉｏｎ体）を作製し、両方向か
らのダイデオキシ法による塩基配列決定を行なった。
これより、この断片上にＡＰＩ成熟蛋白質をコードする
領域がすべて含まれていることが確認されたが、ＡＰＩ
が分泌蛋白質であるにもかかわらず、シグナル配列を見
出せないこと１．いくつかあるＭｅｔの前にＳＤ配列が
見出せないことより。
領域がすべて含まれていることが確認されたが、ＡＰＩ
が分泌蛋白質であるにもかかわらず、シグナル配列を見
出せないこと１．いくつかあるＭｅｔの前にＳＤ配列が
見出せないことより。
枠内（Ｌｎ ｆｒａｍａ）の可能性が考えられた。
グ
完全なＡＰＩ遺伝子をクローニングする目的で、アクロ
モバクタ−リティカスＭ４９７−１ｉのゲノムＤＮＡが
ＢａｍＨＩで消化され、サザンハイプリダイゼーシゴン
が行なわれた。プローブとして（３）で得られたＰＡＰ
Ｃ２５０の５ａｌＩ消化断片である２、５Ｋｂｐ断片が
〔α３２ｐ）ｄＣＴＰを用いたニックトランスレーショ
ンによりラベルされ使用された。
モバクタ−リティカスＭ４９７−１ｉのゲノムＤＮＡが
ＢａｍＨＩで消化され、サザンハイプリダイゼーシゴン
が行なわれた。プローブとして（３）で得られたＰＡＰ
Ｃ２５０の５ａｌＩ消化断片である２、５Ｋｂｐ断片が
〔α３２ｐ）ｄＣＴＰを用いたニックトランスレーショ
ンによりラベルされ使用された。
オートラジオグラム上で検出されるｌ ５Ｋｂ ｐに相
当する領域を同様に泳動したゲルより切り出し、ＤＮＡ
断片を回収した。これらの断片はＰＡＣＹ Ｃ１８４に
挿入され、約１０００個の形質転換体をライブラリーと
して同じプローブを用いコロニーハイブリダイゼーショ
ンを行なった結果、１個の陽性クローンが得られた（ｐ
ＡＩ’Ｗ１５０）、これよりプラスミドを調製、Ｂａｍ
ＨＩ消化し、目的の約１５Ｋｂｐの断片であることを同
一プローブのサザンハイプリダイゼーションで確認、１
５Ｋｂｐ断片が回収された。
当する領域を同様に泳動したゲルより切り出し、ＤＮＡ
断片を回収した。これらの断片はＰＡＣＹ Ｃ１８４に
挿入され、約１０００個の形質転換体をライブラリーと
して同じプローブを用いコロニーハイブリダイゼーショ
ンを行なった結果、１個の陽性クローンが得られた（ｐ
ＡＩ’Ｗ１５０）、これよりプラスミドを調製、Ｂａｍ
ＨＩ消化し、目的の約１５Ｋｂｐの断片であることを同
一プローブのサザンハイプリダイゼーションで確認、１
５Ｋｂｐ断片が回収された。
（５）１５Ｋｂｐ ＢａｍＨＩ断片からの６００ｂｐ
ＥｃｏＲＩ断片のサブクローニング（３）で得られ
た２、５Ｋｂｐ ５ａｉｌ断片に続く領域を持つＤＮ
Ａ断片を得るために、２゜５Ｋｂｐ断片よりプローブと
するＤＮＡ断片が調製された。配列分析の結果、２．５
Ｋｂｒ＋断片中には１ケ所だけＥｃｏＲＩのサイトが確
認されていたので、ｐＡＰｃ２５０を５ａｌｅ／Ｅｃ。
ＥｃｏＲＩ断片のサブクローニング（３）で得られ
た２、５Ｋｂｐ ５ａｉｌ断片に続く領域を持つＤＮ
Ａ断片を得るために、２゜５Ｋｂｐ断片よりプローブと
するＤＮＡ断片が調製された。配列分析の結果、２．５
Ｋｂｒ＋断片中には１ケ所だけＥｃｏＲＩのサイトが確
認されていたので、ｐＡＰｃ２５０を５ａｌｅ／Ｅｃ。
Ｒ１で消化し、得られる２断片のうち蛋白質Ｎ末端側に
わたる１００ｂｐ ＥｃｏＲ［／５ａｌｌ断片を回収
した８次いで、この断片の５″末端リン酸基をバクチリ
アルアルカリンホスファターゼ（Ｂａｃｔａｒｉａｌ
Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）で除去し
、これを〔γ−３″Ｐ）ＡＴＰでオリゴヌクレオチドと
同様にラベルしてプローブとした。
わたる１００ｂｐ ＥｃｏＲ［／５ａｌｌ断片を回収
した８次いで、この断片の５″末端リン酸基をバクチリ
アルアルカリンホスファターゼ（Ｂａｃｔａｒｉａｌ
Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）で除去し
、これを〔γ−３″Ｐ）ＡＴＰでオリゴヌクレオチドと
同様にラベルしてプローブとした。
１５Ｋｂｐ ＢａｍＨＩ断片２０μｇはＥｃ。
Ｒｆで消化されサザンハイプリダイゼーションが行なわ
れた。この時０．ｌＸ５ｓｃ、ｏ、１％ＳＤＳ溶液での
洗浄は５０℃で行なった。
れた。この時０．ｌＸ５ｓｃ、ｏ、１％ＳＤＳ溶液での
洗浄は５０℃で行なった。
オートラジオグラム上で約６００ｂｐの位置にバンドが
出現したので、１５Ｋｂ Ｐ断片のＥｃ。
出現したので、１５Ｋｂ Ｐ断片のＥｃ。
Ｒ１消化物の６％ポリアクリルアミド電気泳動を行なっ
たゲルより、これに相当するバンドを切り出し溶出し、
Ｍ１３ファージｍｐ９へ挿入した。
たゲルより、これに相当するバンドを切り出し溶出し、
Ｍ１３ファージｍｐ９へ挿入した。
両方向挿入クローンをとり、塩基配列の決定を行った。
この結果、プローブとしたＥｃｏＲ［−８ａｉｌ断片
１００ｂｐの配列も確認された。後に、この６００ｂｐ
ＥｃｏＲＩ断片はｐｔＪｃ９へ移された（ｐＡＰＮ
６００）。
１００ｂｐの配列も確認された。後に、この６００ｂｐ
ＥｃｏＲＩ断片はｐｔＪｃ９へ移された（ｐＡＰＮ
６００）。
実施例２（第３図）
Ｄ ＡＰＩ全 伝 の構築
（６）ＡＰＩ全遺伝子を有するプラスミドの構築ＡＰＩ
全遺伝子を持つプラスミドの製造は第３図の如く行なわ
れた。
全遺伝子を持つプラスミドの製造は第３図の如く行なわ
れた。
■ｐＡＰｃ２５０をＥｃｃｉＲＩで切断し、プラスミド
上のＥｃｏＲＩサイトと挿入ＤＮＡ断片中のＥｃｏ
Ｒ１サイトの間にはさまれた部分を取り去り、５′末端
リン酸基をバクチリアルアルカリンホスファターゼによ
り除去した。
上のＥｃｏＲＩサイトと挿入ＤＮＡ断片中のＥｃｏ
Ｒ１サイトの間にはさまれた部分を取り去り、５′末端
リン酸基をバクチリアルアルカリンホスファターゼによ
り除去した。
■ｐＡＰＮ６００をＥｃｏ Ｒ１で切断し、プラスミ
ドよりＥｃｏＲ１挿入断片を分離、回収した。
ドよりＥｃｏＲ１挿入断片を分離、回収した。
■と■を連結し、ＡＰＩ全領域を持つプラスミドが構築
された。なお、ＥｃｏＲＩ断片の挿入方向はプラスミド
上にあるＰｖｕ■制限サイトす入断片中にあるＰｖｕｎ
、５ａｉｌを利用して消化断片の大きさで確認した。
された。なお、ＥｃｏＲＩ断片の挿入方向はプラスミド
上にあるＰｖｕ■制限サイトす入断片中にあるＰｖｕｎ
、５ａｉｌを利用して消化断片の大きさで確認した。
実施例３（第４図）
ＤＡＰＩ 仏子 の構
ｐＡＦＬ１３００をＰｖｕｌｌで消化し、０．８％アガ
ロースゲルから約１．７Ｋｂｐ断片を回収した０次いで
、この断片をＣｆ ｒ １３５で消化し。
ロースゲルから約１．７Ｋｂｐ断片を回収した０次いで
、この断片をＣｆ ｒ １３５で消化し。
混合物のままでＴ４ＤＮＡポリメラーゼで末端を平滑化
した。この断片に８７−Ｎｃａｌリンカ−ＧＣＣＡＴＧ
ＧＣを結合した。Ｎｃｏｌリンカ−上のこの断片をＥｃ
ｏＲＩ、Ｎａｏｌで消化し目的とするＮｃｏｌ−Ｅｃｏ
ＲＩ断片（■）を得た。
した。この断片に８７−Ｎｃａｌリンカ−ＧＣＣＡＴＧ
ＧＣを結合した。Ｎｃｏｌリンカ−上のこの断片をＥｃ
ｏＲＩ、Ｎａｏｌで消化し目的とするＮｃｏｌ−Ｅｃｏ
ＲＩ断片（■）を得た。
ＰＡＰＣ２５０ｔｉ−ＥｃｏＲＩ／Ｎｃｏｌで消化し、
約１．８ＫｂのＥｃｏＲ［−Ｎｃｏ ［（■）を０．８
％アガロースゲルから回収した。
約１．８ＫｂのＥｃｏＲ［−Ｎｃｏ ［（■）を０．８
％アガロースゲルから回収した。
発現ベクターであるＰＫＫ２３３−２をＮｅ。
１で消化し、５°末端のリン酸基をバクチリアルアルカ
リンホスファターゼで除去した。
リンホスファターゼで除去した。
断片■、■、ｐＫＫ２３３−２を結合し、ＡＰＩの発現
プラスミドｐＫＹＮ２００を得た。Ｎｃｏ１断片の挿入
の方向性はＥｃｏＲＩ （ベクター側に一ケ所、挿入
断片に一ケ所）、Ｈｉｎｄｌｌｌ（ベクター側に一ケ所
）の消化で出現する断片の大きさで確認した。
プラスミドｐＫＹＮ２００を得た。Ｎｃｏ１断片の挿入
の方向性はＥｃｏＲＩ （ベクター側に一ケ所、挿入
断片に一ケ所）、Ｈｉｎｄｌｌｌ（ベクター側に一ケ所
）の消化で出現する断片の大きさで確認した。
この発現のシステムは第５図に示すようなものである０
図中、アがアクロモバクタ−由来遺伝子であり、イの部
分にあるＭｅｔで始まる翻訳は矢印の部分で終結する。
図中、アがアクロモバクタ−由来遺伝子であり、イの部
分にあるＭｅｔで始まる翻訳は矢印の部分で終結する。
−度終結した翻訳は、ＳＤを利用して再びへのＭｅｔか
ら始められ、ＡＰＩ蛋白質を生産する。
ら始められ、ＡＰＩ蛋白質を生産する。
実施例４
Ｅ、ｃｏｌｉ ＵＴ４８１はＩｏｎ一種であり（Ｌｏ
ｎ＝プロテアーゼＬａ：ＡＴＰ依存プロテアーゼ）、産
物の分解がある程度抑えられるものと考えられた。
ｎ＝プロテアーゼＬａ：ＡＴＰ依存プロテアーゼ）、産
物の分解がある程度抑えられるものと考えられた。
ｐＫＹＮ２００のＥ、ｃｏｌｉ ＵＴ４８１への形質転
換体を一夜１００ ／Ａ ｇ ／ ｍ ｌのアンピシリ
ンを含む培地中で前培養し、２５０ｍ１の同じ培地に２
．５ｍｌ加え２５℃で２４時間培養した。
換体を一夜１００ ／Ａ ｇ ／ ｍ ｌのアンピシリ
ンを含む培地中で前培養し、２５０ｍ１の同じ培地に２
．５ｍｌ加え２５℃で２４時間培養した。
培養液より集菌した菌体よりオスモティック ショック
方法（Ｏｓ＋ｗｏｔｉｃ ５ｈｏｃｋ ｐｒｏｃｅｄｕ
ｒｅ）（ウィルスキー、ジー アール（Ｗｉｌｌｓｋｙ
、 Ｇ、 Ｉｔ、）等、ジャーナルオブバクテリオロジ
イ−（Ｊ、 Ｂａｃｔｓｒｉｏｌ、）１２７５９５−６
０９（１９７６））によりペリプラズム蛋白質を抽出し
た。この蛋白質溶液を１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ ｐ
Ｈ９，５で平衡化したＱＡＥセファデックスＡ−５０（
ＩＸ４０■）に吸着させた後、５００ｍＭまでのＮａＣ
１リニアーグラジェントをかけ溶出させた。６０〜６５
ｍＭで溶出されたピークを分取し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣ１ｐＨ８，０に対し透析した後、凍結乾燥した。
方法（Ｏｓ＋ｗｏｔｉｃ ５ｈｏｃｋ ｐｒｏｃｅｄｕ
ｒｅ）（ウィルスキー、ジー アール（Ｗｉｌｌｓｋｙ
、 Ｇ、 Ｉｔ、）等、ジャーナルオブバクテリオロジ
イ−（Ｊ、 Ｂａｃｔｓｒｉｏｌ、）１２７５９５−６
０９（１９７６））によりペリプラズム蛋白質を抽出し
た。この蛋白質溶液を１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ ｐ
Ｈ９，５で平衡化したＱＡＥセファデックスＡ−５０（
ＩＸ４０■）に吸着させた後、５００ｍＭまでのＮａＣ
１リニアーグラジェントをかけ溶出させた。６０〜６５
ｍＭで溶出されたピークを分取し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣ１ｐＨ８，０に対し透析した後、凍結乾燥した。
凍結乾燥した粗蛋白は２ｍｌの水に溶解し、ＴＳＫゲル
２０００ＳＷカラムを用いたＨＰＬＣによるゲルろ過で
最終精製を行なった。ＨＰＬＣの条件は流速０．７ｍｌ
／分、バッフｙ−０，２Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ７，
０であった。
２０００ＳＷカラムを用いたＨＰＬＣによるゲルろ過で
最終精製を行なった。ＨＰＬＣの条件は流速０．７ｍｌ
／分、バッフｙ−０，２Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ７，
０であった。
培養１＆ＩＱ当り１．６ｍｇのＡＰＩ類（第１図のアミ
ノ酸配列１〜４４８位に相当するもの）が生成し、上記
の方法により約０．５■の精製標品を得た。この標品は
成熟ＡＰＩ（第１図のアミノ着配列１〜２６８位に相当
するもの）の６０％の比活性を示し、腸炎ビブリオ由来
へモリジンの消化物の分析からＬｙｓ−Ｘ結合を特異的
に加水分解することが判明した。また単離したＡＰＩ類
のＮ末端２３残基は標準Δ１）Ｉ（市販品、天然品）の
それと完全に一致し、アミノ酸組成は第１表に示すとお
り１位のグリシンから４４８位のグリシンに至るペプチ
ド鎖の組成とよく一致した。また分子鼠４．８万は計算
値４．６万とほぼ一致した。
ノ酸配列１〜４４８位に相当するもの）が生成し、上記
の方法により約０．５■の精製標品を得た。この標品は
成熟ＡＰＩ（第１図のアミノ着配列１〜２６８位に相当
するもの）の６０％の比活性を示し、腸炎ビブリオ由来
へモリジンの消化物の分析からＬｙｓ−Ｘ結合を特異的
に加水分解することが判明した。また単離したＡＰＩ類
のＮ末端２３残基は標準Δ１）Ｉ（市販品、天然品）の
それと完全に一致し、アミノ酸組成は第１表に示すとお
り１位のグリシンから４４８位のグリシンに至るペプチ
ド鎖の組成とよく一致した。また分子鼠４．８万は計算
値４．６万とほぼ一致した。
第１表 アミノ酸組成
ｓｐ
ｈ ｒ
ｅ ｒ
Ｌｕ
Ｐｒ。
ｔｙ
Ｌａ
ａ１
ｅ ｔ
１ｅ
Ｌ ｅ ｕ
ｙｒ
ｈｅ
Ｌｙｓ
Ｈｉ ｓ
ｒ ｇ
５３゜
５６゜
５１ 。
２２゜
２５゜
５１ 。
４５゜
２６゜
３゜
１５゜
１９ 。
１３゜
１３゜
１０゜
８゜
１５゜
第１図はＡＰＩ類をコードするＤＮＡを包含するＤＮＡ
配列、およびそれに対応するアミ２ノ酸配列である。 第２図は本発明におけるＡＰＩ類をコードするＤＮＡの
クローニングの過程を示すフローチャートである。 第３図はＡＰＩ類全長全長遺伝子築図であり、第４図は
ＡＰＩ類遺伝子発現系の構築図である。 第５図は本発明におけるＡＰＩ類発現のシステムの概略
を示す図である。
配列、およびそれに対応するアミ２ノ酸配列である。 第２図は本発明におけるＡＰＩ類をコードするＤＮＡの
クローニングの過程を示すフローチャートである。 第３図はＡＰＩ類全長全長遺伝子築図であり、第４図は
ＡＰＩ類遺伝子発現系の構築図である。 第５図は本発明におけるＡＰＩ類発現のシステムの概略
を示す図である。
Claims (12)
- （１）アクロモバクタープロテアーゼ I 類をコードす
るＤＮＡを含有するＤＮＡ。 - （２）アクロモバクタープロテアーゼ I 類をコードす
るＤＮＡが第１図の３８７位から２３４８位の塩基配列
で表わされる請求項１記載のＤＮＡ。 - （３）アクロモバクタープロテアーゼ I 類をコードす
るＤＮＡがアクロモバクターリティカスＭ４９７−１の
染色体ＤＮＡ由来のＤＮＡである、請求項１または２記
載のＤＮＡ。 - （４）請求項１、２または３記載のＤＮＡを、アクロモ
バクタープロテアーゼ I 類を発現させるように、発現
用ベクターに構築した組み換えＤＮＡ。 - （５）第１図における３５４位から２４１４位の塩基配
列で表わされるＤＮＡを発現用ベクターに構築した請求
項４記載の組み換えＤＮＡ。 - （６）請求項４もしくは５記載のＤＮＡを保持する形質
転換体。 - （７）形質転換体の宿主が大腸菌である請求項６記載の
形質転換体。 - （８）請求項６または７記載の形質転換体を培養し、培
養物中にアクロモバクタープロテアーゼ I 類を生成蓄
積せしめ、これを採取することを特徴とする、該アクロ
モバクタープロテアーゼ I 類の製造法。 - （９）部位特異的変異により改変した請求項８記載のア
クロモバクタープロテアーゼ I 類の製造法。 - （１０）アクロモバクタープロテアーゼ I 類蛋白質。
- （１１）第１図のアミノ酸配列における１〜２６８位で
表わされる請求項１０記載のアクロモバクタープロテア
ーゼ I 蛋白質。 - （１２）第１図のアミノ酸配列における１〜２６９位乃
至１〜４４８位で表わされる請求項１０記載のアクロモ
バクタープロテアーゼ I 類蛋白質。
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP05972689A JP3205331B2 (ja) | 1989-03-14 | 1989-03-14 | アクロモバクタープロテアーゼｉ類遺伝子及びその遺伝子産物 |
| US07/482,266 US5248599A (en) | 1989-03-14 | 1990-02-20 | Achromobacter protease i gene and gene product thereof |
| CA002011378A CA2011378C (en) | 1989-03-14 | 1990-03-02 | Achromobacter protease i gene and gene product thereof |
| DE69027466T DE69027466T2 (de) | 1989-03-14 | 1990-03-03 | Achromobacter-Protease-I-Gen sowie Genprodukt |
| DK90104163.2T DK0387646T3 (da) | 1989-03-14 | 1990-03-03 | Achromobacter-protease I-gen og genprodukt deraf |
| EP90104163A EP0387646B1 (en) | 1989-03-14 | 1990-03-03 | Achromobacter protease I gene and gene product thereof |
| AT90104163T ATE139568T1 (de) | 1989-03-14 | 1990-03-03 | Achromobacter-protease-i-gen sowie genprodukt |
| ES90104163T ES2088911T3 (es) | 1989-03-14 | 1990-03-03 | Gen de la proteasa i de achromobacter y el producto de este gen. |
| GR960402170T GR3020790T3 (en) | 1989-03-14 | 1996-08-14 | Achromobacter protease I gene and gene product thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP05972689A JP3205331B2 (ja) | 1989-03-14 | 1989-03-14 | アクロモバクタープロテアーゼｉ類遺伝子及びその遺伝子産物 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02242686A true JPH02242686A (ja) | 1990-09-27 |
| JP3205331B2 JP3205331B2 (ja) | 2001-09-04 |
Family
ID=13121495
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP05972689A Expired - Lifetime JP3205331B2 (ja) | 1989-03-14 | 1989-03-14 | アクロモバクタープロテアーゼｉ類遺伝子及びその遺伝子産物 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5248599A (ja) |
| EP (1) | EP0387646B1 (ja) |
| JP (1) | JP3205331B2 (ja) |
| AT (1) | ATE139568T1 (ja) |
| CA (1) | CA2011378C (ja) |
| DE (1) | DE69027466T2 (ja) |
| DK (1) | DK0387646T3 (ja) |
| ES (1) | ES2088911T3 (ja) |
| GR (1) | GR3020790T3 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5693318A (en) * | 1996-07-15 | 1997-12-02 | Basf Corporation | Stable salicylic acid and peroxide containing skin and hair cleanser composition |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6171823B1 (en) * | 1994-12-09 | 2001-01-09 | Novo Nordisk A/S | Process for producing extracellular proteins in bacteria |
| WO1997033984A1 (en) * | 1996-03-12 | 1997-09-18 | Novo Nordisk A/S | Novel achromobacter lyticus protease variants |
| US6455678B1 (en) * | 1996-04-26 | 2002-09-24 | Amcell Corporation | Human hematopoietic stem and progenitor cell antigen |
| US6753155B1 (en) * | 1997-05-13 | 2004-06-22 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Protein biomarker for mustard chemical injury |
| US6485956B1 (en) * | 2000-07-14 | 2002-11-26 | Immunex Corporation | Testis-specific human SVPH1-8 proteinase |
| DE69930370T2 (de) * | 1998-01-14 | 2006-10-12 | Immunex Corp., Seattle | Testisspezifische, menschliche proteinase, svph1-8 |
| ATE332373T1 (de) * | 1998-08-21 | 2006-07-15 | Immunex Corp | Menschlisches il-1 epsilon dna und polypeptide |
| CN116334050B (zh) * | 2019-11-20 | 2024-02-02 | 珠海联邦制药股份有限公司 | 人工设计的赖氨酰内切酶及编码序列和发酵方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4624926A (en) * | 1981-01-02 | 1986-11-25 | The Research Foundation Of State University Of New York | Novel cloning vehicles for polypeptide expression in microbial hosts |
| JPS5959189A (ja) * | 1982-09-28 | 1984-04-04 | Wako Pure Chem Ind Ltd | 新規なアルカリプロテア−ゼ |
-
1989
- 1989-03-14 JP JP05972689A patent/JP3205331B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-02-20 US US07/482,266 patent/US5248599A/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-02 CA CA002011378A patent/CA2011378C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-03 AT AT90104163T patent/ATE139568T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-03-03 ES ES90104163T patent/ES2088911T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-03 DE DE69027466T patent/DE69027466T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-03 DK DK90104163.2T patent/DK0387646T3/da active
- 1990-03-03 EP EP90104163A patent/EP0387646B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-08-14 GR GR960402170T patent/GR3020790T3/el unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5693318A (en) * | 1996-07-15 | 1997-12-02 | Basf Corporation | Stable salicylic acid and peroxide containing skin and hair cleanser composition |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0387646B1 (en) | 1996-06-19 |
| US5248599A (en) | 1993-09-28 |
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| EP0387646A1 (en) | 1990-09-19 |
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| CA2011378C (en) | 1999-10-26 |
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| ES2088911T3 (es) | 1996-10-01 |
| CA2011378A1 (en) | 1990-09-14 |
| DE69027466D1 (de) | 1996-07-25 |
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