JPH0222275A - 蛍光細胞内カルシウム指示薬 - Google Patents

蛍光細胞内カルシウム指示薬

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JPH0222275A
JPH0222275A JP1127716A JP12771689A JPH0222275A JP H0222275 A JPH0222275 A JP H0222275A JP 1127716 A JP1127716 A JP 1127716A JP 12771689 A JP12771689 A JP 12771689A JP H0222275 A JPH0222275 A JP H0222275A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明はテトラカルボキシ化合物およびこれらの化合物
を用いて細胞内カルシウムを測定する方法に関する。
発明の背景 カルシウムは多くの細胞プロセスの制御において鍵とな
る元素である。例えば、血管平滑筋および心筋における
張力の発達は、遊離シストリック（ｃｙｓｔｏｌｉｃ）
Ｃａ”＋濃度の上昇に依存している。また、細胞内Ｃａ
”＋濃度の変化が、血小板凝集、エキソサイト−シスお
よび細胞増殖のような種々の生理学的事象に関連してい
ることが知られている。
重要な細胞プロセスにおけるＣａ−の役割により、生細
胞におけるカルシウムイオン濃度の測定法の開発研究が
促されている。光学指示薬、特に、テトラカルボキシレ
ート化合物を使用することが、最も確実なカルシウムイ
オン検出方法であると思われる。エステル誘導体形のテ
トラカルボキシレート化合物が細胞膜を通り、ついで細
胞中にて酵素的に分裂し、細胞膜に不浸透性である（ま
たは低速度でのみ浸透可能な）テトラカルボキシレート
イオンが得られる。該テトラカルボキシレート化合物が
カルシウムイオンと結合した場合、紫外線スペクトルに
てシフトが生じる。このシフトを用い、結合したカルシ
ウムイオン量を測定し、その解離定数を用い、細胞内カ
ルシウム濃度を測定することができる。
１９８５年において、改良されたＣａ０指示薬として次
の２つのカルシウム検出用テトラカルボキシレートキレ
ート化剤が報告された（グリンキーヴ４　’ｙクスら（
Ｇｒｙｎｋｉｅｖｉｃｚ　ｅｔ　ａｌ、）、ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂ　ｉｏ
ｌ、ｃｈｅｍ、）、２６０　：　３４４０）。
７ラー２ インド−１ しかしながら、フロー血球計算法 （ｆｌｏ冒ｃｙｔｏｎｅｔｒｙ）におけるフラー２およ
びインド−１の使用は、個々の細胞におけるパラメータ
ー測定に対して非常に有効な方法であるが（ムアーヘッ
ド（Ｍｕｉｒｈｅａｄ）、　　）レンズ・イン・アナリ
ティカル・ケミストリー（Ｔｒｅｎｄ、Ａｎａｌ、Ｃｈ
ｅｍ、）、３：１０７．１９８４）、紫外線能を有する
高出力レーザーの使用を必要とし、その短吸収波長によ
って著しく制限される。本発明の化合物は長吸収波長特
性を有しており、該化合物は混合した細胞集団における
細胞内カルシウムイオン濃度のマルチパラメーター・フ
ロー血球計算解析に有用なものとなる。
発明の開示 本発明は、無傷の細胞内のカルシウムイオン濃度の測定
に有用である新規なテトラカルボキシレート化合物に関
する。特に、これらの化合物は、７ラー２およびインド
−１のような以前に報告されているテトラカルボキシレ
ートプローブヨリモ、より広範囲の機械使用および適用
にて細胞内カルンウム測定を利用可能なものとする。本
発明の化合物は、細胞内カル／ラムイオン濃度のフロー
血球計算解析に有用である。
本発明の化合物は、次式： ［式中、Ｒは水素まｊ；はアセトキシメチル呟Ｒ３は低
級アルキル、特に、メチルまたはエチル、Ｚは酸素、硫
黄またはＮＨおよびＹはＮＨまたは硫黄を意味する］ で示される化合物、またはＲが水素である場合、そのナ
トリウム、カリウムまたはリチウム塩である。
好適には、Ｒはアセトキンメチルである。好適には、Ｒ
１はメチルである。好適には、Ｒ＋はメチル、Ｚは酸素
およびＹはＮＨである。
Ｒがアセトキシメチルである前記式Ａの化合物は、カル
シウムイオン濃度のような細胞パラメーターの測定につ
いて好ましいフロー血球計算法において有用である。こ
れらの化合物は細胞膜を通り、細胞内にて酵素的に分裂
する。得られた荷電形の化合物はカルシウムとキレート
環を形成する。
Ｒが水素である式Ａの化合物またはそのナトリウム、カ
リウムまたはリチウム塩を、細胞内微量注入法のような
他の方法にて、カルシウム指示薬として用いてもよい。
これらの化合物はまた、式Ｉのアセトキシメチルエステ
ルを調製する中間体としても有用である。
本発明の化合物の製造法を、以下の反応式および以下の
実施例にて説明する。
反応式■における出発物質は以下のように調製する。
反応式■ Ｚが酸素の弐Ｂ 符号の説明 ａ　：　Ｌａ（ＮＣ）ｓ）＋、ＮａＮＯ３、Ｈ２０／Ｈ
Ｃｌ２ｂ：ＴＭＳＣα、Ｋ、Ｃｏ、、ＤＭＦ ｃ：Ｍｎｏｚ、ＣＨ，Ｃ（１２ ｄ　：　Ｂｕ、Ｎ”Ｆ−１ＴＨＦ、ＲＴｅ　：　ＨＯ（
ＣＨｔ）ｓＯＨ，ｐ−ＣＨ３ＣｓＨ４５Ｏ，ＣＱ。
還流、３時間 ｆ　：　Ｋ、Ｃｏ３、ＤＭＦ、１３０℃、２時間ｇ：ｌ
ｏ％ＰＬ／Ｃ％Ｈ２／ｌＡｔ％ＥｔＯＨ，ＲＴ。
１０時間 ｈ　：　ＢｒＣＨｔＣＯＯＭｅ、Ｎａ１ＨＰＯａ、ＣＨ
３ＣＮ。
還流、９６時間 反応式ｒ−■において、使用されている語ＹおよびＺは
式Ａにおける定義と同じである。
反応式■によれば、出発物質（弐Ｂ）のエステル基を、
例えば、水酸化リチウムを用いて加水分解し、得られた
テトラ酢酸化合物をチオヒダントインまたはロダニンと
反応させ、ｌ−［６−アミノ−２−（５−オキソ−２−
チオキソ−４−イミジゾリジニリデン）メチル−５−ベ
ンゾフラニルオキシ］−２−（２′−アミノ−５′−メ
チルフェノキシ）エタン−Ｎ。
Ｎ、Ｎ’、Ｎ−テトラ酢酸およびその対応する４−チア
ゾリジニリデン化合物を得る。酢酸ブロモメチルを用い
てカルボン酸基をエステル化し、対応するＮ、Ｎ、Ｎ’
、Ｎ’−テトラ酢酸テトラアセチルオキ。
ジメチルエステルを得る。同様に、５−ベンゾチエニジ
または５−インドリルオキシ中間体を用い、対応する化
合物（２が硫黄またはＮＨ）を調製する。
反応式■および■は、反応式■の出発物質の調製に関す
る。
実施例 次に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、
これらに限定されるものではない。
実施例１ アセトニトリル１７０−中、１−（２−アミノ−４−ペ
ンゾキシフエノキシ）−２−（２’−アミノ−５°−メ
チルフェノキシ）エタン（グリンキーヴイックスら、ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２６
０．３４４０　（１９８５））６．２３ｇ（０，０１７
モル）、ブロモ酢酸メチル１３．０９ｇ（０，０８６モ
ル）、第２リン酸ナトリウム１２．１４　ｇ（０，０８
６モル）およびヨウ化ナトリウム０゜０３ｇの混合物を
９６時間加熱還流し、その時点にてブロモ酢酸メチルｌ
−を加え、該第を１２時間加熱した。塩化メチレンを該
混合物に加え、それを塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、
有機層を分離し、Ｍｇ５ＯＩ上で乾燥し、溶媒を真空下
にて除去し、褐色残渣を得、それをヘキサン−酢酸エチ
ルで処理し、黄色結晶として１−（２−アミノ−４−ペ
ンゾキシフエノキシ）−２−（２’−アミノ−５″−メ
チルフェノキシ）エタン−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラ
酢酸テトラメチルエステル９．７ｇ（収率８８％）を得
た。融点９５〜９７℃。
Ｉ　Ｒ：　１７４５ ＮＭＲ（ＣＤＣＱｓ、２５０Ｍ　Ｈｚ　）　＋　７．４
３〜７．２６、ｍ、　５Ｈ；　６．７９−６．６６、ｍ
、　４Ｈ；　６．５０−６．４７、ｍ１２Ｈ、４，９８
、ｓ　、　２Ｈ；　４．２２、ｓ　、　４Ｈ；　４．１
３．５１４Ｈ；　３．５８、Ｓ、６Ｈ；　３．５７、ｓ
　、　６Ｈ；　２−２６、ｓ１Ｈ オキン塩化リン１．１８ｇ（７，７０ミリモル）を、０
℃にて２０分間にてジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）４
０ｄに滴下した。該溶液を０℃にて０゜５時間撹拌し、
ＤＭＦ　４０ｍ１ｌ中、前記調製テトラメチルエステル
５．０２ｇ（７，７０ミリモル）の溶液を０．５時間に
わたって滴下しｔ；。得られた黄色混合物を５０℃にて
３時間加熱し、室温に冷却し、水冷飽和酢酸ナトリウム
溶液上に注ぎ、塩化メチレンで抽出し、有機層を塩化ナ
トリウム水溶液で洗浄し、Ｍｇ５Ｏ，上で乾燥した。溶
媒を真空下にて除去し、残渣をエーテルで処理し、淡黄
色固体として１−（２−アミノ−４−ベンゾキシ−５−
ベンズアルデヒド）オキシ−２−（２’−アミノ−５′
〜メチルフエノキシ）エタン−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テ
トラ酢酸テトラメチルエステル１．１２ｇ（収率９６％
）を得た。融点１２７〜１２９℃。
Ｉ　Ｒ：　１７４０．１６６Ｏ ＮＭＲＣＣＤＣＱ３．２５０Ｍ　Ｈｚ　）　：　１０．
３２．５１１Ｈ；　７．４０−７．３６、ｍ、　５Ｈ；
　７．２９、Ｓ％ｌＨ；６．７５、ｄ、　５Ｈｚ、　　
Ｉ　Ｈ；６．６７、ｄｓ　５Ｈｚ　ｓ　ｉ　Ｈ；６．６
５．５ＳＩＨ；６−３０、ｓ、ＩＨ；５．ｌＬ　　ｓ、
２Ｈ；４．２３、ｂｒ　ｓ　、　４Ｈ；　４．１９．５
１４Ｈ；４．ｌＬ　　ｓ。
４Ｈ；　３．５９、ｓ　、　６Ｈ；　３．５７、ｓ　、
　６Ｈ；　２．２６、ｓ１Ｈ 以下の操作に従い、４−ベンゾキシ基を分離し、対応す
る４−ヒドロキシ化合物を得た：エタノール２〇−中、
前記調製ベンズアルデヒド化合物１．１　ｇ　（１，６
０ミリモル）および炭素上１０％パラジウム０．１１ｇ
の混合物を、大気圧下、７５℃（かかる温度にて該ベン
ズアルデヒド化合物は溶解する）にて、３時間水素添加
した。
ついで該溶液を塩化メチレンで希釈し、濾過し、溶媒を
真空下にて除去し、灰色粉末として４−ヒドロキシ化合
物０．９８ｇ（定量）を得た。融点１３０．５〜１３２
．５℃。
Ｉ　Ｒ：　３４００（ｂｒ）、１７４０．１６２５ＮＭ
ＲＣＣＤＣＱｓ、２５０Ｍ　Ｈｚ　）　：　１１．２０
．５１１Ｈ、９，２６、ｓ　、　ＩＨ；　６．９１．　
　ｓ　、　ＩＨ；　６．７９−６．６６、ｍ、　４Ｈ；
　６−１５、ｓ、　ＩＨ；４．２３、ｓ、　８Ｈ；４゜
１２、ｓ　、　４Ｈ；　３．６０８、ｓ　、　６Ｈ；　
３．６０５、Ｓ、６Ｈ：２．２３、ｓ、３Ｈ ＭＳ（ＣＩ）：ｍ／ｅ　５９１　（Ｍ＋Ｈ）″０℃に冷
却したヘキサメチルホスポルアミド４０−中、水素化ナ
トリウム４３．０ｍｇ（２，２０ミリモル）の懸濁液に
、前記調製ヒドロキシ化合物１、］８８ｇ２．０ミリモ
ル）を加えた。得られた溶液を５分間撹拌し、ブロモア
セトアルデヒド・ジメチルアセタール０．８５ｇ（５，
０ミリモル）を−度に加えた。溶液を８５〜９５℃にて
３．５時間加熱し、ついで室温にて冷却し、塩化メチレ
ンで希釈し、塩化ナトリウム溶液で５回洗浄し、有機層
をＮａｚＳＯｔ上で乾燥し、溶媒を除去し、残渣を塩化
メチレン−エーテルで処理し、ｌ−［２−アミノ−４−
（２，２−ジメトキシエトキシ）−５−ベンズアルデヒ
ド化合物シ−２−（２’−アミノ−５′−メチルフェノ
キシ）−エタン−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ″−テトラ酢酸テト
ラメチルエステル１．１２ｇ（収率８３％）を得Ｉこ。
Ｉ　Ｒ：　１２２Ｏ ＮＭＲ（ＣＤＣＱｓ−２５０ＭＨｚ）　：　１０−２７
．５１１Ｈ；　７．２８、ｓ　、　］　ＩＨ；　６．７
６−６．６５、ｍ、　３Ｈ；　６−３０、Ｓ、　ｌ）ｌ
　；４．７０．　　ｔ、　５．１Ｈｚ、　ＩＨ；４．２
３．５１８Ｈ；４．ＩＬ　ｓ、４Ｈ；　４．０２、ｄ、
５．ＩＨｚ、２Ｈ：３．５９９、Ｓ、６Ｈ：　３．５８
５、Ｓ、６Ｈ；　３．４７、Ｓ、６Ｈ、２，２６、ｓ、
３Ｈ ＭＳ（ＣＩ）：６７９　ｍ／ｅ　（Ｍ＋Ｈ）”氷酢酸２
５−中、前記調製中間体０．１７ｇ（０゜２５ミリモル
）の溶液に、９６％Ｈ，Ｓ０．０．０２８ｍ１２（０，
５０ミリモル）を加え、練糸を室温にて２４時間撹拌し
た。ついで、該溶液を水で希釈し、クロロホルムで繰り
返し抽出し、有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶媒
を真空下にて除去した。
橙色残渣を、７５°Ｃにて６時間、氷酢酸で処理した。
純粋な生成物、１−（６−アミノ−２−ベンゾフルアル
デヒド−５−オキシ）−２−（２’−アミル５′−メチ
ルフエノキシ）エタン−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ″−テトラ酢
酸テトラメチルエステル０．０９　ｇ（５９％、融点１
４６〜１４７°Ｃ）を前記のように単離した。
Ｉ　Ｒ：　１７４８．１６８Ｏ ＮＭＲＣＣＤＣＱ、、２５０Ｍ　Ｈｚ　）　：　９．７
２、Ｓ、ＩＨ；　７．４４、ｓ、　ｌＨ；７．１０Ｓｓ
、　ＩＨ；６．９５．５１１Ｈ；　６．７５−６．６７
、ｍ、　３Ｈ；　４．３０、ｓ、２Ｈ；４．２９、Ｓ、
２Ｈ；　４．２３、ｓ　、　４Ｈ；　４．１２、ｓ、４
Ｈ；３．５９、Ｓ、６Ｈ、３，５６、Ｓ、６Ｈ；２．２
７、ｓ、３ＨＭＳ（ＣＩ）：ｍ／ｅ　　６１５　（Ｍ＋
Ｈ）”塩化メチレンｌ０ｍ１２中、前記調製ベンゾフル
アルデヒド中間体０．２２　ｇ（０，３３ミリモル）の
溶液に、１．３−プロパンジオール０．０３ｇ（０，３
６ミリモル）、つづいてｐ−トルエンスルホン酸０゜［
３ｍｇを加えた。該溶液を３時間加熱還流し、室温にて
一夜撹拌し、塩化メチレンで希釈し、塩化ナトリウム水
溶液で洗浄しＩ；。有機層をＮａ２５Ｏ。
上で乾燥し、溶媒を真空下にて除去し、黄色残渣を得、
それを溶出液としてエーテルの２０％石油エーテルを用
いるフラツンユクロマトグラフイーにより精製し、２−
プロピレンジオキジペンゾフラノキシ中間体を得た。生
成物収量は１８０ｍｇ（８１％）であった。融点１４７
〜１４８℃。
［Ｒ：　１１６５ ＮＭＲＣＣＤＣＱ、、２５０Ｍ　Ｈｚ　）　：　７．０
１．　　ｓ　。
ｌＨ，６，９９、ｓ　、　ｌ　Ｈ；　６．７９−６．６
０、ｍ、　４Ｈ；　５．６６、ｓ１団、　４．２８、ｂ
ｒ　ｓ　、　４Ｈ；　４．１７、ｓ、４Ｈ；４゜１２、
ｓ　、　４Ｈ；　４．０６−３．９３、ｍ、　４Ｈ；　
３．５６．５１６Ｈ；　３．５３、Ｓ、６Ｈ；　２．２
６、ｓ　、　３Ｈ；　１．５７〜１．４０、ｍ、　２Ｈ ＭＳ（ＣＩ）：６７３　ｍ／ｅ　（Ｍ＋Ｈ）”前記調製
中間体のエステル基を、以下のように加水分解した。該
中間体０．２２　ｇ（０，３２ミリモル）をＴＨＦ４＋
ｎＱに溶かしｔ；。この溶液に、水４ｍ１２に溶かした
水酸化リチウム七ノ水利物０１１３４　ｇ（３，２ミリ
モル）を加え、該溶液を室温にて一夜撹拌した。希塩酸
溶液を加え、ｐＨを４〜５に調整し、得られた油状物を
塩化メチレンで抽出し、水および塩化ナトリウム溶液で
洗浄し、Ｎａ、ＳＯａ上で乾燥し、溶媒を真空下にて除
去し、Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラ酢酸２−プロピレン
ジオキシベンゾフラノキシ中間体０．１９６ｇ（収率９
９％）を得た。融点１１０〜ｌ１１”ｏ（ｄ）。
Ｉ　Ｒ：　３４００〜２５４Ｏ ＮＭＲ（ＣＤＣ１１３，２５０Ｍ　Ｈｚ　）　：　７．
１８、Ｓ。
ＩＨ；６．９６、Ｓ、ＩＨ；６．８０．　　ｓ、　ＩＨ
；６．７Ｌ　　ｓ。
ＩＨ；　６．６６、ｓ　、　２Ｈ；　５．６７、ｓ、　
ＩＨ；４．２７、ｂｒＳ、４Ｈ；　４．１０Ｓｓ、　４
Ｈ；　４．０１、ｓ　、　４Ｈ；　２．２２、ｓ、３Ｈ ＭＳ（ＦＡＢ）：ｍ／ｅ　６１７　（Ｍ＋Ｈ）”氷酢酸
５ｆｆ１１２中、前記調製中間体０．０５ｇ（０゜０８
ミリモル）、チオヒダントイン０．Ｏｌｇ（０゜０９ミ
リモル）および酢酸アンモニウム０．０２ｇ（０，２９
ミリモル）の混合物を７５°Ｃに加熱し、その温度にて
すべての固形成分は溶解した。この温度にて１．５時間
撹拌した後、橙−赤色沈澱物が形成した。この沈澱物を
エーテルで処理し、橙色粉末としてｌ−［６−アミル２
−（５−オキソ−２−チオキソ−４−イミダゾリジニリ
デン）メチル−５−ベンゾフラニルオキシ］−２−（２
’−アミノ−５°−メチルフェノキシ）エタン−Ｎ、Ｎ
、Ｎ″、Ｎｏ−テトラ酢酸０．０３５ｇ（収率６７％）
を得た。融点１６４゜５〜１６７℃。
ＩＲ・３６００〜２５００．１７２６．１４９０．１１
９２ＮＭＲ（ＤＭＳ　Ｏ−ｄ　イ２５０ＭＨｚ　）　：
　１２．０．　ｍ。
２Ｈ；　７．３６、ｓ、　　ＩＨ；７．２３．５ＳＩＨ
；７．１８．５１１Ｈ；７．０５、ｓ、　　ＩＨ；６．
８０、ｓ、　　ＩＨ；６．６５．５１２Ｈ；　６．４９
、ｓ、　　ＩＨ；４．２９、ｓ　、　４Ｈ；　４．１３
．５１４Ｈ；３．９９、ｓ　、　４Ｈ；　２．２２、ｓ
、３ＨＭＳ（ＦＡＢ）：　ｍ／ｅ　　６５７　（Ｍ＋Ｈ
）”炭酸カリウム０．００２　ｇ（０，０１５ミリモル
）を、乾燥ＤＭＦ　２ｍ＋２中、前記調製テトラカルボ
ン酸化合物２．０ｍｇ（０，００３ミリモル）の溶液に
加えた。混合物を室温にて０．５時間撹拌し、トリプロ
ピルアミン０．００１＋ｎ１２（０，００６ミリモル）
を−度に加え、該第を０．５時間撹拌した。酢酸ブロモ
メチル４５．０ｍｇ（０，０３ミリモル）を加え、５分
間撹拌した後、薄層クロマトグラフィー（シリカ、塩化
メチレン中、２５％メタノール）は、すべての出発物質
が消耗され、より極性の小さい成分が形成されているこ
とを示した。溶媒を真空下にて除去し、残りの固体を水
、ついでエーテルで処理し、ｌ−［６−アミノ−２−（
５−オキソ−２−チオキソ−４−イミダゾリジニリデン
）メチル−５−ベンゾフラニルオキシ］−２−（２°−
アミノ−５′−メチルフェノキシ）エタン−Ｎ、Ｎ、Ｎ
’、Ｎ’−テトラ酢酸テトラアセチルオキシメチルエス
テル２ｍｇを得ｔ：。
ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ＠、２５０Ｍ　Ｈｚ　）　：　７
．５０−６．５７、ｍ、７Ｈ；　５．６０、ｓ　、　４
Ｈ；　５．５９．５％４Ｈ；４゜２８、ｂｒ　ｓ　、　
４Ｈ；　４．１４、ｓ、　４Ｈ；　２．２１、ｓ、２Ｈ
：２．００、ｓ、　１２Ｈ ＭＳ（ＦＡＢ）：　ｍ／ｅ　９４５　（Ｍ十Ｈ）’実施
例２ チオヒダントインの代わりにロダニンを用い、実施例１
の操作に従い、以下の化合物：ｌ−［６−アミハ２−（
５−オキソ−２−チオキソ−４−チアゾリジニリデン）
メチル−５−ベンゾ７ラニルオキン］−２−（２’−ア
ミノ−５′−メチルフェノキシ）エタンＮ、Ｎ、Ｎ’、
Ｎ’−テトラ酢酸およびそのテトラアセチルオキシメチ
ルエステルを調製する。
実施例３ ２−ヒドロキシメチル−５−ヒドロキシインドールを、
トリ硝酸ランタン、硝酸ナトリウムおよび水性塩酸で処
理し、５−ニトロ誘導体を得る。５−ヒドロキシ基を塩
化トリメチルシリルを用いて保護し、ジクロロメタン中
の酸化マンガンでＭＪＩし、ついで室はにてテトラヒド
ロ７ラン中、フッ化テトラブチルアンモニウムで処理す
ることにより、２−ヒドロキシメチル基を酸化し、４−
ヒドロキシ−５−ニトロ−２−インドールアルデヒドを
得る。
前記調製アルデヒドを、実施例１に記載の操作に、ｌ：
’）１，３−プロパンジオールと反応させ、２−プロピ
レンジオキシインドール中間体を得る。
ジメチルホルムアミド中、前記調製プロピレンジオキシ
化合物、３−ブロモエトキシ−４−二トロトルエンおよ
び炭酸カリウムの混合物を、１３０°Ｃにて２時間加熱
する。該生成物は、１−（６−ニトロ−２−プロピレン
ジオキシ−５−インドリルオキシ）−２−（２’−アミ
ノー５′−メチルフェノキシ）エタンである。
前記調製中間体のニトロ基を、エタノール中、炭素上白
金を用い、室温にて１０時間、水素添加することにより
アミノ基に還元する。
該ジアミノ中間体を、アセトニトリル中、ブロモ酢酸メ
チルおよびニリン酸ナトリウムで処理し、９６時間還流
し、Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラ酢酸テトラメチルエス
テル（ＺがＮＨである弐Ｂの化合物）を得る。
実施例１の操作により、該エステル基を酸基に加水分解
し、得られた中間体をチオヒダントインと反応させ、ｌ
−［６−アミノ−２−（５−オキソ−２〜チオキソ−４
−イミダゾリジニリデン）−メチル−５−インドリルオ
キシ］−２−（２″−アミノ−５″−メチルフェノキシ
）エタンＮ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラ酢酸を得る。
実施例１の操作により、前記調製テトラ酢酸を酢酸ブロ
モメチルと反応させて対応するテトラアセチルオキシメ
チルエステルを製造する。
実施例４ ２−とドロキンメチル−５−ヒドロキシベンゾチオフェ
ンを対応するインドールの代わりに用い、実施例３の操
作により、以下の化合物：ｌ−［６−アミノ−２−（５
−オキソ−２−チオキソ−４−イミダゾリジニリデン）
メチル−５−ベンゾチエニルオキ／］−２−（２’−ア
ミノ−５゛−メチルフェノキ／）エタンＮ、Ｎ、Ｎ’、
Ｎ’−テトラ酢酸およびそのテトラアセチルオキシメチ
ルエステルを調製する。
以下の操作は、２つの異なる細胞型および測定系におけ
る細胞内カルシウム濃度の測定についての本発明のテト
ラカルボキシレート化合物の有用性を示す。
ヒト辺縁血液単核細胞を、密度勾配分離法により精製す
る。２５ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７。
３〜７４）、２％自己血清および０，５〜２．５μＭの
テトラカルボキシレート化合物を含有するＲＰＭＴ１６
４０培地において、３７°Ｃにて４５９間インキュベー
ションすることにより、細胞（４Ｘ　Ｉ　Ｏ’／ｍ１２
）を本発明のテトラカルボキンレート化合物で負荷する
。エステル基は、（例えば、トシエン、アール・ワイ（
Ｔｓｉｅｎ、　　ＲＹ）、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ
）　、２９０　：　５２７−５２８．１９８１に記載さ
れているように）荷電形の指示薬をトラップする細胞内
エステラーゼにより切り離され、その遊離カルボキシル
基がカルシウムとキレート環を形成する。負荷後、細胞
をＲＰＭＩ−ＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ−２％血清培地で３回洗
浄し、２部に分ける。一つは、７０−血球計算解析が行
われるまで（負荷の１〜２．５時間後）、培地中、４Ｘ
１０６／−および室温にて保持する。もう一つは、４℃
にて１５分間、ＲＰＭＩ−ＨＥＰＥＳ−２％血清中、製
造上の奨励する濃度でインキュベーションすることによ
り、特異的リンパ球サブタイプ（ｓｕｂｔｙｐｅ）を認
識するフルオレセイン−標識抗Ｌｅｕ２ａｓ抗Ｌｅｕ３
ａｓ抗Ｌｅｕｌｌａおよび／または抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体
で標識化する（ベクトン・ディッキンソン・イムノサイ
トメトリー・システム）　（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉ
ｎｓｏｎ　　Ｉ　ｍｍｕｎｏｃ＋ｙｔｏｍｅｔｒｙＳ　
ＹＳｔｅｍｓ）。抗体標識化後、細胞を３回洗浄し、フ
ロー血球計算解析を行うまで、同一培地中、４ＸＩＱ’
／ｍ１２および室温にて保持する。ヨウ化プロピジウム
を排除する能力により、解析時点での細胞生存能力を評
価する。
７０−血球計算解析は、４８８ｎｍで２００ｍＷの励起
を付与するアルゴンイオンレーザーヲ備えｆ二：ｌ−）
レター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）　Ｅ　Ｐ　Ｉ　ＣＳ　７５３
で行う。直角スキャタ−（ｓｃａｔｔｅｒ）を、４８８
ｎｍロングパスダイクロイックミラーおよび４８８ｎｍ
バンドパスフィルターを用いて収集スル。フォワードお
よび直角分散の励起光を用いてリンパ球を単球と区別し
、蛍光ヒストグラムを特異的リンパ球スキャター域にお
いて収集する。「抗体」（フルオレセイン）蛍光を、５
６０ｎｍショートパスダイクロイックミラーおよび５２
５ｎｍバンドパスオヨび５１５ｎｍロングパスフィルタ
ーを用いて収集する。「カルシウム」蛍光を６２０ｎｍ
ショートパスダイクロイックミラーおよび６６５ｎｍロ
ングパスフィルターを用いて収集する。遊離形（非カル
シウム結合）は、４８８ｎｍの光によって選択的に励起
されているため、６６５ｎｍよりも大きな波長でのシグ
ナル強度は細胞内カルシウム濃度に対して反比例の関係
にあるはずである。
７０−血球計算解析は、室温、培地中での細胞１００μ
Ｑを、３７℃培地４００μＱと混合し、１０／ＩＭイオ
ノマイシン（ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ）、２０μｇ／ｄフイ
トヘムアグルチニン、ｌＯμｇ／＋ｍ２抗ヒト免疫グロ
ブリンまたは他の適当な刺激剤を加え、または加えるこ
となく、３７℃にて５分間、時間に対する蛍光を蓄積さ
せて行う。刺激剤での旭理による細胞内カルシウムの上
昇が蛍光強度の減少をもたらし、個々のリンパ球サブセ
ットの応答は、励起用のシグナル可視波長レーザーライ
ンを用いて測定することができる。インド−１を用いる
フロー血球計算法により同様な測定を行うには、般に、
５〜ｌＯ倍の高負荷濃度の指示薬色素を用い、２つの別
個のレーザーを必要とし、そのうち１つはｕｖ能を有し
なければならない（ラビノビツチら（Ｒａｂｉｎｏｖｉ
ｔｃｈｅｔ　ａｌ、、ジャーナル・オブ・イム１０ジー
（Ｊ　、　■ｍｍｕｎｏ１．）、上３７：９５２−９６
１．１９８６）。
ＡＩＯ平滑筋細胞培養をカバースリップ上にプレートし
、対数期の増殖を試験する。細胞を、３７°Ｃにて３０
分間、Ｃａ”およびＭｇト、５ｍＭグルコース、１５ｍ
Ｍ　ＨＥＰＥＳ、０．１％ウシ血清アルブミンおよび５
μＭ色素を含有するｐＨ７。
２のダルベツコ（［）　ｕｌ　ｂｅｃｃｏ）リン酸塩緩
衝食塩水中にてインキュベーションすることにより、指
示薬色素（インド−１または本発明のテトラカルボキシ
レート化合物）で負荷する。負荷後、細胞を３回洗浄し
、顕微鏡解析を行うまで同一の緩衝塩溶液中、室温にて
保持する。
解析は、５Ｗのアルゴンイオンレーザ−８，１−び蛍光
定量用のデュアル・フォトマルチピア・チューブ（ｄｕ
ａｌ　ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｉｅｒ　ｔｕｂｅ）を備
えたメリディアン（Ｍｅｒｉｄｉａｎ）　Ａ　ＣＡ　Ｓ
　４７０を用いて実施する。３５６〜３６５ｎｍでのレ
ーザー出力１００ｍＷを用い、カルシウム−結合インド
−１の蛍光を励起し、それを４０５ｎｍバンドパスフィ
ルターを用いて収集する。４８８ｎｍでのレーザー出力
１００ｍＷを用い、カルシウム−遊離テトラカルボキシ
レートの蛍光を励起し、それを６４０ｎｍロングパスフ
ィルターを用いて収集する。すべての解析は室温にて実
施する。シグナル細胞を顕微鏡対象レンズの中心に置き
、ついで１分間、繰り返してスキャン（３秒／スキャン
）させ、基線蛍光濃度を確立する。１分にて、グルコー
ス塩溶液をンリンジを介して速やかに採取し、等容量の
１１００ｎバソブレンン含有溶液で置き換える。バンプ
レシンはこの細胞型の内部ストアーからのカルシウムの
放出および外部培地からのカルシウムの吸収を刺激する
ことが知られている。刺激後約２分間、反復スキャンを
続ける。
細胞内カルシウムにおけるバンプレシン刺激の増加は、
カルシウム−テトラカルボキシレート遊離形の減少、す
なわち、４８８ｎｍ−励起蛍光の減少をもたらす。逆に
、該増加は、カルシウム−結合形のインド−１の増加お
よびその３５６〜３６５ｎｍ励起蛍光の増加をもたらし
た。両方の指示薬とも応答の程度および時期で同様の評
価が得られる。しかしながら、インド−１はｕｖレーザ
ー能のない系においては用いることができないが、テト
ラカルボキンレートは用いることができる。
また、インド−１は、クローニング用に使用する皿のｕ
ｖ吸収特性のため、カルシウム応答を示す（または欠い
ている）クローン細胞に用いることができない。しかし
ながら、本発明のテトラカルボキンレートはクローニン
グ研究の使用に好適である。
特許出願人　スミスクライン・ベックマン・コーポレイ
ンヨン

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒは水素またはアセトキシメチル、Ｒ＿１はメ
    チルまたはエチル、Ｚは酸素、硫黄またはＮＨおよびＹ
    はＮＨまたは硫黄を意味する］ で示される化合物、またはＲが水素である場合、そのナ
    トリウム、カリウムまたはリチウム塩。
  2. （２）Ｒがアセトキシメチルである請求項（１）記載の
    化合物。
  3. （３）Ｒ＿１がメチルである請求項（１）記載の化合物
    。
  4. （４）Ｒ＿１がメチル、Ｚが酸素およびＹがＮＨである
    請求項（１）記載の化合物。
  5. （５）Ｒ＿１がメチルである請求項（２）記載の化合物
    。
  6. （６）Ｒ＿１がメチル、Ｚが酸素およびＹがＮＨである
    請求項（２）記載の化合物。
  7. （７）細胞を光学指示薬として作用するに十分な量の請
    求項（１）の化合物で処理することを特徴とする光学測
    定系を介する無傷の細胞内の細胞内カルシウム濃度測定
    方法。
  8. （８）フロー血球計算法または定量蛍光顕微鏡検査法を
    用い、細胞内カルシウム濃度を測定する請求項（７）記
    載の方法。
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