JPH0813812B2 - 蛍光細胞内カルシウム指示薬 - Google Patents

蛍光細胞内カルシウム指示薬

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JPH0813812B2
JPH0813812B2 JP1127716A JP12771689A JPH0813812B2 JP H0813812 B2 JPH0813812 B2 JP H0813812B2 JP 1127716 A JP1127716 A JP 1127716A JP 12771689 A JP12771689 A JP 12771689A JP H0813812 B2 JPH0813812 B2 JP H0813812B2
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スミスクライン・ベックマン・コーポレイション
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明はテトラカルボキシ化合物およびこれらの化合
物を用いて細胞内カルシウムを測定する方法に関する。
発明の背景 カリシウムは多くの細胞プロセスの制御において鍵と
なる元素である。例えば、血管平滑筋および心筋におけ
る張力の発達は、遊離シストリック（cystolic）Ca++濃
度の上昇に依存している。また、細胞内Ca++濃度の変化
が、血小板凝集、エキソサイトーシスおよび細胞増殖の
ような種々の生理学的事象に関連していることが知られ
ている。
重要な細胞プロセスにおけるCa++の役割により、生細
胞におけるカルシウムイオン濃度の測定法の開発研究が
促されている。光学指示薬、特に、テトラカルボキシレ
ート化合物を使用することが、最も確実なカルシウムイ
オン検出方法であると思われる。エステル誘導体形のテ
トラカルボキシレート化合物が細胞膜を通り、ついで細
胞中にて酵素的に分裂し、細胞膜に不浸透性である（ま
たは低速度でのみ浸透可能な）テトラカルボキシレート
イオンが得られる。該テトラカルボキシレート化合物が
カルシウムイオンと結合した場合、紫外線スペクトルに
てシフトが生じる。このシフトを用い、結合したカルシ
ウムイオン量を測定し、その解離定数を用い、細胞内カ
ルシウム濃度を測定することができる。
1985年において、改良されたCa++指示薬として次の２
つのカルシウム検出用テトラカルボキシレートキレート
化剤が報告された（グリンキーヴィックスら（Grynkiew
icz et al.）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリー（J.Biol.Chem.）、260:3440）。
しかしながら、フロー血球計算法 （flow cytometry）におけるフラ‐２およびインド‐１
の使用は、個々の細胞におけるパラメーター測定に対し
て非常に有効な方法であるが（ムアーヘッド（Muirhea
d）、トレンズ・イン・アナリティカル・ケミストリー
（Trend.Anal.Chem.）、3:107、1984）、紫外線能を有
する高出力レーザーの使用を必要とし、この短吸収波長
によって著しく制限される。本発明の化合物は長吸収波
長特性を有しており、該化合物は混合した細胞集団にお
ける細胞内カルシウムイオン濃度のマルチパラメーター
・フロー血球計算解析に有用なものとなる。
発明の開示 本発明は、無傷の細胞内のカルシウムイオン濃度の測
定に有用である新規なテトラカルボキシレート化合物に
関する。特に、これらの化合物は、フラ‐２およびイン
ド‐１のような以前に報告されているテトラカルボキシ
レートプローブよりも、より広範囲の機械使用および適
用にて細胞内カルシウム測定を利用可能なものとする。
本発明の化合物は、細胞内カルシウムイオン濃度のフロ
ー血球計算解析に有用である。
本発明の化合物は、次式： ［式中、Ｒは水素またはアセトキシメチル、R1は低級ア
ルキル、特に、メチルまたはエチル、Ｚは酸素、硫黄ま
たはNHおよびＹはNHまたは硫黄を意味する］ で示される化合物、またはＲが水素である場合、そのナ
トリウム、カリウムまたはリチウム塩である。
好適には、Ｒはアセトキシメチルである。好適には、
R1はメチルである。好適には、R1はメチル、Ｚは酸素お
よびＹはNHである。
Ｒがアセトキシメチルである前記式Ａの化合物は、カ
ルシウムイオン濃度のような細胞パラメーターの測定に
ついて好ましいフロー血球計算法において有用である。
これらの化合物は細胞膜を通り、細胞内にて酵素的に分
裂する。得られた荷電形の化合物はカルシウムとキレー
ト環を形成する。
Ｒが水素である式Ａの化合物またはそのナトリウム、
カリウムまたはリチウム塩を、細胞内微量注入法のよう
な他の方法にて、カルシウム指示薬として用いてもよ
い。これらの化合物はまた、式Ｉのアセトキシメチルエ
ステルを調製する中間体としても有用である。
本発明の化合物お製造法を、以下の反応式および以下
の実施例にて説明する。
反応式Ｉにおける出発物質は以下のように調製する。
符号の説明 a:La(NO3)3、NaNO3、H2O/HCl b:TMSCl、K2CO3、DMF c:MnO2、CH2Cl2 d:Bu4N+F-、THF、RT e:HO(CH2)3OH、p-CH3C6H4SO2Cl、還流、３時間 f:K2CO3、DMF、130℃、２時間 g:10％Pt/C、H2/1At、EtOH、RT、10時間 h:BrCH2COOMe、Na2HPO4、CH3CN、還流、96時間 反応式Ｉ〜IIIにおいて、使用されている語Ｙおよび
Ｚは式Ａにおける定義と同じである。
反応式Ｉによれば、出発物質（式Ｂ）のエステル基
を、例えば、水酸化リチウムを用いて加水分解し、得ら
れたテトラ酢酸化合物をチオヒダントインまたはロダニ
ンと反応させ、1-［6-アミノ‐2-（5-オキソ‐2-チオキ
ソ‐4-イミジゾリジニリデン）メチル‐5-ベンゾフラニ
ルオキシ］‐2-（２′‐アミノ‐５′‐メチルフェノキ
シ）エタン‐N,N,N′,N′‐テトラ酢酸およびその対応
する4-チアゾリジニリデン化合物を得る。酢酸ブロモメ
チルを用いてカルボン酸基をエステル化し、対応するN,
N,N′,N′‐テトラ酢酸テトラアセチルオキシメチルエ
ステルを得る。同様に、5-ベンゾチエニシまたは5-イン
ドリルオキシ中間体を用い、対応する化合物（Ｚが硫黄
またはNH）を調製する。
反応式IIおよびIIIは、反応式Ｉの出発物質の調製に
関する。
実施例 次に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する
が、これらに限定されるものではない。
実施例１ アセトニトリル170ml中、1-（2-アミノ‐4-ベンゾキ
シフェノキシ）‐2-（２′‐アミノ‐５′‐メチルフェ
ノキシ）エタン（グリンキーヴィックスら、ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケキストリー、260、3440（1
985））6.23g（0.017モル）、ブロモ酢酸メチル13.09g
（0.086モル）、第２リン酸ナトリウム12.14g（0.086モ
ル）およびヨウ化ナトリウム0.03gの混合物を96時間加
熱還流し、その時点にてブロモ酢酸メチル1mlを加え、
該系を12時間加熱した。塩化メチレンを該混合物に加
え、それを塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、有機層を分
離し、MgCO4上で乾燥し、溶媒を真空下にて除去し、褐
色残渣を得、それをヘキサン‐酢酸エチルで処理し、黄
色結晶として1-（2-アミノ‐4-ベンゾキシフェノキシ）
‐2-（２′‐アミノ‐５′‐メチルフェノキシ）エタン
‐N,N,N′,N′‐テトラ酢酸テトラメチルエステル9.7g
（収率88％）を得た。融点95〜97℃。
IR:1745 NMR（CDCl3、250MHz）:7.43〜7.26、ｍ、5H;6.79〜6.6
6、ｍ、4H;6.50〜6.47、ｍ、2H;4.98、ｓ、2H;4.22、
ｓ、4H;4.13、ｓ、4H;3.58、ｓ、6H;3.57、ｓ、6H;2.2
6、ｓ、3H オキシ塩化リン1.18g（7.70ミリモル）を、０℃にて2
0分間にてジメチルホルムアミド（DMF）40mlに滴下し
た。該溶液を０℃にて0.5時間撹拌し、DMF40ml中、前記
調製テトラメチルエステル5.02g（7.70ミリモル）の溶
液を0.5時間にわたって滴下した。得られた黄色混合物
を50℃にて３時間加熱し、室温に冷却し、氷冷飽和酢酸
ナトリウム溶液上に注ぎ、塩化メチレンで抽出し、有機
層を塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、MgSO4上で乾燥し
た。溶媒を真空下にて除去し、残渣をエーテルで処理
し、淡黄色固体として1-（2-アミノ‐4-ベンゾキシ‐5-
ベンズアルデヒド）オキシ‐2-（２′‐アミノ‐５′‐
メチルフェノキシ）エタン‐N,N,N′,N′‐テトラ酸酸
テトラメチルエステル1.12g（収率96％）を得た。融点1
27〜129℃。
IR:1740,1660 NMR（CDCl3、250MHz）:10.32、ｓ、1H;7.40〜7.36、
ｍ、5H;7.29、ｓ、1H;6,75、ｄ、5Hz、1H;6.67、ｄ、5H
z、1H;6.65、ｓ、1H;6.30、ｓ、1H;5.11、ｓ、2H;4.2
3、brs、4H;4.19、ｓ、4H;4.11、ｓ、4H;3.59、ｓ、6H;
3.57、ｓ、6H;2.26、ｓ、3H 以下の操作に従い、4-ベンゾキシ基を分離し、対応す
る4-ヒドロキシ化合物を得た： エタノール20ml中、前記調製ベンズアルデヒド化合物
1.1g（1.60ミリモル）および炭素上10％パラジウム0.11
gの混合物を、大気圧下、75℃（かかる温度にて該ベン
ズアルデヒド化合物は溶解する）にて、３時間水素添加
した。ついで該溶液を塩化メチレンで希釈し、濾過し、
溶媒を真空下にて除去し、灰色粉末として4-ヒドロキシ
化合物0.98g（定量）を得た。融点130.5〜132.5℃。
IR:3400（br）、1740、1625 NMR（CDCl3、250MHz）:11.20、ｓ、1H;9.26、ｓ、1H;6.
91、ｓ、1H;6.79〜6.66、ｍ、4H;6.15、ｓ、1H;4.23、
ｓ、8H;4.12、ｓ、4H;3.608、ｓ、6H;3.605、ｓ、6H;2.
23、ｓ、3H MS（CI）:m/e591(M+H)+ ０℃に冷却したヘキサメチルホスホルアミド40ml中、
水素化ナトリウム43.0mg（2.20ミリモル）の懸濁液に、
前記調製ヒドロキシ化合物1.18g（2.0ミリモル）を加え
た。得られた溶液を５分間撹拌し、ブロモアセトアルデ
ヒド・ジメチルアセタール0.85g（5.0ミリモル）を一度
に加えた。溶液を85〜95℃にて3.5時間加熱し、ついで
室温にて冷却し、塩化メチレンで希釈し、塩化ナトリウ
ム溶液で５回洗浄し、有機層をNa2SO4上で乾燥し、溶媒
を除去し、残渣を塩化メチレン‐エーテルで処理し、1-
［2-アミノ‐4-（2,2-ジメトキシエトキシ）‐5-ベンズ
アルデヒド］オキシ‐2-（２′‐アミノ‐５′‐メチル
フェノキシ）‐エタン‐N,N,N′,N′‐テトラ酢酸テト
ラメチルエステル1.12g（収率83％）を得た。
IR:1220 NMR（CDCl3、250MHz）:10.27、ｓ、1H;7.28、ｓ、1H;6.
76〜6.65、ｍ、3H;6.30、ｓ、1H;4.70、ｔ、5.1Hz、1H;
4.23、ｓ、8H;4.11、ｓ、4H;4.02、ｄ、5.1Hz、2H;3.59
9、ｓ、6H;3.585、ｓ、6H;3.47、ｓ、6H;2.26、ｓ、3H MS（CI）:679m/e(M+H)+ 氷酢酸25ml中、前記調製中間体0.17g（0.25ミリモ
ル）の溶液に、96％H2SO40.028ml（0.50ミリモル）を加
え、該系を室温にて24時間撹拌した。ついで、該溶液を
水で希釈し、クロロホルムで繰り返し抽出し、有機層を
硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶媒を真空下にて除去し
た。橙色残渣を、75℃にて６時間、氷酢酸で処理した。
純粋な生成物、1-（6-アミノ‐2-ベンゾフルアルデヒド
‐5-オキシ）‐2-（２′‐アミノ‐５′‐メチルフェノ
キシ）エタン‐N,N,N′,N′‐テトラ酢酸テトラメチル
エステル0.09g（59％、融点146〜147℃）を前記のよう
に単離した。
IR:1748、1680 NMR（CDCl3、250MHz）:9.72、ｓ、1H;7.44、ｓ、1H;7.1
0、ｓ、1H;6.95、ｓ、1H;6.75〜6.67、ｍ、3H;4.30、
ｓ、2H;4.29、ｓ、2H;4.23、ｓ、4H;4.12、ｓ、4H;3.5
9、ｓ、6H;3.56、ｓ、6H;2.27、ｓ、3H MS（CI）:m/e615(M+H)+ 塩化メチレン10ml中、前記調製ベンゾフルアルデヒド
中間体0.22g（0.33ミリモル）の溶液に、1.3-プロパン
ジオール0.03g（0.36ミリモル）、つづいてp-トルエン
スルホン酸0.6mgを加えた。該溶液を３時間加熱還流
し、室温にて一夜撹拌し、塩化メチレンで希釈し、塩化
ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層をNa2SO4上で乾燥
し、溶媒を真空下にて除去し、黄色残渣を得、それを溶
出液としてエーテルの20％石油エーテルを用いるフラッ
シュクロマトグラフィーにより精製し、2-プロピレンジ
オキシベンゾフラノキシ中間体を得た。生成物収量は18
0mg（81％）であった。融点147〜148℃。
IR:1165 NMR（CDCl3、250MHz）:7.01、ｓ、1H;6.99、ｓ、1H;6.7
9〜6.60、ｍ、4H;5.66、ｓ、1H;4.28、brs、4H;4.17、
ｓ、4H;4.12、ｓ、4H;4.06〜3.93、ｍ、4H;3.56、ｓ、6
H;3.53、ｓ、6H;2.26、ｓ、3H;1.57〜1.40、ｍ、2H MS（CI）:673m/e(M+H)+ 前記調製中間体のエステル基を、以下のように加水分
解した。該中間体0.22g（0.32ミリモル）をTHF4mlに溶
かした。この溶液に、水4mlに溶かした水酸化リチウム
モノ水和物0.134g（3.2ミリモル）を加え、該溶液を室
温にて一夜撹拌した。希塩酸溶液を加え、pHを４〜５に
調製し、得られた油状物を塩化メチレンで抽出し、水お
よび塩化ナトリウム溶液で洗浄し、Na2SO4上で乾燥し、
溶媒を真空下にて除去し、N,N,N′,N′‐テトラ酢酸2-
プロピレンジオキシベンゾフラノキシ中間体0.196g（収
率99％）を得た。融点110〜111℃（ｄ）。
IR:3400〜2540 NMR（CDCl3、250MHz）:7.18、ｓ、1H;6.96、ｓ、1H;6.8
0、ｓ、1H;6.71、ｓ、1H;6.66、ｓ、2H;5.67、ｓ、1H;
4.27、brs、4H;4.10、ｓ、4H;4.01、ｓ、4H;2.22、ｓ、
3H MS（FAB）:m/e617(M+H)+ 氷酢酸5ml中、前記調製中間体0.05g（0.08ミリモ
ル）、チオヒダントイン0.01g（0.09ミリモル）および
酢酸アンモニウム0.02g（0.29ミリモル）の混合物を75
℃に加熱し、その温度にてすべての固形成分は溶解し
た。この温度にて1.5時間撹拌した後、橙‐赤色沈澱物
が形成した。この沈澱物をエーテルで処理し、橙色粉末
として1-［6-アミノ‐2-（5-オキソ‐2-チオキソ‐4-イ
ミダゾリジニリデン）メチル‐5-ベンゾフラニルオキ
シ］‐2-（２′‐アミノ‐５′‐メチルフェノキシ）エ
タン‐N,N,N′,N′‐テトラ酢酸0.035g（収率67％）を
得た。融点164.5〜167℃。
IR:3600〜2500、1726、1490、1192 NMR（DMSO-d6、250MHz）:12.0、ｍ、2H;7.36、ｓ、1H;
7.23、ｓ、1H;7.18、ｓ、1H;7.05、ｓ、1H;6.80、ｓ、1
H;6.65、ｓ、2H;6.49、ｓ、1H;4.29、ｓ、4H;4.13、
ｓ、4H;3.99、ｓ、4H;2.22、ｓ、3H MS（FAB）:m/e657(M+H)+ 炭酸カリウム0.002g（0.015ミリモル）を、乾燥DMF2m
l中、前記調製テトラカルボン酸化合物2.0mg（0.003ミ
リモル）の溶液に加えた。混合物を室温にて0.5時間撹
拌し、トリプロピルアミン0.001ml（0.006ミリモル）を
一度に加え、該系を0.5時間撹拌した。酢酸ブロモメチ
ル45.0mg（0.03ミリモル）を加え、５分間撹拌した後、
薄層クロマトグラフィー（シリカ、塩化メチレン中、20
％メタノール）は、すべての出発物質が消耗され、より
極性の小さい成分が形成されていることを示した。溶媒
を真空下にて除去し、残りの固体を水、ついでエーテル
で処理し、1-［6-アミノ‐2-（5-オキソ‐2-チオキソ‐
4-イミダゾリジニリデン）メチル‐5-ベンゾフラニルオ
キシ］‐2-（２′‐アミノ‐５′‐メチルフェノキシ）
エタン‐N,N,N′,N′‐テトラ酢酸テトラアセチルオキ
シメチルエステル2mgを得た。
NMR（DMSO-d6、250MHz）:7.50〜6.57、ｍ、7H;5.60、
ｓ、4H;5.59、ｓ、4H;4.28、brs、4H;4.14、ｓ、4H;2.2
1、ｓ、2H;2.00、ｓ、12H MS（FAB）:m/e945(M+H)+ 実施例２ チオヒダントインの代わりにロダニンを用い、実施例
１の操作に従い、以下の化合物： 1-［6-アミノ‐2-（5-オキソ‐2-チオキソ‐4-チアゾ
リジニリデン）メチル‐5-ベンゾフラニルオキシ］‐2-
（２′‐アミノ‐５′‐メチルフェノキシ）エタンN,N,
N′,N′‐テトラ酢酸およびそのテトラアセチルオキシ
メチルエステルを調製する。
実施例３ 2-ヒドロキシメチル‐5-ヒドロキシインドールを、ト
リ硝酸ランタン、硝酸ナトリウムおよび水性塩酸で処理
し、5-ニトロ誘導体を得る。5-ヒドロキシ基を塩化トリ
メチルシリルを用いて保護し、ジクロロメタン中の酸化
マンガンで処理し、ついで室温にてテトラヒドロフラン
中、フッ化テトラブチルアンモニウムで処理することに
より、2-ヒドロキシメチル基を酸化し、4-ヒドロキシ‐
5-ニトロ‐2-インドールアルデヒドを得る。
前記調製アルデヒドを、実施例１に記載の操作により
1,3-プロパンジオールと反応させ、2-プロピレンジオキ
シインドール中間体を得る。
ジメチルホルムアミド中、前記調製プロピレンジオキ
シ化合物、3-ブロモエトキシ‐4-ニトロトルエンおよび
炭酸カリウムの混合物を、130℃にて２時間加熱する。
該生成物は、1-（6-ニトロ‐プロピレンジオキシ‐5-イ
ンドリルオキシ）‐2-（２′‐アミノ‐５′‐メチルフ
ェノキシ）エタンである。
前記調製中間体のニトロ基を、エタノール中、炭素上
白金を用い、室温にて10時間、水素添加することにより
アミノ基に還元する。
該ジアミノ中間体を、アセトニトリル中、ブロモ酢酸
メチルおよび二リン酸ナトリウムで処理し、96時間還流
し、N,N,N′,N′‐テトラ酢酸テトラメチルエステル
（ＺがNHである式Ｂの化合物）を得る。
実施例１の操作により、該エステル基を酸基に加水分
解し、得られた中間体をチオヒダントインと反応させ、
1-［6-アミノ‐2-（5-オキソ‐2-チオキソ‐4-イミダゾ
リジニリデン）メチル‐5-インドリルオキシ］‐2-
（２′‐アミノ‐５′‐メチルフェノキシ）エタンN,N,
N′,N′‐テトラ酢酸を得る。
実施例１の操作により、前記調製テトラ酢酸を酢酸ブ
ロモメチルと反応させて対応するテトラアセチルオキシ
メチルエステルを製造する。
実施例４ 2-ヒドロキシメチル‐5-ヒドロキシベンゾチオフェン
を対応するインドールの代わりに用い、実施例３の操作
により、以下の化合物： 1-［6-アミノ‐2-（5-オキソ‐2-チオキソ‐4-イミダ
ゾリジニリデン）メチル‐5-ベンゾチエニルオキシ］‐
2-（２′‐アミノ‐５′‐メチルフェノキシ）エタンN,
N,N′,N′‐テトラ酢酸およびそのテトラアセチルオキ
シメチルエステルを調製する。
以下の操作は、２つの異なる細胞型および測定系にお
ける細胞内カルシウム濃度の測定についての本発明のテ
トラカルボキシレート化合物の有用性を示す。
カルシウムイオノフォールに対するリンパ球サブセット
応答のフロー血球計算法による測定 ヒト辺縁血液単核細胞を、密度勾配分離法により精製
する。25mMHEPES緩衝液（pH7.3〜7.4）、２％自己血清
および0.5〜2.5μＭのテトラカルボキシレート化合物を
含有するRPMI1640培地において、37℃にて45分間インキ
ュベーションすることにより、細胞（４×106/ml）を本
発明のテトラカルボキシレート化合物で負荷する。エス
テル基は、（例えば、トシエン，アール・ワイ（Tsien,
RY）、ネイチャー（Nature）、290:527〜528、1981に記
載されているように）荷電形の指示薬をトラップする細
胞内エステラーゼにより切り離され、その遊離カルボキ
シル基がカルシウムとキレート環を形成する。負荷後、
細胞をRPMI-HEPES-2％血清培地で３回洗浄し、２部に分
ける。一つは、フロー血球計算解析が行われるまで（負
荷の１〜2.5時間後）、培地中、４×106/mlおよび室温
にて保持する。もう一つは、４℃にて15分間、RPMI-HEP
ES-2％血清中、製造主の奨励する濃度でインキュベーシ
ョンすることにより、特異的リンパ球サブタイプ（subt
ype）を認識するフルオレセイン−標識抗Leu2a、抗Leu3
a、抗Leul1aおよび／または抗HLA-DR抗体で標識化する
（ベクトン・ディッキンソン・イムノサイトメトリー・
システム）（Becton Dickinson Immunocytometry Syste
ms）。抗体標識化後、細胞を３回洗浄し、フロー血球計
算解析を行うまで、同一培地中、４×106/mlおよび室温
にて保持する。ヨウ化プロピジウムを排除する能力によ
り、解析時点での細胞生存能力を評価する。
フロー血球計算解析は、488nmで200mWの励起を付与す
るアルゴンイオンレーザーを備えたコールター（Coulte
r）EPICS753で行う。直角スキャター（scatter）を、48
8nmロングパスダイクロイックミラーおよび488nmバンド
パスフィルターを用いて収集する。フォワードおよび直
角分散の励起光を用いてリンパ球を単球と区別し、蛍光
ヒストグラムを特異的リンパ球スキャター域において収
集する。「抗体」（フルオレセイン）蛍光を、560nmシ
ョートパスダイクロイックミラーおよび525nmバンドパ
スおよび515nmロングパスフィルターを用いて収集す
る。「カルシウム」蛍光を620nmショートパスダイクロ
イックミラーおよび665nmロングパスフィルターを用い
て収集する。遊離形（非カルシウム結合）は、488nmの
光によって選択的に励起されているため、665nmよりも
大きな波長でのシグナル強度は細胞内カルシウム濃度に
対して反比例の関係にあるはずである。
フロー血球計算解析は、室温、培地中での細胞100μ
ｌを、37℃培地400μｌと混合し、10μＭイオノマイシ
ン（ionomycin）、20μg/mlフィトヘムアグルチニン、1
0μg/ml抗ヒト免疫グロブリンまたは他の適当な刺激剤
を加え、または加えるとなく、37℃にて５分間、時間に
対する蛍光を蓄積させて行う。刺激剤での処理による細
胞内カルシウムの上昇が蛍光強度の減少をもたらし、個
々のリンパ球サブセットの応答は、励起用のシグナル可
視波長レーザーラインを用いて測定することができる。
インド−１を用いるフロー血球計算法により同様な測定
を行うには、一般に、５〜10倍の高負荷濃度の指示薬色
素を用い、２つの別個のレーザーを必要とし、そのうち
１つはuv能を有しなければならない（ラビノビッチら
（Rabinovitchet al.、ジャーナル・オブ・イムノロジ
ー（J.Immunol.）、137:952〜961、1986）。
個々のA10の平滑筋細胞におけるバソプレシン刺激に対
する応答の定量的顕微鏡測定 A10平滑筋細胞培養をカバースリップ上にプレート
し、対数期の増殖を試験する。細胞を、37℃にて30分
間、Ca2+およびMg2+、5mMグルコース、15mM HEPES、0.1
％ウシ血清アルブミンおよび５μＭ色素を含有するpH7.
2のダルベッコ（Dulbecco）リン酸塩緩衝食塩水中にて
インキュベーションすることにより、指示薬色素（イン
ド−１または本発明のテトラカルボキシレート化合物）
で負荷する。負荷後、細胞を３回洗浄し、顕微鏡解析を
行うまで同一の緩衝塩溶液中、室温にて保持する。
解析は、5Wのアルゴンイオンレーザーおよび蛍光定量
用のデュアル・フォトマルチピア・チューブ（dual pho
tomultipier tube）を備えたメリディアン（Meridian）
ACAS470を用いて実施する。356〜365nmでのレーザー出
力100mWを用い、カルシウム‐結合インド−１の蛍光を
励起し、それを405nmバンドパスフィルターを用いて収
集する。488nmでのレーザー出力100mWを用い、カリシウ
ム‐遊離テトラカルボキシレートの蛍光を励起し、それ
を640nmロングパスフィルターを用いて収集する。すべ
ての解析は室温にて実施する。シグナル細胞を顕微鏡対
象レンズの中心に置き、ついで１分間、繰り返してスキ
ャン（３秒／スキャン）させ、基線蛍光濃度を確立す
る。１分にて、グルコース塩溶液をシリンジを介して速
やかに採取し、等容量の100nMバソプレシン含有溶液で
置き換える。バソプレシンはこの細胞型の内部ストアー
からのカルシウムの放出および外部培地からのカルシウ
ムの吸収を刺激することが知られている。刺激後約２分
間、反復スキャンを続ける。
細胞内カルシウムにおけるバソプレシン刺激の増加
は、カルシウム‐テトラカルボキシレート遊離形の減
少、すなわち、488nm−励起蛍光の減少をもたらす。逆
に、該増加は、カルシウム−結合形のインド−１の増加
およびその356〜365nm励起蛍光の増加をもたらした。両
方の指示薬とも応答の程度および時期で同様の評価が得
られる。しかしながら、インド−１はuvレーザー能のな
い系においては用いることができないが、テトラカルボ
キシレートは用いることができる。また、インド−１
は、クローニング用に使用する皿のuv吸収特性のため、
カルシウム応答を示す（または欠いている）クローン細
胞に用いることができない。しかしながら、本発明のテ
トラカルボキシレートはクローニング研究の使用に好適
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｄ 409/06 ２３３ 417/04 ３０７ 417/06 ３０７ // Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｋ 33/84 Ｚ (72)発明者 キャサリン・アン・ミューアヘッド アメリカ合衆国ペンシルベニア州19380、 ウエスト・チェスター、カスウォーレン・ ドライブ226番

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】式： ［式中、Ｒは水素またはアセトキシメチル、R1はメチル
    またはエチル、Ｚは酸素、硫黄またはNHおよびＹはNHま
    たは硫黄を意味する］ で示される化合物、またはＲが水素である場合、そのナ
    トリウム、カリウムまたはリチウム塩。
  2. 【請求項２】Ｒがアセトキシメチルである請求項（１）
    記載の化合物。
  3. 【請求項３】R1がメチルである請求項（１）記載の化合
    物。
  4. 【請求項４】R1がメチル、Ｚが酸素およびＹがNHである
    請求項（１）記載の化合物。
  5. 【請求項５】R1がメチルである請求項（２）記載の化合
    物。
  6. 【請求項６】R1がメチル、Ｚが酸素およびＹがNHである
    請求項（２）記載の化合物。
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