JPH02225498A - 新規インスリン誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 知られているように糖尿病（ｄｉｓｅａｓｅ　ｄｉａ−
ｂｅｒｅｓ　ｍｅｌｌｉｔｕｓ）の治療には相当量のイ
ンスリンおよびインスリン誘導体が必要であり、またそ
れらの一部は工業的規模で生産されてもいる。

様々な作用プロフィールをもった相当数の既存のインス
リン組成物および修飾物が存在するにも拘らず、個体相
互間のおよび個体自体内の変動を伴う生物間座の故に、
一般と異なる性質および作用特徴を有する別のインスリ
ン生成物が依然として必要とされている。

遅延作用を有するインスリン誘導体は、例えばＥＰ−Ｂ
　１３２．７６９およびＥＰ−Ｂ　１３２．７７０など
に記載されている。これらは詳細には、次の式ｌ：（こ
こで式中、 Ｒ１はＨまたはＨ−Ｐｈｅを表わし、 Ｒ工０は中性で、遺伝子的にコード化可能なし一アミノ
酸の残基であり、そして Ｒ″１は事実上（ｉｎ　ｎａｔｕｒｅ）塩基性であって
５０個までの炭素原子を有し、その構造には０〜３個の
Ｃ−アミノ酸が関与し、そして適切な場合に存在する末
端カルボキシル官能が遊離状態で、エステル官能として
、アミド官能として、ラクトンとして存在するか、また
はＣＢ、ＯＨに還元されていてもよい、生理学的に許容
し得る有機基を表わす） で示される、インスリンＢ鎖のＲ３１位が基本的に修飾
されｔ；誘導体である。

これらインスリン誘導体の特徴は５．８〜８．５の等電
点（等ｔフォーカシングにより測定）である。

等電点（これは未修飾天然インスリンまたはプロインス
リン等電点（ｐＨ−５，４）と比較すると中性域にシフ
トしている）は、塩基性修飾の結果分子表面に局在する
付加的な陽性荷電によって決まる。これによって塩基性
修飾を伴うこれらインスリン誘導体は、例えば中性域で
は通常溶解状態にある天然インスリンまたはプロインス
リンよりも、生理学的中性域における溶解性が低下する
。

式ｌで示される塩基性修飾を伴うインスリン誘導体の遅
延またはデボ−作用は、等電点における難溶性に由来し
ている。前記二つの刊行物には、誘導体に応じてトリプ
シンまたはトリプシン様および／またはカルボキシペプ
チダーゼＢまたはカルボキシペプチダーゼＢ様および／
またはエステラーゼ活性により生じる付加的塩基性基の
除去によって、生理学的条件下におけるインスリン誘導
体の再溶解が達成されると記載されている。各場合に除
去される基は純生理学的代謝物であるか、または易代謝
性の生理学的に許容し得る物質である。

インスリンを塩基性修飾した結果としての前述のデボ−
原理は、その後、更に、主としてＡＳよびＢｌＩ内を塩
基性修飾した他のインスリン誘導体（例えばＥＰ−Ａ　
Ｏ，１９４，８６４およびＥＰ−ＡＯ，２５４，５１６
参照）の提供および相当する使用により利用されている
。

Ａ８位を超えたＡ鎖延長部に塩基性修飾を有するいくつ
かのインスリン誘導体も知られている（Ｐ、　Ｒ５５ｅ
ｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｍ、　Ｊ、　　（
１９８０）＋　　１８６゜９４５−９５２参照）、修ｆ
ｉ成分として塩基性アミノ酸を有するかかるインスリン
誘導体として、前記文献には特定的に、 Ｌｙｓ−Ａｒｚ−Ｇｌｙ”−ウシインスリン、Ａｒｇ−
Ｇｌｙ”−ウシインスリン、 Ａｒｇ−Ａｒｚ−Ｇｌｙ”−ウシインスリン、およびＡ
ｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇ　ｌｙ”−ウシインスリンが
記載されている。これらのインスリン誘導体は未修飾イ
ンスリンに比べ相当にマイナーな生物活性を有するもの
とされている（特に前記文献記事中の第９４７頁の第１
表参照）、シかしながら、究極のデボ−活性については
前記記事中には全く關示されていない。

糖尿病の疾病を有利に治療すべく前述のデポ−ａ理を更
に拡大しそして利用可能にしようとして、研究の結果こ
のたび、塩基性修飾を伴う新しいインスリン誘導体群を
見出しｔ；、これらはＡＯ位に塩基性アミノ酸アルギニ
ンが局在する次の式■で示されるインスリン誘導体であ
る：（ここで式中、 ａ）　　Ｒ”＋Ｒ”−ＯＨまたは ｂ）Ｒ”−中性の、遺伝子的にコード化可能な、Ｌ−ア
ミノ酸、および Ｒ”−ＯＨまたは事実上（ｉｎ　ｎａｔｕｒｅ）塩基性
であって５０個までの炭素原子を有し、その構造に０〜
３個のａ−アミノ酸が関与しそして適切な場合には存在
する末端カルボキシル官能が遊離状態で、エステル官能
として、アミド官能として、ラクトンとして存在するか
またはＣＨ！ＯＨに還元され得る、生理学的に許容し得
る有機基。

ただし、同時にＲ”ｍＡｌａ％Ｒ３１鴫ＯＨであって八
−およびＢ−鎖がウシインスリンの配列である場合（す
なわち、　ＡＱ−Ａｒｇ−ウシインスリン〕を除く、）
。

これらのインスリン誘導体の生理学的に許容し得る塩（
例えばアルカリ金属またはアンモニウム塩）も本発明に
包含される。

これらの新規インスリン誘導体は、　ＡＱ位が塩基性修
飾される結果（やはり塩基性修飾を有する既知のインス
リン誘導体と同様）遅延作用プロフィール、および（塩
基性修飾を有する既知のインスリン誘導体と比較した場
合）体内許容性に関し、際立った長所を冑している。ま
たＰ。

Ｒ５５ｅｎ　ａｔ　ａｌ、の前述の論文に鑑みれば、そ
れらの生物活性が天然インスリンのそれに対応するとい
うことは全く驚くべきことでもおる。

ａ）Ｒ”十Ｒ”−ＯＨである式■の化合物は対応する１
０−Ａｒｇ−ｄａｌｏ−Ａｒインスリンである；これら
の化合物は特に好ましい。

ｂ）あるいはまた、式■のＲ１０−中性の、遺伝子的に
コード化可能なし一アミノ酸、およびＲｊｌ・ＯＨまた
は事実上塩基性であって５０個までの炭素原子を有する
相当する生理学的に許容し得る有機基であってもよい。

中性の、遺伝子的Ｓ；フード化可能なＬ−アミノ酸（Ｒ
３＠について）は、ｃｌｙ％Ａｌａ、　Ｓｅｒ％Ｔｈｒ
。

Ｌａｌ、Ｌｅｕ、　ｌｉｅ、　Ａｓｎ、　Ｇｌｎ、　Ｃ
ｙｓ、　Ｍｅｔ、　ＴｙｒｓＰｈｅおよびＰｒｏであり
、そしてＡｌａ％　ＴｈｒおよびＳｅｒが好ましく、特
に丁ｈ「が好ましい。

Ｒ３１・ＯＨである場合には、生成するインスリン誘導
体は対応するインスリンとは、ＡＱ位（Ａｒｇ）が修飾
されている点のみ異なる。特に好ましい中性の遺伝子的
にコード化可能なし一アミノ酸であるＴｈｒ、およびＡ
８よびＢ１−Ｂ２９Ｍがヒトインスリン配列の場合、こ
れはＡＱ−Ａｒｇ−ヒトインスリンである。

２口が、事実上塩基性でありそして５０個までの炭素原
子を有する相当する生理学的に許容し得る有機基である
場合、得られるインスリン誘導体は基本的にＡＱ位に付
加的Ａｒｇ！ｉ基が存在する点でのみ、導入部に記載の
刊行物ＥＰ−Ｂ１３２．７６９およびＥＰ−Ｂ　１３２
．７７０による塩基性修飾を有するインスリン誘導体と
異なる。

Ｒ３１の構造のぽ−アミノ酸が全く関与しない場合、こ
のラジカルに適した塩基性基の例は次のとおりであるニ
アミノ−（Ｃｔ〜Ｃａ）−アルコキシ、（ｃｔ”ｃａ）
−アルキルアミノ−（Ｃ，〜ｃｍ）−アルコキシ、ジー
（ＣＳ−Ｃ４）−アルキルアミノ−（Ｃ３−〇、）−ア
ルコキシ、トリー（Ｃ＋〜Ｃａ）−アンモニオ−（Ｃ８
〜Ｃ６）−アルコキシ、アミノ−（ｃｍ〜Ｃａ）−アル
キルアミノ、〔（０１〜Ｃ４）−アルキルアミノ）　−
（Ｃ１〜ｃｍ）−アルキルアミノ、ジー（Ｃｔ〜Ｃ，）
−アルキルアミノ−（Ｃ３〜Ｃ，）−アルキルアミノま
たは〔トリー（ＣＳ−Ｃ４）−アルキルアミノ）　−（
Ｃ＊〜Ｃ６）−アルキルアミノ、特に、−０−（ＣＨ，
〕、−ＮＲ，、−０−（ＣＨｘ）ｐ−Ｎ＠Ｒ，、−ＮＨ
−（ＣＨ，）、−ＮＲ，または−ＮＨ−（ＣＨｘ）ｐ−
Ｎ”Ｒｓ〔式中、ｐ−２〜６であり、モしてＲは同一で
あるかまたは異なり、そして水素まｔ；は（Ｃｔ〜Ｃ４
）アルキルを表わす〕。

３個までのＣ−アミノ酸がＲ１１の構造に関与する場合
、これらは主として中性または塩基性の天然Ｌ−アミノ
酸および／または後者に相当するＤ−アミノ酸である。

中性の天然アミノ酸は、特に、Ｇｌｙ％Ａｌａ、　　５
ｅｒｓ　　Ｔｈｒ、　　Ｖａｌ、ｌｅｕ。

ｌｉｅ％Ａｓｎ、　Ｇｉｎ、　Ｃｙｓ、　ＭｅＬ％Ｔｙ
ｒ、Ｐｈｅ％ＰｒｏおよびＨＶＩＰである。塩基性の天
然アミノ酸は、特に、Ａｒｉ　Ｌｙｓ％ａｙｌ、　Ｏｒ
ｎ、　Ｃｉｔおよび旧Ｓである。中性のσ−アミノ酸の
みが関与する場合　（Ｒ１Ｉを事実上塩基性とするため
には）その末端カルボキシル官能は遊離であってはなら
ない、゛反対にこの場合にはそのカルボキシル官能は塩
基性基でアミド化またはエステル化されていなければな
らず、またこのタイプの遥切な塩基性基は、例えば、Ｃ
−アミノ酸がＲｌｌの構造に全く関与しない場合につい
て既述した塩基性基である。

もちろん、これらの塩基性エステルまたはアミド基は塩
基性ａ−アミノ酸のカルボキシル官能をブロックするこ
ともできる。中性のエステルまたはアミド基、例えば（
Ｃ＋〜Ｃａ）−アルコキシ、（ＣＳ−Ｃ１）−シクロア
ルコキシ、Ｎｕ！、（Ｃ１〜ｃｍ）−アルキルアミノま
たはジー（Ｃ＋〜Ｃａ）−アルキルアミノなども、ブロ
ッキングが所望される場合、塩基性Ｃ−アミノ酸のカル
ボキシル官能のブロッキングに適切であり得る。

もちろん、末端カルボキシル官能は末端アミノ酸がヒド
ロキシアミノ酸である場合にのみラクトン形態であり得
る。

末端カルボキシル官能をＣＢ、ＯＨに還元することも更
に可能である。

Ｈｌｌは、好ましくは、１１２または３個の前述の塩基
性天然アミノ酸で構成される；Ｒ３１は特に好ましくは
Ａｒｇ−ＯＢまたはＡｒｇ−Ａｒｇ−ＯＢである。

Ｒｌｌの特に好ましい意味は、ＲＩ−ムＩａ、Ｔｈｒま
たはＳｅｒ、特にＴｈｒ、と組合せるのが好ましい。

Ｒ”ＴｈｒおよびＡｌｌおよびＢ１−Ｂ２９鎖−ヒトイ
ンスリン配列とした場合の結果はＡＯ−Ａｒｇ−Ｂ３１
Ａｒｇ−ＯＨヒトインスリンおよびＡＯ−Ａｒｇ−Ｂ３
１−Ａｒｇ−Ｂ３２−Ａｒｇ−ＯＨヒトインスリンテあ
る。

式゛■のＡ鎖およびＢ１−Ｂ２９鎖は基本的にあらゆる
可能なインスリンの配列であってよい、しかしながら、
それらは、好ましくは、ヒト、ブタまたはウシインスリ
ンの配列、特にヒトインスリンの配列（これはブタイン
スリンのＡｌ−Ａ２１およびＢｌ−Ｂ２９配列に一致す
る）である。

式■のインスリン誘導体の等電点は５．５〜９．０であ
る（導電フォーカシングにより測定）。

式Ｉのインスリン誘導体は ａ）次の弐■または■ 〔ここで式中、 Ｘ−同一のまたは異なる遺伝子的にコード化可能なし一
アミノ酸、 Ｙ　＝　ＬｙｓまたはＡｒｇｘ− ｎ＝０または１〜６０の整数、 Ｒ，およびＲ，−ＯＨまたは 天然アミノ酸の所望により誘導体化された！！基、また
は １〜９０個、好ましくは７０〜８０個、の天然アミノ酸
より成る所望により誘導体化されｔ；ペプチド残基。

Ｒ３−およびＲ１１は式Ｈにおけるのと同じ意味を有し
、そしてＡおよびＢ（１〜２９）鎖は好ましくはヒト、
ブタ、またはウシインスリンの、特にヒトまｔ；はブタ
インスリンの配列を有する。〕 で示されるインスリン生成物をリジルエンドペプチダー
ゼと接触させ、Ｌｙｓ残基のＣ末端の結合を開裂させ、
そして適切な場合（すなわちＹ＝Ａｒｇである場合）に
はトリプシンまｔ；はトリプシン様プロテアーゼとも混
合させ、ＢｖＡからＲ，−７部分を除去し、そして式１
［ａで示されるＡＯ−Ａｒｇ−ｄｅ−Ｒ３０−インスリ
ン誘導体を生成させ、および／または ｂ）弐ｎｂで示されるインスリン誘導体を製造するため
に、弐Ｈａで示されるＡＯ−Ａｒｇ−ｄｅ−Ｒ３０−イ
ンスリン誘導体をリジルエンドペプチダーゼまたはトリ
プシンの、またはトリプシン様プロテアーゼの存在下に
式Ｖ ＨＲＩＩ−Ｒ１１（ｙ　） （式中、Ｒ３０およびＲ″′は弐ｎｂについて特定され
た意味を有し、そして存在する遊離のＣ０ＯＨ，ＯＨ％
ＳＨ，ＮＨ，、グアニジノおよびｌまたはイミダゾール
官能は自体既知の方法で保護された形態であってもよい
） で示される化合物と反応させ、そして次に、適切な場合
に存在する保護基を自体既知の方法で除去し、または Ｃ）次の式■ ｄ）次の式■′ で示されるＡＯ−Ａｒｍ−ｄｅ−オクタペプチドＣＢ２
３〜３０）−インスリンをトリプシンまたはトリプシン
様プロテアーゼの存在下に次の式■Ｈ−Ｃ１ｙ−Ｐｈｅ
−Ｐｈｅ−丁ｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｅ−Ｒ”−１
”　　　　　（■　）（ここで式中、Ｒ３＠およびＲ３
Ｉはａ）およびｂ）において弐■について特定された意
味を有し、そして存在する遊離のＣｏｏｌ、　　ＯＨ％
　ＳＨ，ＮＢ、、グアニジノおよび／またはイミダゾー
ル官能は自体既知の方法で保護された形態であってもよ
い） で示される化合物と反応させ、そして次に適切な場合に
存在する保護基を自体既知の方法で除去し、または （ここで式中、Ｒ３１およびＲ３１は式！Ｉ　（ａ／ｂ
）におけるのと同じ意味を有し、そしてその反応性アミ
ノ基（ＡＩ−Ｇｌｙのアミノ基は除く）は既知の方法に
より保護された形態にある） で示されるインスリン（誘導体）を、アミノ基が同じく
既知の方法で保護されており、またＣ０ＯＨ基が適切な
場合には活性化された形態にあるアルギニンと反応させ
、そして次に存在する保護基を既知の方法で除去するこ
とにより製造することができる。

得られる弐■のインスリン誘導体は所望により既知の方
法て相当する生理学的に許容される壇に変えることがで
きる。

前述の変法ａ）〜ｄ）を以下詳細に説明する一変法ａ）
： 出発物質■および■の式の説明： 記号Ｘは弐■に存在しそして同一のまたは異なる遺伝子
的にコード化し得るアミノ酸である。

次のアミノ酸（各々Ｌ体）は遺伝子的にコード化可能で
ある： Ｇｌｙ％Ａｌａ％Ｓｅｒ％Ｔｂｒ、Ｖａ１％Ｌｅｕ、　
ｌｉｅ％ＡＳｐｓＡｓｎ、　Ｇｌｕ、　Ｇｌｎｘ　Ｃｙ
ｓ、　Ｍｅ５　Ａｒｇｓ　Ｌｙｓｓ旧５１Ｔｙｒ、　Ｐ
ｈａ、　Ｔｒｐ、　Ｐｒ。

式ＩＶのラジカルＲ３およびＲ３におけるまたはそれら
の為の中性アミノ酸は特にＧ１７．＾ｌａ、　Ｓｅｒ。

丁ｈｒｓ　　Ｖａ１％　Ｌｅｕｌ　１１ｅ％　Ａｓｎ、
　　Ｇ１ｎ５　　Ｃｙｓ、　　Ｍｅｔ。

Ｔｙｒ％Ｐｈｅｓ　Ｐｒｏ％Ｈｙｐ％Ａｒｔｓ　Ｌｙｓ
％ａｙ１％０ｒｎｓＣｉｔおよびＨｉｓ”Ｉ’ある。

アミノ酸およびペプチド鎖は常法により誘導体化するこ
とができる。すなわち、それらにアミノおよび／または
カルボキシル基に対しペプチド化学において慣用される
保護基を付与することができる。

弐ｍの化合物およびそれらのジスルフィド橋のない前駆
体は、好ましくは遺伝子工学的方法、特にＥＰ−Ａ　０
．２８９．９３６に關示された方法により製造される。

そこに記載された前駆体はサルインスリンに短ペプチド
架橋員を介して（所望により切線められた）　ｔｅｎｄ
ａａｉｓｔａｔが連結したものから成る融合タンパク質
である。このタイプの融合タンパク賞はストレプトマイ
セス類（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）細胞で発現さ
せ培地中に分泌させることができ、そこからそれらを特
に容易に単離することができる。西独特許出願Ｐ３８３
７２７３．８　（）ＩＯＥ　８８／Ｆ　３１３）は、イ
ンスリンＴＮＳの八およびＢ鎖が正しいジスルフィド橋
連結を有しモしてＣペプチドがアミノ酸リジンまで切線
められた特別に設計された融合タンパク質を提案してい
る。これと全く同様にして、Ｃ鎖がアミノ酸アルギニン
まで切線められた融合タンパク質を製造することができ
る。しかしながら、提案された方法の特に有利な改変は
、アミノ酸アルギニンのコドンを融合タンパク買の遺伝
子中に存在するリジンのコドンに結合させることより成
り、従ってその結果、そのＣ鎖がＬ’ｓ−Ａｒｇより成
る融合タンパク質が得られる。

相当する融合タンパク質はまた自体知られｔ；他°の方
法、例えばＥＰ−ムＱ、２２７．９３８　ＥＰ−ＡＯ，
２２９，９９８、ＥＰ−Ａ　　Ｏ，２８６，９５６およ
びＥＰ−ＡＯ，２９０，００５の方法により大脇菌（Ｅ
、　ｃｏｌｉ）で製造することもできる。

弐■の化合物、村よびそれらの前駆体は、個個の鎖 Ａｌ　　　　　　＾２１ 菫、−Ｙ石［α口団Ｒ３・−３ｍ１ を、好ましくは遺伝子工学により、例えば、ＥＰ−Ａ　
Ｏ，２８９，９：３６、ＥＰ−ム０．２Ｂ６．９５６、
ＥＰ−ＡＯ，２２９，９９８、ＥＰ−Ａ　　Ｏ，２２７
，９３８およびＥＰ−ＡＯ，２９０，００５の方法に従
って形成させることにより製造される０次いで、適切な
場合には適当な形の保護基を備えた鎖を自体既知の方法
により連結する。このタイプの方法については文献に様
々な記述がある（例えばＰ、Ｇ、　　Ｋａｔｓｏｙａｎ
ｎｉｓｅｔ　　ａｌ、、　　Ｊ、　　Ａｍ、　　Ｃｈｅ
ｗ、　　Ｓｏｃ、　　８５．　２８６３−２８６５（１
９６３）参照）。

変法ａ）を寅施するには、弐ｍまたは■の化合物を次に
、例えばリソバクター・エンザイモゲネス（Ｌｙｓｏｂ
ａｃｔｅｒ　ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓ）からのりジルエ
ンドペプチダーゼと水性溶液または懸濁液中で接触させ
る。純酵素の使用量（重量基準）は、弐ｍまたは■の出
発インスリン物質量の約ｌ／、。

〜１八＠＊＠＠＊が好ましく、約１八１．〜／Ｉ＊＠＠
＆が特に好ましい。

反応混合物のｐ）Ｉは比較的広い範囲にわたって変え得
る。しかしながら、約５．５〜１Ｏ０５の範囲が好まし
く、約７〜９の範囲が特に好ましい。

反応温度は好ましくは室温である。

反応時間は主として酵素量に依存し、そして数分〜数日
、好ましくは数時間である。

酵素リジルエンドペプチダーゼはリジンのカルボキシル
側にアミノ酸リジンを含有するペプチド鋼を開裂する。

従って、弐ｍおよび■の化合物より得られるものは、（
Ｙ−Ｌｙｓの場合”）　ＡＯ−Ａｒｇ−ｄｅ−Ｂ２Ｏ−
インスリンであり、これは自体既知の方法により精製す
ることができる。出発化合物ｍおよび■のＹがＡｒｇで
ある場合には、基Ｒｔ−Ｙ−ＰｈｅがＢ鎖のＮ−末端に
保持される０次にＢ鎖からのラジカルＲ，−Ｙ（＝Ｒ，
−Ａｒｇ）の除去を、引続きトリプシンまたはトリプシ
ン様プロテアーゼによる開裂により行う必要があるが、
これは、中間生成物（Ｒ＋−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−・・・）
の単離を行うことなく、またはその後で行うことができ
る。

次いで、形成されるＡＯ−Ａｒｇ−ｄｅ−Ｂ２Ｏ−イン
スリン誘導体の単離および精製を既知の方法で行う。

文献にはリジルエンドペプチダーゼはトリプシン様エン
ドペプチダーゼに包含され、また、しばしばそれらに加
えても記載される。ここでは後者の見解を選択する。

変法ｂ）； これは、式Ｖの化合物を（例えば変法ａ）により得られ
る）　ＡＯ−Ａｒｔ−ｄｅ−Ｂ２Ｏ−インスリン誘導体
（式！＆で示される）に連結して式ＨｂのＡＯ−Ａｒｇ
−インスリンまたは−インスリン誘導体とするカプリン
グ反応である。これは自体既知の方法により、例えばＥ
Ｐ−Ｂ　０．０５６．９５１にトランスアミド化につい
て記載された方法と同様にして行われる。

この場合に保護基を惰えた出発物質を用いたときは、保
護基は最後に既知の方法で再び除去すべきである。

変法ｃ）： 式■の出発物質は、変法ａ）の出発物質と同様にして得
ることができる０式■のペプチドとの連結は自体既知の
方法で行われる（例えばＩｎｏｕｙｅ　　ｅｔ　　ａ！
、、　　Ｊ、　　Ａｍ、　　Ｃｈｅｗ、　　Ｓｏｅ、　
　！コ）１．　７５１−７５２（１９７９）参照）。

この場合も、（保護基を設けた出発物質を用いたときは
）保護基は最後に再び除去すべきである。

変法ｄ）： これは式■′のインスリン誘導体のＡＯ位へのアルギニ
ンＭｌｌｉである。

式■′のインスリン誘導体（この場合にはＡ　ｌ　−Ｇ
ＩＹのアミノ基は未保護のままにしておかねばならない
）およびアミノ酸アルギニンのいずれにおいても、アミ
ノ基に適した保護基は、ペプチド化学においてアミノ基
に慣用される保護基、例えばベンジルオキシカルボニル
、ｔａｒｔ−フｆルオキシ力ルポニルまたはフルオレン
−９−イル−メトキシカルボニル基である。

遊離カルボキシル基を有する出発アルギニンを用いると
きは、ＡＩ−Ｇｌｙとの連結をカルボジイミドを用いて
行うのが便利である。あるいは、カルボキシル基を“活
性化する“、すなわち、それを実際の反応の前に、活性
化された形、例えば酸ハライドまたはアジドの形に変え
るのが便利である。

式Ｈ（ａ／ｂ）のインスリン誘導体およびその生理学的
に貯容し得る塩は、主として、糖尿病治療用薬学的ｉ酸
物の為の活性物質として用いられる。

従って、本発明は、少くとも一種の式■のインスリンお
よび／または少くとも一種のその生理学的に許容し得る
塩を、溶解された、無定形のおよび／または結晶の形、
好ましくは無定形のおよび／または結晶の形で含む薬学
的組成物にも関する。

この薬学的組成物に好ましい式■のインスリン誘導体は ＡＯ−Ａｒｍ−Ｄｅ−Ｂ２Ｏ−ヒトインスリン、ＡＯ−
Ａｒｇ−ヒトインスリン、 ＡＯ−Ａｒｇ−Ｂ３１−Ａｒｇ−ＯＨ−ヒトインスリン
およびＡＯ−Ａｒｍ−Ｂ３１−Ａｒｇ−Ｂ３２−Ａｒｇ
−ＯＲ−ヒトインスリンおよびそれらの生理学的に許容
される塩である。

この薬学的組成物は好ましくは、 適当な張度調節剤（ｔｏｎｉｃｉｚｉｎｇ　ａｇｓｎｔ
）、適当な保存剤、および適切な場合には適当な緩衝剤
、 および適切な場合には、ある亜鉛イオン濃度または他の
デポ−主剤（ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）例えば硫酸プロタミ
ン、 をもちろんすべて滅菌水性溶液または懸濁液中に含有す
る約３．０〜９．０、好ましくは約５．０〜８．５のｐ
Ｈを有する注射用溶液または懸濁液である。

活性物質以外の組成物成分全体が組成物ビヒクルを形成
する。

適当な張度調節剤の例はグリセロール、グルコース、マ
ンニトール、ＮａＣ６，カルシウムまたはマグネシウム
化合物、例えばＣａＣＱｌ、ＭｇＣ４，などである。

適当な保存剤の例はフェノール、ｍ−クレゾール、ベン
ジルアルコールおよび／またはｐ−ヒドロキシ安息香厳
エステルである。

特に約５．０〜８．５にｐＨを調節するのに用いること
ができる緩衝物質の例は、酢酸ナトリウム、クエン酸ナ
トリウム、燐酸ナトリウムなどである。その他、ｐＨｒ
ＩＲｓに適しているのは生理学的に許容し得る希酸ＣＡ
ｍ的にはａＣｃ）またはアルカリ（典型的にはＭａｉ１
）である。

組成物が亜鉛を含有する場合、約ｌＪＩｇ〜２諺９、特
に約５μｇ〜２００μ９の亜鉛（ｌ諺ｇあたり）という
含有量が好ましい。

本発明の組成物の作用プロフィールを変えるために他の
修飾された（ＥＰ−Ｂ　１３２．７６９およびＥＰ−Ｂ
　１３２．７７０参Ｆ＠）および／または未修飾のイン
スリン、好ましくはウシ、ブタまたはヒトインスリン、
特にヒトインスリン、を混合することも可能である。

活性物置の好ましい濃度は、約１〜１５００．好ましく
は約５〜１０００、特に好ましくは約４０〜４００国際
単位／ｍａに相当する濃度である。

薬学的組成物は、少（とも一種の式ｌのインスリン誘導
体および／または少くとも一種のその生理学的に許容し
得る塩を、適切な場合には他の修飾されたおよび／また
は未修飾のインスリンまたはそれらの誘導体と共に、生
理学的に許容し得るビヒクルを用いて、適切な場合には
適当な添加剤および助剤と共に、適当な剤形に変えるこ
とにより製造される。

本発明を以下の！ｌ！施例により詳細に説明する。

変法ａ）によるＡＯ−ムｒｚ−ｄｅ−Ｂ３０−ヒトイン
スリンの製造 Ａ）弐■の出発物質の製造 ＡＩ） ｔｊｉ１表に記載の合成遺伝子（１）を自体既知の方法
でホスホルアミダイト法により化学的に合成する。スト
レプトマイセス類がＧおよびＣを好むことをコドンの選
択に際し考慮に入れた。

ＥＰ−Ａ　Ｏ，２Ｂ９．９３６　（そこに記載される第
２表）におけるサルプロインスリンをコードする遺伝子
と同様、第１表に示された遺伝子も５′末端に制限酵素
ＥｃｏＲＩに典型的な突出配列を有する。構造遺伝子の
下流には２個の停止コドンおよび酵素５ａｌｌの認識部
位を有するリンカ−配列が存在する。３′末端には制限
酵素Ｈｉｎｄｍに対応する突出配列が存在する。

高菜的に入手可能なプラスミドｐＵｃ１９を酵素Ｅｃｏ
ＲＩおよび旧ｎｄ！Ｉ［で切断し、そして第１表に示さ
れた合成遺伝子（１）を連結する。これによりプラスミ
ドｐ１３　　（２）が得られる。増幅後、合成遺伝子を
酵素ＥｃｏＲＩおよび５ａｉｌを用いて断片（３）とし
て切り出す。

プラスミドｐｔｌｃ１９をＳ■ａｌで完全に消化し、そ
して第２表に示されたターミネータ配列（４）に連結す
る。正しい方向にこの配列を含むプラスミドをｐＴ３　
（５）と呼ぶ。

このプラスミド（５）をＥｃｏＲＩで屍き、モして回層
部位をＤＮＡポリメラーゼで填める（Ｋｌａｎｏｗ断片
）、再連結によりプラスミドｐＴ４　（６）が得られる
。このプラス・ミドを酵素５ａｉｌおよびｓｐｈ　Ｉで
開きそして大断片（７）を単離する一 プラスミドｐＫＫ４００　（８）　（ＵＰ−＾−０，２
８９，９３６の第４図（２０）参照）を５ｐｈ１８よび
ＥｃｏＲＩで切断し、そしてｔｅｎｄａ園１ｓＬａＬ遺
伝子を有する小断片（９）を単離する。

断片（３）、（７）および（９）の連結により、Ｌｅｎ
ｄａｍｉｓＬａＬ配列の次に１２個のアミノ酸をコード
する架橋員 Ｐｈｓ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｍａｔ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｇ
ｌｙ　Ａｓｎ　Ｓａｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　１ｙｓＴＴＣ
ＡＡ丁　ＣＣＧ　　ＡＴＧ　　ＧＣＣＡＣＣＧＣＧ　　
ＡＴＴ　　ＴＣに　　ＡＡＣＧＧＣＡＡＧＡＡＧ　　Ｔ
ＴＡ　　ＣＧＣ丁ＡＣＣＯＯＴＣＧ　　ＣＣＣＴＡＡ　
　ＡＣＣＴＴに　　ＣＣＧ　　ＴＴＣｒｏＲＩ そして、その後に修飾されたプロインスリンの遺伝子が
（るプラスミドｐＫＫ７００　（１０）が得られる。こ
のアレンジメントの正しさをｓｐｈ　Ｉおよび５ｓＬＩ
で切断することによりチエツクしたところ、約３．５ｋ
ｂのサイズのプラスミドから８２６ｂＰの断片が得られ
る。ジデオキシ法によるＤＮＡ配列決定により、配列の
正しいことが確認されている。

Ｃペプチドとして働＜　Ｌｙｓがムｒｇにより置き換え
られた遺伝子構成は同様にして製造される。

このためには、ＬｙｓをコードするトリプレットをＣＣ
Ｃで置き換える。プラスミドｐ１５、およびこれよりベ
クターｐＫＫ８００が同様にして得られる。

第１図はここに記載したＡｔ法による遺伝子構築を説明
したものであるが、スケールは真実のものではない。

Ａ２） ＥＰ−Ａ　Ｏ，２８９，９３６に記載のベクターｐＧＦ
　ｌと同様にして、ベクターｐＨｃ７００８よびｐＫＫ
８００から発現プラスミドｐＧＦ４およびｐＧＦ５を製
造する。このために、ベクターｐＫＫ７００およびｐＫ
Ｋ８００からそれぞれｓｐｈ　Ｉおよび５ｓｔｌを用い
た二重消化によりそれぞれ８２６および８２３　ｂｐの
インサートを単離し、そしてこれらのＤＮＡ断片を同じ
酵素で開裂させた発現プラスミドｐｌＪ　　７０２に連
結する。連結混合物をＳ、リビダンス（１ｉｖｉｄａｎ
ｓ）丁１２４に形質転換し１．そしてｔａｎｄ１ｍｉｓ
ＬａＬ活性を示す（プレート試験）チオストレプトン抵
抗性形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離する。すべ
ての陽性クローンは使用されたｐＫＫ７００またはｐＫ
Ｋ８００を含む。

コード化された融合タンパク質は既知の方法で発現させ
ることができる。形質転換株Ｓ、リビダンスＴＸ２４を
振盪フラスコ中２８℃で４日間インキユペートシ、モし
て菌糸体を遠心分離により培養液から分離した場合、融
合タンパク質は次のようにして透明溶液中に検出するこ
とができる； ｌＯ〜ｔｏｏｇａの溶液を２０〜２００μＣの１５％強
度トリクロロ酢酸と混合し、そして沈澱したタンパク質
を遠心分離により集め、洗浄し、そして５ＯＳ−含有サ
ンプル緩衝液にとる（Ｉｌ、　Ｌａｅｍｍｌｉ。

Ｎａｔｕｒｅ　２２７　（１９７０）　６８０−６８５
）、　９０℃で２分間インキュベートした後ｌＯ〜１７
％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルでの電気泳動により分
画する０分子量１５ＫＤのタンパク質、すなわち、Ｌｅ
ｎｄａｍｉｓｔａｔおよびプロインスリンより成る融合
タンパク質に対して予測される分子量範囲にあるものが
得られる。（弐ｍに包含される生成物である）融合タン
パク質はｔｅｎｄａ■１ｓｔａｔに対する抗体、および
インスリンに対する抗体と反応する。

Ａ３） 菌株維持および発酵 Ａ２）よりの組換えプラスミドｐＧＦ４を含むＳ。

リビダンス株を複合（ｃｏｍｐｌｅｘ）栄養培地として
Ｒ２ＹＥ培地（Ｈｏｐｖｏｏｄ　ａｔ　ａｌ、、　Ｇｅ
ｎｅｔｉｃ　Ｍａｎｉｐｕ−ｌａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：　　Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙＭａｎｕａｌ；　　Ｊｏｈｎ　　Ｉｎｎｅｓ　　
Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、　　Ｎｏｒｗｉｃｈ、　　英国
：１９８５）を含む栄養寒天プレートに画線し、そして
２５〜３０℃、好ましくは２８℃でインキュベートする
。プラスミドを安定させるために、胞子形成培地は選択
添加剤として、２０ｔｔｅ／　ｍＱ濃にのチオストレプ
トンを含有する。胞子形成が生じた後、水の層をプレー
トに入れそして超音波処理することにより胞子を集める
。胞子力価測定（Ｌｉｂｒａｔｉｏｎ）後、１０”胞子
／ｍＱの２０％水性グリセロール中の溶液を調製し、そ
して−２０℃で貯蔵する。

Ａ４） 培養の実嵐（ｓｅｔｔｉｎｇ　ｕｐ） 予備培養培地としては大豆粉（２０ｇ／ｆｆ１）　、グ
ルコース（１ｈ＃））　、コーンスターチ（２ｙ／　ｆ
ｆ）、尿素（１ｇ／（１）、硝酸アンモニウム（１９／
　Ｑ）、麦芽エキＸ（５ｇ／ｆｆ）およびｘＨｘＰＯ＊
　（２ｙ／　ｎ）、そして選択添加剤としての１０〜５
０μｙ／（ｌ濃度のチオストレプトンより成る複合栄養
培地を用いる。

５ＸｌＯ”胞子／ＩＮ最終容量）を接種物として用いる
。予備培養液を２２０ｒｐｍおよび２７℃で振盪し、そ
して６０時間後、１：２０の希釈割合で主培養液に移す
。

主培養液としてはｐｇが７．２に１４ｍされ、そして可
溶性デンプン（４０ｙ／ａ）　、コーンステープリカー
（４ｇ／ｆｆ１）、スキムミルク粉（７ｙ／　ｆｆ１）
、クルコ−ス（ｌｈ／４）　、（ＮＨａ）＊ＳＯ＊　（
１２９／１りおよび大豆粉（４９／　ｆｆ）より成る複
合栄養培地である。

発酵は慣用の撹拌タンク発酵槽で、０．５　ｖｖ園で通
気し２００〜２４Ｏｒｐｍで撹拌しながら２５℃で４８
時間行う０発酵完了後の培養液の処理は、細胞ベレット
をエアロゾル形成回避のため密閉した漏斗を通して吸引
か遇することにより培１ＪＩＰ液から分離することより
成る。透明培＊ｔｉ；ｓ液は目的とする融合タンパク質
を含有する。

融合タンパク質の収率は、主培養液のｐＨをＮａ０Ｈｊ
；よび３％リン酸で６．５〜７．２、好ましくは６．９
に一定１；保つと、約２０％まで高くなる。

Ａｓ） 融合タンパク質Ｐ丁Ｆｌの単離 ＥＰ−Ａ　Ｏ，２８９，９３６の方法に従って得られる
プラスミドにフード化された融合タンパク質（以下ＰＴ
ＦＩと呼ぶ）を製造するためのストレプトマイセス−リ
ビダンス（Ｓｔｒａｐｔｏｍｙｃｅｓ　１ｉｖｉｔａｎ
ｓ）発酵よりの３０４の培養液を４．０ｇのｐ−クロロ
−ｍ−クレゾールと混合し、モして３０分間放置して培
養物を殺菌する（Ｋｉｌ１）　、この後、バイオマスを
フィルタプレスで分離し、そして炉液を冷却しながらト
リクロロ酢酸でｐＨ４、０に調節する。

３時間後、沈澱を遠心分離により集める０次いで１０倍
量のア七トンと共に撹拌して脂肪を除去する。アセトン
相を炉去して捨てる。タンパク質ＰＴＦＩを６Ｍ尿素溶
液中に懸濁しモしてｐＨを７．５に調節することにより
溶解し、そして残る不溶物を改めて遠心分離することに
より除去する。その透明液相は、３Ｍ尿素中Ｔｒｉｓ／
ｌＩＣｆｆ！ｌ衝液（ｐＨ７，５）で平衡、させたＱ−
＠５ｅｐｈａｒｏｓｅ力ラムにｍ接かけることができる
。カラム（ＩＥＷ５ｃｍ、高さ１５ｃｍ）は３００鳳Ω
のイオン交換体を含有する。

溶出はＯ＝　０．５Ｍ　ＮａＣＱ／尿素溶液を用いて行
う。

ＰＴＦＩ−含有６分を集めそして透析して塩を除く。

次に３００＋ｎの濃縮生成物を目孔（ｍａｃｒｏｂｏｒ
ａ）　＠Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ　　１２０〜ｌＯＣＪ　Ｈ
ＰＬＣカラムにかけそして漸増量のアセト−ニトリルを
添加した０、１％強度トリフルオロ酢酸で溶出する。タ
ンパク質ＰＴＦＩを３６％強度アセトニトリルを用いて
カラムから脱蒼させる。溶媒を対応画分から真空下に除
去する。　１８６ｍｇの純ＰＴＦＩが得られる。構造式
を第２Ａ図に示す（アミノ酸配列のコピーは第２Ｂ図に
示す）。

Ａ６） 融合タンパク質ＰＴＦＩの再生 ３４諺９のＰＴＦＩを７０＋ｆｉの８Ｍ尿素（ｐＨ８，
６）に溶解し、そしてヘリウムを５分間通す０次に７６
０μａのβ−メルカプトエタノール（ｐ）１１０．５）
を添加する。３０分間還元後、酸素の排除下に１６時間
グリシン／ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０，５）に対して透
析する。この後、空気を通じ、次いでその混合物をは性
化し、そしてＮｕｃｌｅｏｓｉｌ　１２０−　ｔｏ　Ｃ
４で分離する。この再生生成物の構造を第３Ａ図に示す
（アミノ酸配列のコピーは第３Ｂ図に示す）。

収率は８．：）＋ｙで、これは理論値の２４％に相当す
る。

Ａ７） タンパク質ＰにＦ４の単離 Ａ４）におけると同様に製造されたタンパク質をＡｓ）
に従って後処理する。

本発明の実施例１： 再生タンパク質ＰＴＦＩの酵素分解 ８．２１ＤＩの再生ＰＴＦ　ｌを１ｍ１２のｔｒｉｓＪ
ｌｌｉ液（ｐＨ８，０）に溶解し、そして１０μＣのリ
ソバクター・ニンザイモゲネスよりの１ｍｇ／ｓｅａリ
ジルエンドペプチダーゼ（ＬＥＰ）を含有する溶液を添
加する。

その溶液を室温に２時間放置し次いで再びＮｕｃｌｅｏ
ｓｉｌ　１２０−５　ＣＪ　ＨＰＬＣカラムで弁面する
。

収率：　３−Ｂａｙ、理論値の９２％に相当。

その３．８雪９のインスリン前駆体を１冨ａのｔｒｉｓ
緩衝液（ｐＨ８，４）に溶解し、そしテ１　ｍｇ／　ｍ
ｕ　）　！Ｊプシン含有溶液を５μａ６加する。ｐＨを
３．０まで下げることにより９０分後に反応を止め、そ
してＮｕｃｌｅｏｓ目１２０−５　ＣＪ　ＨＰＬＣ力ラ
ムニう水／アセトニトリル中０．０５％トリフルオロ酢
酸なる系を用いて分離する。活性画分を凍結乾燥するこ
とにより２．１ｍｓの純ムＯ−Ａｒｇ−ｄｅ−Ｔｈｒ−
Ｂ３０−ヒトインスリンが得られる。この新規物質の等
電点は約６．２である。

本発明の実施例２： 大腸菌タンパク質よりのＡＯ−Ａｒｇ−ｄｅ−Ｔｈｒ−
Ｂ１０−インスリンの取得 出発物質ニ プラスミドｐＷＺＩＰ　ｄＭｄＣ（ＥＰ−Ａ　Ｏ，２８
６，９５６、実施例３）に相当するがＣ鎖がＡｒｇまで
切り縮められたプロインスリンをコードするプラスミド
で形質転換された大腸菌株を発酵させ、次いでタンパク
買生成物を単離し転化すると同様のインスリン前駆体が
得られる。

本発明： ２０８ｍｇのこの物質を１００ｍ＋２のｔｒｉｓ／ＨＣ
Ｃｌｉ衝液、０−ＩＭ（ｐ！１８．４）に溶解し、そし
て同じ緩衝液に溶解したりソパクター・工ンザイモゲネ
スよりのｌ第９のりジルエンドペプチダーゼを添加する
。

反応は時々撹拌しながら室温で４時間行わせる。

反応をＨＰＬＣにより規則的Ｉ：チェックする。前記の
時間の後９５％以上のＣペプチドが除去された。

次に４１６μｇのトリプシン溶液（濃度ｌＮｇ／ｌ１１
２）を反応混合物に添加し、そして反応を更に３Ｗｔ間
行わせる０次いで反応をトリフルオロ酢酸で酸性化する
ことにより止め、そしてその混合物をＮｕｅｌｅｏｓｉ
ｌ　ＲＰ−Ｃ４カラム（２５ｃｍＸ　４．ｇｃｎ）にて
、水／トリフルオロ酢酸（０，１％）−アセトニトリル
なる溶媒系で分画する。インスリン含有画分を凍結乾燥
すると８８１１９のＡＯ−Ａｒｇ−ｄｅ−Ｔｈｒ−Ｂ２
Ｏ−ヒトインスリンが得られる。

変法ｂ）によるＡＱ−Ａｒｇ−ヒトインスリンの製造二
本発明の実施例３： ＡＯ−ＡｒＫ−ｄｅ−Ｔｈｒ−Ｂ２Ｏ−インスリンのＡ
Ｏ−Ａｒｇ−インスリンへの転化 本発明の実施例１または２と同様にして得られ／：１３
ｍｙのＡＯ−Ａｒｇ−Ｂ２Ｏ−ｄｏ−Ｔｈｒ−インスリ
ンを、０．２５ｍＣノｌＯＭ酢酸および０．６５ｍｆｆ
（’）１．５４Ｍ　　Ｌ　−トレオニンメチルエステル
（ＤＭＳＯ／１．３−ブタンジオール（１：１）中）に
溶解する。これに、予め水に溶解（１４ｍｇ／諺ｆｆ）
　したリソバクター・エンザイモゲネスよりの１５０μ
ｇのりジルエンドペプチダーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ
　Ｎｏ、　４４０２７５）を添加する。得られるｐＨは
約５．３である。その混合物を室温で２時間放置する。

９４％の相当するＡＯ−Ａｒｇ−ヒトインスリンのメチ
ルエステルが生成する０反応をＨＰＬＣによりフォロー
するｓ１ｇ＋（Ｉのメタノールおよび４ｍＱのメチルｔ
＋ｓｒｔ、−ブチルエーテルの添加によりタンパク質を
沈澱させる。

その沈澱をエーテルで１回洗浄しそして乾燥する。メチ
ルエステルを除去するために生成物をｌＱｍｆｌのグリ
シン緩衝液、０．１Ｍ＋　１０ｍＭブチルアミンおよび
ｐＨ−１０，０に数時間放置する。

この後、それを再沈澱し、そしてその沈澱を０．１％ト
リフルオロ酢酸にとりそして分取式ＨＰＬＣにより精製
する。精製画分はＡＯ−Ａｒｇ−ヒトインスリンを含有
する。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明による方法の一態様による遺伝子構築例
を示す。 第２Ａ図は融合タンパク質ＰＴＦＩの構造式を示す。 第２Ｂ図はそのアミノ酸配列のコピーである。 第３Ａ図は再生融合タンパク質の構造式を示す。 第３Ｂ図はそのアミノ酸配列のコピーである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）次の式II ▲数式、化学式、表等があります▼（II） （ここで式中、 ａ）Ｒ＾３＾０＋Ｒ＾３＾１＝ＯＨまたは ｂ）Ｒ＾３＾０＝中性の遺伝子的にコード化可能なＬ−
   アミノ酸、および Ｒ＾３＾１＝ＯＨまたは 事実上塩基性であって５０個までの炭素原 子を有しその構造に０〜３個のα−アミノ 酸が関与しそして適切な場合には存在する 末端カルボキシル官能が遊離状態で、エス テル官能として、アミド官能として、ラク トンとして存在するかまたはＣＨ＿２ＯＨに還元されて
   いてもよい、生理学的に許容し得る 有機基 ただし、同時にＲ＾３＾０＝Ａｌａ、Ｒ＾３＾１＝ＯＨ
   であってＡ−およびＢ−鎖がウシインスリンの配列であ
   る場合を除く） で示されるインスリン誘導体およびその生理学的に許容
   し得る塩。 ２）式IIにおいてＲ＾３＾０＋Ｒ＾３＾１＝ＯＨである
   請求項１記載のインスリン誘導体およびその生理学的に
   許容し得る塩。 ３）式IIにおいて、ｂ）の場合であってＲ＾３＾０＝Ａ
   ｌａ、ＴｈｒまたはＳｅｒ、特にＴｈｒのラジカル、お
   よびＲ＾３＾１＝ＯＨ、Ａｒｇ−ＯＨまたはＡｒｇ−Ａ
   ｒｇ−ＯＨである請求項１記載のインスリン誘導体およ
   びその生理学的に許容し得る塩。 ４）式IIのＡ鎖およびＢ鎖（Ｂ１〜Ｂ２９）が、ヒト、
   ブタまたはウシインスリン、好ましくはヒトまたはブタ
   インスリン、の配列である請求項１〜３のいずれかに記
   載のインスリン誘導体およびその生理学的に許容し得る
   塩。 ５）５．５〜９．０に等電点を有する請求項１〜４のい
   ずれかに記載のインスリン誘導体。 ６）ａ）次の式IIIまたはIV ▲数式、化学式、表等があります▼（III） ▲数式、化学式、表等があります▼（IV） 〔ここで式中、 Ｘ＝同一のまたは異なる遺伝子的にコー ド化可能なＬ−アミノ酸、 Ｙ＝ＬｙｓまたはＡｒｇ、 ｎ＝０または１〜６０の整数、 Ｒ＿１およびＲ＿２＝ＯＨまたは 天然アミノ酸の所望により誘導体化され た残基、または １〜９０個、好ましくは７０〜８０個、の天然アミノ酸
   より成る所望により誘導体化され たペプチド残基 Ｒ＾３＾０およびＲ＾３＾１は式IIにおけるのと同じ意
   味を有し、そしてＡおよびＢ（１〜２９）鎖は好ましく
   はヒト、ブタ、またはウシイン スリンの、特にヒトまたはブタインスリン の配列を有する〕 で示されるインスリン生成物をリジルエン ドペプチダーゼと接触させ、Ｌｙｓ残基のＣ末端の結合
   を開裂させ、そして適切な場合 （すなわちＹ＝Ａｒｇである場合）にはトリプシンまた
   はトリプシン様エンドペプチダーゼ とも混合させ、Ｂ鎖からＲ＿１−Ｙ部分を除去し、そし
   て式IIａで示されるＡＯ−Ａｒｇ−ｄｅ−Ｂ３０−イン
   スリン誘導体を生成させ、および／また は ｂ）式IIｂで示されるインスリン誘導体を製造するため
   に、式IIａで示されるＡＯ−Ａｒｇ−ｄｅ−Ｂ３０−イ
   ンスリン誘導体をリジルエンドペプチダーゼまたはトリ
   プシンの、または トリプシン様エンドペプチダーゼの存在下 に式Ｖ ＨＲ＾３＾０−Ｒ＾３＾１（Ｖ） （式中、Ｒ＾３＾０およびＲ＾３＾１は式IIｂについて
   特定された意味を有し、そして存在する遊離 のＣＯＯＨ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ＿２、グアニジノおよび
   ／またはイミダゾール官能は自体既知の方法 で保護された形態であってもよい） で示される化合物と反応させ、そして次に、適切な場合
   に存在する保護基を自体既知の 方法で除去し、または ｃ）次の式VI ▲数式、化学式、表等があります▼（VI） で示されるＡＯ−Ａｒｇ−ｄｅ−オクタペプチド（Ｂ２
   ３〜３０）−インスリンをトリプシンまたはトリプシン
   様エンドペプチダーゼの存在下に 式VII 【遺伝子配列があります】（VII） （ここで式中、Ｒ＾３＾０およびＲ＾３＾１はａ）およ
   びｂ）において式IIについて特定された意味を有 し、そして存在する遊離のＣＯＯＨ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ
   ＿２、グアニジノおよび／またはイミダゾール官能は自
   体既知の方法で保護された形態 であってもよい） で示される化合物と反応させ、そして次に 適切な場合に存在する保護基を自体既知の 方法で除去し、または ｄ）次の式II′ ▲数式、化学式、表等があります▼（II′） （ここで式中、Ｒ＾３＾０およびＲ＾３＾１は式II（ａ
   ／ｂ）におけるのと同じ意味を有し、そしてその 反応性アミノ基（Ａｌ−Ｇｌｙのアミノ基は除く）は既
   知の方法により保護された形態にあ る） で示されるインスリン（誘導体）を、アミ ノ基が同じく既知の方法で保護されており、またＣＯＯ
   Ｈ基が適切な場合には活性化された形態にあるアルギニ
   ンと反応させ、そして 次に存在する保護基を既知の方法で除去す る ことより成る請求項１〜５のいずれかに記載の式IIのイ
   ンスリン誘導体の製造方法。 ７）請求項１〜５のいずれかに記載のインスリン誘導体
   およびその生理学的に許容し得る塩の、糖尿病治療用薬
   学的組成物の活性物質としての使用。 ８）請求項１〜５のいずれかに記載の少くとも一種の式
   IIのインスリン誘導体および／または少くともその生理
   学的に許容し得る塩を溶解された、無定形のおよび／ま
   たは結晶の、好ましくは無定形および／または結晶の、
   形態で含有する薬学的組成物。 ９）式IIに包含される以下のインスリン誘導体 ＡＯ−Ａｒｇ−ｄｅ−Ｂ３０−ヒトインスリン、ＡＯ−
   Ａｒｇ−ヒトインスリン、 ＡＯ−Ａｒｇ−Ｂ３１−Ａｒｇ−ＯＨ−ヒトインスリン
   および ＡＯ−Ａｒｇ−Ｂ３１−Ａｒｇ−Ｂ３２−Ａｒｇ−ＯＨ
   −ヒトインスリンおよびそれらの生理学的に許容し得る
   塩 のうちの少くとも一種を含む請求項８記載の薬学的組成
   物。 １０）約３．０〜９．０、好ましくは約５．０〜８．５
   のｐＨを有する注射用溶液または懸濁液としての請求項
   ８または９記載の薬学的組成物。 １１）少くとも一種の式IIのインスリン誘導体および／
   または少くとも一種のその生理学的に許容し得る塩を、
   適切な場合には他の修飾されたおよび／または未修飾の
   インスリンまたはそれらの誘導体と共に生理学的に許容
   し得るビヒクルを用いて、適切な場合には適当な添加剤
   および助剤と共に適当な剤形に変えることより成る請求
   項８〜１０のいずれかに記載の薬学的組成物の製造方法
   。