JPH0222555A

JPH0222555A - 電気泳動ゲル媒体用キット

Info

Publication number: JPH0222555A
Application number: JP1107932A
Authority: JP
Inventors: Jr Kenneth G Christy; ケニス　ジョージ　クリスティ，ジュニア; Hans W Osterhoudt; ハンス　ウォルター　オスターハウンド; Ignazio S Ponticello; イグナツイオ　サルバトレ　ポンティツェロー
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Eastman Kodak Co
Priority date: 1988-05-02
Filing date: 1989-04-28
Publication date: 1990-01-25
Also published as: EP0340653A2; US4948480A; EP0340653A3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は電気泳動用媒体又は要素に関し、更に詳しくは
、蛋白質のようなバイオポリマーの電気泳動分離又はＤ
ＮＡ、　ＲＮＡ及びそれらの誘導体の断片の電気泳動分
離のために適しているポリアクリルアミド型ポリマーゲ
ル媒体を、便利に安全に形成するためのキット及び該キ
ットを使用する方法に関する。

〔従来の技術〕

米国特許筒４，７０４，１９８号には、電気泳動の種り
の面の包括的な記載が含まれている。その特許及び多く
の他の刊行物に記載されているように、電気泳動は荷電
分子又は基体が電場に置かれるときに移動する原理に基
づいている。蛋白質及び他のバイオポリマー（例えば、
ＤＮＡ、　ＲＮ八、酵素及びある種の炭水化物）は荷電
されるので、それらはそれらの等電点とは異なったｐＨ
値で移動する。移動速度は、特に蛋白質又はバイオポリ
マーの電荷濃度及び電気泳動マトリックス又は媒体の制
限性質に依存する。質量に対する電荷の比が高くなるほ
ど、イオンはより速く移動する。媒体がより制限的であ
るほど、イオンはよりゆっくり移動する。

理論的には、分子がその電荷濃度に於て十分界なってい
る場合には、異なった蛋白質の分離は遊離溶液（ｆｒｅ
ｅ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）中で容易に達成できる。

しかしながら、実際には、電気泳動の間に発生する熱が
蛋白質バンドを歪める対流変動を引き起こすために、遊
離溶液中の分離は達成するのが困難である。個々の蛋白
質の分解能は、そのバンドが広くなっているために低下
する。また、バンドの広がりは、溶解した溶質の拡散の
ために電気泳動が停止した後でも続く。そこで、遊離溶
液中の電気泳動はめったに行なわれない。実際には、現
在種々の支持媒体が、対流及び拡散を最小にし、サイズ
及び分子電荷に基づく両者の分離を行なわせるために使
用されている。

電気泳動のための多くの支持媒体が現在使用されている
。最も一般的なものは、紙又は酢酸セルロース、アガロ
ース、澱粉及びポリアクリルアミドのシートである。紙
、酢酸セルロース及び同様の多孔質材料は比較的不活性
であり、主に支持体として対流を最小にするために機能
する。これらの材料を使用する蛋白質の分離は、主とし
て選択されたｐＨ値での蛋白質の電荷濃度に基づいてい
る。

他方、澱粉、アガロース及びポリアクリルアミドゲルは
、対流及び拡散を最小にするのみならず、分離プロセス
に積極的に関与する。これらの材料は、ポリマー網目開
口の平均サイズが所望の分子サイズ範囲に分子分別を達
成するために制御できる制限媒体を与える。この方法で
、分子ふるい分けが生じ、電荷濃度及び分子サイズの両
方に基づく分離を提供する。

分子ふるい分けの範囲は、ゲル網目開口サイズが移動す
る粒子のサイズよりもどれだけ大きいかに依存している
と考えられる。アガロースゲルの網目開口サイズは、は
とんどの蛋白質分子の分子ふるい分けが最小であるよう
な大きさで、媒体中の分離は主に電荷濃度に基づいてい
る。対照的に、ポリアクリルアミドゲルは、そのサイズ
が蛋白質分子のサイズに更にぴったり近づき、そうして
分子ふるい分は効果に寄与する開口を有することができ
る。ポリアクリルアミドは高度に精製した形で製造でき
る合成ポリマーであるというその他の利点を有している
。

広範囲のポリマー濃度を有するゲルを製造できる可能性
及び、そのために、ゲル網目開口はポリマー濃度に反比
例するので、ポリマー濃度勾配の影響によるゲル内の孔
サイズ勾配を形成することと同様に、広範囲の制御され
た網目開口サイズは、電気泳動ゲル媒体としてのポリア
クリルアミドの別の利点である。開口サイズについての
制御は、分子サイズを基準にして混合物をふるい分けす
ることを可能にし、実施される分子量決定を可能にする
。これらの決定は、若し蛋白質が、全てのドデシル硫酸
ナトリウム（ＳＯ５）処理された分子がサイズに関係な
く概略同じ電荷濃度値を有するように分子電荷の効果を
中和するような、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯ３）の
よ・うな洗剤で処理されるならば、特に正確である。こ
の技術は５Ｏ３−ＰＡＧＩＥ電気泳動と言われる。

従来、ポリアクリルアミドゲル媒体は、アクリルアミド
のようなモノマーとＮ、Ｎ’　−メチレンビスアクリル
アミドのような架橋剤を、水、緩衝液、重合開始剤及び
重合触媒の存在Ｆに酸素のない条件下で遊離ラジカル誘
発重合することにより製造されてきた。特に、このよう
な重合は酸素の存在によって重相できるので、電気泳動
のためのポリアクリルアミドゲル媒体は、アクリルアミ
ド、架橋（ビス）モノマー、緩衝液、遊離ラジカル重合
開始剤、及び重合触媒を含有する前もって脱酸素した水
溶液を、選定された間隙（例えば、０．３〜３ｎ＋ｎ＋
）を有する２枚のガラス板の間に形成されたセル中に導
入し、そして、ゲル形成溶液を酸素からシールし、そう
して遊離ラジカル重合を所望のゲルを製造するように行
なうなどの方法によって典型的に製造されてきた。これ
はしばしば、電気泳動を行なう科学者によりｉｎ　５ｉ
ｔｕで行なわれる。

製造者又は個々のユーザーのための普通の実施は、ゲル
を得るためにアクリルアミド及びＮ、Ｎ’メチレンビス
アクリルアミド（しばしば単に「ビス」と言われろ）の
ような適当なビスモノマーで遊離ラジカル重合を行なう
ことである。このようなゲル形成は、いくつかの注意を
払ったときのみうまく達成される。即ち、（ａ）非常に
高純度の出発物質を使用する必要がある、（ｂ）モノマ
ー及び緩衝液の溶液を脱ガスして酸素を除く必要がある
、（ｃ）遊離ラジカル開始剤と触媒とを脱ガスした溶液
中で迅速に混合する必要がある、（ｄ）溶液を２枚のガ
ラス板の間又はガラス管（何れの場合もその下端を漏液
を防ぐためにシールする）に迅速に往く必要がある、そ
して、（ｅ）（ｉ）大量に除去された酸素及び（ｉｉ　
）熱消散をさせて過剰の熱がゲル不均一性を起こさない
ようにするための適当な手段でゲル化を行なわせる必要
がある。

ゲルの製造のために使用されるセルは、一般に約６〜１
００　ｃｍの長さを有している。従って、このような長
いセルへのゲル形成溶液の導入は、溶液が完全に注入さ
れる前に溶液がゲル化することを防ぎ、それによって、
所望の長さの均一なポリアクリルアミドゲル媒体の製造
ができるようにするために、注意深い操作を必要とする
。かくして、所望の長さを有する電気泳動のためのポリ
アクリルアミドゲル媒体の製造は、該溶液を酸素が無い
ように保存することと同様に、大変な技術と注意を必要
とする。

使用者がｉｎ　５ｉｔｕで遊離ラジカル重合及び架橋に
より電気泳動ゲルを作成する上記方法に代わる幾つかの
ものがある。これらには、（ａ）カセット中の前形成さ
れたゲルの使用及び（ｂ）可撓性支持体上に前形成され
たゲルの使用が含まれる。

しかしながら、これらの代わりのものの何れによっても
、ゲルサイズ、ゲル中のポリマー含量及び緩衝液含量に
関するいくつかの操作上の自由度又は柔軟性が失われる
。また、−特に遊離ラジカル重合及び架橋により作成さ
れたカセット中の前成形されたゲルについて−ゲル形成
反応が完結した後に幾らかの未反応のモノマーが一般に
残留する。

このような種類の存在は、ユーザーに幾らかの毒物の危
険を示し、実施される電気泳動分離と干渉する。また、
このような前成形されたゲルは制限された貯蔵寿命を有
することが見出されている。

特に、米国特許第４，５８２，８６８号には、酸素の除
去を必要としない非遊離ラジカル誘発機構により電気泳
動ゲル媒体を形成するためのアクリルアミド−リッチの
コポリマーの架橋重合が記載されている。典型的に、ア
クリルアミド、任意に、重合の間に遊離ラジカル架橋を
させるＮ、Ｎ’　−メチレンビスアクリルアミドのよう
な二官能性モノマー及び架橋剤、例えばＮ−［３−（２
−り四ロエチルスルホニル）プロピオンアミドメチルコ
アクリルアミドＩＪ　　　　　　　　　　　ｔＪのようなアクリルアミド誘導体、２−　［３−（２クロ
ロエチルスルホニル）プロピオニルオキシ］エチルアク
リレートのようなアクリレート誘導体、又は、Ｎ−［２−（エト
キシカルボニルメトキシカルボニル）エチルコアクリル
アミドのような活性エステルで処理することによって非遊離ラ
ジカル開始架橋をすることができるモノマーのコポリマ
ーが、米国特許筒４．５８２．８６８号に従って、酸素
の不存在下で遊離ラジカル開始重合により製造される。

その後クロロエチルスルホニル基含有ポリマーは、側鎖
のクロロエチルスルホニル基の脱水素ハロゲン反応及び
それに続（ジアミンのようなビス求核架橋剤での反応に
より架橋される。この点に関し、電気泳動がしばしばク
ロロエチルスルホニル基の脱水素ハロゲン反応を容易に
するｐＨ値で行なわれることが注目される。若しこのよ
うにして形成されたビニルスルホニル基が全部意図する
架橋剤と反応しない場合には、それらは電気泳動中に溶
解した蛋白質上のアミノ基と反応する。このような反応
は、蛋白質の電気泳動移動を人為的に遅延させ、その結
果、アクリルアミド及びビスのみの遊離ラジカル重合に
より形成された電気泳動で得られた結果に対して間違っ
た電気泳動結果を与える。

更に、クロロエチルスルホニル基は上記架橋工程の前に
自発的に脱水素ハロゲン化する。脱水素ハロゲン化した
生成物は、他の方法で作ったポリマーよりも速く架橋し
、電気泳動媒体を製造し使用するための少ない（即ち、
不十分な）時間を与える。

〔発明が解決しようとする課題〕

電気泳動媒体は、前記したような代替物の有効性にもか
かわらず、−Ｓに使用時点でのビニルモノマーの重合に
より製造される。この場合、使用する前のモノマー及び
使用中の残留上ツマ−にオペレーターが曝されることが
必要になる。このような七ツマ−は、発ガン性であると
考えられ、少なくともあるものは神経毒として同定され
ている。

〔課題を解決するための手段〕

本発明のキット及び方法は、（ａ）先行技術に於いて遭
遇する神経毒性のアクリルアミド及びビスモノマーを、
高純度、非毒性及び適度に反応性のコポリマーに置換し
、（ｂ）脱ガスを不必要にし、（ｃ）ゲル化及び注入の
直前に注意深く迅速に添加されるべき架橋剤を必要とし
、そして（ｄ）（ｉ）酸素の存在下に、（ｉｉ　）架橋
反応は非常に僅かの熱を発生するのみであるので、熱消
散の必要なしにゲル化を起こさせる。

本発明は、従来技術において認識されている幾つかの欠
点をオペレーターが克服できる、ポリアクリルアミド型
電気泳動ゲルを製造するためにこれまで利用されていた
手段よりも、便利で安全な手段を提供する。

本発明に従えば、（１）（ａ）非置換及び置換のアクリ
ルアミドモノマーから選択されたモノマー少なくとも５
０重量％、好ましくは８０〜９８重量％、（ｂ）遊離ラ
ジカル開始機構以外により架橋反応に関与する官能性基
を含有するモノマー１〜５０重量％、好ましくは２〜２
０重量％並びに（ｃ）モノマー（ａ）及び（ｂ）とは異
なった１種又は２種以上のモノマー０〜４９重量％から
なる非荷電ビニルモノマー混合物の水溶性非架橋非イオ
ン性コポリマー並びに（２）該コポリマーとは分離した
容器内の、前記モノマー（ｂ）から誘導されるコポリマ
ーの繰り返し単位の官能基と反応する架橋剤の組合せを
含んでなる、電気泳動ゲル媒体の製造用キットが提供さ
れる。

本発明の好ましい態様に於て、該キットにはまた、選択
された量の、実施される特別の電気泳動のために適して
いる電気泳動緩衝液が含まれる。

また、若し意図される用途が５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動
であるならば、このキットには更に選択された量のＳＤ
Ｓが含まれる。しかしながら、用途の柔軟性のために、
緩衝液とＳＤＳどを分離した貯蔵状態に維持し最終ユー
ザーが所望するように電気泳動媒体を「誂える」ことが
できるようにすることが、最廖冬ユーザーにとって望ま
しい。

〔実施態様〕

本発明の実施に於て、コポリマー（キット中に乾燥形状
又は濃縮溶液で存在する）を、最終電気泳動ゲル中のポ
リマーの所望の濃度を与えるように十分に脱イオンした
水に溶解し、緩衝液をＳＤＳのような任意の成分と一一
緒にポリマー溶液に添加しく添加順序は制限されず、事
実、緩衝液と他の相溶性の任意の成分は、所望するなら
ばキット中でポリマーと混合できる）、電気泳動ゲルを
製造する直前に、コポリマー／緩衝液溶液に、架橋剤を
添加後５分〜１５時間の時間内にゲル化が生じるような
濃度の架橋剤を添加し、そして次に、得られた溶液を、
適当な電気泳動ゲル成形手段、例えば選択された金型又
は他のゲル媒体成形装置に注入するか、又は該ゲル化が
生じる前に支持体上に被覆することにより、所望の寸法
のゲル媒体に形成する。

本発明はまた、上記のようにして製造されたポリアクリ
ルアミド電気泳動ゲル媒体を提供する。

本発明の実施により、遊離ラジカル重合に於けるゲル化
でしばしば遭遇する神経毒への露出は避けられ、一方、
公知のポリアクリルアミド重合で利用できるゲル寸法、
ポリマー濃度及び緩衝液組成の広い許容範囲は維持され
、多分増強される。

適当な緩衝液の選択及び導入は、十分電気泳動波４＋ｉ
の当業者の知識内であり、その媒体が使用される電気泳
動方法により分離される物質に依存する。このような緩
衝液及びそれを選択するための基礎は、例えば、Ａｎｄ
ｒｅａｓ　Ｃｈｒａｍｂａｃｈ、“Ｔｈｅ　ＰｒａｃＬ
ｉｃｅ　ｏｆ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｇｅｌ　Ｅ
ｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓＶＣＨＰｕ１ｉｓｈｅｒ
ｓ、　　Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ　　Ｂｅａｃｈ、　　Ｆｌ
ｏｒｉｄａ、　　ｌＪ、ｓ、八。

（１９８５年）及びＵ、に、Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｎａｔ
ｕｒｅ＋　２２７：６８０（１９７０年）に記載されて
いる。

また、上記のように、本発明のキットの成分は貯蔵寿命
と取扱の容易性を最大にするために乾燥状態にあるか又
は水性媒体中にあるが、コポリマー（キットを使用する
前に架橋剤から確実に分離されていなくてはならない）
は、キット中で乾燥した容易に溶解できる形状で存在す
ることが好ましい。

本発明のコポリマーに含有させるための適当なアクリル
アミドモノマーとしては、例えばアクリルアミド、Ｎ−
イソプロピルアクリルアミド、Ｎヒドロキシメチルアク
リルアミド、Ｎ−（１。

１−ジメチル−３−オキソブチル）アクリルアミド、Ｎ
−メチルメタクリルアミド、２−アクリルアミド−２−
ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、メタク
リルアミド、３−（３−ジメチルアミノプロピル）アク
リルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ、Ｎ
−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタアク
リルアミド及び３−（２−ジメチルアミノエチル）アク
リルアミドなどがあげられる。特に好ましいものは（未
置換の）アクリルアミドである。

架橋反応に関与することができる官能基を有する適当な
ビニルモノマー（ｂ）には、下記のものが含まれる。

１）活性メチレン基含有上ツマ−１即ち、（式中、Ｒ２
はシアノ、アリール又はアルコキシカルボニル基である
）なる基を有するモノマーこのような基を含有するアク
リル酸エステルモノマーの適当な例には、２−アセトア
セトキシエチルアクリレート、２−アセトアセトキシエ
チルメタクリレート、エチルα−アセトアセトキシメチ
ルアクリレート及び２−シアノアセトキシエチルメタク
リレート（米国特許筒３，４５９，７９０号及び同第３
，５５４，９８７号に記載されている）などが含まれる
。このような基を含有するビニルモノマー、例えばエチ
ルアクリロイルアセテート、６−（ｍ及びｐ−ビニルフ
ェニル）　−２、４−ヘキサンジオン（６０：　４０）
　、エチル５−（ｍ−及びｐ−ビニルフェニル）−３−
オキソペンタノエート（６０：４０）並びに対応するメ
チルエステルは、米国特許筒３，９２９，４８２号、同
第３，９３９．１３０号及び同第３．９０４．４１８号
に記載されている。Ｎ−（２−アセトアセトキシエチル
）アクリルアミド、Ｎ−（２アセトアセタミドエチル）
メタクリルアミド、４−アセトアセチル−１−メタクリ
ロイルピペラジン、アセトアセタミドエチルメタクリレ
ート及びＮ−（３−アセトアセタミドプロピル）メタク
リルアミドのような、活性メチレン基を含有するアミド
モノマーは、米国特許筒４，２４７，６７３号及び同第
４．２１５．１９５号に記載されている。

２）適当な活性化ハロゲン含有モノマーには、重合後、
ジアミン、ジチオール、ジオール等々のような適当な架
橋剤で架橋する、ハロメチルアリール、ハロメチルカル
ボニル、ハロメチルスルホニル、ハロエチルカルボニル
及びハロエチルスルホニル基を有するモノマーが含まれ
る。このようなハロメチルアリール基を有するモノマー
、例えば塩化ビニルベンジル及び臭化ビニルベンジルは
米国特許筒４，０１７，４４２号に記載されている。ｍ
−及ヒｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）スチ
レン及びＮ−（４−クロロエチルスルホニルメチルフェ
ニル）アクリルアミドのような、ハロエチルスルホニル
基を有する有用なモノマーは、米国特許筒４，１６１，
４０７号及び同第４，５４８．８７０号に記載されてい
る。

クロロアセチル及びクロロプロピオニルのような、ハロ
エチルカルボニル及びハロエチルカルボニル基を有する
ポリマーは、米国特許筒３．６２５，６９４号に記載さ
れている。このような架橋性基を与えるモノマーには、
クロロ酢酸ビニル、Ｎ−（３−クロロアセタミドプロピ
ル）メタクリルアミド、２−クロロアセタミドエチルメ
タクリレート、４クロロアセタミドスチレン、ｍ−及び
ｐ−クロロアセタミドメチルスチレン、Ｎ−（３−クロ
ロアセタミドカルボニルイミノプロピル）メタクリルア
ミド、２−クロロアセタミドカルボニルイミノエチルメ
タクリレート、４−クロロアセタミドカルボニルイミノ
スチレン、ｍ−及びｐ−クロロアセタミドカルボニルイ
ミノメチルスチレン、Ｎビニル−Ｎ’−（３−クロロプ
ロピオニル）尿素、４−（３−クロロプロピオンアミド
）スチレン、４−（３−クロロプロピオンアミドカルボ
ニルイミノ）スチレン、２−（３−クロロプロピオンア
ミド）エチルメタクリレート並びにＮ−［２−（３−ク
ロロプロピオンアミド）エチル］メタクリルアミドが含
まれる。

３）他の種々の有用な活性ハロゲンモノマーには、Ｎ−
［３−（３，５−ジクロロ−１−トリアジニルアミノ）
プロピル］メタクリルアミドのようなトリアジニル基を
有するものが含まれる。

４）米国特許筒４，５４８．８７０号に開示されたよう
な活性エステル基含有モノマー。好ましい活性エステル
モノマーは、Ｎ−［２−（エトキシカルボニルメトキシ
カルボニル）エチルコアクリルアミド、Ｎ−（３−メタ
クリルアミドプロピオニルオキシ）サクシンイミド、Ｎ
−（アクリロイルオキシ）サクシンイミド及びＮ−（メ
タクリロイルオキシ）サクシンイミドなどである。

５）架橋できるサイトとしてアルデヒド基を有するポリ
マーは、また、米国特許筒３，６２５．６９４号に開示
されている。このような基を与えるモノマーとしては、
例えばｐ−メタクリロイルオキシベンズアルデヒド及び
ビニルベンズアルデヒドなどがあげられる。

６）Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸
塩、２−アミノエチルメタクリレート塩酸塩、及びｐ−
アミノスチレンのような、第一アミノ基含有モノマー７）ｍ−＆Ｐ−ビニルスルホニルメチルスチレン（米国
特許筒４，１６１，４０７号）及びＮ−（３−アクリル
アミドプロピル）メタクリルアミドのような、ビニルス
ルホニル及びビニルカルボニル基を有するモノマーも有
用である。

８）米国特許筒３．６７１，２５６号に記載されたよう
な、Ｎ−アクリロイルアジリジン、Ｎ−（Ｎ−ビニルカ
ルバミル）゛アジリジン及び２−（１−アジリジニル）
エチルアクリレートのような付属するアジリジン基を有
する七ツマ−０９）グリシジルアクリレート及びグリう・ジルメタクリ
レートのようなエポキシド基を有するモノマーモノマー（ｂ）の現在好ましい種類は、下記構造を有す
る前記分類ｌ）のものである。

を有するアルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アリ
ール、アリールオキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジア
ルキルアミノ又はアリールアミノ基、例えばメチル、エ
チル、フェニル、メトキシ、エトキシ、ジエチルアミノ
等々である）であり、Ｒ２がシアノ又は−ＣＯＲ’であ
るために、隣接するメチレン基は活性メチレン基であり
、即ちそれは求核試薬により容易に置き換えられる酸性
水素原子を有し、Ｌは、ムＣ＝０［式中、Ｒ１は、水素又は好ましくは１〜８個の炭素原
子を有する低級アルキル、例えばメチル若しくはプ凸ピ
ルであり、Ｒ２は、シアノ基又はＣＯＲ’基（但し、Ｒ
３は、１〜１５個の炭素原子１〜３０個の炭素原子を有
するアルキレン基、アリーレン基又は該Ｃ−Ｚ− アルキレン基及びアリーレン基の２個又は３個以上の組
合せ（但し、Ｚは、約５〜７個の環炭素原子及びヘテロ
原子を有する二価の複素環基、例えば１，４−ピベラジ
ニレン基である）から成る群から選択された結合基であ
る１゜好ましくは、結合基りは、主鎖に１〜２０個の炭素原子
を有する置換又は非置換のアルキレン基である。アルキ
レンについてのこの定義は、ヘテロ原子含有基、例えば
オキシ、チオ、−ＮＲ＝［但し、Ｒ３は、水素、置換若
しくは非置換の１〜６個の炭素原子のアルキル（例えば
、メチル、クロロメチル若しくは２−ヒドロキシエチル
）又は置換若しくは非置換の６〜１０個の炭素原子のア
リール（例えば、フェニル、ナフチル、若しくはキシリ
ル）である］、−Ｚ−（上記定義の通り）、エステル（
−Ｃｏｏ−）　、アミド（−ＣＯＮｌｌ−）　、ウリシ
ン（−ＮＩＩＣＯＮＩ＋　−）　、ウレタン（−Ｎｌｌ
ＣＯＯ−）、スルホニル（−ＳＯ□−）、カーボネート
、スルホンアミド、アゾ、ホスホン又は他の同様の基が
、中間にか又は末端に付いたアルキレン基を含むことを
意味する。代表的なアルキレン基には、メチレン、エチ
レン、イソブチレン、ヘキサメチレン、カルボニルオキ
シエトキシカルボニル、メチレンビス（イミノカルボニ
ル）、カルボニルオキシドデシレン力ルポニルオキシエ
チレン、カルボニルイミノメチレンイミノカルボニルイ
ミノエチレン、カルボニルイミノメチレンイミノカルボ
ニルエチレン及び米国特許第４，１６１，４０７号及び
同第４，５４８，８７０号に記載された他の基が含まれ
る。

Ｌが置換又は非置換のアリ−１／ンである場合には、そ
れは一般に６〜１２個の炭素原子を有する。

代表的なアリーレン基には、フェニレン、トリレン、ナ
フチレン及び上記米国特許第４．１６１，４０７号及び
同第４，５４８，８７０号に記載された他の基が含まれ
る。Ｌのこの定義にはまた、上記定義した−Ｃ−Ｚ−。

アルキレン及びアリーレン基のそれぞれの１個又は２個
以上の組合せである二価の基（例えば、アリーレンアル
キレン、アルキレンアリーレンアルキレン及び当業者に
より容易に決定される他のもの）が含まれる。

アクリルアミドモノマーは、他のビニル又はアクリルモ
ノマー、例えばアクリル酸エステルよりももっと容易に
他のアクリルアミドモノマーと重合する。それで、側鎖
にアミド結合を有するアクリルアミドモノマーは、活性
メチレン基又は非遊離ラジカル開始架橋反応に関与する
ことができる他の基を含む好ましいモノマー（ｂ）であ
る。

本発明の方法で使用するための好ましい活性メチレン含
有モノマー（ｂ）の代表例は、下記のものである。

ＵしｈＬ２Ｌ！２ｆ’ｌｋＬしｊｉ２（、ｌ−他Ｃ＝０本発明の方法で使用するための活性メチレン基を有する
繰り返し側鎖を含有する特に好ましいポリマーは、重合
されたアクリルアミドのＮ−（３アセトアセタミドプロ
ピル）メタクリルアミドに対する重量比が９５＝５であ
るポリ［アクリルアミド−共−Ｎ−（３−アセトアセタ
ミドプロピル）メタクリルアミド］である。

活性メチレン又は第一アミン基を有するポリマーは、ホ
ルムアルデヒド、グリオキザール並びに米国特許筒３．
２３２，７６４号に記載されているサクシンアルデヒド
及びグルタルアルデヒドのようなジアルデヒドのような
公知のゼラチン硬化剤；米国特許筒３，５４２．５５８
号に記載されているような活性エステル；米国特許筒３
，１０６，４６８号、同第３．３０５，３７６号及び同
第３　、９５７　、８８２号に記載されているような活
性ハロゲン化合物；米国特許筒３，３２５，２８７号に
記載されているようなＳ−トリアジン；米国特許筒３，
５７５，７０５号に記載されているようなアジリジン；
米国特許筒３．４９０．９１１号及び同第３，６４０，
７２０号に記載されているような活性オレフィン；米国
特許筒３，８４１．８７２号及び同第３，５３９．６４
４号に記載されているようなビス（ビニルスルホニルメ
チル）エーテル及びビス（ビニルスルホニル）メタンの
ようなビニルスルホン；ムコ塩素酸及びムコ臭素酸のよ
うなハロゲン置換アルデヒド酸並びにジアルデヒド澱粉
、ポリ（アクロレイン−共−メタクリル酸）、ポリ　（
アクリルアミド−共−２−クロロエチルスルホニルメチ
ルスチレン）及びポリ（アクリルアミド−共−ビニルス
ルホニルメチルスチレン）のようなポリマー硬化剤で、
便利に架橋される。

アルデヒド、活性ハロゲン、アジリジン、エポキシド又
は活性エステル基を有するポリマーは、エチレンジアミ
ン、■、３−プロパンジアミン、１．３−プロパンジチ
オール、ジチオスレイト−ル、ジチオエリスリトール及
びブチレンジアミンのような２個又は３個以上のアミノ
、メルカプト又はヒドロキシ基を有する試薬で架橋でき
る。

〔実施例〕

下記実施例は本発明の詳細な説明するために示す。

型上本発明の方法により電気泳動ゲルを形成するのに有用な
可溶性ポリマーは、例ＩＡに記載したようにして製造で
きる。

窒素雰囲気下に維持した、アクリルアミド（電気泳動グ
レード）（３４，２ｇ、０．４８モル）とＮ−（３−ア
セトアセタミドプロピル）メタクリルアミド（１，８ｇ
、０．００８モル）との、Ｍｉｌｌｉ　Ｑ水（３００ｍ
Ｌ）及びイソプロパツール（１００ｍＬ）中の混合物に
、２２′−アゾビス（２−メチルプロピオニトリル）（
２，０ｇ）を添加した。この溶液をサーモスタット付き
浴中６０〜６５°Ｃで７時間加熱した。反応混合物をア
セトン（３，８Ｌ）’に添加することにより溶液からポ
リマーを沈澱させ、濾過し、メタノール（４Ｌ）で洗浄
し、アセトン（４Ｌ）で洗浄し、吸引乾燥した。固体を
Ｍｉｌｌｉ　Ｑ水（２７５ｍｌ、）に再溶解し、上記の
手順を繰り返して白色固体（３０，０ｇ、８３％収率）
を得た。ポリマーは、２５°Ｃで１．０　Ｍ塩化ナトリ
ウム溶液中０．２５　ｇ　／ｄＬの濃度で測定して０．
３２ｄＬ／　ｇの固有粘度を有していた。第１表に記載
したように重量比とモノマーを変えることによって、同
族の他のポリマーを製造した。第１表には、また、２５
°Ｃで０．２５　ｇ　／ｄＬの濃度で１．０Ｍ塩化ナト
リウム溶液中で測定したコポリマーの固有粘度（η）を
記載した。

第一」ニー表２、　重■比−９０／１０以外は上記１と同し３、　重
量比−８０／２０以外は上記１と同し６、　重量比−９
５１５以外は上記５と同し例ＩＡで製造した９５：５ポ
リ［アクリルアミド−共−Ｎ−（３−アセトアセタミド
プロピル）メタクリルアミド］から、１２％（ｗ／ｖ）
電気泳動ゲルを製造した。

０．３００．３５０．８２高純度の脱イオン水［旧”ｉ　Ｑ］　２５．６ｍＬに該
コポリマー４．８４　ｇを溶解して、出発コポリマー溶
液を作った。（４，８４）０．０５／２２６＝１．０７
（１０−’）化学当量のＮ−（３−アセトアセタミドプ
ロピル）メタクリルアミドが存在している。水中にコポ
リマーを溶解の後、濃塩酸を添加することによって予め
ｐｌｌを８．８に調整した１、５Ｍ″Ｔｒｉｓ’　［’
ｒリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］？！街液１
０．１ｍＬを添加して、ρ■を約８．８に調整する。（
この緩衝液を１、５　Ｍ　Ｔｒｉｓ　・ＩＩｃＩと言い
、０．１重量％のドデシル硫酸ナトリウムを含有する。

）緩衝溶液をコポリマー溶液全体に混合し、平板ゲル成
形スタンドを組み立てた後、架橋剤溶液を添加する。

Ｔｒｉｓ　・ＩＩｃＩＩｃ法（ｐＨ８，８）は活性メチ
レンサイトとグリオキザール架橋剤を競うので、３倍の
化学当量のグリオキザール（即ち３．２１　Ｘ　１０−
’当量）を添加する。好ましくは、これは水中のグリオ
キザールの７　（１０）　−’ｅｑｃｍ−”の溶液とし
て添加され、本実施例では、添加され緩衝されたコポリ
マー溶液を攪拌しながら、このような溶液０．４６ｍＬ
を添加する。次いで、架橋剤溶液の最後を添加した後１
５分以内に、水、コポリマー、緩衝液及び架橋剤の十分
混合した溶液を、ガラス板の間の０．１５ｃｍ溝（スロ
ット）に流下注入する。コポリマーとグリオキザールと
の間の反応はコポリマーの分子量（及びそれにより溶液
粘度）を増加させ、注入を更に困難にさせるので、この
注入は典型的に約４分間を要し、５分間より長くかける
べきではない。

架橋剤を添加した後、約２０〜２５分でゲル化が始まり
ゲルが堅くなるまで続ける。

拠Ｉ上記概要に従って形成したゲルを、ドデシル硫酸ナトリ
ウム（ＳＯ５）が蛋白質の変性剤として存在するポリ（
アクリルアミド）ゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）実験のため
に使用した。５ＯＳ−ＰＡＧＥとして当該技術で知られ
ているこのような実験は、蛋白質の分子量を決定するた
めに使用される。

簡単に言うと、実験の詳細は下記のことを含んでいた。

（ａ）使用される蛋白質は、旧ｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓからの公知の混合物の２セツト（低分子量
標準及び高分子量標準のために、それぞれＣ／　Ｎ　１
６１−０３０４及び１６１−０３０３）であり、それら
を存在するＳＤＳ及び２−メルカプトエタノールと共に
Ｔｒｉｓ　・ＩＩｃＩＩｃ法（ｐＨ６，５）に溶解した
。これらの試料を、全部が大体同じ電荷一対一質量比を
有するドデシル硫酸塩／蛋白質錯体に完全に変性及び転
換した。電極より約２ｐ１１単位下の緩衝液及び分解（
ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ）ゲル緩衝液の使用は、実験の初期
段階で、以下に詳細に述べるように、使用ウェル及び積
み重ねゲル中で、負に荷電した蛋白質が電流の大部分を
運ぶようにする。（ｂ）アクリルアミド／ビス（約４％
Ｔ）の「積み重ねゲル」を、Ｔｒｙｓ　・ｌｌＣｌ　５
衝液（ｐＨ６，５）及び、例えば、ＩＪ、に、Ｌａｅｍ
ｍｌｉ、　Ｎａｔｕｒｅ、　２２７：６８０　（１９７
０年）に記載された方法を使用して作成した。これを例
２のグリオキザール架橋分解ゲルの頂上に置いた。細道
を形成するテフロンくしを、積み重ねゲル溶液の中にゲ
ル溶液を注入した直後に挿入した。ゲル化が２時間以内
に起こり、くしを取り除き細道に蛋白質標準溶液４０〜
５０ｕＬを載せることにより電気泳動実験を始めたしこ
の方法は、［ディスク」又は「多相緩衝液」電気泳動と
言われ、一般にＵ、Ｋ。

Ｌａｅｍｍｌｉ　　［Ｎａｔｕｒｅ、　２２７：６８０
（１９７０年）］に属する。

これはＢｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　
Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　Ｃ＾９４８０４から販売されてい
る旧ｎｉ　Ｐｒｏｔｅａｎ　ＩＩ　Ｄｕａｌ　５ｌａｂ
（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）Ｃｅｌｌに付いて
いる使用説明書に記載されている（使用説明書の例２参
照）］。

（Ｃ）この実施例の電気泳動装置は、１ｌｏｅｆｅｒ　
ＭｏｄｅｌＳＥ　４００（Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ
、　ＣＡ　９４１０７）、縦型平板ゲルセルであった。

電極緩衝液は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ使用説明書の第２３頁に
示されているような、ＳＤＳを含むＴｒｉｓグリシネー
ト緩衝液（ｐＨ８，３）であった。

電極緩衝液中のＴｒｉｓおよびグリシンの実際の濃度は
、それぞれ０．０２５Ｍ及び０．１９Ｍである。（ｄ）
この実験のための電気的パラメーターは、かけた電圧が
１８０■に達するまでは一定電流３０ｍＡであり、電圧
が一定値１８０■に維持された後は電流はゆっくり下降
した。かけた電圧が初期値８９Ｖから１８０■に上昇す
るまでに２時間と少々を要した。

全部の実験は殆ど４時間を要した。

電気泳動を行なった後、ゲルをガラス板の間から取り出
し、メタノール（４０％）、酢酸（１０％）及び水（５
０％）の溶液に溶解したＣｏｏｍａｓｓｉｅＢｌｕｅ　
Ｒ２５０色素で染色した。色素は蛋白質の多い領域で優
先的に吸着されて暗色蛋白質バンドを形成し、分子サイ
ズによる電気泳動的移動が優れた分解能で起きているこ
とは疑いない。横座標として移動路ｙ４（染色溶液中に
膨潤した４、９％ゲルについて補正した）をプロットし
、縦座標として対数分子量をプロットしたグラフは、は
ぼ直線状であり、これは５ＯＳ−ＰＡＧＥでしばしば観
察されるものである。かくして、この例のゲル媒体は、
アクリルアミド／ビス重合から作ったゲルを使用して５
Ｏ５−ＰＡＧＥで得られたものと非常によく似た結果を
与えた。

Claims

【特許請求の範囲】１、（１）（ａ）非置換及び置換のアクリルアミドモノ
マーから選択されたモノマー少なくとも５０重量％、（
ｂ）遊離ラジカル開始機構以外により架橋反応に関与す
る官能性基を含むモノマー１〜５０重量％並びに（ｃ）
モノマー（ａ）及び（ｂ）とは異なった１種又は２種以
上のモノマー０〜約４９重量％からなる非荷電ビニルモ
ノマー混合物の水溶性非架橋非イオン性コポリマー並び
に（２）該コポリマーとは分離した容器内の、前記モノ
マー（ｂ）から誘導されるコポリマーの繰り返し単位の
官能基と反応する架橋剤の組合せを含んでなる、電気泳
動ゲル媒体の製造用キット。２、（Ａ）（１）（ａ）非置換及び置換のアクリルアミ
ドモノマーから選択されたモノマーの少なくとも５０重
量％、（ｂ）遊離ラジカル開始機構以外により架橋反応
に関与する官能性基を含むモノマー１〜５０重量％並び
に（ｃ）モノマー（ａ）及び（ｂ）とは異なった１種又
は２種以上のモノマー０〜約４９重量％からなる非荷電
ビニルモノマー混合物の水溶性非架橋非イオン性コポリ
マー並びに（２）該コポリマーとは分離した容器内の、
前記モノマー（ｂ）から誘導されるコポリマーの繰り返
し単位の官能基と反応する架橋剤の組合せを含んでなる
キットを組み立てる工程、（Ｂ）所望のコポリマー濃度
及びｐＨのゲルを与えるようなコポリマー、緩衝液及び
水の比率を使用して、脱イオン水中の該キットのコポリ
マー及び電気泳動緩衝液の溶液を形成する工程、（Ｃ）
所望の寸法の成形電気泳動ゲル媒体を形成する手段を用
意する工程、（Ｄ）該キットからの架橋剤を、コポリマ
ーと緩衝液の該溶液に、添加後５分〜１５時間の時間内
にゲル化を生じるような架橋剤の濃度で添加する工程並
びに（Ｅ）次いでそうして生成したゲルから所望の寸法
のゲル媒体を形成するために該ゲル成形手段を直ちに使
用する工程を含んでなる、有害な化学薬剤への露出を最
小にする電気泳動ゲル媒体を製造する方法。