JPS6060548A - 電気泳動用媒体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ＤＮＡ塩基配列決定のために用いられるゲル
電気泳動用媒体（以下、ゲル媒体ということがある）に
関するものであり、特に、ゲル媒体の加工適性を改良す
るためのゲル媒体組成に関するものである。

ポストラベル法に基づ＜ＤＮＡやＲＮＡの塩基配列決定
法においては、ポリアクリルアミ；・ケル■りを用いた
スラブ電気泳動が必須の操作となっている。この目的に
用いられるポリアクリルアミドゲル膜は、アクリルアミ
ドのような単量体約９５重量部とＮ、Ｎ’−メチレンビ
スアクリルアミドのような二官能性の架橋剤約５重量部
の割合の混合物、および重合開始剤を含む水溶液（以下
、ゲル形成液ということがある）中で単量体と架橋剤を
架橋重合させることによって得ている。

特に近年において遺伝子関連の研究が進むにつれて、Ｄ
　Ｎ　Ａ　塩基配列決定の操作の迅速化が急゛　務とな
っており、上記のようなポリアクリルアミドを泳動層と
する電気泳動方式は分離能が極めて、−７１いためＤＮ
Ａの塩基配列決定に必須となっている。

しかしながら現在用いられているポリアクリルアミドゲ
ル膜は、もろくてこわれやすいといったＩＩシ物性上の
大きな欠点を有している。このためＤＮＡ塩基配列決定
のためのポリアクリルアミドゲル膜は、２枚のガラス板
で形成されたセル（たとえば０．３ｍｍ−１ｍｍの厚さ
の空間を有する）の中にゲル形成液を注入して、そのセ
ル内でゲル１１りを形成させる方法により作成している
。ただしケル膜にはＤＮＡ試料（Ｍａｘａ＋１−Ｇｉｌ
ｂｅｒｔ分解した３２　ｐラベルされたＤＮＡなど）を
注入するためのサンプル注入口を設けることが必要であ
るため、ゲル化の前に注入口を作成するためのサンプル
スロットホーマー　（Ｓａｍｐｌｅ　５ｌｏｔ　ｆｏｒ
ｍｅｒ）が挿入される。すなわちゲル膜が非常にもろく
て破れやすいため、ゲル化をさせた膜をのちにカミソリ
等でサンプル注入口を切って作ることが出来ず、予め前
述のようにサンプルスロットホーマーをゲル化前に挿入
しゲル化させる工程がとられている。従ってこのような
工程がポリアクリルアミドゲル膜の多量製造においての
大きな障害の−っとなっている。

次に、以」二のようにして作成したポリアクリルアミド
ゲル膜をガラス板にはさんだままで垂直に立て、サンプ
ルホーマーを取り去ったのち、そのサンプルスロットに
試料（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ分解した３２　ｐラ
ベルされたＤＮＡなど）を一定量注入し電気泳動を行な
う。一定時間電気泳動を行なったのち、片面のガラス板
を注意深く除去し、このゲル膜を用いてオートラジオグ
ラフィー処理を行なう。そしてこの後ＤＮＡの塩基配列
の決定操作が行なわれる。なお、この際においても現在
のゲルＩ＋！、！が非常にもろいため、ガラス板をはず
す時に膜か破れてしまうことさえあり、ゲル膜のもろさ
は非常に大きな問題となっている。

本発明はこの大きな問題点であるゲル膜のもろさを改良
する方法を鋭意検討した結果、到達されたものである。

本発明はゲル媒体組成に起因するＤＮＡ塩基配列決定用
ポリアクリルアミドゲル電気泳動膜の欠点（もろさ）を
改良するだめのゲル組成を提供するものである。

すなわち、本発明の目的は、分離能、泳動速度などの゛
電気泳動特性が良好でかつ、ゲル膜が破損しに〈＜、取
り扱い性が良く、その−ヒ、任意の形体にゲル膜を裁断
加工でき、また必要によりディスク電気泳動法用のゲル
カラム等にも用いることができ、総合的に見て、従来の
ものよりも著しく優れた特性を有するＤＮＡ塩基配列用
の分子ふるい効果を有するポリアクリルアミドゲル媒体
を提供する事である。

本発明の目的は、アクリルアミドゲル形成液（例えば、
アクリルアミドとＮ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミ
ド等を含む液）中に予め親水性の合成ポリマーを含有さ
せたのち、形成させたゲル媒体により達成される。

本発明は、アクリルアミド系化合物（以−ド、中量体と
いうことがある。）と架橋剤が水の存在ドで架橋重合し
てなるポリアクリルアミド系ゲル、および変性剤を含む
ゲル電気泳動用媒体において、さらに水溶性ポリマーを
含むケル電気泳動方式体を提供するものである。

本発明において、アクリルアミド系化合物と架橋剤は、
水溶液または水分散！αとして水中に溶解または分散さ
せておき、水中で１１４者を架橋重合させて、架橋重合
した水性ゲル媒体を形成する。本明細書においては、特
にことわらない限り、（水中に）溶解と（水中に）分散
の両者を含めて中に（水中に）溶解といい、水溶液と水
分散液の両者を含めて単に水溶液という。また、溶媒ま
たは分散媒として、所望により加えられる有機溶媒と水
のΔへ合物をも包含する。

本発明に用いることができるアクリルアミド系化合物の
例としては、アクリルアミド、Ｎ−メチルアクリルアミ
ド、Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−（ヒドロキ
シメチル）アクリルアミド、ジアセトンアクリルアミド
等のアクリルアミドホモログがあげられ、これらの化合
物は単独であるいは二種以」二を併用して用いることが
できる。

そして、これらのアクリルアミド系化合物のうちではア
クリルアミドが最も好ましく、またアクリルアミドと他
のアクリルアミド系化合物の一種以上との併用も好まし
い。

未発明のポリアクリルアミド系ゲルを得るために用いら
れる架橋剤としてはＦ　Ｅｌｅｃｔｏｒｏｐｈｏｒｅｓ
ｉｓＪｌ　１９８１．　ｇ、　２２０−２２８などに記
載の架橋剤を用いることができる。そして、架橋剤の具
体例としてはＮ、Ｎ”−メチレンビスアクリルアミド（
ＢＩＳ）；Ｎ、Ｎ’−プロピレンビスアクリルアミド（
ＰＢＡ）；ジアクリルアミドジメチルエーテル（ＤＡＥ
）；　ｌ　、２−ジアクリルアミドエチレングリコール
（ＤＥＣ）、エチレンウレアヒスアクリルアミド（ＥＵ
Ｂ）；エチレンジアクリレート（ＥＤＡ）、Ｎ、Ｎ’−
ジアリルタータルジアミド　（Ｎ、Ｎ’−ｄｉａｌｌｙ
ｌｔａｙｔａｒ−ｄｉａｍｉｄｅ、Ｄ　Ａ　Ｔ　Ｄ　）
　；Ｎ、Ｎ’−ビスアクリリルシスタミｙ　（Ｎ、Ｎ’
−ｂｉｓａｃｒｙｌｙｌｃｙｓｔａｍｉｎｅ、　Ｂ　Ａ
　Ｃ）等の二官能性化合物を挙げることかできる。架橋
剤の濃度としては、単量体と架橋剤の総重量に対して約
１ｗｔ％から約３０ｗｔ％が用いられ、特に約３ｗＬ％
から約１０ｗｔ％が好ましく用いられる。

変性剤としては少なくとも一個のカル八モイル基をもつ
化合物を用いることかで５、その具体例として尿素、ホ
ルムアミド等があげられる。これらのうちで尿素が特に
好ましく用いられる。変性剤の量は単量体と架橋剤とを
含む水性ゲルの容積に対し約４０ｗｔ％から約６０ｗｔ
％の範囲で用いられる。また変性剤として尿素を用いる
場合には、単量体と架橋剤を含む水性ゲル媒体１立１３
対し約６モル（約３６０　ｇ）から飽和溶解量まで、好
ましくは約７モル（約４２０　ｇ）から飽和溶解量まで
の範囲で用いることができる。

水溶性ポリマーとしては、付加重合型または縮重合型の
水溶性ポリマーを用いることができる。

１゛・ｊ加重金型ポリマーの具体例としてポリビニルア
ルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド
等の非イオン性水溶性ポリマーがあげられる。縮重合型
ポリマーの具体例としてポリエチレングリコール、ポリ
プロピレンクリコール等の非イオン性水溶性ポリアルキ
レングリコールがあげられる。水溶性ポリマーの分子量
は約１万から約−へ１００万の範囲のものが好ましい。

これらの水溶性ポリマーのうちではポリアクリルアミ１
きとポリエチレングリコールが好ましい。水溶性ポリマ
ーは単量体と架橋剤の合計重量に対して約１ｗｔ％から
約５０ｗｔ％の範囲、好ましくは約５ｗｔ％から約３０
ｗｔ％の範囲で用いられる。

本発明においては水溶性ポリマーの添加によりゲル媒体
が可塑性を有するようになり、またゲル媒体は乾仔吟に
も可塑性を有するようになり、もろさが改良され、こわ
れにくくなる。また、水溶性ポリで−の分子量および益
加星を選択することによりゲル媒体の粘度をコントロー
ルすることもできる。

本発明のケル媒体にはｐＨ緩衝剤を含有させることがで
きる。緩衝剤としては、ｐＨ８，０から９．０、好まし
くはｐ　Ｈ８、２から８．３の範囲内のｐＨ値に緩衝で
きる緩衝剤であれば、いずれをも用いることかできる。

用いうる緩衝剤としては、１−１本化学会編Ｗ化学便覧
　基礎編Ａ　（東京、丸み■　１９６６年発行）　１３
１２−１３２０ページ；Ｊｌｌｌａｔａ　ｆｏｒ　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　、１　（Ｒ，
Ｍ、Ｃ。

Ｄａｗｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ　ｍ　第２版、　０ｘｆｏｒ
ｄ　ａｔ　ｔｈｅ　Ｃ１ａｒｅｎｄｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、
１９８９年発行）　４７Ｂ−５０８ページ。

ｌ′Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｌ　、　５，４ｆｉ７
（１９８６）　；ｆｆＡｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｊ　１０４，３００−３１０（＋９
８０）等の刊行物に記載の緩衝剤があげられる。モして
その具体例としては、トリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン（Ｔｒｉｓ）　、　Ｎ　、　Ｎ−ヒス（２−ヒ
ドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−２〜
ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ″−２−ヒドロキシプ
ロパン−３−スルホン酸のＮａ塩またはＫ　ｉｉＡ等、
Ｎ−２−ヒドロキシエチル、ピペラジン−Ｎ’−３−プ
ロパンスルホン酸（７）　Ｎ　ａ　塩またはに塩等、Ｎ
−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−３−アミノ
プロパンスルホン酷のＮａ用またはに塩および、これら
のいずれかと心安により組合せられる酸、アルカリまた
は塩等をあげることができる。特に好ましい緩衝剤の例
としては、Ｔｒｉｊ、ホウ酩およびＥＤＴＡ・２Ｎａ塩
の組合せ（ｐＨ８，３）がある。

本発明のゲル媒体を層または膜として用いる場合には、
平滑な親水性表面を有する電気絶縁性支持体の４二にケ
ル形成液を公知の方法により塗布して設けたのちにゲル
形成液を架橋重合させることによりゲル層またはゲル膜
に成形することができる。支持体としてはガラス板、親
木性ポリマー、または公知の表面処理により表面を親水
化したポリで−（例、ポリエチレンテレフタレート、ビ
スフェノールＡのポリカルボネート、ポリ塩化ビニル、
塩化ビニリデン−塩化ビニルコポリマー、ポリメチルメ
タアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、セル
ロースアセテート類、セルロースアセテートプロピオネ
ート等）の板またはシート等の成形物をあげることがで
きる。これらのポリマー成形物の表面を親水化するため
の処理としては、紫外線照射、グロー放電処理、コロナ
放電処理、火焔処理、電子線照射、ケミカルエツチング
、電解エツチング等の公知の方法を適用することができ
る。

ケル形成液を支持体の表面で架橋重合させる場合にはゲ
ル形成液の上をさらに力／ヘーフイルム、シートまたは
板などでおおうことができる。この目的に使用されるカ
バーフィルム、シート・　または板としては前期支持体
と同様な素材からなるものを用いることができる。

本発明で用いられるゲル媒体は、アクリルアミドの様な
単量体と二官能性のアクリル化合物又はアクリル化合物
（架橋剤）とが、水溶性ポリマーを実質的に均一に溶解
させた水溶液中でラジカル架橋重合させて得られるもの
であり、三次元架橋重合体に、水溶性ポリマーが実質的
に均一に分散され、ポリマー鎖が三次元架橋重合体とか
らみあっていると推定される構造に特徴がある。

」二記架橋重合反応は過酸化物の存在及び／又は紫外線
照射により起こすことができる。更にこの反応は熱およ
び紫り（線により加速することができる。

ラジカル架橋重合用触媒としては、ｒ　Ｅｌｅｃｔｒ。

ｐｈｏｒｅｓｉｓ　Ｊ　１９８１．２Ｌ２１３−２１９
．同１９８１．　ｇ。

２２０−２２８　、古木、永井編「最新電気泳動法」（
１８７３年発行）等に記載の公知の低温ラジカル重合開
始剤のうちから適宜選択して用いることができる。好ま
しいラジカル重合開始剤の具体例としては、β−ジメチ
ルアミノプロピオニトリル（ＤＭＡＰＮ）−ペルオクソ
ニ硫酸アンモニウム混合物、Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テト
ラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）−ペルオクソ
ニ硫酸アンモニウム混合物、ＴＥＭＥＤ−リボフラビン
混合物、ＴＥＭＥＤ−リボフラビン−過酸化水素混合物
と紫外線照射の組合せ等が挙げられる。ラジカル重合開
始剤の含有量は、単量体と架橋剤の合計重量に対して約
Ｑ　、３ｗｔ％から約５ｗｔ％、そして好ましくは約０
．５ｗｔ％から約３ｗｔ％の範囲である。

なお、本発明のゲル媒体には、湿潤剤としてグリセリン
、エチレングリコール等のポリオール化合物を含ませる
ことができ、その添加量は水性ゲル媒体の容積に対して
約１ｗｔ％から約４０ｗｔ％の範囲である。ポリオール
化合物のうちではグリセリンが特に好ましい。

以下に本発明の効果を明確にするために実施例を挙げて
説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定する
ものではない。

［実施例１］ 表面が平滑なガラス板２枚と０．５ｍｒｎ厚みのスペー
サー板を用いて０．５ｍｍ厚み空間をイ１するガラス板
セルを作成し、このセルの中に第１表に示すアクリルア
ミドゲル組成溶液（ゲル形成液）を注入し架橋重合させ
ることによりポリアクリルアミド系ゲル膜を形成した。

そして充分にゲル化させたのち片面のガラス板をはずし
、ポリアクリルアミドゲル膜に鋭い刃を用いてサンプル
注入用のスロットを作った。

試料Ｎ０１（比較ゲル膜）では、切り口にひびが生じ、
膜がやぶれたりして、鋭い切口のサンプルスロットが得
られなかった。しかしながら、試料Ｎｏ２〜４（本発明
のゲル媒体によるゲル膜）ではいずれも鋭い切口のサン
プルスロットが容易に得られた。

このようにして得たゲル膜に再度ガラス板でカバーをし
、常法に従って電気泳動を行ない色素の泳動パターンを
観察した。

試料Ｎｏｔでは色素の乱れがひどく、シャープな泳動パ
ターンが得られなかった。これに対して試料Ｎｏ２〜４
は色素の乱れもなく、均一な泳動パターンが得られた。

以上のように、本発明のゲル媒体によるゲル膜は、従来
公知のゲル膜と比較して、もろさの欠点が著しく改良さ
れていることが明らかになった。

第１表　ゲル媒体組成 ｌ　２　３　４ アクリルアミド　１１．８７ｇ　同左　同左　同左Ｎ、
Ｎ’−メチレンビス アクリルアミド　０．６１３ｇ　同左　同左　同左尿素
　４２ｇ　同左　同左　同左 固形ポリアクリルアミド （平均分子量５万）　なし　１．２５ｇ　２．５ｇなし
固形ポリアクリルアミド （平均分子８０万）　なし　なし　なし　１．２５ｇト
リス（ヒドロキシメチル） アミンメタン　１０８ｇ　同左　同左　同左ホウ酸　０
．５５ｇ　同左　同左　同左ＥＤＴＡ・２Ｎａ　９３ｍ
ｇ　同左　同左　同左水　（水を加えて１００　ｍ文と
する）血論」Ｌ肛剣 ペルオクソ＆Ｌｍアンモニ ラム（５ｗｔ、％水溶液）　１．３ｍＪＬ　同左　同左
　同左Ｎ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’−テトラメチル エチレンジアミン　３３ル文　同左　同左　同左註ニド
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ホウ酸および
ＥＤＴＡ・２ＮａはｐＨ８，２（７）緩せ１剤組成 ［実施例２コ 実施例１と同じゲル処方を用いゲル膜を作成した。比較
のために試料陥、１についてはゲル膜作成時にスロット
ホーマを挿入しスロットをあらかじめ作成した膜も作っ
た（これを試料ＮＤｌ−Ａとする。比較ゲル膜）。

これらのゲル膜を用いＤＮＡ塩基配列決定の実験を、３
２　ｐラベルされたＤＮＡを用いＭａｘａｍ−Ｇ　ｉ　
１ｂｅｒｔ分解した試料を用いて行なった。

試料Ｎｏ１−Ａと試料２〜４は正常な電気泳動パターン
を示しＤＮＡ塩基配列解析が行なえたが、試料Ｎ０１は
電気泳動パターンに乱れが生した。

以上のごとく本発明のゲル媒体によるゲル＋１９は電気
泳動特性に問題がなく、且つもろさが改良されたゲル膜
を提供できることが明らかになった。

［実施例３］ 実施例１における固形ポリアクリルアミド（水溶性ポリ
マー）の代りにポリエチレングリコール（平均分子量２
０万）を用いてポリアクリルアミＩ・系ゲル膜を形成し
、このゲル膜を用いて同様の実験を行なったところ、電
気泳動特性１−特に問題がなく、その」−膜物性におけ
る欠点であったもろさも著しく改良され、ゲル膜を任意
に加圧裁断できる事が判明した結果１本発明の効果が明
らかになった。

特許出願人　富士写真フィルム株式会拐代理人　弁理士
　柳川泰男

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ■。アクリルアミド系化合物と架橋剤が水の存在下で架
   橋重合してなるポリアクリルアミド系ゲルおよび変性剤
   を含む電気泳動用媒体において、水溶性ポリマーを含む
   ことを特徴とする電気泳動用媒体。 ２゜水溶性ポリマーが公刊１万から１００万の範囲の伺
   加重合型または縮重合型の水溶性ポリマーである特許請
   求の範囲第１項記載の電気泳動用媒体。 ３゜前記アクリルアミド系化合物と前記架橋剤との合計
   重量に対し、前記架橋剤が１ｗｔ％がら３０ｗｔ％の範
   囲、前記水溶性ポリマーが１ｗｔ％から５０ｗｔ％の範
   囲で含まれ、かつ前記ポリアクリルアミド系ゲルの容積
   に対し前記変性剤が４０　ｗ　ｔ　／　ｖ％から６　Ｑ
   　ｗ　ｔ　／　ｖ％の範囲で含まれる特許請求の範囲第
   １項または第２項記載の電気泳動用媒体。 ４゜前記変性剤が尿素またはホルムアｚトである特許請
   求の範囲第１項乃至第３項のいずれかの項記載の電気泳
   動用媒体。 ５゜前記電気泳動用媒体が平担な表面を有する支持体の
   上に設けられた実質的に一様な厚さの膜である特許請求
   の範囲第１項乃至第４項のいずれかの項に記載の電気泳
   動用媒体。