JPS61296258A - 電気泳動用媒体材料およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野１ 本発明は、電気泳動用媒体材料およびその製造法に関す
るものであり、さらに詳しくは特に蛋白質等の生体高分
子成分の電気泳動分析に使用するのに適した電気泳動用
媒体材料およびその製造法に関するものである。

［発明の背景］ 電気泳動分析の代表的な態様としては、ガラス板支持体
に寒天、セルロース、セルロースアセテート、デンプン
、シリカゲル、ポリアクリルアミド等の膜形成材料を塗
布または流延して製造した電気泳動膜に緩衝液をしみこ
ませ、この上に分析対象の物質を付着させ、支持体の両
端に電圧をかけ、支持体の上または内部で展開（移動）
させたのち、染色し、この染色した試料の光学濃度を測
定して物質の各成分の定量分析を行なう態様を挙げるこ
とができる。

このような電気泳動分析および電気泳動膜の詳細につい
ては、電気泳動実験法［電気泳動実験法（改訂第５版）
」（文光堂、１９７５年発行）。

青水、水弁編著「最新電気泳動法」　（床用書店。

１９７３年発行）等に記載されている。

近年において、電気泳動法は生体成分の分析に多用され
ており、特に蛋白分析は病気診断のための生化学検査に
おいて頻繁に用いられている。

電気泳動用膜またはシートとしては古くから濾紙が用い
られていたが、上述のように性能上の面から最近はアガ
ロース膜やポリアクリルアミドゲル膜が用いられるよう
になり、特に分子ふるい効果を有するポリアクリルアミ
ドゲル膜は現在最も多く利用されている。

ポリアクリルアミドゲル膜は、アクリルアミドのような
単量体を、重合触媒の存在下、Ｎ、Ｎ’−メチレンビス
アクリルアミドのような二官能性の架橋剤で酸素不存在
条件下で重合架橋させることによって得られている。

なお、ポリアクリルアミドゲル膜の製造に際しては変性
剤として陰イオン界面活性剤が添加されることが多いが
、蛋白質分析用ゲル膜の製造においては、変性剤の必要
量が少ないため、湿潤ゲル膜に変性剤水溶液を塗布する
方法、ゲル膜を変性剤水溶液に浸漬する方法等によりゲ
ル膜内に変性剤を含浸させることができる。

上記のようにポリアクリルアミド形成の重合反応はラジ
カル架橋重合であるため、酸素の影響により架橋重合が
阻害される。従って、ポリアクリルアミドゲル膜は酸素
を遮断した状態で作成する必要がある。このため、一般
にポリアクリルアミドゲル膜は、二枚のガラス板から構
成されたセル（一定の空間、たとえば０．３ｍｍ−１ｍ
ｍ）の中にゲル形成液を注入−したのち酸素を遮断し架
橋重合させてゲル化させることにより形成されている。

しかしながら、二枚のガラス板の間でゲル膜を形成する
作業は、ガラスが割れやすく、かつ重い等の欠点があり
、またガラスに挟まれたゲル膜は持ち運びに不便で取扱
い性が悪いため、ゲル膜を量産するには多大の困難を伴
う。

更に従来では、ガラス板に挟まれたポリアクリルアミド
ゲル膜を用いて、所定条件でｍ＝定時間水平あるいは垂
直スラブ電気泳動を行なったのち、ゲル膜を染色（例え
ば、デンソ３Ｒ染色、クマシーブリリアントブルーＧ−
２５０染色、銀染色等がある）処理し、生体成分の分析
を行なうような操作が行なわれているが、ガラス板と湿
潤状態のゲル膜との接着性が悪いためこの染色工程にお
いてゲル膜がガラス板より剥離しやすく、その作業には
高度の熟練した技術が必要となる。

前記の取り扱い性の難点を解決するためにガラス支持体
の代りに、軽いプラスチック支持体に設けたポリアクリ
ルアミドゲル膜の開発が望まれている。このような目的
に用いられるプラスチック支持体の好ましい材料として
は、たとえばポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）の
ように、取扱い性がよく、かつ各種性能の優れたプラス
チックが想定されるが、これらのプラスチックは一般に
疎水性であり、このためゲル膜と支持体との間の接着性
が乏しいとの問題がある。また疎水性プラスチックシー
トの表面を親水性にしたとしても、あるいは親水性のプ
ラスチックシートを用いたとしても、ゲル膜と支持体と
の接着性は必ずしも満足できるレベルには達しない。

［発明の要旨］ 従って、本発明は、プラスチック支持体層と電気泳動用
媒体層（ポリアクリルアミドゲルりとからなる電気泳動
用媒体材料であって、取り扱い性、および湿潤状態での
電気泳動用媒体層と支持体との間の接着性が優れた電気
泳動用媒体材料およびその製造法を提供することを目的
とするものである。

本発明はまた、電気泳動後の染色工程ないし染色処理後
の乾燥工程などにおいても電気泳動用媒体層（ポリアク
リルアミドゲル膜）が支持体から剥離することのない電
気泳動用媒体材料およびその製造法を提供することもそ
の目的とするものである。

本発明は、下記の各層が順次積層されてなる三層構造を
含む電気泳動用媒体材料からなるものである： ［Ｉ］プラスチック支持体層； ［ｎ］　メチルメタクリレートマクロモノマーのアミド
基含有グラフト化誘導体から形成された接着層；および
。

［ＩＩＩ］アクリルアミド系化合物と架橋剤が水の存在
下で架橋重合してなるポリアクリルアミド系水性ゲル電
気泳動用媒体層。

本発明の電気泳動用媒体・材料は、上記のように支持体
層と電気泳動用媒体層とをメチルメタクリレートマクロ
モノマーのアミド基含有グラフト化誘導体から形成され
た接着層により接合しでなる三層構造を含むものであり
、前述の電気泳動用媒体層（ポリアクリルアミドゲル膜
）の染色工程における各種の操作によっても、その三層
構造が分離しにくいため１作業上非常に有利となる。さ
らに、本発明の電気泳動用媒体材料は、水平に置いた支
持体の上にメチルメタクリレートマクロモノマーのアミ
ド基含有グラフト化誘導体層を形成し、次いで電気泳動
用媒体層をその上に形成する方法によっても製造するこ
とが可能であるため、電気泳動用媒体材料の量産化にも
大きく寄与するものもある。

上記の電気泳動用媒体材料は、プラスチック支持体の上
にメチルメタクリレートマクロモノマーのアミド基含有
グラフト化誘導体を含む中間層を設けたのち、該中間層
の上にてアクリルアミド系化合物と架橋剤とを水の存在
下で架橋重合してポリアクリルアミド系水性ゲル電気泳
動用媒体層を形成する方法を利用することにより製造す
ることができる。

［発明の詳細な記述］ 本発明の電気泳動用媒体材料の支持体とじては各種のプ
ラスチックシートを用いることができる・このプラスチ
ックシートとしては、任意のプラスチックから形成した
ものを用いることができる。好ましいプラスチックシー
トの例としては、親水性ポリマーまたは公知の表面処理
により表面を親水化したポリマー（例、ポリエチレンテ
レフタレート、ビスフェノールＡのポリカルボネート、
ポリ塩化ビニル、塩化ビニリデン・塩化ビニルコポリマ
ー、ポリメチルメタアクリレート、ポリエチレン、ポリ
プロピレン、セルロースアセテート類、セルロースアセ
テートプロピオネート等）のシート（フィルム、板状物
も含む）等を挙げることができる。なおプラスチックシ
ートの表面を親水化するための処理としては、紫外線照
射、グロー放電処理、コロナ放電処理、火焔処理、電子
線照射、ケミカルエツチング、電解エツチング等の公知
の方法を適用することができる。

ただし、支持体表面の親木化は必須ではなく、前述のプ
ラスチックシートをそのまま支持体として用いることが
できる。

本発明において、上記支持体の丘に接着層が形成される
。

接着層は、メチルメタクリレートマクロモノマーのアミ
ド基含有グラフト化誘導体から形成される層である。マ
クロモノマーとは、一定の繰返し単位を有する比較的高
分子量の置換基を持った重合可能なモノマーと一般に定
義されるものであり、メチルメタクリレートマクロモノ
マーのアミド基含有グラフト化誘導体は、重合可能なメ
チル、メタクリレート基誘導体を分子内に含有するマク
ロモノマーである。メチルメタクリレートマクロモノマ
ーのアミド基含有グラフト化誘導体はメチルメタクリレ
ートマクロモノマーをアミド基含有のエチレン性不飽和
二重結合を一個含むモノマー、好ましくはアミド基含有
のアクリル酸またはメタクリル酸類化合物上ツマ−の一
種または二種以上で処理してメチルメタクリレートマク
ロモノマーのメチルメタクリレート基末端に前記モノマ
ーによるグラフト共重合を開始させて得られる化合物で
ある。アミド基含有アクリル酸類化合物モノマーとして
例えばアクリルアミド、Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ
、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ジアセトンアクリルア
ミド、Ｎ−メチロールアクリルアミド等、アミド基含有
メタクリル酸類化合物モノマーとして例えばメタクリル
アミド、Ｎ−メチルメタクリルアミド等が挙げられる。

本発明に用いられる代表的なメチルメタクリレートマク
ロモノマーのアミド基含有グラフト化誘導体の合成例を
以下にのべる。なお、各合成例において１部」および１
％」はそれぞれｒ重量部Ｊおよび「重量％」を意味する
。

［合成例１］ 攪拌機、還流冷却器、滴下ロート、温度計およびＮ２ガ
ス吹込口を備えたガラスフラスコにアセトン１７．５部
とトルエン８２．５部との混合溶媒を仕込み、Ｎ２を導
入しながら還流下にメチルメタクリレート（以後ＭＭＡ
と略記）１００部、連鎖移動剤としてチオグリコール酸
（以後ＴＧＡと略記）３．２部および重合開始剤として
アゾビスイソブチロニトリル（以後ＡＩ　ＢＮと略記）
３部の混合溶液を３時間かかって連続的に滴下して重合
を行った。さらにその後２時間加熱して重合を終了し、
下記構造式［１］のポリマーの溶液を得た０反応液の一
部にｎ−ヘキサンを加えて沈澱物を生成させ、この沈澱
物を減圧下で乾燥して酸価を測定したところ０．３４０
ｍｇ当ｍ／ｇであった。

上記反応液からアセトンの一部を留去した後、これにト
リエチルアミン（触奴）０．５％、ヒドロキノン七ツメ
チルエーテル（重合禁止剤）２００ｐｐｍおよび酸に対
して１．３倍モルのグリシジルメタクリレートを加え、
反応温度１１０℃にて４時間反応させた。酸価の減少か
ら求めた反応率は９６％であった。

上記反応液を１０体植倍量のｎ−へキサン中に投入して
沈澱を生成させ、この沈澱をを８０℃で減圧乾燥して下
記構造式［ＩＩ］のマクロモノマー９５部を得た。この
マクロモノマーのゲルパーミェーションクロマトグラフ
（ＧＰＣ）によるポリスチレン換算分子量は２８４０　
（数平均）および６．４７０（重量平均）であった・ま
た・水酸基価は０．３５０ｍｇ当量／ｇであった・［合
成例２］ クシ型グラフトポリマーの合成 合成例１と同様にして、合成例１で得たマクロモノマー
３０部、ＭＭＡ５０部、ジアセトンアクリルアミド２０
部、メチルエチルケトン２００部およびアゾビスイソブ
チロニトリル（以下、ＡＩＢＮと略記する）３．０部を
仕込み、Ｎ２ガス導入還流下（約８０℃）で８００時間
反応せた。

この反応液をｔｏ＠量のｎ−へキサンに投入し沈殿させ
、８０℃で減圧乾燥してグラフトコポリマー９４部を得
た（Ｐ−１）、得られたグラフトコポリマーはＧＰＣに
より単一ピークを示し、数平均分子量約１９，０００で
あった。

同様な操作によりグラフトコポリマーの成分上ツマ−の
組成比を変えて二種のクシ型グラフトポリマー（Ｐ−１
およびＰ−３）を合成した。それぞれのクシ型グラフト
コロリマーを第１表に示す。

以下余白 第１表 番号　共重合モノマー　　　クシ型 グラフトポリマー 平均分子量　収量 Ｐ−１マクロモノマー３０部　　約１９．０００　９２
部ＭＭＡ　　　　　　５０部 （Ａ　）　　　　　　２０部 Ｐ−２マクロモノマー３０部　　約２２．０００　９２
部ＭＭＡ　　　　　３０部 （Ａ　）　　　　　　４０部 Ｐ−３マクロモノマー３０部　　約１２．０００　９５
部ＭＭＡ　　　　　３０部 （Ｂ）　　　　　　４０部 註）（Ａ）ニジアセトンアクリルアミド（Ｂ）：Ｎ、Ｎ
−ジメチルアクリルアミドＭＭＡ　：メチルメタクリレ
ート これらのメチルメタクリレートマクロモノマーのアミド
基含有グラフト化誘導体は単独で使用しても、併用して
もよい、また、層形成成分の５０重量％以内である限り
他の高分子物質や添加剤を含むことができる。このよう
な高分子物質および添加剤の例としては、ジアセチルセ
ルロース、ニトロセルロース、ポリビニルアルコール、
ポリアクリルアミド、ポリメタクリル酸メチル、ポリ塩
化ビニリデン等のポリマー、グリセリン等のポリオール
化合物を挙げることができる。

メチルメタクリレートマクロモノマーのアミド基含有グ
ラフト化誘導体から形成される接着層は、公知の塗布方
法などを利用して支持体の表面に設けることができる。

すなわち、該マクロモノマー誘導体が水溶性または親木
性である場合には、それの水溶液または、水を主成分と
する水・有機溶媒混合溶媒溶液を公知の方法により支持
体の上に塗布、乾燥して接着層を形成する方法を利用す
ることができる。該マクロモノマー誘導体カ疎水性で水
不溶性であ−る場合には、それの有機溶媒溶液または、
有機溶媒を主成分とする有機溶媒・水混合溶媒溶液を、
公知の方法により支持体の上に塗布、乾燥して接着層を
形成する方法を利用することができる。

用いることができる有機溶媒の例としては、アセトン、
メチルエチルケトンなどのケトン類：メタノール、エタ
ノールなどのアルコール類；Ｎ。

Ｎ−ジメチルホルムアミド；ジメチルスルホキシド；ジ
メチルエーテル、ジオキサンなどのエーテル類などを挙
げることができる。

メチルメタクリレートマクロモノマーのアミド基含有グ
ラフト化誘導体から形成された接着層はメチルメタクリ
レートマクロモノマーのアミド基含有グラフト化誘導体
単独あるいは該誘導体を８０重量％以上含む組成物から
形成させることが望ましく、特に実質的にメチルメタク
リレートマクロモノマーのアミド基含有グラフト化誘導
体のみから形成された層であることが望ましい。

乾燥後の接着層の厚さは、約０．１ｇｍから約３μｍ、
好ましくは約０．２１Ｌｍ力、ら約２ｇｍｃ７）範囲と
する。

次に電気泳動用媒体層（以下においてゲル媒体層、ポリ
アクリルアミドゲル膜あるいは単にゲル膜ともいう）に
ついて説明する。

ポリアクリルアミドゲル膜は、アクリルアミド系化合物
と架橋剤とを、水溶液または水分散液として水中に溶解
または分散させてゲル形成液を調製したのち、液中で両
者を架橋重合させて架橋重合した水性ゲル膜として形成
することにより得ることができる０本明細書においては
、特にことわらない限り、（水中に）溶解と（水中に）
分散の両者を含めて単に（水中に）溶解といい、水溶液
と水分散液の両者を含めて単に水溶液という、また溶媒
または分散媒としては、所望により加えられる有機溶媒
と水の混合物をも包含する。

ポリアクリルアミドゲル膜の製造に用いることができる
アクリルアミド系化合物としては、アクリルアミド、Ｎ
−メチルアクリルアミド５．Ｎ　、　Ｎ−ジメチルアク
リルアミド、Ｎ−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド
、ジアセトンアクリルアミド等のアクリルアミドホモロ
グやメクリルアミドのようなメクリルアミド系化合物が
あげられ、これらの化合物は単独で、あるいは二種以上
を併用して用いることができる。これらのアクリルアミ
ド系化合物のうちではアクリルアミドが最も好ましく、
またアクリルアミドと他のアクリルアミド系化合物の一
種以上の併用も好ましい。

架橋剤としては「エレクトロフォレシス（Ｅｌｅｃｔｒ
ｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）　Ｊ　１９８１．２．２２０−２
２８等に記載の公知の化合物（一種または二種以上の組
合せ）を用いることができる。架橋剤の具体例としては
、Ｎ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＢＩＳ）、
Ｎ、Ｎ’−プロピレンビスアクリルアミド（ＰＢＡ）、
ジ（アクリルアミドメチル）エーテル（またはＮ、Ｎ’
−オキシジメチレンアクリルアミド）；１，２−ジアク
リルアミドエチレングリコール；１，３−ジアクリロイ
ルエチレンウレア；エチレンジアクリレート（ＥＤＡ）
；Ｎ、Ｎ’−ジアリルタータルジアミド（Ｎ、　Ｎ’−
ｄｉａｌ＋７１ｔａｒｔａｒｄｉａｍｉｄｅ、　Ｄ　Ａ
　Ｔ　Ｄ　）　　；およびＮ。

Ｎ”−ビスアクリリルシスタミン（Ｎ、　Ｎ’−ｂｉｓ
ａｃｒｙｌｙｌｃｙｓｔａｍｉｎｅ　、　Ｂ　Ａ　Ｃ）
等ノ二官能性化合物があげられる。

架橋剤は、単量体と架橋剤の総重量に対して約０．１重
量％から約３０重量％、好ましくは約０．５重量％から
約１０重量％の範囲の量で用いることができる。

ゲル濃度としては、ニス・ヘジャーテン（Ｓ。

Ｈｊｅｒｔｅｎ　）　：　　ｒアーク・バイオケム拳バ
イオフイズ（Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ、）　Ｊ　　１　（補遺）。

１４７　（１９８２）に記載の定義に従って表示して、
単量体、架橋剤および水からなるゲル媒体の容積に対し
て、単量体と架橋剤の量が約３　ｗ　／　ｖ％から約３
０ｗ／ｖ％の範囲で好ましく用いられる。

本発明の電気泳動用媒体材料は、主として蛋白質または
複合蛋白質（たとえば、リボプロティン、糖プロティン
など）の分析に有利に用いられるものであり、電気泳動
用媒体層には、変性剤として陰イオン性界面活性剤を含
有させることができる０分析試料が蛋白−質または複合
蛋白質（例えばリポ蛋白質、糖蛋白質など）の場合には
陰イオン界面活性剤を含ませることは好ましいか、また
は必須であることが多い、陰イオン界面活性剤をゲル媒
体層に含有させないことがあることは勿論である。たと
えば陰イオン界面活性剤を含有しないゲル媒体層は、Ｄ
ＮＡフラグメント分析に基づく遺伝病診断あるいは制限
酵素分解を利用したＤＮＡ構造解析などの目的に用いる
ことができる。

陰イオン界面活性剤を電気泳動用媒体層に含有させるこ
とにより、蛋白質または複合蛋白質の効率的な分離およ
びそれらの分子量測定が可能となる。

陰イオン性界面活性剤の例としてはアルキル硫酸塩が挙
げることができ、特に炭素原子数１０以上の長鎖アルキ
ル基を有するアルキル硫酸塩が好ましく用いられる。塩
を形成する陽イオンとしては、ナトリウムイオン、カリ
ウムイオン、リチウムイオン等のアルカリ金属イオンが
一般的であり、これらのうちではナトリウムイオンが用
いやリ、これらのうちではナトリウムイオンが用いやす
い、アルキル硫酸塩のうちではドデシル硫酸塩（ナトリ
ウム塩、カリウム塩、リチウム塩等）が好ましく、なか
でもドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が最も好ましい
、ＳＤＳを本発明のゲル媒体層に含有させることにより
蛋白質または複合蛋白質の効率的な分離およびそれらの
分子量測定が可能となる。

変性剤としての陰イオン界面活性剤の含有量はゲル形成
液に対して約０．０５ｗ／ｖ％から約２、Ｏｗ／ｖ％、
好ましくは約０．１ｗ／ｖ％から約１．５ｗ／ｖ％の範
囲である。

ポリアクリルアミドゲル膜には、必要に応じて抗酸化剤
を含有させることができる。抗酸化剤としては、ポリア
クリルアミドゲル膜に配合しうることが知られている種
々の化合物を用いることができる。抗酸化剤の具体例と
しては、ジチオスレイトール、２−メルカプトエタノー
ルを挙げることができる。

ポリアクリルアミドゲル膜には場合によって水溶性ポリ
マーが添加される。水溶性ポリマーとしては、付加重合
型または縮重合型の水溶性ポリマーを用いることができ
る。付加重合型ポリマーの具体例としては、ポリビニル
アルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミ
ド等の非イオン性水溶性ポリマーが挙げられる。また縮
重合型ポリマーの具体例としては、ポリエチレングリコ
ール、ポリプロピレングリコール等の非イオン性水溶性
ポリアルキレングリコールが挙げられる。

これらの水溶性ポリマーのうちでは、ポリアクリルアミ
ドとポリエチレングリコールが好ましい。

水溶性ポリマーの分子量は約１万から約１００万の範囲
のものが好ましい、水溶性ポリマーは単量体と架橋剤の
合計重量に対して、約２重量％から約１００重量％の範
囲、そして好ましくは約５重量％から約５０重量％の範
囲で用いられる。

水溶性ポリマーの添加によりポリアクリルアミドゲル膜
が可塑性を有するようになり、裁断加工時に壊れること
がなくなり、またゲル膜は乾燥時にも可塑性を有するよ
うになり、もろさが改良され壊れにくくなるとの利点が
ある。また、水溶性ポリマーの分子量および添加量を選
択することにより、ゲル膜の粘度をコントロールするこ
ともできる。ポリアクリルアミドゲル膜は、さらにアガ
ロースを含有することが好ましい、アガロースとしては
任意のものを使用することができ、低電気浸透性、中電
気浸透性、高電気浸透性アガロースのいずれをも用いる
ことができる。用いることができるアガロースの例とし
ては、特開昭５５−５７３０号、特開昭５５−１１０９
４６号、特開昭５７−５０２０９８号等の各公報に開示
の７ガロース等がある。アガロースは、Ｑｉ量体と架橋
剤を含む水性ゲルの容積に対して約０．２ｗ／ｖ％から
約２　ｗ　／　ｖ％、好ましくは約０．３ｗ／ｖ％から
約１．２ｗ／ｖ％の割合で用いられる。

ポリアクリルアミドゲル膜が７ガロースを含有する場合
には、ゲル形成用溶液の温度を変化させることにより適
当な液粘度にコントロールすることが可能となるため、
その流動性を止めることができ、またゲル膜を成形する
操作において成形しやすくなるとの利点がある。

ゲル媒体層にはｐＨ緩衝剤を含有させることもできる。

緩衝剤としては、電気泳動分析される試料に応じて、Ｐ
Ｈ２，５から１０．Ｏの範囲内のｐＨ値に緩衝できる公
知の緩衝剤から適宜選択して用いることができる。

用いうる緩衝剤としては、 日本化学合線「化学便覧　基礎編」（東京、丸首■１９
６６年発行）　１３１２−１３２０ページ；青水、水弁
編「最新電気泳動法」　（東京、床用書店、１８７３年
発行３２０−３２：２ページ；「データーフォア・バイ
オケミカル・リサーチ（Ｄａｔａ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　Ｊ　（アール・エ
ム会シー・ドーソン（Ｒ，Ｍ、　Ｃ，Ｄａｔｓｏｎ　）
外線、第２版、０ｘｆｏｒｄ　ａｔ　ｔｈｅ　Ｃ１ａｒ
ｅｎｄｏｎ　Ｐｒｅｓｓ。

１９６９年発行）　　４７Ｂ−５０８ページ；「バイオ
ケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅ＋５ｉＳｔｒ７　）　Ｊ５
、４Ｂ？　（１９８Ｂ）；および 「アナリティ力ル・バイオケミストリーＡｎａｌｙｔｉ
ｃａｌ　　ＢｉｏｃｈｅｍｉＳｔｒ７Ｊ　１０４．　３
００−３１０（１９Ｂ０）等に記載の緩衝剤が挙げられ
る。

Ｍ衝剤の例としては、バルビタールを含むＭｍ剤、トリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）を含
む緩衝剤、燐酸塩を含む緩衝剤、ホウ酸塩を含む緩衝剤
、酢酸または酢酸塩を含む緩衝剤、クエン酸またはクエ
ン酸塩を含む緩衝剤、乳酸または乳酸塩を含む緩衝剤、
グリシンを含む緩衝剤、Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシ
エチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−２−ヒドロキ
シエチルピペラジン−Ｎ’−２−ヒドロキシプロパン−
３−スルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）またはその塩、Ｎ−２
−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ　’−３−プロパン
スルホン＃（ＥＰＰＳ）またはその塩、Ｎ−［トリス（
ヒドロキシメチル）］−］３−アミノプロパンスルホン
酸ＴＡＰＳ）またはその塩等をおよび、これらのいずれ
かと必要により組合せられる酸、アルカリ、または塩等
を挙げることができる。好ましい緩衝剤の具体例として
は、燐酸二水素カリウム−燐酸水素二ナトリウム、Ｔｒ
ｉｓ・ホウ酸ナトリウム、ＴｒｉＳ０ホウ酸ナトリウム
・ＥＤＴＡ２Ｎａ塩、Ｔｒｉｓ・り：ン酸、パルビター
ルナトリウム−酢酸ナトリウム・／くルビタールナトリ
ウム−塩酸、バルビタール・パルビタールナトリウム、
酢酸０酢酸ナトリウム、乳酸串乳酸ナトリウム、クエン
酸−燐酸水素二ナトリウム、ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、
ＨＥＰＰＳＯ，ＨＥＰＰＳＯナトリウム塩、ＥＰＰＳ、
ＥＰＰＳナトリウム塩、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳナトリウム
塩等を挙げることができる。

本発明の電気泳動用媒体材料における電気泳動用媒体層
（ポリアクリルアミドゲル膜）は、上記のようにアクリ
ルアミドに代表される単量体、二官能性のアリル（ａｌ
ｌｙｌ　）化合物またはアクリル化合物（架橋剤）、水
溶性ポリマー、およびアガロースを、実質的に均一な水
溶液中で単量体と架橋剤とをラジカル架橋重合させて得
られるものであり、単量体と架橋剤から形成された三次
元架橋重合体に水溶性ポリマーとアガロースが実質的に
分散されて、後二者のポリマー鎖が三次元架橋重合体と
からみあっている構造を有すると推定される。

上記のラジカル架橋重合反応は分子状酸素の不存在下で
過酸化物の存在および／または紫外線照射等公知の方法
により発生させることができる。

さらに、この架橋重合反応は加熱または紫外線照射によ
り加速することもできる。

ラジカル架橋重合用触媒としては、「エレクトロ７、レ
シス（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）　Ｊ　１９８
１．２゜２１３−２１９．同１９８１．２．２２０−２
２８　；青水、水弁編「最新電気泳動法Ｊ　　（１９７
３年発行）等に記載の公知の低温ラジカル重合開始剤の
うちから適宜選択して用いることができる。好ましいラ
ジカル重合開始剤の具体例としては、β−ジメチルアミ
ノプロピオニトリル（ＤＭＡＰＮ）　　−ペルオクソニ
硫酸アンモニウム混合物、Ｎ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’−テト
ラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）　・ペルオク
ソニ硫酸アンモニウム混合物、ＴＥＭＥＤ・リボフラビ
ン混合物、ＴＥＭＥＤ−リボフラビン・過酸化水素混合
物と紫外線照射の組合せ等が挙げられる。ラジカル重合
開始剤の含有量は、単量体と架橋剤の合計重量に対して
約０．３重量％から約５重量％、そして好ましくは約０
．５重量％から約３重量％の範囲である。

ゲル媒体層は、平滑表面を有する支持体の上に設けられ
た前述のメチルメタクリレートマクロモノマー誘導体を
含む層の上にゲル形成液を公知の方法により塗布して設
けたのち、ゲル形成液を架橋重合させることにより、層
状に成形することができる。

ゲル形成液を支持体の表面で架橋重合させる場合には、
ゲル形成液の上を更にカバーフィルム、シートまたは板
などの被覆材料でおおうことができる。この目的に使用
されるカバーフィルム、シート、または板としては前記
支持体と同様な素材からなるものを用いることができる
。この被覆材料の厚さは３００ルｍ以下であり、実用的
に好ましい範囲としては約４ｐｍ〜約２００　ｇｍ、特
に好ましい範囲としては約４．ｇｍ〜約Ｚｏｏ、ｇｍで
ある。

なお、ポリアクリルアミドゲル膜には、湿潤剤としてグ
リセリン、エチレングリコール等のポリオール化合物を
含有させることもできる。ポリオール化合物の含有量は
、ゲル膜の容積に対して約５　ｗ　／　ｖ％から約４０
ｗ／ｖ％の範囲から選ばれる。これらのうちではグリセ
リンが特に好ましい、湿潤剤を配合することによりゲル
膜の保存時の極端な水分の蒸発による乾燥を防ぐことが
可能となり、また極端な乾燥に起因するもろさの発生を
防ぎ、ひびわれを防ぐ等のゲル膜の物性が改善されると
の利点がある。

本発明の電気泳動用媒体材料における電気泳動用媒体層
（ポリアクリルアミドゲル膜）は支持体との接着性が高
い（接着力が大きい）ため、通常の工程においては電気
泳動用媒体層と支持体とは常に一体として処理すること
ができる。従って、本発明の電気泳動用媒体材料を用い
ることによって、特に蛋白質または複合蛋白質の電気泳
動操作において従来必要とされていた複雑な操作工程の
省略が可能になり、また支持体とに電気泳動用媒体層（
ポリアクリルアミドゲル＠）をのせたままで、電気泳動
操作および染色操作を実施することが可ｆ七となる。

次に本発明の実施例を示す。

［実施例１］ 紫外線照射処理により表面を親水性にしたポリエチレン
テレフタレート（ＰＥＴ）シート（支持体）丘に約０．
５７ｚｍの厚み（固形分）になるように、前記の合成例
で得たメタクリレートマクロモノマーのアミド基グラフ
ト化誘導体をアセトンに溶解して得た塗布液（第２表）
を塗布し、約１１０℃で乾燥してマクロモノマーのアミ
ド基グラフト化誘導体層（接着層）を形成した。

以下余白 第２表　接着層形成用塗布液の組成 試料　　　マクロモノマー　　　　塗布液濃度番号　　
誘導体　　　　　　　（ｇ／１００ｍ１溶剤）ｌ　　合
成例１生成物　　　　　　５ｇ２　　　Ｆ−１（合成例
２生成物）５ｇ３　　　Ｆ−２（合成例２生成物）５ｇ
４　　　Ｆ−３（合成例２生成物）５ｇまず、ＰＥＴシ
ート（支持体）と接着層との間の接着性をクロスカット
法により評価した。その結果、試料１〜４すべてにおい
て接着層が支持体に一様に強固に接着しており、特に本
発明の試料２〜４では接着層が特に強く支持体に接着し
ていた。

支持体上に設けられた各接着層の上に、アクリルアミド
９．５ｇ、ＢＩＳｏ、５ｇ、！、１７ｍ水１ｇ二ナトリ
ウム・−工水塩３．５８ｇ、リン、酸二水素ナトリウム
・工水塩０．３３ｇ、および５Ｏ５０、ｌＯｇを含有す
る１００ｍ文の溶液に重合開始剤としてベルオクソニ硫
酸アンモニウム（５重量％）１．３ｍＪＬ、ＴＥＭＥＤ
３３ＩＬｉを加えたものを０．５ｍｍの厚みで成形し、
ポリアクリルアミドゲル膜を形成させた。

なお、別にマクロモノマーのアミド基グラフト化誘導体
層を設けなかった以外は同様にしてＰＥＴシートＬにポ
リアクリルアミドゲル膜を形成させて比較試料を調製し
た。

得られたゲル膜を指でおさえ、ゲル膜と支持体間の接着
性を評価した。その結果、比較用試料ｌおよび本発明の
試料２〜４は接着層としての接着性が優れていたが、比
較用試料は本発明の試料２〜４と比べて接着性が劣って
いた。

［実施例？］ 実施例１の第２表と同じ接着層が形成されたＰＥＴシー
トを作成し、この接着層の上にアクリルアミド９．５ｇ
、ＢＩ３０．５ｇ、アガロース１６００　（和光純薬味
製）０．３ｇ、ポリアクリルアミド２．５ｇ、リン酸二
素ナトリウム・十二本塩１．５８ｇ、リン酸二水素ナト
リウム・二本Ｊｆｉ０．３３ｇ、オヨｒＪ　Ｓ　Ｄ　Ｓ
　Ｏ、１０ｇかう＠る１００ｍＭの溶液に重合開始剤と
してベルオクンニ硫酸アンモニウム（５重量％）１．３
ｍ立、ＴＥＭＥＤ３３．１を加えたものを０．５ｍｍｃ
７）厚みで成形し、ポリアクリルアミドゲル膜を形成さ
せて四種類の試料（試料１〜４）を得た。

このゲル膜を使用して、標準蛋白質を電気泳動にかけた
０次いで、ゲル膜を、０．１％コーマシーブル−（Ｃｏ
ｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｌｕｅ）　Ｒ−２５０（Ｇｏｌｏｒ
Ｉｎｄｅｘ　Ｃｏｎ５ｔｉｔｕｔｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒ
　４２８８０）に浸漬し、染色を行ない、この染色工程
における支持体とゲル膜との接着状態を観察した。

比較用試料ｌおよび本発明の試料２〜４においては、ゲ
ル膜はいずれも染色工程において終始支持体上に完全に
接着していた。さらにゲル膜を１時間激しく振盪させた
後、接着状態を観察したところ、比較用試料１は少しは
がれた部分が見られたが１本発明の試料２〜４は完全に
接着していた。電気泳動特性については、いずれについ
ても問題はなかった。

［実施例３］ 実施例１の第２表と同じ接着層が形成されたＰＥＴシー
ト上に実施例２と同様にしてポリアクリルアミドゲル膜
を形成させて本発明の三種類の試料（試料２〜４）を調
製した。また、実施例２と同様にして比較用試料ｌも調
製した。

このゲル膜を支持体ごと裁断加工したのち、ゲル膜の切
口を観察したところ、比較用試料ｌについてはゲル膜の
剥離が一部観察されたのに対して、本発明の試料２〜４
についてはいずれも裁断口の接着性は良好で、支持体ご
と裁断加工できることがわかった。

［実施例４］ 実施例１に記載した方法と同様な方法によりＰＥＴ支持
体の上に三種類のマクロモノマーのアミド基グラフト化
誘導体層をそれぞれ形成させ、該マクロモノマーのアミ
ド基グラフト化誘導体層の上にアクリルアミド４．５６
ｇ、ＢＩＳｏ、２４ｇ、ポリアクリルアミド１．２ｇ、
アガロース０．３ｇ、トリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン［ＣＡＳ　　Ｒｅｇｉｓｔｒｙ　　Ｎｏ？？−
８８−１］　１　、０８ｇ、ホウ酸０．５５ｇおよびＥ
ＤＴＡ−２Ｎａ塩９３ｍｇ、グリセリン２０ｇを含有す
る１００ｍ文溶液に重合開始剤としてベルオクソニ硫酸
アンモニウム（５ｗｔ％）１．３ｍＭ、ＴＥＭＥＤ３３
沖文を加えたものを１ｍｍの厚み、で塗布し、窒素ガス
下で重合させポリアクリルアミドゲル膜を形成させた。

大腸菌のプラスミドｐＢＲ−３２２を制限酵素ＡｓｕＩ
で処理し、上述のゲル膜にて電気泳動操作を行ない、エ
チジウム染色によりＤＮＡの分解パターンを調べたとこ
ろ正常な染色パターンを示した。

ゲル膜をカッターナイフを用いて裁断し、サンプル注入
口を形成させた。切口は鋭くカットできた。更に分離さ
れたＤＮＡバンドを高い精度で分取することが出来るこ
ともわかった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の各層が順次積層されてなる三層構造を含む電
   気泳動用媒体材料： ［ I ］プラスチック支持体層； ［II］メチルメタクリレートマクロモノマーのアミド基
   含有グラフト化誘導体から形成 された接着層；および、 ［III］アクリルアミド系化合物と架橋剤が水の存在下
   で架橋重合してなるポリアクリル アミド系水性ゲル電気泳動用媒体層。 ２、上記媒体層がさらに水溶性ポリマーおよびアガロー
   スを含むことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
   電気泳動用媒体材料。 ３、上記媒体層がさらに陰イオン界面活性剤からなる変
   性剤を含むことを特徴とする特許請求の範囲第１項また
   は第２項記載の電気泳動用媒体材料。 ４、上記陰イオン界面活性剤がアルキル硫酸塩であるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第３項記載の電気泳動用
   媒体材料。 ５、上記陰イオン界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム
   であることを特徴とする特許請求の範囲第３項記載の電
   気泳動用媒体材料。 ６、上記プラスチック支持体層がポリエチレンテレフタ
   レートからなることを特徴とする特許請求の範囲第１項
   記載の電気泳動用媒体材料。 ７、メチルメタクリレートマクロモノマーのアミド基含
   有グラフト化誘導体から形成された接着層が、実質的に
   メチルメタクリレートマクロモノマーのアミド基含有グ
   ラフト化誘導体のみから形成された層であることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項記載の電気泳動用媒体材料
   。 ８、プラスチック支持体の上にメチルメタクリレートマ
   クロモノマーのアミド基含有グラフト化誘導体を含む中
   間層を設けたのち、該中間層の上にてアクリルアミド系
   化合物と架橋剤とを水の存在下で架橋重合してポリアク
   リルアミド系水性ゲル電気泳動用媒体層を形成すること
   を特徴とする電気泳動用媒体材料の製造法。 ９、上記媒体層がさらに水溶性ポリマーおよびアガロー
   スを含むことを特徴とする特許請求の範囲第８項記載の
   電気泳動用媒体材料の製造法。 １０、上記媒体層がさらに陰イオン界面活性剤からなる
   変性剤を含むことを特徴とする特許請求の範囲第８項ま
   たは第９項記載の電気泳動用媒体材料の製造法。