JPH02227074A - 新規なエキソ型加水分解酵素並びにイヌロトリオース及び／又はイヌロテトラオースの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、フルクタンをそのフルクトース末端側から３
〜４Ａ個の糖単位ごとに特異的に加水分解するという、
従来全く知られていなかった新規なエキソ型加水分解酵
素〔エキソ−イヌロートリオアンドテトラオーヒドロリ
アーゼ（仮称）〕並びに該酵素を用いてイヌロトリオー
ス及び／又はイヌロテトラオースを製造する方法に関す
るものである。

（従来技術及び発明が解決しようとする問題点）フルク
トースが３〜参個結合したイヌロトリオース及びイヌロ
テトラオースは、高機能（ビフィズス因子、抗う触性、
低カロリー等）を有するイヌロオリゴ糖であり、食品、
或いは医薬品分野に有用である。

従来、フルクタンからイヌロトリオースおよびイヌロテ
トラオースを製造する方法として、フルクタン、例えば
イヌリンを酸で加水分解する方法が知られている。

しかし、この方法によると生成物の大部分がフルクトー
ス（Ｆｌ）であシ、イヌロオリゴ糖、もとよシイヌロト
リオース及びイヌロテトラオースの生成収率が極めて悪
く、シかも、着色物質が生成したシ、ジフルクトースア
ンハイドライドの様な副生物が生じてイヌロトリオース
及びイヌロテトラオースの精製を困難にしていた。

一方、酵素を利用してフルクタンを分解し、イヌロトリ
オース及びイヌロテトラオースを製造する方法が提案さ
れている。しかし、従来知られている酵素は、フルクタ
ンをランダムに加水分解するエンド型イヌリナーゼが知
られているのみであり、従って、例えばイヌリンに作用
させた場合、イヌロトリオース、イヌロテトラオースの
他、イヌ口ビオース（Ｆりイヌロテトラオース（Ｆ、）
ヤイヌロヘキサオース（Ｆ６）など種々のフルクトース
が結合したイヌロオリゴ糖が生成し、　しかも、副生フ
ル、クトースを生じるなど生成収率は低く、目的とする
イヌロトリオース及びイヌロテトラオースの製造には不
適当であった。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、フルクタンからイヌロチトオース及ヒ／
又はイヌロテトラオースを製造する方法について鋭意検
討した結果、フルクタンを３〜弘個のフルクトースが結
合した糖単位に特異的に加水分解する性質を有する、従
来全く知られていなかった新規なエキソ型加水分解酵素
〔エキンーイヌロートリオアンドテトラオーヒドロリア
ーゼ（仮称）〕を初めて見い出し、本発明を完成するに
至った。

即ち、本発明の要旨は、フルクタンに作用し、そのフル
クトース末端側から３〜μ個の糖単位ごとに加水分解し
て、イヌロトリオース及び／又はイヌロテトラオースを
生成させる性質を有することを特徴とする新規なエキソ
型加水分解酵素並びにフルクタンを、フルクタンのフル
クトース末端側から３〜４！個の糖単位ごとに加水分解
してイヌロトリオース及び／又はイヌロテトラオースを
生成させる性質を有する新規なエキソ型加水分解酵素と
反応させて、イヌ口）　ＩＪオース及び／又はイヌロテ
トラオースを生成させ、該イヌロトリオース及び／又は
イヌロテトラオースを取得することを特徴とするイヌロ
トリオース及び／又はイヌロテトラオースの製造方法に
存する。

以下本発明につき、詳細に説明する。

イヌロオリゴ糖を生成する酵素（イヌリナーゼ）として
従来知られている酵素は、イヌリン等をランダムに加水
分解して種々の数のフルクトースが結合したイ、ヌロオ
リゴ糖を生成させるエンド型のもの、及びエキソ型とし
て１個の糖単位ごとに加水分解してフルクトースのみを
生成させるもの及びジフルクトース７ノへンドライドを
生成させるもののみであり、本発明の上記性質を有する
酵素は従来知られていなかった全く新しいタイプのエキ
ソ・型加水分解酵素である。

本発明、の酵素は、例えばストレプトマイセス属に属す
る微生物から得られる。

本発明において使用する微生物は、上記した性質を有す
るエキソ型加水分解酵素を生産する能力を有する゛もの
であればよく、ストレプトマイセス属およびその変種、
変異種等に限定されるものではない。

かかるストレプトマイセス属に属する微生物の具体例と
しては、例えばストレプトマイセスｓｐ、ＭＣＩ　Ｊ≠
２３号菌が挙げられる。かかる菌株［微工研菌ＩＦ第ｆ
ｏ５１＞３号（Ｆ　Ｅ　ＲＭ　　Ｐ−７θ、ｆｌＢ　）
として寄託されている。

ストレプトマイセスｓｐ、Ｍｃ１．２！２３（以下、「
放線菌ＭＣＩ、？≠２３号菌または本菌株という）」の
形態学的特徴、各種培地上における性状及び生理学的・
生化学的性、質は以下の通シである。

ｌ）形態学的特徴 胞子形成培地として、ペネット寒天培養及ヒクルコース
・アスパラギン寒天培養を用い、２７℃で１週間培養し
た。

ペネット寒天培地上では、コロニーははじめ黄味白色を
呈し、気菌糸の形成に伴って明るいオリーブ灰色となる
。気菌糸上に分節型の比較的短かい胞子連鎖部を形成す
る。胞子連鎖部は２〜ダ本位放射状に生じて直立し、ラ
セン状に巻くことはない。胞子表面は平滑。

胞子は短円筒形で、その大きさはｉ−、ａｔ、ｉμｍ×
へ２〜八へμｍである。

グルコース曹アスパラギン寒天培地上では、コロニーは
黄味白色を呈す。気菌糸及び胞子形成は貧弱。基生菌糸
の発達は良好で、培養３〜ｌ／−日間以降、基生菌糸の
所々で分節して長い胞子連鎖部を形成する。

２）各種液体培地中での特徴（１７℃で１週間振とう培
養） ３）各種寒天培地上における培養性状 ２７℃、ｌ参日間培養後の各種寒天培地上における性状
は以下に示す通りである。

なお、上記の表中、項目の項における記号の意味は、以
下の通シである。

Ｇ；生育、　ＡＭ；気菌糸、　Ｓｏ；胞子形成、ＳＰ：
可溶性色素 ４／−）生理学的性状 メラニン様色素の生成 （ペプトン、酵母エキス、 鉄寒天培地）、　　　。

デンプンの加水分解　： ゼラチンの液化　　　　０ 脱脂乳の凝固 陰性 陽性 陽性 陰性 脱脂乳のペブトシ化　：　陽性 炭素源の資化性 Ｄ−グルコース　　　　　＋ し−アラビノース　　　　士 Ｄ−キシロース　　　　　＋ イノシトール Ｄ−マンニトール Ｄ−７ラクトース　　　　士 し−ラムノース　　　　　＋ シェフロース　　　　　　士 ラフィノース ＋：資可能有、　±：疑わしい、 一：資化能無 り生化学的性状 細胞壁のアミノ酸組成： Ｌ　Ｌ　−Ａｔ　ｐｔｎ　ｓ　　グリシン（細胞壁タイ
プ■型）主要メナキノン　　：　ＭＫり（Ｈ６）、ＭＫ
り（Ｈ８） ＤＮＡのＧＣ含量　ニアｏ、／％ 菌体脂肪酸　　　　二　分枝型脂肪酸を含有乙）分類学
的考察 属レベルの同定 イヌロオリゴ糖を産生ずる当該放線菌ＭＣＩＪ４ｃＪｊ
号菌は以下に示す特徴を持っニーＩＧ）直立した胞子連
鎖部を持つ、コロニーはづ明るいオリーブ灰色 コ）気菌糸の形成は貧弱で、気菌糸の大半が胞子に発達
する ３）培地中の基生菌糸が分節して胞子を形成する り　液体培養中で菌糸の分断が見られるり細胞壁組成：
Ｌ山−ジアミノピメリン酸、グリシン含有（細胞壁タイ
プＩ型） ６）主要メナキノン：ＭＫＰ（Ｈ＠）、ＭＫり（Ｈ８）
７）分校型脂肪酸を含有する。

これらの形態学的性状及び生化学的性状よシ、本菌株は
ストレプトマイセス（Ｓｔ　ｒｅｐ　ｔｏｍｙｃｅｓ　
）属に帰属する。基生菌糸中が分節する放線菌として“
エリトロスポランギウム（Ｅｌｙｔｒｏｓｐｏｒａｎｇ
ｉｕｎ）属“　ミクａ　ｘ　ｏボスボリア（Ｍｉｃｒｏ
ｅｌｌｏｂｏｓｐｏｒｉａ）属”カイニア（Ｃｈａｉｎ
ｉａ　）属“　　アクチノ菌が知られていたが、グツド
フェロ−（Ｇｏｏｄ−ｆｅｌｌｏｗ）等（Ｓｙｓｔｅｍ
、Ａｐｐｌ　、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　、　ｌｒ　：　ｕ
弘−Ａｔ、１９１６）はこれらの温域がＳｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ属と共通した生化学的性状を有することを重
視して、温域をＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属の異物同名
（シノニム）として扱っている。

種レベルの同定 本菌株ＭＣＩ２１１２Ｊ号菌はｌ）直立した胞子連鎖部
を形成する、コ）コロニーは明るいオリーブ灰色を呈す
ることからＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属のＩＳＰ菌種検
索表（野々村英夫、醗酵工学雑誌１２巻２号７を一タコ
、１２７参年）によって検索したところ、Ｒｅｃ　ｔｕ
ｓ−ｗｈｉ　ｔｅ節に属することが示唆された。

周辺菌として、ストレプトマイセス　カンジトレプトマ
イセス　セトニ−（Ｓ、　５ｅｔｏｎｉｉ　）　。

ストレプトマイセス　シンデネンシス　（Ｓ。

げられる。本成とＩＳＰ記載の各種の性状を対比したと
ころ、これらのＩＳＰ記載種には基生菌糸の分断に関す
る知見は記載されておらず、本菌株とは区別された。

さらにｔ従来”　Ｅｌｙｔｒｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ　
”　、”Ｍｉｃｒｏｅ−１１ｏｂｏｓｐｏｒｉａ　　Ａ
ｃｔｉｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ　ＩＩ及び”　Ａｃｔ
ｉｎｏｐｙｃｎｉｄｉｕｍ″′属に含まれていた各属菌
種の原記載と本菌株の形態学上の性状、生理学的性質を
対比したところ、本菌株はこれらの各菌種から明瞭に区
別された。従って、本菌株をストレプトマイセス　エス
ピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ　、　）ＭＣＩコ
４！２３号菌と同定した。

本発明の新規エキソ型加水分解酵素を生産するためめ放
線菌ＭＣＩＪ≠２３号菌の培養は、通常の、微生物が利
用し得る栄養物を含有する培地で行うことができる。

具体的には、β−コーｌ′フラクトシド結合を含む７ラ
クトオリゴ糖、イヌロオリゴ糖、イヌリン等のフルクタ
ンを基質とし、その細菌の生育に必要な成分、例えば窒
素源として、大豆粉、小麦はい芽、コーンステイープ　
リカー　綿実粕、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、硫
酸アンモニウム、硝酸ソーダ、尿素等を使用し、必要に
応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マクネシウ
ム、コバルト、塩素、硫酸及ヒソノ他のイオンを生成す
ることのできる無機塩類、ビタミン類等を含む培地で培
養する。その際、培地に加えるフルクタンの量は、たと
えばイヌリンの場合、０１５〜２０％の範囲が有効であ
る。

さらに、培養温度は２０〜３７℃が、また培養時間は２
弘〜２６時間が適当である。

培養終了後、培養液上清から本発明の新規なエキソ型加
水分解酵素を精製する方法は、各種公知の精製方法を適
宜組合せることにより行うことができるが、その１例を
示すと次の通シである。

培養液からろ過遠心分離等の適当な手段によシ除菌を杓
い上清液を得、蒸留水に対して透析を行う。得られた透
析液に参〇％飽和になるよう硫酸アンモニウムを加え、
ａＯ％飽和の硫酸アンモニウム含有リン酸緩衝液（０，
０２Ｍ１ｐＨ７，０）　　で平衡化したトヨパールＨＷ
４ｔＦ（東ソー社製）に吸着し、カラムクロマトグラフ
ィーを行う。こめ時ｇｏ−ｏ％飽和の硫酸アンモ三つム
水溶液の直線的濃度勾配により溶出を行う。次にイヌリ
ナーゼ活性のある画分を集め、２０ｒｒＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）で透析を行う。得られる粗酵素液をＤＥ
Ａ’Ｅ−）ヨパールカラム（東ソー社製）に通すと非吸
着画分にイヌリナーゼ活性が認められ、さらにその酵素
液ヲトヨパールＨＷｌｊＦ（東ソー社製）を用いて分子
ふるいによシ分離し、次に／　ＯｍＭ　トリス−塩酸緩
衝液（ｐＨｒ、７）　　で平衡化したＱＡＥ−トヨパー
ル（東ソー社製）に吸着させる。Ｏ−０，１Ｍ食塩水の
直線的濃度勾配によシ溶出、を行い活性画分を集め透析
することにょシ新規エキソ型加水分解酵素の精製品を得
ることができる。

例えば、後述の実施例１のようにして得られる精製され
た本発明の酵素は、以下の様な性質を有する。

ビ）　フルクタンのフルクトース末端側からそのフルク
トースを３〜４ｃ単位ごとに加水分解してイヌロトリオ
ース及び／又はイヌロテトラオースを生成させる。

本酵素はｌ−ケスドース系のオリゴ糖ではペンタオース
以上の糖に作用し、ペンタオースからはシェークロース
とイヌロトリオースを生成し、ヘプタオース以上からは
イヌロトリオース、イヌロテトラオースＯ両方を生成す
る。

イヌロトリオース（Ｆｌ）とイヌロテトラオース（Ｆ４
）の生成比はイヌリンの鎖長によって決ｔシ、鎖長が長
い時はＦａ　＞　　Ｆｓ　、短い時はＦ。

〉Ｆ４　となる。

（ロ）至適ｐＨがｔ〜７で、ｐＨＬｊ〜りで安定である
。

（ハ）　ｐＨＪ〜７における至適温度が約１０℃付近で
、４ｔＯ−ぶ０℃で良好な活性°を示す。

に）　ｐＨ４〜７、３０分間の熱処理条件、下：Ｃ！Ｑ
′℃まで安定である。

ｐＨ１ｊで各種温度に３０分間静置した後、５０℃で反
応を行い、残存活性を測定したところ、１０℃までは活
性の低下がほぼみられず、それ以上の温度では急激に失
活した。

（ホ）　５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
る分子量が約７♂０，００である。

本発明の酵素を使用してイヌロトリオース及び／又はイ
ヌロテトラオースを製造する方法は、フルクトースを弘
個以上を含むフルクタン、特にイヌリンを基質に用い、
酵素を作用させることによシ、イヌロトリオース及び／
又はイヌロテトラオースを製造することかできる。作用
させる酵素としては培養上清から精製した精製酵素を使
っても良いし、また上記基質を含んだ培地で菌体を培養
した時の培養上清を使っても良い。或いは、酵素若しく
は菌体を公知の方法で固定化担体に吸着、結合、包括さ
せたものを使っても良い。

例えば精製酵素を作用させる時は、イヌリンｏ、ｉ　Ｎ
１ｏｑ６含有０．／　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，ｔ）に
酵素ｏ、ｏｔ−ｉｏ単位で、２０〜！Ｏ℃、！分〜１０
０時間の条件で作用させると、反応の初期段階からイヌ
ロトリオース及び／又はイヌロテトラオースが特異的に
生成する。

また上記基質含有培地で菌体を培養すると、培養液中に
イヌロトリオース及び／又はイヌロテトラオースが生成
する。この培養物を除菌し、得られた培養上清を、活性
炭処理、脱塩処理することにより、不純物塩等をとり除
く。次に得られたもので活性炭カラムクロマトグラフィ
ーを行う。エタノール０−１０％の濃度勾配溶出を行う
と、ｊ−ｉｏ％のフラクション部分にイヌロトリオース
及び／又はイヌロテトラオースが溶出され、エタノール
を除くことによシ培養上清中のイヌロトリオース及び／
又はイヌロテトラオースを精製することができる。

（発明の効果） 本発明の酵素は、フルクタンをそのフルクトース末端側
から３〜≠個のフルクトースが結合した糖単位ごとに特
異的に加水分解する新規なエキン型加水分解酵素であっ
て、イヌロトリオース及び／又はイヌロチドラオースを
有利に製造することができる。

（実施例） 次に本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明は
、その要旨を越えない限り、以下に限定されるものでは
ない。

実施例１ ストレプトマイセスｓｐ、ＭＣＩ−２≠Ｊ　Ｊ　号Ｍ株
を、イヌリン八ｊ％、硝酸ナトリウム０．２％、硫酸マ
グネシウム０．０ｊ％、塩化カリウム０．０２係、リン
酸ｌカリウムｏ、ｏｚ％、ｆｌｐ母エキス０．０２％及
び微量の塩化鉄を含む液体培地に接種し、ＪＯ”Ｃで２
日間培養した後、その一部をとり、同じ組成の液体培地
（１００ｙｄ培地／１００ｍ１三角フラスコ）に移し、
３０℃で３日間通気振とり培養を行った。

次に、粗酵素液を蒸留水に対して透析後、４！Ｏ係飽和
になるように硫酸アンモニウムを加えて分画した。次い
で、・≠Ｑ％飽和硫安含有２０ｍＭリン酸緩衝液・（ｐ
Ｈ７−０）で平衡化した　トヨパールＨＷ４　ｊＦカラ
ムクロマト（φｊ　４　Ｘ　−３−０ｃｒｒ１）に吸着
し、４ｃＯ〜０％飽和硫安の濃度勾配をかけて溶出した
。

活性画分を２０　ｍＭリン酸緩衝液、（ｐＨ７，０）に
対して透析した後、ＤＥＡＥ−）ヨバールカラムクロマ
ト（φｊ　ｃｍ　Ｘ　／　ｊ　ｃｍ　）にかけ、非吸着
部分を次のトヨパールＨＷＩｊＦカラムクロマト（φＪ
、／Ｘ７０ｃＩｎ）を用いて分子節によシ分離精製した
。

更に、活性画分を／　ＯｍＭ　）　’）スー塩酸緩衝液
（ｐＨｒ、７）で平衡化したＱＡＥトヨパールカラムク
ロマト（φＪ、／　ｃｍ　Ｘ　／　Ｏｃｍ　）に吸着さ
せ、Ｑ〜０．５Ｍ塩化ナトリウムの濃度勾配をかけて溶
出した。

各工程における精製結果を表１に示した。以上の操作に
より本発明酵素は単離・精製される。

表１ 粗酵素画分　ｌ弘１０　／３／ ３／、り Ｑ、λ≠　　１００ 尚、力価の測定は次の様にして行った。

即ち、０．ｘ係イヌリス水溶液Ｑ、コよｄ及びｐ）ｌｉ
ｔの０．２　Ｍ　＋７ン酸緩衡液０．／、１の混合基質
に、酵素液０．１ｊｔｔｌを加え、３７℃で１時間反応
させ、生成したイヌロトリオース及び／又はイヌロテト
ラオースをＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）で
定量した。１分間に／μｍｏｌのイヌロオリゴ糖を生成
する酵素量をｌ単位（ｕ）とした。

実施例２ 基質として０．１％（ｗ／　ｖ　）イヌリンを含む０．
０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ１ｊ）／肩ｌ中に、実施例１
で得られた精製加水分解酵素０．／　単位を含む溶液を
加え３０℃にて１０分間反応を行った。

反応液を加熱して酵素を失活後、反応液中のイヌロオリ
ゴ糖の生成率をＨＰＬＣを用いて求めると、イヌロトリ
オースが７０．／　％、イヌロテトラオースが一！、、
ｒ　％夫々生成しておシ、他のイヌロオリゴ糖の生成は
見られなかった。尚未反応のイヌリンはｔｊ、１％であ
った。

この様に、本発明の酵素を使用すれば、イヌロトリオー
ス及びイヌロテトラオースを特異的に生成させることが
できる。

実施例３ 実施例２と同様な方法で２ｊ時間反応を行い、実施例コ
と同様な方法で分゛析した結果、イヌロトリオース及び
イヌロテトラオースの生成収率（イヌロトリオース：イ
ヌロテトラオース＝グ：６）は計１ｒ／（１）であった
。

実施例弘 実施例１と同様な方法でストレプトマイセスｓｐ、Ｍｃ
　Ｉ　２４ＡＡｌ１菌を培養し、培養後除菌した酵素液
＋ｒＯ１！Ｌｌにイヌリン、２０？を添加し、≠を時間
３０℃で反応させた。

反応後、反応液を液体クロマトグラフィーにより分析し
たところ、反応液中にイヌロトリオース及びイヌロテト
ラオースの生成率（イヌロトリオース：イヌロテトラオ
ース＝４ｃ：６）は計７３係であった。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）フルクタンに作用し、そのフルクトース末端側か
   ら３〜４個の糖単位ごとに加水分解してイヌロトリオー
   ス及び／又はイヌロテトラオースを生成させる性質を有
   することを特徴とする新規なエキソ型加水分解酵素。
2. （２）フルクタンを、フルクタンのフルクトース末端側
   から３〜４個の糖単位ごとに加水分解してイヌロトリオ
   ース及び／又はイヌロテトラオースを生成させる性質を
   有する新規なエキソ型加水分解酵素と反応させて、イヌ
   ロトリオース及び／又はイヌロテトラオースを生成させ
   、該イヌロトリオース及び／又はイヌロテトラオースを
   取得することを特徴とするイヌロトリオース及び／又は
   イヌロテトラオースの製造方法。