JPH0712309B2 - 新規トレハラ−ゼおよびその製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は新規なトレハラーゼ並びにその製造法に関す
る。更に詳しくは、新規なコリネバクテリウム属に有す
る好熱性微生物を培養して得られる菌体外並びに菌体内
耐熱性トレハラーゼおよびその製造に関する。

従来の技術 一般に、トレハロースは２分子のＤ−グルコースが1,1
−結合した形の非還元性二単糖の一種であり、その結合
様式によって、α，α−、α，β−およびβ，β−の３
種の異性体が存在する。また、天然にはα，α−体のみ
が存在し、麦角、カビ、酵母、紅藻、地衣類並びに多く
の昆虫に広く分布しており、特に昆虫では血リンパ中に
あって主要血糖として存在するばかりでなく、不凍剤と
しての機能をも有し、昆虫は季節に応じてその濃度を調
節し、耐寒性を獲得していることが知られている。

このようなトレハロースを２分子のグルコースに加水分
解する酵素としてトレハラーゼが知られ、これは高等動
物（ラット小腸、ブタ小腸など）、昆虫（カイコ等）、
カビ（例えば黒コウジカビ（Aspergillus nigar）な
ど）、酵母等の動物、植物、微生物に広く分布してい
る。特に、高等動物においてはこのトレハラーゼがクル
コース輸送に強く関与していることが示唆され、また昆
虫においては飛翔の際のエネルギー獲得および変態の際
にこのトレハラーゼが大きく関与していることが予想さ
れている。一方、微生物においては胞子発芽の際のエネ
ルギー獲得の調節などに関与していることが知られてい
る。このように、トレハラーゼは各生物の生理作用の面
から、重要な生理活性物質として注目され、研究が進め
られている。

このトレハラーゼを生産する微生物としては、カビでは
アスペルギルス（Aspergillus）属〔ケー．ホリコシ
（K.Horikoshi），ジャーナル オブ バクテリオロジ
ー（J.Bacteriol.）,1966,91,1883〕；ノイロスポラ（N
eurospora）属〔アイ．エッチ．ラニー（I.H.Lanny），
ジャーナル オブ バクテリオロジー（J.Bacterio
l.）,1973,115,582〕；フミコーラ〔Humicola）属〔エ
ー．アール．エス．プラサッド（A.R.S.Prasad），バイ
オシミカエ バイオフィジカ アクタ．（Biochim.Biop
hys.Acta.）,1978,525,162〕；フィコマイセス（Phycom
yces）属〔ジェイ．エー．ヴァン アッシュ（J.A.VanA
ssche），バイオシミカ エ バイオフィジカ アク
タ．（Biochim.Biophys.Acta.）,1975,391,154〕；トリ
コデルマ（Trichoderma）属〔ピー．フィジャヤクマー
ル（P.Vijayakumar），カナディアン ジャーナル オ
ブ マイクロバイオロジー（Can.J.Microbiol.）,1978,
24,1280〕；プルラリア（Pullularia）属〔イー．メル
ディンガー（B.Merdinger），ジャーナル オブ バク
テリオロジー（J.Bacteriol.）,1971,106,1034〕；ケト
ミウム（Chaetomium）属〔特公昭60−22917号公報発
明〕；コクリオボルス（Cochliobolus）属〔エム．マツ
バラ（M.Matsubara），ケミカル ＆ ファーマシュー
ティカル ブレタン（Chem.Pharm.Bull.）,1981,29,372
3〕；ディクティオステリウム（Dictyosterium）属〔ケ
ー．エー．キリック（K.A.Killick），アチーブス オ
ブ バイオケミストリー ＆ バイオフィジックス（Ar
ch.Biochem.Biophys.）,1983,222,561〕等が、酵母では
サッカロマイセス（Saccharomyces）属〔エー．パネク
（A.Panek），ジャーナル オブ バイオロジカル ケ
ミストリー（J.Biol.Chem.）,1964,239,1671〕等が知ら
れ、詳細な検討が行われている。また、細菌、放線菌な
どでは例が少ないが、マイコバクテリウム（Mycobacter
ium）属〔ビー．ダブリュー．パターソン（B.W.Patters
on），メソッド イン エンザイモロジー（Methed in
Enzymology）,1972,28,996〕；ストレプトマイセス（St
reptomyces）属〔エー．イー．ヘイ（A.E.Hey），ジャ
ーナル オブ バクテリオロジー（J.Bacteriol.）,196
8,96,105〕などが知られている。

しかしながら、このトレハラーゼの所在場所としては、
トリコデルマ（Trichoderma）属〔ピー．フィジャヤク
マール（P.Vijayakumar），カナディアンジャーナル
オブ マイクロバイオロジー（Can.J.Microbiol.）,197
8,24,1280〕で菌体外生産され、またケトミウム（Chaet
omium）属〔特公昭60−22917号公報発明〕で被子器の孔
口からトレハラーゼが放出されることが確認されている
のみで、その他の微生物では胞子および菌体内生産が主
であり、トレハラーゼの調製には多大な労力を必要とし
ていた。

また、従来のトレハラーゼは熱に対して不安定であり、
上記フミコーラ（Humicola）属、サッカロマイセス（Sa
ccharomyces）属〔ピー．ジェイ．ケリー（P.J.Kell
y），アナリティカル バイオケミストリー（Anal.Bioc
hem.）,1976,72,353〕において熱安定化保護物質の検討
が行われているにすぎなかった。

発明が解決しようとする問題点 工業的に、あるいは医学的に有用な各種酵素を大量に得
ることができることは、該酵素を利用し、有用な物質を
得たり、また生理作用の研究を行う上で重要である。こ
のように、特定の酵素を量産するためには、菌体外生産
を可能とする微生物の発見・探索が必要となる。

また、こうして得られる酵素をバイオリアクターなどに
おいて有効に利用するためには、高い安定性、特に温度
に対する高い安定性を有することが重要となる。即ち、
バイオリアクターなどで繰返し使用できるようにするた
めには、一般に酵素を固定化する必要があり、その際固
定化のために比較的恒温に曝されることがあり、耐熱性
の低いものでは固定化操作中に失活してしまう可能性が
高い。また、高温度下で酵素反応を行うことにより反応
速度が増大し、目的とする生成物の量産が可能となる。

更に、トレハラーゼは動物、植物、微生物に広く分布し
ているものの、これらにおけるトレハラーゼの含有量は
著しく低く、そのため精製トレハラーゼ酵素は極めて高
価なものとなっていた。

従って、量産性よく、しかも耐熱性の良好なトレハラー
ゼ並びにその製造方法を開発することが切に望まれてお
り、本発明の目的もこの点にあり、新規な耐熱性トレハ
ラーゼ及びその製造法を提供することにある。

問題点を解決するための手段 本発明者等はトレハラーゼ酵素における上記の如き従来
法を現状に鑑みて、熱に対して安定で、精製の容易なト
レハラーゼを培養外液中に生成蓄積せしめる能力を有す
る微生物を得るべく鋭意検索した結果、中温乃至高温に
生育温度を有し、コリネバクテリウム（corynebacteriu
m）属に属するある種の好熱性細菌が上記要件を備えて
いると共に、菌体内にも目的とする酵素を生成蓄積する
ものであることを見出し、本発明を完成した。

即ち、本発明はまず新規耐熱性トレハラーゼ酵素を提供
するものであり、これは以下のような理化学的諸特性を
有している。

（イ）作用・・α，α−トレハロースのグリコシド結合
を特異的に加水分解し、２分子のグルコースを生成す
る。

（ロ）基質特異性・・α，α−トレハロースに特異的に
作用し、同じ２単糖であるシュークロース、ラクトー
ス、メリビオース、マルトース、セロビオース、ゲンチ
ビオースには作用しない。

（ハ）至適pHおよび安定pH範囲・・至適pHは6.5〜7.5で
あり、60℃、30分間の加熱条件下ではpH5.0〜10.0の範
囲内で安定である。

（ニ）温度に対する安定性・・pH7.0、65℃の加熱条件
下では15時間以上安定である。

（ホ）作用適温の範囲・・60℃近傍に至適作用温度を有
する。

（ヘ）失活条件・・60℃、30分間の処理条件ではpH4.0
および11.0で完全に失活する。また、pH7.0、15分間の
処理条件では85℃で完全に失活する。

（ト）阻害および活性化・・塩化第二水銀、フロレチン
で失活し、60℃、２時間の熱処理で活性化される。

（チ）分子量・・55,000〜65,000。および、 （リ）等電点・・4.4。

また、本発明は上記の新規耐熱性トレハラーゼの製法に
も関り、該トレハラーゼはコリネバクテリウム属に属
し、上記トレハラーゼを菌体外かつ菌体内生産する微生
物を培養し、培養液中および菌体内に該酵素を生成・蓄
積せしめ、これを分離・精製することを特徴とする方法
によって得ることができる。

本発明の方法において使用する新規菌体外並びに菌体内
耐熱性トレハラーゼ生産菌株は本発明者等により新たに
自然界から検索・単離されたものである。これらの菌株
をバージェーズ マニュアル オブ ディターミナティ
ブ バクテリオロリジー（Bergey′ｓ Mannual of D
eterminative Bacteriology）、第８版に従って同定す
ると、いずれも好気性無胞子桿菌であり、運動性がな
く、グラム染色陽性、カタラーゼテスト陽性であること
から、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属に属
することは明らかであったが、60℃前後の高温で良く生
育することから、既知のコリネバクテリウム属菌とは分
類学上異る新菌株と考えられた。

以下の第１表に単離した三種の菌体外並びに菌体内耐熱
性トレハラーゼ生産菌の菌学的諸性質を示す。

尚、上記菌は工業技術院微生物工業技術研究所に、夫々
FERM Ｐ−8484（Ｋ−502）、FERM Ｐ−8485（Ｋ−51
2）およびFERM Ｐ−8486（Ｋ−522）として寄託してい
る。

本発明の新規な菌体外並びに菌体内耐熱性トレハラーゼ
の製造法につき更に詳しく説明する。まず、菌体外耐熱
性トレハーゼは前記の理化学的性質を有するものであ
る。これは、上記のような菌体外かつ菌体内耐熱性トレ
ハラーゼ生産菌を適当な培地に接種し、55〜65℃にて、
48〜72時間、好気的に培養するが、培地としては炭素
源、窒素源の他、必要に応じて無機塩、微量栄養素を含
むものである。

まず、炭素源としては従来公知の各種材料を使用するこ
とができ、例えばグルコース、水飴あるいは可溶性澱粉
などを典型例として例示できる。また、窒素源としても
特に制限はなく、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コ
ーンスティープリカー、アミノ酸液、大豆粕などの有機
態窒素、あるいは硫安、尿素、硝酸アンモニウム、塩化
アンモニウムなどの無機態窒素などが安価かつ入手容易
なものとして例示できる。尚、有機態窒素源は炭素源と
なることはいうまでもない。更に、このような炭素源、
窒素源の他、一般に使用されている各種の塩、例えばマ
グネシウム塩、カリウム塩、リン酸塩、鉄塩等の無機
塩、ビタミンなどを添加することも可能である。

本発明の方法において使用するのに適した培地は、例え
ば１％の可溶性デンプン、１％のグルコース、１％のポ
リペプトン、0.5％の酵母エキス、0.1％のK₂HPO₄および
0.02％のMgSO₄・7H₂Oを含有する液体培地であり得る。

また、本発明の方法で使用する微生物の生育pHは弱酸乃
至塩基性の範囲内であるので、適当な緩衝液を用いて上
記所定のpH値を維持する必要がある。そのために有用な
緩衝液としてはリン酸緩衝液を典型例として挙げること
ができるが、これに限定されず、公知の任意のものを使
用できる。

本発明の上記方法において使用する菌はいずれもトレハ
ラーゼを菌体外生産するので、生成されるトレハラーゼ
は培養液中に放出され、そこに蓄積される。これら菌の
培養はバッチ式、連続式のいずれによっても得ることが
でき、生成される酵素の分離精製は例えば以下のように
して実施することができる。

即ち、まず培養液中の菌体を遠心分離、濾過などで除去
した後、得られる上澄液（粗酵素液）をそのままトレハ
ロースの加水分解反応に適用することも可能であり、こ
れは経済的に有利である。また、これを更に精製して使
用することもできる。そのために、例えば硫安等による
塩析、エタノール、アセトン、イソプロパノール等によ
る溶媒沈殿法、限外濾過法、ゲル濾過法、イオ交換樹脂
等による一般的な酵素精製法により精製することができ
る。

以下に、本発明の菌体外生産されたトレハラーゼの好ま
しい精製法の１例につき説明する。

好熱性コリネバクテリウム属に属する例えばＫ−502菌
株を、例えば上記のような培地に植菌し、55℃にて72時
間好気的に培養して得られる培養液を、10,000rpm、０
℃にて10分間遠心分離して菌体を除き、３の上澄液を
得る。次いで該上澄液を平均分画分子量10,000の限外濾
過膜を用いて約10倍に濃縮し、10mMリン酸緩衝液（pH7.
0）で一夜透析する。この透析後に生じる沈殿を遠心分
離で除き、得られる上澄液を10mMリン酸緩衝液（pH7.
0）で平衡化したDEAE−セルロースカラムに吸着させ、
０〜0.8MのNaClを含む上記と同様な緩衝液の濃度勾配法
によって酵素を溶出させる。溶出した活性画分を集め限
外濾過膜を用いて濃縮した後、上記同様のリン酸緩衝液
を用いて一夜透析する。次いで、該透析酵素を同様に上
記リン酸緩衝液で平衡化したグルコネート−セファロー
ス4Bカラムに吸着させ、0.1MNaClを含む上記緩衝液で洗
浄した後、1MNaClを含む同上緩衝液を用いて活性画分を
溶出した。この活性画分を0.1MNaClを含む同上緩衝液中
で一夜透析する。引き続いて、該透析酵素を0.1MNaClを
含有する上記緩衝液で平衡化したDEAE−トヨパールカラ
ムに吸着させ、0.1〜0.5MのNaClを含む上記緩衝液の濃
度勾配法によって酵素を溶出する。溶出した活性画分を
集め、限外濾過膜を用いて濃縮し、0.1MNaClを含む、上
記緩衝液中で一夜透析する。更に、こうして透析した酵
素を限外濾過膜を用いて濃縮する。この濃縮酵素を0.1M
NaClを含有する上記緩衝液で平衡化したバイオゲルＰ−
150のゲル濾過カラムに充填し、0.1MNaClを含む同上緩
衝液で溶出する。かくして得られた活性画分を濃縮し、
ポリアクリルアミドゲルディスク電気泳動（ゲル濃度7.
5％、pH4.5）において単一の酵素標品15mgが得られた。
活性収率は18％であった。尚、本発明の方法において有
用なＫ−512菌およびＫ−522菌についても、ゲル濾過用
樹脂を適宜変更する以外は上記と同様にして精製するこ
とが可能である。

また、本発明で使用する上記耐熱性トレハラーゼ生産菌
は菌体内にもトレハラーゼを生成・蓄積する。この場合
に得られる耐熱性トレハラーゼも上記記載の菌体外生産
されたトレハラーゼと同様の理化学的性質を有する。こ
のトレハラーゼは上記の菌体外トレハラーゼと殆ど同様
の方法に従って製造することができる。即ち、上記の如
き耐熱性トレハラーゼ生産菌を適当な培地に接種し、55
〜65℃にて、48〜72時間、好気的に培養する。この際に
使用する培地としては菌体外トレハラーゼの製造と全く
同じものが使用できる。

この菌体内トレハラーゼはいずれの場合にも菌体内で生
産されるので、菌体の破砕およびDNAの除去工程を必要
とする。その方法としてはリゾチーム、フレンチプレ
ス、超音波処理による菌体破砕、さらにポリエチレンイ
ミン、DNアーゼ処理等によるDNAの除去を挙げることが
できる。しかしながら、このような方法のみに限定され
るものではなく、その他の公知の任意の手段がいずれも
使用できる。

例えば、まず、培養液中の菌体を遠心分離、濾過などで
集めた後、得られた菌体をリゾチーム（2mg）により40
℃の下で溶菌させ、さらにポリエチレンイミン処理によ
り生じた沈殿を遠心分離等で除去し、得られた上澄液を
粗酵素液とする。この上澄液をそのままトレハロースの
加水分解反応に使用することも可能であり、これは経済
的に有利である。また、これを更に精製して使用するこ
ともできる。そのために、例えば硫安等による塩析、エ
タノール、アセトン、イソプロパノール等による溶媒沈
殿法、限外濾過法、ゲル濾過法、イオン交換樹脂等によ
る一般的な酵素精製法により精製することができる。

以下に、本発明のトレハラーゼの好ましい精製法の１例
につき説明する。

即ち、好熱性コリネバクテリウム属に属する例えばＫ−
502菌株を、例えば上記のような培地に植菌し、55℃に
て72時間好気的に培養して得られる培養液を、10,000rp
m、０℃にて10分間遠心分離して菌体10gを得る。得られ
た菌体を0.85％のNaClを含む10mMリン酸緩衝液でよく洗
浄し、リゾチームで溶菌させ、さらにポリエチレンイミ
ンを加え生じた沈殿を遠心分離で除去する。ついで該上
澄液を平均分画分子量10,000の限外濾過膜を用いて約10
倍に濃縮し、10mMリン酸緩衝液（pH7.0）で一夜透析す
る。この透析後に生じる沈殿を遠心分離で除き、得られ
る上澄液を10mMリン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化したDEA
E−セルロースカラムに吸着させ、０〜0.8MのNaClを踏
む上記と同様な緩衝液の濃度勾配法によって酵素を溶出
させる。溶出した活性画分を集め限外濾過膜を用いて一
夜透析する。次いで、該透析酵素を同様に上記リン酸緩
衝液で平衡化したグルコネート−セファロース4Bカラム
に吸着させ、0.1MNaClを含む上記平衡液で洗浄した後、
1MNaClを含む同上緩衝液を用いて活性画分を溶出した。
この活性画分を0.1MNaClを含む同上緩衝液で一夜透析す
る。引き続いて、該透析酵素を0.1MNaClを含有する上記
緩衝液を用いて平衡化したDEAE−トヨパールカラムに吸
着させ、0.1〜0.5MのNaClを含む上記緩衝液の濃度勾配
法によって酵素を溶出する。溶出した活性画分を集め、
限外濾過膜を用いて濃縮し、0.1MNaClを含む上記緩衝液
中で一夜透析する。更に、こうして透析した酵素を限外
濾過膜を用いて濃縮する。この濃縮酵素を0.1MNaClを含
有する上記緩衝液で平衡化したバイオゲルＰ−150のゲ
ル濾過カラムに充填し、0.1NNaClを含む同上緩衝液で溶
出する。かくして得られた活性画分を濃縮し、ポリアク
リルアミドゲルディスク電気泳動（ゲル濃度7.5％、pH
4.5）において単一な酵素標品3mgが得られた。活性収率
は18％であった。尚、本発明の方法において有用なＫ−
512菌およびＫ−522菌についても、ゲル濾過用樹脂を適
宜変更する以外は上記と同様にして精製することが可能
である。

尚、トレハラーゼの活性測定法並びに活性表示法は以下
の通りである。

即ち、0.1Mのリン酸緩衝液（pH7.0）に溶解させた１％
（W/V）のトレハロース溶液1.0mlに酵素液0.1mlを混合
し、60℃で10分間反応させた後、沸騰水浴中で10分間加
熱して酵素を失活させる。次いで、加水分解により生成
するＤ−グルコースをソモギー・ネルソン法〔メソッド
イン カーボハイドレイト ケミストリー（Method i
n Carbohydrate Chemistry）,1962,１,386〕に従って定
量する。また、酵素活性の単位は前述の条件下で１分間
に１μmolのグルコースを生成するのに要する酵素量を
１単位として表示する。

本発明の方法によって得られる耐熱性トレハラーゼＩの
理化学的、酵素化学的性質は上記の他、各菌株Ｋ−50
2、Ｋ−512およびＫ−522から得られる酵素の分子量は
夫々55,000±2,000、60,000±2,000および65,000±2,00
0である。尚、これらの分子量はゲル濾過法で求めたも
のである。また、本発明の菌体外並びに菌体内生産され
たトレハラーゼおよび従来公知の微生物由来のトレハラ
ーゼの理化学的性質および酵素化学的性質を比較して第
２表に示す。

作用 動物、植物、微生物に広く分布し、各生物の生理作用に
おいて重要な役割を演じているトレハラーゼを簡単な方
法で大量に得るためには、このトレハラーゼ酵素を菌体
外生産する微生物あるいは菌体外かつ菌体内生産する微
生物の検索が重要であり、このような微生物の獲得によ
ってトレハラーゼを安価にかつ安定して供給することが
できる。

また、工業的な観点からすれば、微生物から抽出される
酵素は高い耐熱性を有することが有利であり、例えばこ
れを用いたトレハロースの加水分解を高温で行うことは
その反応速度を早め、加水分解生成物の量産化を図る上
で重要であり、またバイオリアクターなどで使用するた
めに酵素の固定化が行われるが、その際の酵素活性の維
持のためにも、耐熱特性良好な酵素を使用することが有
利である。

このような目的で、微生物の生育温度と耐熱性との関連
性を調べた例がみられるが、望ましい結果を得ることで
きなかった〔バイオシミカ エ バイオフィジカ アク
タ．（Biochim.Biophys.Acta.）,1978,525,162〕。従っ
て、耐熱性酵素を得るためにはこれを生産する新たな微
生物を開拓しなければならない。また、耐熱性の優れた
ものも知られている〔ジャーナル オブ バクテリオロ
ジー（J.Bacteriol.）,1973,115−2,582〕が、これは目
的とする酵素の菌体内生産性を有する微生物、即ちアカ
パンカビ（Neurospora）の菌糸体および子のう胞子から
得られるものであり、また酵素濃度を高くしたり、ポリ
オールを添加することにより、耐熱性の維持を図ってい
る。これは量的に制限されると共に分離・精製も複雑と
なり、好ましくない。

ところで、本発明の方法は好熱性かつ酵素の菌体外生産
性のコリネバクテリウム属に属するある種の新規な菌を
使用したことによって、上記の耐熱性の問題並びに量産
性の問題、更には分離・精製上の問題をいずれも有利に
解決することができた。

更に、本発明で使用する上記コリネバクテリウム属に属
する菌は上記の如くトレハラーゼの菌体外生産を行うと
共に菌体内での生産をも行う。

従って、この場合には従来知られていた微生物と同様に
分離精製の煩雑さはあるが、単一ロットでのトレハラー
ゼの生産性は大巾に改善される。しかも菌体内生産され
たトレハラーゼも高耐熱性であることから耐熱性の要求
される様々な用途において有利に使用できる。何よりも
有利な点は同一の条件下で培養した菌体並びに培養液両
者から有用な酵素が回収できることにある。

実施例 以下、実施例に従って本発明の新規耐熱性トレハラーゼ
並びにその製造方法につき更に具体的に説明する。しか
しながら、本発明の範囲は以下の実施例によって何等制
限されるものではない。

実施例１ 好熱性細菌コリネバクテリウムNo.−Ｋ−502（Coryneba
cterium sp.K−502:FERM P−8484）を、１容の三角フ
ラスコ中の、可溶性デンプン２％、ポリペプトン１％、
酵母エキス0.5％、K₂HPO₄0.1％、MgSO₄・7H₂O0.02％を
含む培地（pH7.2）300mlに植菌し、55℃で72時間、250r
pmで回転振とう培養し、培養液を遠心分離して0.28単位
/mlの粗酵素液を得た。尚、この酵素活性の測定は既に
述べた方法に従った（以下同様）。

実施例２ 好熱性細菌コリネバクテリウムNo.−Ｋ−512（Coryneba
cterium sp.K−512:FERM P−8485）を、実施例１で述べ
た培地組成の可溶性デンプンに代えてグルコース２％を
含む培地300mlに植菌し、実施例１と同一条件下で振と
う培養し、0.37単位/mlの粗酵素液を得た。

実施例３ 好熱性細菌コリネバクテリウムNo.−Ｋ−522（Coryneba
cterium sp.K−522:FERM P−8484）を、実施例１で述べ
た組成の培地に植菌し、60℃で48時間、250rpmで回転振
とう培養し、培養液を遠心分離して0.33単位/mlの粗酵
素液を得た。

実施例４ 好熱性細菌コリネバクテリウムNo.−Ｋ−502（Coryneba
cterium sp.K−502:FERM P−8484）を、１容の三角フ
ラスコ中の、可溶性デンプン２％、ポリペプトン１％、
酵母エキス0.5％、K₂HPO₄0.1％、MgSO₄・7H₂O0.02％を
含む培地（pH7.2）300mlに植菌し、55℃で72時間、250r
pmで回転振とう培養し、培養液を遠心分離して菌体を集
め先にのべた方法で0.5単位/mlの粗酵素液を10ml得た。

実施例５ 好熱性細菌コリネバクテリウムNo.−Ｋ−512（Coryneba
cterium sp.K−512:FERM P−8485）を、実施例４で述べ
た培地組成の可溶性デンプンに代えてグルコース２％を
含む培地300mlに植菌し、実施例４と同一条件下で振と
う培養し、1.25単位/mlの粗酵素液10mlを得た。

実施例６ 好熱性細菌コリネバクテリウムNo.−Ｋ−522（Coryneba
cterium sp.K−522:FERM P−8486）を、実施例４で述べ
た組成の培地に植菌し、60℃で48時間、250rpmで回転振
とう培養し、培養液を遠心分離して0.95単位/mlの粗酵
素液10mlを得た。

発明の効果 以上詳細に説明したように、本発明によれば新規な好熱
性微生物であって、トレハラーゼの菌体外かつ菌体内生
産性を有するコリネバクテリウムに属する菌を利用した
ことに基き、高い耐熱性を有するトレハラーゼ酵素を有
利に量産性良く製造できる。また、特に菌体外生産性の
微生物を用いたことから分離・精製操作が極めて容易で
あり、従来高価であったトレハラーゼを安価にかつ安定
して供給することが可能となった。

また、本発明で使用するトレハラーゼ生産菌は菌体内生
産性をも有するものであり、従って培養液の回収の際に
得られる菌体自体からも耐熱性トレハラーゼを回収でき
る。この事実から、トレハラーゼの収率は更に向上す
る。

更に、本発明のトレハラーゼは高い耐熱性を有するの
で、トレハロースの加水分解反応を高温度下で行うこと
を可能とし、その結果反応速度を大巾に向上し得るので
加水分解生成物の量産が可能となる。また、固定化の際
に高温度下に曝された場合にも十分な酵素活性の維持が
可能であり、優れたバイオリアクター用の固定化酵素を
得ることが可能となる。

フロントページの続き (72)発明者 掘越 弘毅 東京都練馬区桜台４−39−８ (72)発明者 中村 信之 東京都国立市中１−４−23

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の理化学的性質を有する新規トレハラ
   ーゼ。 （イ）作用・・α，α−トレハロースのグリコシド結合
   を特異的に加水分解し、２分子のグルコースを生成す
   る。 （ロ）基質特異性・・α，α−トレハロースに特異的に
   作用し、同じ２単糖であるシュークロース、ラクトー
   ス、メリビオース、マルトース、セロビオース、ゲンチ
   ビオースには作用しない。 （ハ）至適pHおよび安定pH範囲・・至適pHは6.5〜7.5で
   あり、60℃、30分間の加熱条件下ではpH5.0〜10.0の範
   囲内で安定である。 （ニ）温度に対する安定性・・pH7.0、65℃の加熱条件
   下では15時間以上安定である。 （ホ）作用適温の範囲・・60℃近傍に至適作用温度を有
   する。 （ヘ）失活条件・・60℃、30分間の処理条件ではpH4.0
   および11.0で完全に失活する。また、pH7.0、15分間の
   処理条件では85℃で完全に失活する。 （ト）阻害および活性化・・塩化第二水銀、フロレチン
   で失活し、60℃、２時間の熱処理で活性化される。 （チ）分子量・・55,000〜65,000。 （リ）等電点・・4.4。
2. 【請求項２】コリネバクテリウム属に属し、以下に理化
   学的諸特性： （イ）作用・・α，α−トレハロースのグリコシド結合
   を特異的に加水分解し、２分子のグルコースを生成す
   る； （ロ）基質特異性・・α，α−トレハロースに特異的に
   作用し、同じ２単糖であるシュークロース、ラクトー
   ス、メリビオース、マルトース、セロビオース、ゲンチ
   ビオースには作用しない； （ハ）至適pHおよび安定pH範囲・・至適pHは6.5〜7.5で
   あり、60℃、30分間の加熱条件下ではpH5.0〜10.0の範
   囲内で安定である； （ニ）温度に対する安定性・・pH7.0、65℃の加熱条件
   下では15時間以上安定である； （ホ）作用適温の範囲・・60℃近傍に至適作用温度を有
   する； （ヘ）失活条件・・60℃、30分間の処理条件ではpH4.0
   および11.0で完全に失活し、また、pH7.0、15分間の処
   理条件では85℃で完全に失活する； （ト）阻害および活性化・・塩化第二水銀、フロレチン
   で失活し、60℃、２時間の熱処理で活性化される； （チ）分子量・・55,000〜65,000; （リ）等電点・・4.4; を有する新規トレハラーゼ生産能を有する微生物を培養
   し、該トレハラーゼを培養液中に生成・蓄積させ、これ
   を採取することを特徴とする上記新規菌体外トレハラー
   ゼの製造方法。
3. 【請求項３】上記培養を55〜65℃の範囲内の温度下で好
   気的に行うことを特徴とする特許請求の範囲第２項記載
   の菌体外トレハラーゼの製造方法。
4. 【請求項４】上記培養液のpHが５〜９の範囲内にあるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第２項または第３項記載
   の菌体外トレハラーゼの製造方法。
5. 【請求項５】コリネバクテリウム属に属し、以下の理化
   学的諸特性： （イ）作用・・α，α−トレハロースのグリコシド結合
   を特異的に加水分解し、２分子のグルコースを生成す
   る； （ロ）基質特異性・・α，α−トレハロースに特異的に
   作用し、同じ２単糖であるシュークロース、ラクトー
   ス、メリビオース、マルトース、セロビオース、ゲンチ
   ビオースには作用しない； （ハ）至適pHおよび安定pH範囲・・至適pHは6.5〜7.5で
   あり、60℃、30分間ではpH5.0〜10.0の範囲内で安定で
   ある； （ニ）温度に対する安定性・・pH7.0、65℃の加熱条件
   下では15時間以上安定である； （ホ）作用適温の範囲・・60℃近傍に至適作用温度を有
   する； （ヘ）失活条件・・60℃、30分間の処理条件でpH4.0お
   よび11.0で完全に失活する； （ト）阻害および活性化・・塩化第二水銀、フロレチン
   で失活し、60℃、２時間の熱処理で活性化される； （チ）分子量・・55,000〜65,000; （リ）等電点・・4.4; を有する新規トレハラーゼ生産能を有する微生物を培養
   し、該トレハラーゼを菌体内に生成・蓄積させ、これを
   採取することを特徴とする上記新規菌体内トレハラーゼ
   の製造方法。
6. 【請求項６】上記培養を55〜65℃の範囲内の温度下で好
   気的に行うことを特徴とする特許請求の範囲第５項記載
   の菌体内トレハラーゼの製造方法。
7. 【請求項７】上記培養液のpHが５〜９の範囲内にあるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第５項または第６項記載
   の菌体内トレハラーゼの製造方法。