JPH02234671A - 寒天分解酵素及びその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、寒天分解酵素、寒天分解物の製造方法及びそ
れらを製造する微生物に関する。

〔従来の技術および発明が解決しようとする課題〕従来
、食品の保存性を高めるために種々の合成保存料が食品
添加物として使用され実効をあげている。しかしながら
、近年は食品の安全性に対する関心が高まり、これら化
学的に合成された保存料はその使用量が、規制されると
ともに消費者の間にも保存料添加食品を警戒する傾向が
生じている。そこで、天然食品素材を原料とする食品保
存料に対する需要が一層高まり、種々の提案がなざれて
きた。

このような保存料の製造法として寒天等の素材を酸性下
、すなわち塩酸水溶液と混合し、加熱して食品保存料を
得る方法が提案され（特公昭６０−３５１０１公報）、
また最近ではシュードモナス属やサイトファーガ属の微
生物の産生ずる酵素を用いてオリゴ糖を製造し食品を防
腐する方法（特公昭６２−２１０９７４公報）も提案さ
れている。しかしながら、この前者の製造法では寒天等
を酸によって加水分解するため、酸加水分解物を通常の
食品に用いる場合には中和の工程が必要とされ、場合に
よっては、脱塩工程が必要となり効率的製造法とは言い
難い。

一方近年、特に文明社会においては過食による肥満や糖
尿病の増加に伴い、低カロリー飲食品の要求が高まって
いる。これに対して甘味料の代表である砂糖に代替する
低カロリー甘味科としてマルチトーノベソルビトールな
どの糖質系甘味料やステビオザイド、アスパルテーム（
Ｌ−アスパルチルーし−フェニルアラニンメチルエステ
ル）などの高甘味素材の使用が広まりつつある。しかし
ながら、これらの低カロリー甘味料、特に高甘味素材は
たとえば飲料あるいは食品に利用した場合には量感の欠
如という問題があり、この問題を解決するために、消化
性または難消化性の糖質が一般にボディー材として併用
されている。

ところが、従来使用されてきた難消化性糖質の多くは生
体において小腸では消化・吸収されないものの腸管の下
部で腸内細菌による分解・代謝を受け、酢酸・プロピオ
ン酸などの揮発性脂肪酸または乳酸・コハク酸などの不
揮発性有機酸に変換される。これら分解・代謝の過程で
生じる揮発性脂肪酸や不揮発性有機酸は生体に吸収され
、エネルギー源として活用され得るため、ある程度はカ
ロリーとなってしまうことが最近になってわかってきた
。一方、前記のような微生物的方法により寒天分解物を
製造する場合、微生物の産生ずる酵素の量や比活性が十
分ではなく、酵素産生や、酵素反応に時間がかかり、寒
天を基質としてその変換率は１００％とならず、未反応
の寒天が多く残る。

このように酵素の産生及び寒天分解物の収率には多くの
問題が残っている。

〔発明が解決しようとする課題〕

以上述べて来た様に、食品の防腐物質や低力ロリー飲料
及び健康食品きして考えられている寒天分解生成物の酸
加水分解による生産、あるいはシュードモナス属やサイ
トファーガ属の産生ずる酵素による生産には、いくつか
の問題点が有る。これらのことから、本発明の目的はこ
れまでの微生物よりも、寒天分解（能）が高くかつ培養
時間が短く培養制御が容易な、バクテリアを利用した寒
天分“解酵素及び寒天分解生成物の醗酵生産方法を提供
する事にある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者等は寒天分解酵素及び寒天分解能を有するバク
テリアを、広く海洋に求めて鋭意研究した結果、ビブリ
オ（Ｖｉｂｒｉｏ）属に属するバクテリアが高収量で寒
天分解酵素及び寒天分解物を生産することを見出し、こ
の知見に基づいて本発明を完成した。

従って本発明は、次の性質： （１）ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属に属する微生物によ
り生産される （２）寒天及びペクチンを分解するが、マンナン、デキ
ストラン、アルギン酸及びセルロースにはほとんど作用
しない； （３）至適作用ｐＨが約６〜８である：及び（４）作用
至適温度が約３０℃〜５０℃である；を有する寒天分解
酵素を提供する。

本発明はさらに、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属に属し、
寒天分解酵素を生産することができる微生物を寒天含有
酵素培地中で培養することにより寒天分解物を生成せし
め、そして該寒天分解物を採取することを特徴とする寒
天分解物の製造方法を提供１る。

本発明はさらに、前記の寒天分解酵素を寒天に作用させ
て寒天分解物を生成せしめ、そして該寒天分解物を採取
することを特徴とする寒天分解物の製造方法を提供する
。

本発明はさらに、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属に属し、
寒天分解酵素を生産することができる微生物を培養し、
寒天分解酵素を培地中に生成蓄積せしめ、これを採取す
ることを特徴とする寒天分解酵素の製造法を提供する。

本発明はまた、寒天分解酵素を生産することができるビ
ブリオ・エスピー（Ｖｉｂｒｉｏ　ｓｐｐ．）ＳＣＲＣ
−ＢＯＯ７である微生物を提供する。

（具体的な説明） く１〉微生物 本発明において使用する微生物は、ビブリオ属に属し寒
天分解酵素及び寒天分解物を生産する事が出来るもので
あればよく、このような微生物は自然界から新たに分離
する事が出来る。ビブリオに属する微生物の例として、
ビブリオ・ハルベイ（Ｖｉｂｒｉｏ　ｈａｒｖｅｙｉ）
を挙げる事が出来、また新菌株として本発明者等が分離
したビブリオ・エスピー（Ｖｉｂｒｉｏ　ｓｐｐ．）Ｓ
ＣＲＣ−ＢＯＯ７を挙げる事が出来る。

この新菌株は次のように分離した。次の第一表に示す組
成の培地を調製した。

第１表 この寒天平板培地に各地の海洋より採取した海洋性生物
体サンプルを滅菌した生理食塩水で適度に希釈したもの
を接種し、２５℃で１〜２日間培養した。この寒天平板
培地に出現したコロニーを同じ培地組成の斜面培地に釣
菌した。こうして各地の海洋より採取した海洋性生物体
サンプルから多数の菌株を分離した。次に寒天を唯一の
炭素源とした寒天平板培地上で寒天を資化して液化する
菌を選抜した。こうして、寒天分解酵素及び寒天分解物
を顕著に生産する上記の菌株を相模湾より採取したイン
アワモチより得た。

この新規な菌株は、次のような菌学的性質を有する。

観察項目 ＳＣＲＣ−ＢＯＯ７の 観察結果 このような諸性質を有ずる本菌株ＳＣＲＣ　−　ＢＯＯ
７株の分類学的な位置は、バージイズ・マニュアル・オ
ブ・システマティク・バクテリオロジ−（［ｌｅｒｇｅ
ｙ’　ｓＭａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ），１９８４年の分類基準に
より、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属に属する細菌である
と同定される。

なお、糖からの酸およびガスの生成テストの項目の中に
は必ずしも文献記載のそれと一致しない項目があるが、
これらは分類学上さほど重要な項目ではなく、同一種で
も一般的によく変化するものであり、これらの記載に必
ずしも規定されるものではない。

以上、自然界から分離した菌株について詳細に記載した
が、これらの菌に変異を生じさせて一層生産性の高い菌
株を得ることも出来る。

この発明の菌株は、常法に従って保存することが出来、
例えば寒天スラント培地上で、または凍結乾燥法により
保存ずることが出来る。寒天スラント培地としては、ビ
ブリオ属細菌の保存に常用されている培地、例えば菌の
分離に関して前記した培地を使用することが出来る。ま
た、凍結乾燥保存も常法に従って行なうことができる。

上記の菌株ビブリオ・エスピー（Ｖｉｂｒｉｏ　ｓｐｐ
．ＳＣＲＣ　−　ＢＯＯ７は工業技術院微生物工業技術
研究所に微工研菌寄第１０５６０号（ＦＢＩ’ｌＭ　Ｐ
−１０５６０＞として寄託されている。

（２）寒天分解酵素及び寒天分解物 前記の微生物を培養して本発明の寒天分解酵素及び寒天
分解物を製造しようとする場合、基礎栄養培地として、
この発明の微生物が増殖しうるものであればいずれを使
用しても良い。この培地は例えば基質なる寒天を唯一の
炭素源として含有する。またこの培地には必要に応じて
窒素源として例えば酵母エキス、ペプトン、肉エキス等
の１種類または複数種類を炭素源として各種の糖類を加
えることが出来る。この培地には、塩化ナトリウム、も
しくは天然海水や人工海水を加えることが必要である。

培養温度は菌が生育し、寒天分解酵素が生産される温度
範囲であればいずれの温度でも良く、好ましくは５〜３
７℃であり、より好ましくは１５〜２５℃である。ｐＨ
は６〜１１、好ましくは７〜８の範囲である。培養時間
は採取し得る量の寒天分解酵素及び寒天分解物が生産さ
れる時間を選べば良く、好ましくは１２〜４８時間であ
る。

次に得られた培養物から本発明の寒天分解酵素及び寒天
分解物が採取される。寒天分解酵素は培養液より常法に
より酵素蛋白の分離、１｛ｈ製し、また寒天分解物は、
培養液より常法により、糖の分離、精製法により得るこ
とができる。精製法として通常の脂質精製法を用いるこ
とが出来る。かくて本発明によれば上記のバクテリアを
使用して醗酵生産することにより、高収率でかつ短時間
で多量に寒天分解酵素及び寒天分解物を得ることが出来
る。また本菌より酵素を精製し、酵素反応により目的と
する寒天分解物を得ることも出来る。

なお本寒天分解酵素活性の測定法及びその力価の表示法
を以下に示す。

次の表に示す反応液を調製する。

これを４０℃、１時間反応せしめる。反応終了後、ソモ
ギーネルソン法にて、ガラクトースを対照に用いて、生
成した還元糖を測定する。ｌユニットを、ＩＪＮの還元
糖が１時間の酵素反応により生成する力価として定義す
る。比活性（ユニット／ｍｇ蛋白／時）はＬ■の蛋白当
りのｕｎｉｔ　（力価〉をあらわす。

次に本発明の寒天分解酵素及び寒天分解物の製造方法の
具体的な１例を示す。

寒天１．５％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．２％
及び食塩１．５％を含有し、ｐＨ１．０に調整した培地
１βを１２１℃、１５分間加熱した後、ビブリオ・．．
Ｔ−スピー（Ｖｉｂｒｉｏ　ｓｐｐ．）ＳＣＲＣＢＯＯ
７　（微］二研菌第１．０　５　６　０号を接種し、２
０℃で４８時間振とう培養した。培養後遠心分離機で培
養」二清を採取した。

得られた培養」二清のうち６００ｍｊ？を使用して以下
の行程に従い、最終的にドデシル硫酸ナトリウムディス
クゲル電気泳動により単一バンドを示す寒天分解酵素が
得られた。

６００彪の培養土清中の酵素活性を測定したところ６ユ
ニッ｝　／　ｍｇ蛋白／時の比活性を示した。この培養
−１１清を１００％硫安飽和による塩析を行い得られた
両分の比活性を測定したところ４９．０ユニッ｝　／　
ｍｇ蛋白／時であった。この硫安分画物をＳｅｐｈａｄ
ｅｙ　Ｇ−２５カラム（２．　５　Ｘ４０ｃｍ＞を用い
、２　０ｍＭ　ｌ−　ＩＪス塩酸緩衝液にて流出し活性
画分を得た。この両分の比活性は１００．　５ユニッ｝
　／　ｍｇ蛋白／時であった。さらに本画分を最終的に
ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−１５０カラム（１．］７Ｘ５０ｃ
ｍ）を用い２０ｍＭ｝リス塩酸緩衝液にて流出して活性
画分を得た。この両分は上述のように電気泳動的に単一
バンドを示し寒天分解活性を有する精製酵素を得た。

この過程における比活性、総蛋白、総活性及び収率をま
とめて第２表に示す。

第２表 寒天分解酵素の精製 実施例１で得られた寒天分解酵素を用い寒天以外の多糖
体に対する本酵素の基質特異性を調らべたところ、寒天
を１００％にした時にはペクチン（シグマ製）に対して
は２６６％の比活性が見られたが、アルギン酸（シグマ
製）に対しては２９％、セルロース（メルク製）に対し
ては２．８％、マンナン（シグマ製）及びデキストラン
（フナコン製、分子量２００，　０００）に対してはＯ
％であった。結果をまとめて第３表に示す。

第３表 基質ｑ４ｒ異性 用い、ｐ｝１８及び９は０．１Ｍトリス−塩酸を用い、
またｐ｝１９　．　１０．　１１及び１２は０．１Ｍグ
リシンー水酸化ナトリウムを用いる緩衝液により調整し
た。

ｐ１１６の時の酵素活性を１００％とした時の各ｐＨＯ
比活性として第１図に示す。

実施例４　酵素活性の反応温度依存性 実施例１で得られた寒天分解酵素を用い酵素反応時の反
応温度による活性のちがいを調らべた。

反応温度は１５゜　，２０゜　，３０゜　，４０゜　．
５０゜　．６０゜及び７０℃とした。反応温度４０℃の
時の酵素活性を１００％とした時の各温度の比活性とし
て第２図に示す。

実施例１で得られた寒天分解酵素を用い、酵素反応にお
ける反応ｐＨによる活性のちがいを調らべた。ｐｔｌ３
，４，５．及び６は０．１Ｍクエン酸−リン酸２ナ｝　
ＩＪウムを用い、ｐＨ６＝７，及び８は０．　］．　Ｍ
リン酸１カリウムーリン酸２ナトリウムを寒天１．５％
、ペプトン０．５％、酵母エキス０．　１％及び食塩１
．５％を含有し、ｐＨ７．０に調製した培地Ｂを１２１
ｔ、１５分間加熱した後ビブリオ・エスピー（Ｖｉｂｒ
ｉｏ　ｓｐｐ、）　ＳＣＲＣ−ＢＯＯ７　（微工研菌第
１０５６０号）を接種し、２０℃で４８時間振とう培養
した。寒天が全て液化したのを確認後、培養液より常法
により遠心分離、濾過、脱塩などにより不溶物を除去し
た。

本溶液に２倍容のエチルアルコールを加え、沈澱を７，
ＯＯＯｘ　ｇ　，１５分間の遠心分離にて除去したもの
を濃縮した。本濃縮物をＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１５（
５．　５　Ｘ８５ｃｍ）カラムを用いて蒸留水にて寒天
分解物を流出させた。得られた寒天分解物を濃縮乾固し
たところ約１０．　５　ｇであった。なお、本寒天分解
物は、分子量から推定して重合度２〜２０の糖であった
。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の寒天分解酵素の作用ｐＨと活性との関
係を示すグラフである。 第２図は本発明の寒天分解酵素の作用温度と活性との関
係を示すグラフである。 （ｌ９） ′　Ｏ 次　Ｏ 旧 明 朋

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の性質： （１）ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属に属する微生物によ
   り生産される； （２）寒天及びペクチンを分解するが、マンナン、デキ
   ストラン、アルギン酸及びセルロースにはほとんど作用
   しない； （３）至適作用ｐＨが約６〜８である；及び（４）作用
   至適温度が約３０℃〜５０℃である；を有する寒天分解
   酵素。 ２、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属に属し、寒天分解酵素
   を生産することができる微生物を培養し、寒天分解酵素
   を培地中に生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴
   とする寒天分解酵素の製造法。 ３、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属に属し、寒天分解酵素
   を生産することができる微生物を寒天含有培地中で培養
   することにより寒天分解物を生成せしめ、そして該寒天
   分解物を採取することを特徴とする寒天分解物の製造方
   法。 ４、請求項１に記載の寒天分解酵素を寒天に作用させて
   寒天分解物を生成せしめ、そして該寒天分解物を採取す
   ることを特徴とする寒天分解物の製造方法。 ５、寒天分解酵素を生産することができるビブリオ・エ
   スピー（Ｖｉｂｒｉｏ　ｓｐｐ．）ＳＣＲＣ−Ｂ００７
   である微生物。