JPH0222910B2 - - Google Patents
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Description
本発明はＮ−５メチルテトラヒドロ葉酸濃度決
定方法の改良に関するものである。 葉酸欠乏は人の巨大赤芽球性貧血の共通原因で
ある。葉酸は人体内で代謝されテトラヒドロ葉
酸、ついでＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸とな
る。次に、ビタミンB12の存在下、これはテトラ
ヒドロ葉酸に再変し、炭素１個化合物の伝達体と
して代謝プールに再び入る。漿液、血漿および／
または赤血球中のＮ−５−メチルテトラヒドロ葉
酸量を測定できることは重要である。 血液中の主な葉酸誘導体であるＮ−５−メチル
テトラヒドロ葉酸の濃度測定には、争奪たんぱく
質結合検定が非常によく用いられている。後で詳
細に説明するが、争奪たんぱく質結合検定による
Ｎ−５−メチルテトラヒドロ葉酸の検定では、標
準試薬としてＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸を
利用することが好ましい。しかしながら、Ｎ−５
−メチルテトラヒドロ葉酸は非常に不安定であ
り、適切に保存するためには、窒素雰囲気下凍結
乾燥した状態でアンプル中に密封するような手段
が必要とされる。かかる手段は、検定試薬用具一
式の製造には実際的でない。更に、気密封止して
も再構成後の安定性を伸ばすことはできず、Ｎ−
５−メチルテトラヒドロ葉酸の安定性は４℃で約
３日に過ぎない。 人間におけるビタミンB12と葉酸との関係か
ら、Ｎ−５−メチルテトラヒドロ葉酸水準のみば
かりでなく、ビタミンB12の濃度も決定するため
に、共通多段検定手法を用いる検定法が開発され
た。ビタミンB12／葉酸の同時放射線検定につい
ては米国特許第4146602号明細書の記載を参照の
こと。事実、ビタミンB12および葉酸の欠乏は血
液学的にも、臨床的にも区別できないので、巨大
赤芽球性貧血の病因学を完全に確立するために、
通常漿液中のビタミンB12水準および漿液中なら
びに赤血球中の葉酸水準の決定が必要とされる。 Ｎ−５−メチルテトラヒドロ葉酸の安定化に用
いられる各種保存剤の中で、アスコルビン酸が好
ましい。しかしながら、アスコルビン酸は争奪結
合ビタミンB12分析を邪魔することが分つてい
る。よく知られているように、Ｎ−５−メチルテ
トラヒドロ葉酸が不安定であるので、標準葉酸を
必要とする多くの葉酸検定、特にビタミンB12／
葉酸の同時検定手段を用いる場合、では、標準葉
酸として、親化合物である葉酸が使用されてい
る。しかしながら、この検定法においては、葉酸
がＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸の活性を常に
複製するとは限らない。 本発明の目的の一つは、特別に安定化されたＮ
−５−メチルテトラヒドロ葉酸試薬を用いる改良
された争奪たんぱく質結合検定法を供することで
ある。 また、本発明の他の目的の一つは、Ｎ−５−メ
チルテトラヒドロ葉酸およびビタミンB12の両水
準を同時に決定するための改良された争奪たんぱ
く質結合放射線検定を供することである。 更に、本発明の他の目的の一つは、Ｎ−５−メ
チルテトラヒドロ葉酸水準の決定において、その
精度を改良したことを特徴とする葉酸エステル争
奪たんぱく質結合検定を供することである。 本発明により、患者試料および凍結乾燥したＮ
−５−メチルテトラヒドロ葉酸−葉酸結合たんぱ
く質複合体の復元によるところの少なくとも一つ
の標準試薬を別々に、既知量のラベルした葉酸も
しくは葉酸誘導体と混合して、少なくとも二種類
の個別試験試料とし、当該少なくとも一つの標準
試薬の葉酸結合たんぱく質を分解し、患者試料中
の全ての結合たんぱく質を分解し、既知量の葉酸
結合たんぱく質を好ましくは不活性担体に固定し
た形で各試験試料に加え、各試験試料中の固定化
結合たんぱく質に結合しもしくは結合していない
ラベルした葉酸またはラベルした葉酸誘導体の量
を測定し、ついで患者試料から得られた測定結果
と少なくとも一つの標準試料から得られた測定結
果を比較して患者試料中のＮ−５−メチルテトラ
ヒドロ葉酸濃度の決定ができる。 当該分野で周知のように、好ましくは濃度水準
の異なる複数の既知のＮ−５−メチルテトラヒド
ロ葉酸試薬を患者の未知試料と併行して試験し、
その結果から標準曲線を描き、ついで内挿法によ
り患者試料中のＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸
濃度を決定する。本発明の好ましい具体例では、
ビタミンB12／葉酸同時検定の一部としてＮ−５
−メチルテトラヒドロ葉酸濃度の決定ができる。 本発明の他の好ましい具体例は、放射線ラベル
を用いることである。 更に本発明のもう一つの具体例では、標準試薬
試料中の葉酸結合用たんぱく質ならびに患者試料
中の内因性結合用たんぱく質に、ラベルした葉酸
もしくはラベルした葉酸誘導体を加えた後、当該
たんぱく質が分解する温度で十分な時間試験試料
を加熱して当該たんぱく質を分解する。 また、所望に応じ、ラベルした葉酸またはラベ
ルした葉酸誘導体をこの系に加える前に、結合剤
を分解することもできる。 概説したように、安定性の問題により、争奪た
んぱく質結合検定、特にビタミンB12／葉酸型の
同時検定におけるＮ−５−メチルテトラヒドロ葉
酸の使用が妨げられる。本発明は、Ｎ−５−メチ
ルテトラヒドロ葉酸と葉酸結合たんぱく質との安
定な複合体を用いる、改良された葉酸検定を供す
る。本発明の複合体は、特開昭58−27063号に詳
述されている。 結合たんぱく質は、例えば牛ミルクから精製さ
れる葉酸結合たんぱく質のような、知られている
限りの如何なる葉酸結合たんぱく質も用いること
ができる。複合体はラベルしてないＮ−５−メチ
ルテトラヒドロ葉酸と結合たんぱく質を液体中で
混合し、適切な保温条件で作る。ついで、混合物
を急速冷凍および脱水、好ましくは凍結乾燥して
乾燥粉末とする。 例えば、Ｎ−５−メチルテトラヒドロ葉酸20n
ｇ／mlを含む水溶液に、牛葉酸結合たんぱく質
66.5マイクログラムを加える。ついで、４℃で２
時間保温したのち、凍結乾燥を行う。必要時に
は、凍結乾燥試料に水を加えて再構成する。再構
成物は結合たんぱく質のない物よりも安定性が増
している。 前述の牛ミルクから得られる葉酸結合たんぱく
質の他に、市販されているものや山羊ミルク葉酸
たんぱく質結合剤、各種動物器官（特に腎臓、肝
臓および膵臓）、β−ラクトグロブリン調製もし
くはいるかの漿液から抽出した受容体または結合
剤のような実験的に入手可能な葉酸結合たんぱく
質も用いることができる。 放射線ラベル、酵素ラベル、螢光ラベル等の適
切なラベル化技術で、葉酸もしくは葉酸誘導体を
ラベルすることができる。放射性ヨウ素（例えば
125I）を用いるような、放射性ラベルが好まし
い。葉酸とビタミンB12の同時検定の場合には、
葉酸もしくは葉酸誘導体およびビタミンB12試薬
をそれぞれ異なるものでラベルするのが好都合で
ある。 以下の実施例は、本発明の具体例を示すもの
で、一患者試料中のＮ−５−メチルテトラヒドロ
葉酸濃度およびビタミンB12濃度を同時に分析し
た。しかしながら、かかる実施例は、如何なる態
様においても、本発明を制限するものではない。
例えば、保温時間、試料規模、温度およびその他
の因子を変えることができる。 実施例 検定用に使用した試薬 Ａ 結合たんぱく質 結合たんぱく質（牛ミルクから精製した葉酸
結合たんぱく質および、ビタミンB12用結合た
んぱく質として用いられる精製豚内因子）はガ
ラス粒子に共有結合し、保存剤として0.02％の
アジ化ナトリウムを含む0.03モル、PH7.4のリ
ン酸塩緩衝食塩水（塩化ナトリウム中に0.15モ
ル）に懸濁する。 Ｂ 〔 57Co〕ビタミンB12および〔 125I〕葉酸
混合物 0.001％シアン化カリウム、ピペツト操作を
楽にするためのアマラント赤染料（2μｇ／ml）
および保存剤としての0.2％アジ化ナトリウム
を含む0.1モルホウ酸塩緩衝液PH9.3に〔 57Co〕
ビタミンB12および〔 125I〕葉酸を溶解する。 Ｃ ジチオスレイトール 凍結乾燥した薬びん入りジチオスレイトール Ｄ 標準ビタミンB12／葉酸 人漿液アルブミン１％および保存剤として
0.2％のアジ化ナトリウムを含む0.1モルリン酸
塩緩衝食塩水（PH7.4）中の６種類の濃度のビ
タミンB12ならびにＮ−５−メチルテトラヒド
ロ葉酸で、５倍過剰葉酸結合たんぱく質の存在
下、凍結乾燥したもの。 Ｅ 比較対照ビタミンB12／葉酸 ２種の比較対照ビタミンB12／Ｎ−５−メチ
ルテトラヒドロ葉酸を脱フイブリンした人血漿
から調製し、ついで葉酸結合たんぱく質の存在
下凍結乾燥した。 上記試薬ＤおよびＥの調製において、牛ミルク
から精製した葉酸結合たんぱく質を有す複合体の
形状にあるＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸を葉
酸成分として用いた。 試薬の保存、取扱いおよび再構成条件は熟練臨
床医に知られている。ジチオスレイトールを２
mg／ml水準で試薬Ｂと再構成すると、加熱中に非
固有の結合が起り、かつＮ−５−メチルテトラヒ
ドロ葉酸とビタミンB12の安定性が改良される。
任意的に、この具体例の中でほぼ正確な濃度水準
の比較対照を選ぶと、葉酸欠乏や正常な患者の範
囲およびビタミンB12の正常／異状範囲を概算し
た検定結果を得ることができる。未知試料と同じ
方法で取扱うと、検定の性能を検査することがで
きる。 この特別の実施例において、次に示したように
６種類の標準ビタミンB12／葉酸を選択したが、
当業者はその研究所標準に準じるよう、その数や
濃度を変えることができる。標準濃度はミリリツ
トル当りを示す。 試験管の濃度（ml当り） 標準ビタミンB12／葉酸、 ０／0pｇ／ｎｇ 標準ビタミンB12／葉酸、 100／1.0pｇ／ｎｇ 標準ビタミンB12／葉酸、 250／2.0pｇ／ｎｇ 標準ビタミンB12／葉酸、 500／5.0pｇ／ｎｇ 標準ビタミンB12／葉酸、 1000／10.0pｇ／ｎｇ 標準ビタミンB12／葉酸、 2000／20.0pｇ／ｎｇ 検定方法 全ての実験にパイレツクス（Pyrex：登録商
標）ガラス製または、プロピレン製の試験管を用
いる。実験は、標準、対照および各患者試料につ
いてのものである。この特別な検定例において、
漿液または血漿（EDTA抗凝固薬を加えた）を
使用することができる。赤血球葉酸エステル分析
を行うために、全血溶解産物を調製しアスコルビ
ン酸で安定化することもできる。 １ 試験管を次のようにした：
定方法の改良に関するものである。 葉酸欠乏は人の巨大赤芽球性貧血の共通原因で
ある。葉酸は人体内で代謝されテトラヒドロ葉
酸、ついでＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸とな
る。次に、ビタミンB12の存在下、これはテトラ
ヒドロ葉酸に再変し、炭素１個化合物の伝達体と
して代謝プールに再び入る。漿液、血漿および／
または赤血球中のＮ−５−メチルテトラヒドロ葉
酸量を測定できることは重要である。 血液中の主な葉酸誘導体であるＮ−５−メチル
テトラヒドロ葉酸の濃度測定には、争奪たんぱく
質結合検定が非常によく用いられている。後で詳
細に説明するが、争奪たんぱく質結合検定による
Ｎ−５−メチルテトラヒドロ葉酸の検定では、標
準試薬としてＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸を
利用することが好ましい。しかしながら、Ｎ−５
−メチルテトラヒドロ葉酸は非常に不安定であ
り、適切に保存するためには、窒素雰囲気下凍結
乾燥した状態でアンプル中に密封するような手段
が必要とされる。かかる手段は、検定試薬用具一
式の製造には実際的でない。更に、気密封止して
も再構成後の安定性を伸ばすことはできず、Ｎ−
５−メチルテトラヒドロ葉酸の安定性は４℃で約
３日に過ぎない。 人間におけるビタミンB12と葉酸との関係か
ら、Ｎ−５−メチルテトラヒドロ葉酸水準のみば
かりでなく、ビタミンB12の濃度も決定するため
に、共通多段検定手法を用いる検定法が開発され
た。ビタミンB12／葉酸の同時放射線検定につい
ては米国特許第4146602号明細書の記載を参照の
こと。事実、ビタミンB12および葉酸の欠乏は血
液学的にも、臨床的にも区別できないので、巨大
赤芽球性貧血の病因学を完全に確立するために、
通常漿液中のビタミンB12水準および漿液中なら
びに赤血球中の葉酸水準の決定が必要とされる。 Ｎ−５−メチルテトラヒドロ葉酸の安定化に用
いられる各種保存剤の中で、アスコルビン酸が好
ましい。しかしながら、アスコルビン酸は争奪結
合ビタミンB12分析を邪魔することが分つてい
る。よく知られているように、Ｎ−５−メチルテ
トラヒドロ葉酸が不安定であるので、標準葉酸を
必要とする多くの葉酸検定、特にビタミンB12／
葉酸の同時検定手段を用いる場合、では、標準葉
酸として、親化合物である葉酸が使用されてい
る。しかしながら、この検定法においては、葉酸
がＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸の活性を常に
複製するとは限らない。 本発明の目的の一つは、特別に安定化されたＮ
−５−メチルテトラヒドロ葉酸試薬を用いる改良
された争奪たんぱく質結合検定法を供することで
ある。 また、本発明の他の目的の一つは、Ｎ−５−メ
チルテトラヒドロ葉酸およびビタミンB12の両水
準を同時に決定するための改良された争奪たんぱ
く質結合放射線検定を供することである。 更に、本発明の他の目的の一つは、Ｎ−５−メ
チルテトラヒドロ葉酸水準の決定において、その
精度を改良したことを特徴とする葉酸エステル争
奪たんぱく質結合検定を供することである。 本発明により、患者試料および凍結乾燥したＮ
−５−メチルテトラヒドロ葉酸−葉酸結合たんぱ
く質複合体の復元によるところの少なくとも一つ
の標準試薬を別々に、既知量のラベルした葉酸も
しくは葉酸誘導体と混合して、少なくとも二種類
の個別試験試料とし、当該少なくとも一つの標準
試薬の葉酸結合たんぱく質を分解し、患者試料中
の全ての結合たんぱく質を分解し、既知量の葉酸
結合たんぱく質を好ましくは不活性担体に固定し
た形で各試験試料に加え、各試験試料中の固定化
結合たんぱく質に結合しもしくは結合していない
ラベルした葉酸またはラベルした葉酸誘導体の量
を測定し、ついで患者試料から得られた測定結果
と少なくとも一つの標準試料から得られた測定結
果を比較して患者試料中のＮ−５−メチルテトラ
ヒドロ葉酸濃度の決定ができる。 当該分野で周知のように、好ましくは濃度水準
の異なる複数の既知のＮ−５−メチルテトラヒド
ロ葉酸試薬を患者の未知試料と併行して試験し、
その結果から標準曲線を描き、ついで内挿法によ
り患者試料中のＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸
濃度を決定する。本発明の好ましい具体例では、
ビタミンB12／葉酸同時検定の一部としてＮ−５
−メチルテトラヒドロ葉酸濃度の決定ができる。 本発明の他の好ましい具体例は、放射線ラベル
を用いることである。 更に本発明のもう一つの具体例では、標準試薬
試料中の葉酸結合用たんぱく質ならびに患者試料
中の内因性結合用たんぱく質に、ラベルした葉酸
もしくはラベルした葉酸誘導体を加えた後、当該
たんぱく質が分解する温度で十分な時間試験試料
を加熱して当該たんぱく質を分解する。 また、所望に応じ、ラベルした葉酸またはラベ
ルした葉酸誘導体をこの系に加える前に、結合剤
を分解することもできる。 概説したように、安定性の問題により、争奪た
んぱく質結合検定、特にビタミンB12／葉酸型の
同時検定におけるＮ−５−メチルテトラヒドロ葉
酸の使用が妨げられる。本発明は、Ｎ−５−メチ
ルテトラヒドロ葉酸と葉酸結合たんぱく質との安
定な複合体を用いる、改良された葉酸検定を供す
る。本発明の複合体は、特開昭58−27063号に詳
述されている。 結合たんぱく質は、例えば牛ミルクから精製さ
れる葉酸結合たんぱく質のような、知られている
限りの如何なる葉酸結合たんぱく質も用いること
ができる。複合体はラベルしてないＮ−５−メチ
ルテトラヒドロ葉酸と結合たんぱく質を液体中で
混合し、適切な保温条件で作る。ついで、混合物
を急速冷凍および脱水、好ましくは凍結乾燥して
乾燥粉末とする。 例えば、Ｎ−５−メチルテトラヒドロ葉酸20n
ｇ／mlを含む水溶液に、牛葉酸結合たんぱく質
66.5マイクログラムを加える。ついで、４℃で２
時間保温したのち、凍結乾燥を行う。必要時に
は、凍結乾燥試料に水を加えて再構成する。再構
成物は結合たんぱく質のない物よりも安定性が増
している。 前述の牛ミルクから得られる葉酸結合たんぱく
質の他に、市販されているものや山羊ミルク葉酸
たんぱく質結合剤、各種動物器官（特に腎臓、肝
臓および膵臓）、β−ラクトグロブリン調製もし
くはいるかの漿液から抽出した受容体または結合
剤のような実験的に入手可能な葉酸結合たんぱく
質も用いることができる。 放射線ラベル、酵素ラベル、螢光ラベル等の適
切なラベル化技術で、葉酸もしくは葉酸誘導体を
ラベルすることができる。放射性ヨウ素（例えば
125I）を用いるような、放射性ラベルが好まし
い。葉酸とビタミンB12の同時検定の場合には、
葉酸もしくは葉酸誘導体およびビタミンB12試薬
をそれぞれ異なるものでラベルするのが好都合で
ある。 以下の実施例は、本発明の具体例を示すもの
で、一患者試料中のＮ−５−メチルテトラヒドロ
葉酸濃度およびビタミンB12濃度を同時に分析し
た。しかしながら、かかる実施例は、如何なる態
様においても、本発明を制限するものではない。
例えば、保温時間、試料規模、温度およびその他
の因子を変えることができる。 実施例 検定用に使用した試薬 Ａ 結合たんぱく質 結合たんぱく質（牛ミルクから精製した葉酸
結合たんぱく質および、ビタミンB12用結合た
んぱく質として用いられる精製豚内因子）はガ
ラス粒子に共有結合し、保存剤として0.02％の
アジ化ナトリウムを含む0.03モル、PH7.4のリ
ン酸塩緩衝食塩水（塩化ナトリウム中に0.15モ
ル）に懸濁する。 Ｂ 〔 57Co〕ビタミンB12および〔 125I〕葉酸
混合物 0.001％シアン化カリウム、ピペツト操作を
楽にするためのアマラント赤染料（2μｇ／ml）
および保存剤としての0.2％アジ化ナトリウム
を含む0.1モルホウ酸塩緩衝液PH9.3に〔 57Co〕
ビタミンB12および〔 125I〕葉酸を溶解する。 Ｃ ジチオスレイトール 凍結乾燥した薬びん入りジチオスレイトール Ｄ 標準ビタミンB12／葉酸 人漿液アルブミン１％および保存剤として
0.2％のアジ化ナトリウムを含む0.1モルリン酸
塩緩衝食塩水（PH7.4）中の６種類の濃度のビ
タミンB12ならびにＮ−５−メチルテトラヒド
ロ葉酸で、５倍過剰葉酸結合たんぱく質の存在
下、凍結乾燥したもの。 Ｅ 比較対照ビタミンB12／葉酸 ２種の比較対照ビタミンB12／Ｎ−５−メチ
ルテトラヒドロ葉酸を脱フイブリンした人血漿
から調製し、ついで葉酸結合たんぱく質の存在
下凍結乾燥した。 上記試薬ＤおよびＥの調製において、牛ミルク
から精製した葉酸結合たんぱく質を有す複合体の
形状にあるＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸を葉
酸成分として用いた。 試薬の保存、取扱いおよび再構成条件は熟練臨
床医に知られている。ジチオスレイトールを２
mg／ml水準で試薬Ｂと再構成すると、加熱中に非
固有の結合が起り、かつＮ−５−メチルテトラヒ
ドロ葉酸とビタミンB12の安定性が改良される。
任意的に、この具体例の中でほぼ正確な濃度水準
の比較対照を選ぶと、葉酸欠乏や正常な患者の範
囲およびビタミンB12の正常／異状範囲を概算し
た検定結果を得ることができる。未知試料と同じ
方法で取扱うと、検定の性能を検査することがで
きる。 この特別の実施例において、次に示したように
６種類の標準ビタミンB12／葉酸を選択したが、
当業者はその研究所標準に準じるよう、その数や
濃度を変えることができる。標準濃度はミリリツ
トル当りを示す。 試験管の濃度（ml当り） 標準ビタミンB12／葉酸、 ０／0pｇ／ｎｇ 標準ビタミンB12／葉酸、 100／1.0pｇ／ｎｇ 標準ビタミンB12／葉酸、 250／2.0pｇ／ｎｇ 標準ビタミンB12／葉酸、 500／5.0pｇ／ｎｇ 標準ビタミンB12／葉酸、 1000／10.0pｇ／ｎｇ 標準ビタミンB12／葉酸、 2000／20.0pｇ／ｎｇ 検定方法 全ての実験にパイレツクス（Pyrex：登録商
標）ガラス製または、プロピレン製の試験管を用
いる。実験は、標準、対照および各患者試料につ
いてのものである。この特別な検定例において、
漿液または血漿（EDTA抗凝固薬を加えた）を
使用することができる。赤血球葉酸エステル分析
を行うために、全血溶解産物を調製しアスコルビ
ン酸で安定化することもできる。 １ 試験管を次のようにした：
【表】
【表】
２ 適切な標準、対照または試料100μを試験
管に入れる。 ３ 試薬Ｂ（放射性トレーサービタミンB12／葉
酸）1.0mlを各試験管に加える。 ４ 充分に混合する。 ５ 15分間沸騰水中に温置したのち、15分間室温
に置く。 これで、Ｎ−５メチルテトラヒドロ葉酸複合
体を生成するために使用された葉酸結合たんぱ
く質を分解する、と同時に生物学的試料中の内
因性葉酸結合たんぱく質も分解させる。 ６ 試薬Ａ（葉酸／ビタミンB12結合たんぱく質）
0.6mlを各試験管に加える。 ７ 充分に混合する。 ８ 室温にて１時間放置する。 少なくとも、この工程中において試験管を光
に当てないようにするのが好ましい。 ９ 全ての試験管を遠心分離にかける。 10 全ての試験管をデカンテーシヨンする。 11 全ての試験管について、 57Coおよび 125Iを
同時に、または別々に計算できるガンマ線計数
器で計数する。 本実施例では、沈澱（ペレツト）の方を計数し
たが、計数を変えたり、標準曲線を作つて上澄液
の方を計数することもできる。更に、結合たんぱ
く質試薬Ａを有機ポリマー、無機粒子等のよう
な、他の担体に固定化することができる。結合た
んぱく質と担体の結合には、担体への直接接合か
当該分野で知られている穴埋め部分（Spacer
moiety）を介する結合で、共有結合が好ましい
が、イオン結合やフアンデルワールス力等を用い
た化学的または物理的結合方法も適用できる。本
検定においては、当該分野で周知である多孔質ガ
ラス粒子にシランカツプリング剤やグルタルアル
デヒドを介して、結合たんぱく質を共有結合させ
ている（米国特許第3669841参照）。 患者試料中の未知水準の決定は、当業者に知ら
れている一連のデータ約分計算方式のいずれを使
つてもできる。例えば、標準、対照および未知の
ラベルされたビタミンB12およびラベルされた葉
酸の相対的結合パーセントは次式を用いて計算で
きる。 相対的結合パーセント＝ 試料の毎分当りの平均計数／標準０／０の毎分当り
の平均計数 従つて、半対数（３サイクル）図表、即ち、一
軸線上に相対的結合パーセントおよび対数線上に
標準濃度をプロツトして、標準曲線が得られる。
内挿により、未知ならびに検査用としての対照の
ビタミンB12および葉酸の水準が分る。 当業者に知られているように、同様にして、赤
血球溶解産物中の葉酸濃度も決定できる。 試料中のＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸濃度
の定量には、標準曲線を作るために十分異なる濃
度の標準を少なくとも２種類必要とすることは、
当業者に周知である。この方法を上の例で用いて
いる。しかしながら、試料中のＮ−５−メチルテ
トラヒドロ葉酸濃度がある値以上か以下かだけを
知りたい場合には、１種類の標準の使用でよいこ
とは、当業者に明らかである。 上述した葉酸および／またはビタミンB12／葉
酸検定で使用されるもので、当業者によく知られ
ている特定の因子、例えば、検定が通常PH9.2付
近で行われる、といつた因子については、本明細
書では説明していない。本発明は、固定化結合た
んぱく質およびＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸
複合体を使用することで、従来の葉酸および葉
酸／ビタミンB12の争奪たんぱく質結合検定を大
巾に改良することである。従つて、従来技術で使
用されていた因子、条件、試薬等は本発明の主要
点を構成するものでないので、本明細書では全く
説明していないか、もしくはその詳細について説
明していない。
管に入れる。 ３ 試薬Ｂ（放射性トレーサービタミンB12／葉
酸）1.0mlを各試験管に加える。 ４ 充分に混合する。 ５ 15分間沸騰水中に温置したのち、15分間室温
に置く。 これで、Ｎ−５メチルテトラヒドロ葉酸複合
体を生成するために使用された葉酸結合たんぱ
く質を分解する、と同時に生物学的試料中の内
因性葉酸結合たんぱく質も分解させる。 ６ 試薬Ａ（葉酸／ビタミンB12結合たんぱく質）
0.6mlを各試験管に加える。 ７ 充分に混合する。 ８ 室温にて１時間放置する。 少なくとも、この工程中において試験管を光
に当てないようにするのが好ましい。 ９ 全ての試験管を遠心分離にかける。 10 全ての試験管をデカンテーシヨンする。 11 全ての試験管について、 57Coおよび 125Iを
同時に、または別々に計算できるガンマ線計数
器で計数する。 本実施例では、沈澱（ペレツト）の方を計数し
たが、計数を変えたり、標準曲線を作つて上澄液
の方を計数することもできる。更に、結合たんぱ
く質試薬Ａを有機ポリマー、無機粒子等のよう
な、他の担体に固定化することができる。結合た
んぱく質と担体の結合には、担体への直接接合か
当該分野で知られている穴埋め部分（Spacer
moiety）を介する結合で、共有結合が好ましい
が、イオン結合やフアンデルワールス力等を用い
た化学的または物理的結合方法も適用できる。本
検定においては、当該分野で周知である多孔質ガ
ラス粒子にシランカツプリング剤やグルタルアル
デヒドを介して、結合たんぱく質を共有結合させ
ている（米国特許第3669841参照）。 患者試料中の未知水準の決定は、当業者に知ら
れている一連のデータ約分計算方式のいずれを使
つてもできる。例えば、標準、対照および未知の
ラベルされたビタミンB12およびラベルされた葉
酸の相対的結合パーセントは次式を用いて計算で
きる。 相対的結合パーセント＝ 試料の毎分当りの平均計数／標準０／０の毎分当り
の平均計数 従つて、半対数（３サイクル）図表、即ち、一
軸線上に相対的結合パーセントおよび対数線上に
標準濃度をプロツトして、標準曲線が得られる。
内挿により、未知ならびに検査用としての対照の
ビタミンB12および葉酸の水準が分る。 当業者に知られているように、同様にして、赤
血球溶解産物中の葉酸濃度も決定できる。 試料中のＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸濃度
の定量には、標準曲線を作るために十分異なる濃
度の標準を少なくとも２種類必要とすることは、
当業者に周知である。この方法を上の例で用いて
いる。しかしながら、試料中のＮ−５−メチルテ
トラヒドロ葉酸濃度がある値以上か以下かだけを
知りたい場合には、１種類の標準の使用でよいこ
とは、当業者に明らかである。 上述した葉酸および／またはビタミンB12／葉
酸検定で使用されるもので、当業者によく知られ
ている特定の因子、例えば、検定が通常PH9.2付
近で行われる、といつた因子については、本明細
書では説明していない。本発明は、固定化結合た
んぱく質およびＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸
複合体を使用することで、従来の葉酸および葉
酸／ビタミンB12の争奪たんぱく質結合検定を大
巾に改良することである。従つて、従来技術で使
用されていた因子、条件、試薬等は本発明の主要
点を構成するものでないので、本明細書では全く
説明していないか、もしくはその詳細について説
明していない。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ Ｎ−５−メチルテトラヒドロ葉酸濃度が未知
である生物学的試料中のＮ−５−メチルテトラヒ
ドロ葉酸濃度を決定する方法であつて、 (a) 水を基質とする媒体中においてＮ−５−メチ
ルテトラヒドロ葉酸を葉酸結合たんぱく質と複
合化し、該媒体を凍結乾燥し、凍結乾燥された
複合体を復元する工程、 (b) 前記生物学的試料および前記工程(a)で凍結乾
燥され、復元された複合体を別々に既知量のラ
ベルした葉酸もしくは葉酸誘導体と混合し、少
なくとも２つの異なつた試験試料を得る工程、 (c) 前記凍結乾燥され、復元された複合体の葉酸
結合たんぱく質を分解し、前記生物学的試料中
に存在する全ての結合たんぱく質を分解する工
程、 (d) 既知量の葉酸結合たんぱく質を前記試験試料
の各々に添加する工程、 (e) 前記試験試料の各々に添加した葉酸結合たん
ぱく質に結合した、もしくは結合していないラ
ベルした葉酸もしくは葉酸誘導体の量を測定す
る工程、および (f) この測定結果から前記生物学的試料中のＮ−
５−メチルテトラヒドロ葉酸濃度を決定する工
程からなる方法。 ２ 前記試験試料の各々に添加される既知量の葉
酸結合たんぱく質が不活性担体上に固定化されて
いるものであることを特徴とする特許請求の範囲
第１項記載の方法。 ３ 各々異なる濃度のＮ−５−メチルテトラヒド
ロ葉酸を含有し、該Ｎ−５−メチルテトラヒドロ
葉酸は葉酸結合たんぱく質に複合化している複数
の凍結乾燥され、復元されたＮ−５−メチルテト
ラヒドロ葉酸試薬を前記生物学的試料と並行して
試験し、ついで、これらの試薬の試験結果から標
準曲線を作成し、この標準曲線と前記生物学的試
料の試験結果を比較することによつて前記生物学
的試料中のＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸濃度
を決定することを特徴とする特許請求の範囲第１
項記載の方法。 ４ 前記ラベルが放射性であることを特徴とする
特許請求の範囲第１項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/288,477 US4399228A (en) | 1981-07-30 | 1981-07-30 | Polate competitive protein binding assay |
| US288477 | 1981-07-30 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5827064A JPS5827064A (ja) | 1983-02-17 |
| JPH0222910B2 true JPH0222910B2 (ja) | 1990-05-22 |
Family
ID=23107272
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57132915A Granted JPS5827064A (ja) | 1981-07-30 | 1982-07-29 | Ｎ―５―メチルテトラヒドロ葉酸濃度決定方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4399228A (ja) |
| JP (1) | JPS5827064A (ja) |
| DE (1) | DE3227911A1 (ja) |
| FR (1) | FR2510760B1 (ja) |
| GB (1) | GB2103363B (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1335707C (en) * | 1989-08-15 | 1995-05-30 | Pyare Khanna | Drug screening assay |
| US5434087A (en) * | 1993-02-24 | 1995-07-18 | Abbott Laboratories | Folate immunoassay utilizing folate binding protein in a multiclonal antibody format |
| EP1558286A4 (en) * | 2002-11-08 | 2006-12-13 | Sheldon P Rothenberg | METHOD OF DETECTING AUTOANTIBODIES AGAINST FOLATE RECEPTORS |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3989812A (en) * | 1974-08-09 | 1976-11-02 | Smithkline Instruments, Inc. | Folic acid derivatives and use in radio-assay |
| US4336185A (en) * | 1976-03-02 | 1982-06-22 | Rohm And Haas Company | Folic acid derivatives |
| US4146602A (en) * | 1977-01-27 | 1979-03-27 | Becton, Dickinson & Company | Simultaneous radioassay of folate and vitamin B12 |
| DE2803154C2 (de) * | 1977-01-27 | 1986-07-24 | Becton, Dickinson and Co., Paramus, N.J. | Gleichzeitige Radiountersuchung von Folat und Vitamin B 12 |
| US4136159A (en) * | 1977-02-28 | 1979-01-23 | New England Nuclear Corporation | Radioassay of folates |
| US4279859A (en) * | 1977-07-21 | 1981-07-21 | Becton Dickinson & Company | Simultaneous radioassay of folate and vitamin B12 |
| US4350659A (en) * | 1981-07-30 | 1982-09-21 | Corning Glass Works | Stabilization of sensitive biologically active intermediate metabolites such as folic acid derivatives |
-
1981
- 1981-07-30 US US06/288,477 patent/US4399228A/en not_active Expired - Lifetime
-
1982
- 1982-07-27 DE DE19823227911 patent/DE3227911A1/de active Granted
- 1982-07-28 GB GB08221768A patent/GB2103363B/en not_active Expired
- 1982-07-29 JP JP57132915A patent/JPS5827064A/ja active Granted
- 1982-07-29 FR FR8213244A patent/FR2510760B1/fr not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3227911C2 (ja) | 1992-01-16 |
| GB2103363B (en) | 1985-01-03 |
| FR2510760A1 (fr) | 1983-02-04 |
| FR2510760B1 (fr) | 1986-05-16 |
| GB2103363A (en) | 1983-02-16 |
| JPS5827064A (ja) | 1983-02-17 |
| DE3227911A1 (de) | 1983-02-17 |
| US4399228A (en) | 1983-08-16 |
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