JPS5827064A - Ｎ―５―メチルテトラヒドロ葉酸濃度決定方法 - Google Patents
Ｎ―５―メチルテトラヒドロ葉酸濃度決定方法Info
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- JPS5827064A JPS5827064A JP57132915A JP13291582A JPS5827064A JP S5827064 A JPS5827064 A JP S5827064A JP 57132915 A JP57132915 A JP 57132915A JP 13291582 A JP13291582 A JP 13291582A JP S5827064 A JPS5827064 A JP S5827064A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
検定方法の改良に関．するものである。
葉酸エステルの欠乏は人の巨大赤芽球性貧血の共通原因
である。葉酸は人体内で代謝されテトラヒドロ葉酸、つ
いでＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸となる。次に、ビ
タミンＢＩ２の存在下、これはテトラヒドロ葉酸に再変
し、炭素１個化合物の伝達体として代謝プールに再び入
る。漿液、血漿および／または赤血球中のＮ−５−メチ
ルテトラヒドロ葉酸量を測定できることは重要である。
である。葉酸は人体内で代謝されテトラヒドロ葉酸、つ
いでＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸となる。次に、ビ
タミンＢＩ２の存在下、これはテトラヒドロ葉酸に再変
し、炭素１個化合物の伝達体として代謝プールに再び入
る。漿液、血漿および／または赤血球中のＮ−５−メチ
ルテトラヒドロ葉酸量を測定できることは重要である。
血液中の主な葉酸エステル誘導体であるＮ一５−メチル
テトラヒドロ葉酸の濃度測定には、争奪たんばく質結合
検定が非常によく用いられている。後で詳細に説明する
が、争奪たんばく質結合検定によるＮ−５−メチルテト
ラヒドロ葉酸の検定では、標準試薬としてのＮ−５−メ
チルテトラヒドロ葉酸を利用することが好ましい。しか
しながら、Ｎ−５−メチルテトラヒドロ葉酸は非常に不
安定であり、適切に保存するためには、窒素ｌ囲気上凍
結乾燥した状態でアンプル中に密封するような手段が必
要とされる。かかる手段は、検定試薬用具一式の製造に
は実際的でない。更に、気密封止しても再構成後の安定
性を伸ばすことはできず、Ｎ−５−メチルテトラヒドロ
葉酸の安定性は４℃で約３日に過ぎない。
テトラヒドロ葉酸の濃度測定には、争奪たんばく質結合
検定が非常によく用いられている。後で詳細に説明する
が、争奪たんばく質結合検定によるＮ−５−メチルテト
ラヒドロ葉酸の検定では、標準試薬としてのＮ−５−メ
チルテトラヒドロ葉酸を利用することが好ましい。しか
しながら、Ｎ−５−メチルテトラヒドロ葉酸は非常に不
安定であり、適切に保存するためには、窒素ｌ囲気上凍
結乾燥した状態でアンプル中に密封するような手段が必
要とされる。かかる手段は、検定試薬用具一式の製造に
は実際的でない。更に、気密封止しても再構成後の安定
性を伸ばすことはできず、Ｎ−５−メチルテトラヒドロ
葉酸の安定性は４℃で約３日に過ぎない。
人間におけるビタミンＢ１２と葉酸との関係から、Ｎ−
５−メチルテトラヒドロ葉酸水準のみばかりでなく、ビ
タミンＢ１２の濃度も決定するために、共通多段検定手
法を用いる検定法が開発された。ビタミンＢ１２／葉酸
エステルの同時放射線検定について説明している米国議
定誉４，１４６，６０２号を参照のこと。事実、ビタミ
ン８１２および葉酸エステルの欠乏は血液学的にも、臨
床的にも区別できないので、巨大赤芽球性貧血の病因学
を完全に確立するために、通常漿液中のビタミン８１２
水準および漿液中ならびに赤血球中の葉酸エステル水Ｎ
−５−メチルテトラヒドロ葉酸の安定化に用いられる各
種保存剤の中で、アスコルビン酸が好ましい。しかしな
がら、アスコルビン酸は争奪結合ビタミンＢｌ ２分析
を邪魔することが分っている。よく知られているように
、Ｎ−５−メチルテトラヒドロ葉酸が不安定であるので
、標準葉酸エステルを必要とする多くの葉酸エステル検
定、特にビタミｙＢ＋ｚ／葉酸エステルの同時検定手段
を用いる場合、では、標準葉酸エステルとして、親化合
物である葉酸が使用されている。しかしながら、この検
定法においては、葉酸がＮ−５−メチルテトラヒドロ葉
酸の活性を常に複製するとは限らない。
５−メチルテトラヒドロ葉酸水準のみばかりでなく、ビ
タミンＢ１２の濃度も決定するために、共通多段検定手
法を用いる検定法が開発された。ビタミンＢ１２／葉酸
エステルの同時放射線検定について説明している米国議
定誉４，１４６，６０２号を参照のこと。事実、ビタミ
ン８１２および葉酸エステルの欠乏は血液学的にも、臨
床的にも区別できないので、巨大赤芽球性貧血の病因学
を完全に確立するために、通常漿液中のビタミン８１２
水準および漿液中ならびに赤血球中の葉酸エステル水Ｎ
−５−メチルテトラヒドロ葉酸の安定化に用いられる各
種保存剤の中で、アスコルビン酸が好ましい。しかしな
がら、アスコルビン酸は争奪結合ビタミンＢｌ ２分析
を邪魔することが分っている。よく知られているように
、Ｎ−５−メチルテトラヒドロ葉酸が不安定であるので
、標準葉酸エステルを必要とする多くの葉酸エステル検
定、特にビタミｙＢ＋ｚ／葉酸エステルの同時検定手段
を用いる場合、では、標準葉酸エステルとして、親化合
物である葉酸が使用されている。しかしながら、この検
定法においては、葉酸がＮ−５−メチルテトラヒドロ葉
酸の活性を常に複製するとは限らない。
本発明の目的の一つは、特別に安定化されたＮ−５−メ
チルテトラヒドロ葉酸試薬を用いる改良された争奪たん
ばく質結合検定法を供することである。
チルテトラヒドロ葉酸試薬を用いる改良された争奪たん
ばく質結合検定法を供することである。
また、本発明の他の目的の一つは、Ｎ−５−メチルテト
ラヒドロ葉酸およびビタミンＢ１２の両水準を同時に決
定するための改良された争奪たんばく質結合放射線検定
を供することである。
ラヒドロ葉酸およびビタミンＢ１２の両水準を同時に決
定するための改良された争奪たんばく質結合放射線検定
を供することである。
更に、本発明の他の目的の一つは、Ｎ−５−メチルテト
ラヒドロ葉酸水準の決定において、その精度を改良した
ことを特徴とする葉酸エステル争奪たんばく質結合検定
を供することである。
ラヒドロ葉酸水準の決定において、その精度を改良した
ことを特徴とする葉酸エステル争奪たんばく質結合検定
を供することである。
本発明により、患者試料および凍結乾燥したＮ−５−メ
チルテトラヒドロ葉酸−葉酸エステル結合たんばく買被
合体の再構成によるところの少なくとも一つの標準試薬
を別々に、既知蓋のラベルした葉酸もしくは葉酸誘導体
と混合して、少なくとも二種類の個別試験試料とし、当
該少なくとも一つの標準試薬の葉酸エステル結合たんば
く質を分解し、患者試料中の全ての結合たんばく質を分
解し、既知量の葉酸結合たんばく質を好ましくは不活性
担体に固定した形で各試験試料に加え、各試験試料中の
固定化結合たんばく質に結合しもしくは結合していない
ラベルした葉酸またはラベルした葉酸誘導体の量を測定
し、ついで患者試料から得られた測定結果と少なくとも
一つの標準試料から得られた測定結果を比較して患者試
料中のＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸濃度の決定がで
きる。
チルテトラヒドロ葉酸−葉酸エステル結合たんばく買被
合体の再構成によるところの少なくとも一つの標準試薬
を別々に、既知蓋のラベルした葉酸もしくは葉酸誘導体
と混合して、少なくとも二種類の個別試験試料とし、当
該少なくとも一つの標準試薬の葉酸エステル結合たんば
く質を分解し、患者試料中の全ての結合たんばく質を分
解し、既知量の葉酸結合たんばく質を好ましくは不活性
担体に固定した形で各試験試料に加え、各試験試料中の
固定化結合たんばく質に結合しもしくは結合していない
ラベルした葉酸またはラベルした葉酸誘導体の量を測定
し、ついで患者試料から得られた測定結果と少なくとも
一つの標準試料から得られた測定結果を比較して患者試
料中のＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸濃度の決定がで
きる。
当該分野で周知のように、好ましくは濃度水準の異なる
複数の既知のＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸試薬を患
者の、未知試料と併行して試験し、その結果から標準曲
線を描き、ついで内挿法により患者試料中のＮ−５−メ
チルテトラヒドロ葉酸濃度を決定する。本発明の好まし
い具体例では、ビタミンＢ１２／葉酸エステル同時検定
の一部としてＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸濃度の決
定ができる。
複数の既知のＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸試薬を患
者の、未知試料と併行して試験し、その結果から標準曲
線を描き、ついで内挿法により患者試料中のＮ−５−メ
チルテトラヒドロ葉酸濃度を決定する。本発明の好まし
い具体例では、ビタミンＢ１２／葉酸エステル同時検定
の一部としてＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸濃度の決
定ができる。
本発明の他の好ましい具体例は、放射線ラベルを用いる
ことである。
ことである。
更に本発明のもう一つの具体例では、標準試薬試料中の
葉酸エステル結合用たんばく質ならびに患者試料中の内
因性結合用たんばく質に、ラベルした葉酸もしくはラベ
ルした葉酸誘導体を加えた後、当該たんばく質が分解す
る温度で十分な時間試験試料を加熱して当該たんばく質
を分解する。
葉酸エステル結合用たんばく質ならびに患者試料中の内
因性結合用たんばく質に、ラベルした葉酸もしくはラベ
ルした葉酸誘導体を加えた後、当該たんばく質が分解す
る温度で十分な時間試験試料を加熱して当該たんばく質
を分解する。
また、所望に応じ、ラベルした薄酸またはラベルした葉
酸誘導体をこの系に加える前に、結合剤を分解すること
もできる。
酸誘導体をこの系に加える前に、結合剤を分解すること
もできる。
概説したように、安定性の問題により、争奪たんばく質
結合検定、特にビタミンＢ１２／葉酸エステル型の同時
検定におけるＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸の使用が
、妨げられる。
結合検定、特にビタミンＢ１２／葉酸エステル型の同時
検定におけるＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸の使用が
、妨げられる。
本発明は、Ｎ−５−メチルテトラヒドロ葉酸と葉酸エス
テル結合たんばく質との安定な複合体を用いる、改良さ
れた葉酸エステル検定を供する。本発明の複合体は、本
出願人の同口特許出願（特許願（１） ） （米国特許
出願番号２８８．４６３ ）に詳述されている。
テル結合たんばく質との安定な複合体を用いる、改良さ
れた葉酸エステル検定を供する。本発明の複合体は、本
出願人の同口特許出願（特許願（１） ） （米国特許
出願番号２８８．４６３ ）に詳述されている。
結合たんばく質は、例えば牛ミルクから精製される葉酸
エステル結合たんばく質のよう層結合たんば（質も用い
ることができる。複合体はラベルしてないＮ−５−メチ
ルテトラヒドロ葉酸と結合たんばく質を液体中で混合し
、適切な保温条件で作る。ついで、混合物を急速冷凍お
よび脱水、好ましくは凍結乾燥して乾燥粉末とする。
エステル結合たんばく質のよう層結合たんば（質も用い
ることができる。複合体はラベルしてないＮ−５−メチ
ルテトラヒドロ葉酸と結合たんばく質を液体中で混合し
、適切な保温条件で作る。ついで、混合物を急速冷凍お
よび脱水、好ましくは凍結乾燥して乾燥粉末とする。
例えば、Ｎ−５−メチルテトラヒドロ葉酸２０ ｎ９
／ ｍｌを含む水溶液に、牛葉酸エステル結合たんばく
質６６．５マイクログラムヲ加エル。ツイテ、４℃で２
時間保温したのち、凍結乾燥を行う。必要時には、凍結
乾燥試料に水を加えて再構成する。再構成物は結合たん
ばく質のない物よりも安定性が増している。
／ ｍｌを含む水溶液に、牛葉酸エステル結合たんばく
質６６．５マイクログラムヲ加エル。ツイテ、４℃で２
時間保温したのち、凍結乾燥を行う。必要時には、凍結
乾燥試料に水を加えて再構成する。再構成物は結合たん
ばく質のない物よりも安定性が増している。
前述の牛ミルクから得られる葉酸エステル結合たんばく
質の他に、市販されているものや山羊ミルク葉酸エステ
ルたんばく質結合剤、各種動物器官（特に腎臓、肝臓お
よび膵臓）、β−ラクトグロブリン調製もしくはいるか
の漿液から抽出した受容体または結合剤のような実験的
に入手可能な葉酸エステル結合たんばく質も用いること
ができる。
質の他に、市販されているものや山羊ミルク葉酸エステ
ルたんばく質結合剤、各種動物器官（特に腎臓、肝臓お
よび膵臓）、β−ラクトグロブリン調製もしくはいるか
の漿液から抽出した受容体または結合剤のような実験的
に入手可能な葉酸エステル結合たんばく質も用いること
ができる。
放射線ラベル、酵素ラベル、螢光ラベル等の適切なラベ
ル化技術で、葉酸もしくは葉酸誘導体をラベルすること
ができる。放射性ヨウ素（例えば１２５■＞を用いるよ
うな、放射線ラベルが好ましい。葉酸エステルとビタミ
ンＢｌｚの同時検定の場合には、葉酸もしくは葉酸誘導
体およびビタミンＢ１２試薬をそれぞれ異なるものでラ
ベルするのが好都合である。
ル化技術で、葉酸もしくは葉酸誘導体をラベルすること
ができる。放射性ヨウ素（例えば１２５■＞を用いるよ
うな、放射線ラベルが好ましい。葉酸エステルとビタミ
ンＢｌｚの同時検定の場合には、葉酸もしくは葉酸誘導
体およびビタミンＢ１２試薬をそれぞれ異なるものでラ
ベルするのが好都合である。
以下の実施例は、本発明の具体例を示すもので、−患者
試料中のＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸濃度およびビ
タミンＢＩ２濃度を同時に分析した。しかしながら、か
かる実施例は、如何なる態様においても、本発明を制限
するものではない。例えば、保温時間、試料規模、温度
およびその他の因子を変えることができる。
試料中のＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸濃度およびビ
タミンＢＩ２濃度を同時に分析した。しかしながら、か
かる実施例は、如何なる態様においても、本発明を制限
するものではない。例えば、保温時間、試料規模、温度
およびその他の因子を変えることができる。
実施例
Ａ、結合たんばく質
結合たんぼ（質（牛ミルクから精製した葉酸エステル結
合たんばく質で、ビタミンＢ１２用結合たんばく質とし
ては精製豚内因子）はガラス粒子に共有結合し、保存剤
として０．０２％のアジ化ナトリウムを含む０．０３モ
ル、ｐＨ７，４のリン酸塩緩衝食塩水（塩化ナトリウム
中に０．１５モル）に懸濁する。
合たんばく質で、ビタミンＢ１２用結合たんばく質とし
ては精製豚内因子）はガラス粒子に共有結合し、保存剤
として０．０２％のアジ化ナトリウムを含む０．０３モ
ル、ｐＨ７，４のリン酸塩緩衝食塩水（塩化ナトリウム
中に０．１５モル）に懸濁する。
０．００１ ％シアン化カリウム、ピペット操作を楽に
するためのアマラント赤染料（２μＩ／ｍｌ）および保
存剤としての０．２％アジ化ナトリウムを含む０．１モ
ルホウ酸塩緩衝液ｐＨｇ、３に（ｌｌ？ｃｏ）ビタミン
Ｂ１２および（１！５１ 〕葉酸エステルを溶解する。
するためのアマラント赤染料（２μＩ／ｍｌ）および保
存剤としての０．２％アジ化ナトリウムを含む０．１モ
ルホウ酸塩緩衝液ｐＨｇ、３に（ｌｌ？ｃｏ）ビタミン
Ｂ１２および（１！５１ 〕葉酸エステルを溶解する。
凍結乾燥した薬びん入りジチオスレイトール
人漿液アルブミン１チおよび保存剤として０．２％のア
ジ化ナトリウムを含む０．１モルリン酸塩緩衝食塩水（
ｐＨ７，４）中の６種類の濃度のビタミンＢ１２ならび
にＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸で、５倍過剰葉酸エ
ステル結合たんぽ（質の存在下、凍結乾燥したもの。
ジ化ナトリウムを含む０．１モルリン酸塩緩衝食塩水（
ｐＨ７，４）中の６種類の濃度のビタミンＢ１２ならび
にＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸で、５倍過剰葉酸エ
ステル結合たんぽ（質の存在下、凍結乾燥したもの。
２棟の比較対照ビタミンＢ１２／Ｎ−５−メチルテトラ
ヒドロ葉酸を脱フィブリンした人血漿から調製し、つい
で葉酸エステル結合たんばく質の存在下凍結乾燥した。
ヒドロ葉酸を脱フィブリンした人血漿から調製し、つい
で葉酸エステル結合たんばく質の存在下凍結乾燥した。
上記試薬りおよびＥの調製において、牛ミルクから精製
した葉酸エステル結合を有す複合体のＮ−５−メチルテ
トラヒドロ葉酸な葉酸エステル成分として用いた。
した葉酸エステル結合を有す複合体のＮ−５−メチルテ
トラヒドロ葉酸な葉酸エステル成分として用いた。
試薬の保存、取扱いおよび再構成条件は熟練臨床医に知
られている。ジチオスレイトールを２ ｍ ｇ ／ ｍ
ｌＪ水準で試薬Ｂと再構成すると、加熱中に非固有の結
合が起り、かつＮ ＝５−メチルテトラヒドロ葉酸とビ
タミンＢＩ２の安定性が改良される。任意的に、この具
体例の中でほぼ正確な濃度水準の比較対照を選ぶと、葉
酸欠乏や正常な患者の範囲およびビタミンＢ１２の正常
／異状範囲を概算した検定結果を得ることができる。未
知試料と同じ方法で取扱うと、検定の性能を検査するこ
とができる。
られている。ジチオスレイトールを２ ｍ ｇ ／ ｍ
ｌＪ水準で試薬Ｂと再構成すると、加熱中に非固有の結
合が起り、かつＮ ＝５−メチルテトラヒドロ葉酸とビ
タミンＢＩ２の安定性が改良される。任意的に、この具
体例の中でほぼ正確な濃度水準の比較対照を選ぶと、葉
酸欠乏や正常な患者の範囲およびビタミンＢ１２の正常
／異状範囲を概算した検定結果を得ることができる。未
知試料と同じ方法で取扱うと、検定の性能を検査するこ
とができる。
この特別の実施例において、次に示したように６種類の
標準ビタミンＢ１２／葉酸を選択したが、当業者はその
研究所標準に準じるよう、その数や濃度を変えることが
できる。標準濃度はミリリットル当りを示す。
標準ビタミンＢ１２／葉酸を選択したが、当業者はその
研究所標準に準じるよう、その数や濃度を変えることが
できる。標準濃度はミリリットル当りを示す。
標準ビタミンＢ１２／葉酸エステル、 ｏ／ Ｏ
ｐ９／ｎ９標準ヒタミンＢｔ ｚ ／葉酸エステ／Ｉｚ
、 １００／ ｘ、Ｏｐｇ／ｎＪＦ１１ｉｉ準ヒ
タミｙＢｔｇ／葉酸ニスｆル、 ２５０／ ２．
ＯｐＶｎ９標準ヒｌ ミｙ Ｂｌｚ ／葉酸エステＡ／
、 ５００／ ５．０ｐｇ／ｎｇ標準ビタミ７Ｂ
１１１／葉酸エステＡ／、１０００／１０．Ｏｐ、！ｉ
’／ｎｇ標準ヒタミンＢ１２／葉酸ｘステル、２０００
／２０．０ｐｆｉ／ｎｌ検定手法 全ての実験にパイレックス（Ｐｙｒｅｘ ：登録商標）
ガラス製または、プロピレン製の試験管を用いる。実験
は、標準、対照および各患者試料についてのものである
。この特別な検定例にお（・て、漿液または血漿（ＥＤ
ＴＡ抗凝固薬を加えた）を使用することができる。赤血
球葉酸エステル分析を行うために、全血液リセーテ（Ｉ
ｙｓａｔｅ ）を１１１ｆ！ Ｌ ７ ス：Ｆ ルピン
酸で安定化することもできる。
ｐ９／ｎ９標準ヒタミンＢｔ ｚ ／葉酸エステ／Ｉｚ
、 １００／ ｘ、Ｏｐｇ／ｎＪＦ１１ｉｉ準ヒ
タミｙＢｔｇ／葉酸ニスｆル、 ２５０／ ２．
ＯｐＶｎ９標準ヒｌ ミｙ Ｂｌｚ ／葉酸エステＡ／
、 ５００／ ５．０ｐｇ／ｎｇ標準ビタミ７Ｂ
１１１／葉酸エステＡ／、１０００／１０．Ｏｐ、！ｉ
’／ｎｇ標準ヒタミンＢ１２／葉酸ｘステル、２０００
／２０．０ｐｆｉ／ｎｌ検定手法 全ての実験にパイレックス（Ｐｙｒｅｘ ：登録商標）
ガラス製または、プロピレン製の試験管を用いる。実験
は、標準、対照および各患者試料についてのものである
。この特別な検定例にお（・て、漿液または血漿（ＥＤ
ＴＡ抗凝固薬を加えた）を使用することができる。赤血
球葉酸エステル分析を行うために、全血液リセーテ（Ｉ
ｙｓａｔｅ ）を１１１ｆ！ Ｌ ７ ス：Ｆ ルピン
酸で安定化することもできる。
１、試験管を次のようにした：
１、 ２ ノサクグラウンド標準ビタミンＢ１
２／葉酸エステル、ｏｌｏｐ、＠＋４ ３．４ 標準ビタミンＢ１２／葉酸エステル。
２／葉酸エステル、ｏｌｏｐ、＠＋４ ３．４ 標準ビタミンＢ１２／葉酸エステル。
ｔｏｏ ／ ｉ、ｏ ｐｅｌ１
５．６ 標準ビタミンＢ１２／葉酸エステル。
２５０ ／ ２，５ ｐφｇ
７．８ 標準ビタミンＢ１！／葉酸エステル。
ｓｏｏ １５．Ｏｐｅｌ
９、ｌＯ標準ビタミンＢｓｘ／葉酸エステル。
１ｏａｏ ７１０．Ｏｐｅｌ・
１１．１２ ＠準ヒｐ ミンＢｔ ｚ ／葉酸工
ｘチル。
ｘチル。
２０００ ／２０．０ ｐＩＰｇ
１３．１４ 第１対照ビタミン＆１／葉酸エステ
ル１５．１６ 第２対照ビタミンＢ１２ ／葉
酸エステル結合、１８ 患者漿液試料（未知）２
、適切な標準、対照または試料１００μｊを試験管に入
れる。
ル１５．１６ 第２対照ビタミンＢ１２ ／葉
酸エステル結合、１８ 患者漿液試料（未知）２
、適切な標準、対照または試料１００μｊを試験管に入
れる。
３、試薬Ｂ（放射性トレーサービタミンＢ１２／葉酸エ
ステル）１．０ｍＡ！を各試験管に加える。
ステル）１．０ｍＡ！を各試験管に加える。
４、充分に混合する。
５、１５分間沸騰水中に装置したのち、１５分間室温に
置く。
置く。
これで、使用された葉酸エステル結合たんばく質を分解
してＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸錯体を生成する、
と同時に生物学的試料中の内因性葉酸エステル結合たん
ばく質も分解させる。
してＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸錯体を生成する、
と同時に生物学的試料中の内因性葉酸エステル結合たん
ばく質も分解させる。
６、試薬Ａ（葉酸エステル／ビタミンＢＩ２結合たんぽ
（質＞ ０．６ ｍ７を各試験管に加える。
（質＞ ０．６ ｍ７を各試験管に加える。
７、 充分に混合する。
８、室温にて１時間放置する。
この段階で、少なくとも試験管を光に当てないようにす
るのが好ましい。
るのが好ましい。
９、全ての試験管を遠心分離にかける。
１０、 全ての試験管をデカンテーションする。
１１、全ての試験管について、５７Ｃｏお゛よび１２５
■を同時に、または別々に計算できるガンマ線計数器で
計数する。
■を同時に、または別々に計算できるガンマ線計数器で
計数する。
本実施例では、沈澱（ペレット）の方を計数したが、計
数を変えたり、標準曲線を作って上澄液の方を計数する
こともできる。更に、結合たんばく質試薬Ａを有機ポリ
マー、無機粒子等のような、他の担体に固定化すること
ができる。結合たんばく質と担体の結合には、担体への
直接結合か当該分野で知られている穴埋め部分（５ｐａ
ｃｅｒ ｍｏｉｅｔｙ ）を介する結合で、共有結合が
好ましいが、イオン結合やファンデルワールス力等を用
いた化学的または物理的結合方法も適用できる。本検定
においては、当該分野で周知である多孔質ガラス粒子に
シランカップリング剤やグルタルアルデヒドを介して、
結合たんばく質を共有結合させている（米国特許第３
、６６９ 、８４１参照）。
数を変えたり、標準曲線を作って上澄液の方を計数する
こともできる。更に、結合たんばく質試薬Ａを有機ポリ
マー、無機粒子等のような、他の担体に固定化すること
ができる。結合たんばく質と担体の結合には、担体への
直接結合か当該分野で知られている穴埋め部分（５ｐａ
ｃｅｒ ｍｏｉｅｔｙ ）を介する結合で、共有結合が
好ましいが、イオン結合やファンデルワールス力等を用
いた化学的または物理的結合方法も適用できる。本検定
においては、当該分野で周知である多孔質ガラス粒子に
シランカップリング剤やグルタルアルデヒドを介して、
結合たんばく質を共有結合させている（米国特許第３
、６６９ 、８４１参照）。
患者試料中の未知水準の決定は、当業者に知られている
一連のデータ約分計算方式のいずれを使ってもできる。
一連のデータ約分計算方式のいずれを使ってもできる。
例えば、標準、対照および未知のラベルされたビタミン
Ｂ１２およびラベルされた葉酸エステルの相対的結合パ
ーセントは次式を用いて計算できる。
Ｂ１２およびラベルされた葉酸エステルの相対的結合パ
ーセントは次式を用いて計算できる。
従って、半対数（３サイクル）図表、即ち、−軸線上に
相対的結合パーセントおよび対数線上に標準濃度をプロ
ットして、標準曲線が得られる。内挿により、未知なら
びに検査用としての対照のビタミンＢ１２および葉酸エ
ステルの水準が分る。
相対的結合パーセントおよび対数線上に標準濃度をプロ
ットして、標準曲線が得られる。内挿により、未知なら
びに検査用としての対照のビタミンＢ１２および葉酸エ
ステルの水準が分る。
当業者に知られているように、同様にして、赤血球リサ
ーチ（Ｉｙｓａｔｅ ）中の葉酸濃度も決定できる。
ーチ（Ｉｙｓａｔｅ ）中の葉酸濃度も決定できる。
試料中のＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸濃度の定量に
は、標準曲線を作るために十分具なる濃度の標準を少な
くともり２種類必要とすることは、当業者に周知である
。この方法を上の例で用いている。しかしながら、試料
中のＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸濃度がある値以上
か以下かだけを知りたい場合には、１種類の標準の使用
でよいこと見、当業者に明らかである。
は、標準曲線を作るために十分具なる濃度の標準を少な
くともり２種類必要とすることは、当業者に周知である
。この方法を上の例で用いている。しかしながら、試料
中のＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸濃度がある値以上
か以下かだけを知りたい場合には、１種類の標準の使用
でよいこと見、当業者に明らかである。
上述した葉酸エステ゛ルおよび／またはビタミンＢ１２
／、葉酸エステル検定で使用されるもので、当業者によ
く知られている特定の因子、例えば、検定が通常ｐＨ９
，２付近で行われる、どいった因子については、本明細
書では説明していない。本発明は、固定化結合たんばく
質およびＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸複合体を使用
することで、従来の葉酸エステルおよび葉Ｖ／ビタミン
Ｂ１２の争奪たんばく質結合検定を大巾に改良すること
である。従って、従来技術で使用されていた因子、条件
、試薬等は本発明の主要点を構成するものでないので、
本明細書では全く説明していないが、もしくはその詳細
について説明していない。
／、葉酸エステル検定で使用されるもので、当業者によ
く知られている特定の因子、例えば、検定が通常ｐＨ９
，２付近で行われる、どいった因子については、本明細
書では説明していない。本発明は、固定化結合たんばく
質およびＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸複合体を使用
することで、従来の葉酸エステルおよび葉Ｖ／ビタミン
Ｂ１２の争奪たんばく質結合検定を大巾に改良すること
である。従って、従来技術で使用されていた因子、条件
、試薬等は本発明の主要点を構成するものでないので、
本明細書では全く説明していないが、もしくはその詳細
について説明していない。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）生物学的試料および凍結乾燥したＮ−５−メチルテ
トラヒドロ葉酸−葉酸エステル結合たんばく質複合体の
再構成によるところの少なくとも一つの標準試薬を別々
に、既知蓋のラベルした葉酸もしくは葉酸誘導体と混合
して、少なくとも二種類の個別試験試料とすること、当
該少なくとも一つの標準試薬の葉酸エステル結合たんば
く質を分解すること、生物学的試料中の全ての結合たん
ばく質を分解すること、既知量の葉酸結合たんばく質を
各試験試料に加えること、各試験試料中に加えた結合た
んばく質に結合しもしくは結合していないラベルした葉
酸またはラベルした葉酸誘導体の量を測定することおよ
び当該測定結果から生物学的試料中のＮ−５−メチルテ
トラヒドロ葉酸濃度を決定することからなる、生物学的
試料中のＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸濃度を決定す
る方法。 ２）各試験試料に加える既知量の葉酸エステル結合たん
ばく質が不活性担体に固定化されている特許請求の範囲
第１項記載の方法。 ３）イ）水基質媒体中でＮ−５−メチルテトラヒドロ葉
酸と葉酸エステルとの複合体、口）当該複合体を含む水
基質媒体の凍結乾燥、および ハ）−Ｎ−５−メチルテトラヒドロ葉酸試薬として再構
成した形で、凍結乾燥した複合体を用いるＮ−５−メチ
ルテトラヒドロ葉酸の争奪たんぽ（質結合検定の実施、
からなる方法。 ４）検定が、ビタミンＢ１２７葉酸エステルの同時検定
である特許請求の範囲第２または３項記載の方法。 ５）各々異なる濃度のＮ−Ｍ−メチルテトラヒドロ葉酸
を含み、そのＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸は葉酸エ
ステル結合たんばく質と複合イ６しており、複数の再構
成凍結乾燥Ｎ−５−メチルテトラヒドロ葉酸試薬を未知
試料と併行して分析し、ついで当該既知濃度試薬から標
準曲線を作成したのち、当該標準曲線と当該未知試料を
比較することにより当該未知試料中の葉酸濃度を決定す
る特許請求の範囲第２−１′たは３項記載の方法。 ６）各々異なる濃度のＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸
を含み、そのＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸は葉酸エ
ステル結合たんばく質と複合化しており、複数の再構成
凍結乾燥Ｎ−５−メチルテトラヒドロ葉酸試薬を未知試
料と併行して分析し、ついで当該既知濃度試薬から標準
曲線を作成したのち、当該標準白−と当該未知試料を比
較することにより、当該未知試料中の葉酸濃度を決定す
る特許請求の範囲第４項記載の方法。 ７）ラベルが放射線である特許請求の範囲第２または３
項記載の方法。 ８）ラベルが放射組であり、かつビタミ７Ｂ１２の争奪
結合検定において放射性ビタミンＢ１２標準試薬を使用
し、および当該ビタミンＢ１２試薬の放射線ラベルが当
該ラベルした葉酸もしくはラベルした葉酸誘導体の放射
線ラベルと異っている特許請求の範囲第４項記載の方法
。 ９）イ）葉酸エステル結合たんばく質と複合化したＮ−
５−メチルテトラヒドロ葉酸、および 口）不活性担体上に固定化した葉酸エステル とからなる争奪たんばく質結合検定用具。 １０）放射線検定用具であり、かつ再構成に際し各々異
なる濃度のＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸を含み、そ
のＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸を葉酸エステル結合
たんぽ（質と複合化した複数の標準凍結乾燥Ｎ−５−メ
チルテトラヒドロ葉酸試薬を含んでおり、当該標準試薬
から標準葉酸エステル結合曲線を作成できる特許請求の
範囲第９項記載の検定用具。 １１）不活性担体がガラス粒子から得られるシラン−グ
ルタルアルデヒドであり、かつ葉酸エステル結合たんば
く質が当該担体に共有結合している特許請求の範囲第１
０項記載の放射線検定用具。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/288,477 US4399228A (en) | 1981-07-30 | 1981-07-30 | Polate competitive protein binding assay |
| US288477 | 1981-07-30 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5827064A true JPS5827064A (ja) | 1983-02-17 |
| JPH0222910B2 JPH0222910B2 (ja) | 1990-05-22 |
Family
ID=23107272
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57132915A Granted JPS5827064A (ja) | 1981-07-30 | 1982-07-29 | Ｎ―５―メチルテトラヒドロ葉酸濃度決定方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4399228A (ja) |
| JP (1) | JPS5827064A (ja) |
| DE (1) | DE3227911A1 (ja) |
| FR (1) | FR2510760B1 (ja) |
| GB (1) | GB2103363B (ja) |
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| US4399228A (en) | 1983-08-16 |
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