JPH02233610A - 血管新生阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｉｌよ旦皿貝立１ この発明は新規な血管新生阻害剤に関するものである．
さらに詳細には、この発明はＷ　Ｆ　２０１５Ａおよび
／またはＷＦ２０１５Ｂを有効成分として含有する血管
新生阻害剤に関するものである．の　　　び　　が　　
しようとする　　占従来、血管新生阻害剤としては種々
のものが知られているが、これらのものは医薬品として
必ずしも満足される性質を備えて１いるものではなかっ
た．そこで、この発明者等は新しいタイプの血管新生阻
害剤の開発を企図した． の　　およびク この発明の血管新生阻害剤の有効成分である示される． で示される基である化合物がＷＦ２０１５Ｂを意味する
） 上記一般式（Ｉ）で示される化合物は例えば特願昭６３
−２６２０４４号記載の方法、より具体的には後記製造
例で示す方法ゝにより製造することができる． 後記製造例で得られるＷ　Ｆ　２０１５ＡおよびＢは下
記の理化学的性質を有する： （１）　ＷＦ２０１５Ａ ●》分子量 ４１Ｇ　［ＦＡＢ−ＭＳ　：　ｓ／ｘ　４１１　　（Ｍ
＋Ｈ）］ｂ）元素分析 Ｃ８４．ｓｓ：　　Ｈ　　ａ．ｏａ：　　０　　２７．
３９　（差として算出） Ｃ）比旋光度 【α１　竃−５２＠ Ｏ （Ｃ−１．０　　，　　Ｃ｝１３０Ｈ）ｄ）　ＵＶ吸収
スペクトル 末端吸収（ＣＩＣＩ，中） ｅ）　ＩＲ吸収スペクトル １１７０．１１２Ｇ，１１００．１０７０．１０５０，
１０００．　　９８０，　　９２０，　　８８０．　　
８３０　ｃｍ−’ｌ ｆ）ＨＮＭＲ吸収スペクトル（ＣＤＣＩｓ）δ：　８．
９５　（ＩＨ，ｄｄ，Ｊ−１５．５および４．５ＨＺ）
　．６．２０（ＩＨ．ｄｄ，Ｊ−１５．５および２Ｈｘ
）　．５．７０（ＩＨ，広いＳ》， ５．２０（ＩＨ，広いｔ，Ｊ−７｝１ｘ）　，４．３１
（ＩＨ劃》， ３．９０（ＩＨ劃）． ３．６８（ＩＨ，ｄｄ，Ｊ−１１および３Ｈｚ）　，３
．４４（３Ｌｓ）． ２．９８（ＩＨ，ｄ，Ｊ−４．２１）．２Ｊ２　（ＩＨ
．ｄｄ．Ｊ−６．５およびｌ！Ｈｚ）　，２．５８（Ｉ
Ｈ，ｄ，Ｊ−４．２ｔｌｚ），２．３６（ＩＩＩ，ｍ）
． ２．１８（１Ｂ，＋ｓ）　， ２．１０（１Ｂ，＋ａ）， ２．００（ＩＮ，ｍ）， １．９８（ＩＨ，ｄ，Ｊ−１１Ｈｘ），１．８７（ＩＨ
，ｍ）． １．７４　（３Ｈ，ｄ，Ｊ−１＋１ｚ）　．１．８６　
（３｝１，ｄ，Ｊ−１＋１ｚ）　．１．２１（３Ｈ．ｓ
）． １．１４（３１１，ｄ，Ｊ−８．５ＨＺ）．１．０７（
１｝１．＠）， ｇ）　”Ｃ　ＮＭＲ吸収スペクトル（ＣＤＣｌｉ）δ　
：　　１Ｂ５．８（Ｓ）． １４６．６（ｄ）． １３５．０（＄）． １２１．ｌｌ（ｄ）． １１８．３　（ｄ）　． ７９　．４　（ｄ）　， ７４．５　（ｄ）　． ６９．９（．ｄ）， ６６．３　（ｄ）　， ８１．１（ｄ）． ５９．４　（ｓ）　． ５Ｌ９　（Ｓ）　． ｓａ．７　（ｑ）　． ５０．７（ｔ）， ４８．２　（ｄ）　， ２９．２　（ｔ）　， ２７．２（ｔ）， ２５．６　（ｑ）　． ２５．６　（ｔ）　， １７．９　（＋１）　． １７．１　（ｑ）　， １３．７　（ｑ）　， ｈ》溶解性 可溶：クロロホルム、メタノール、アセトン、エタノー
ル 不溶：ｎ−ヘキサン、水 ｉ》呈色反応 陽性：沃素蒸気との反応 陰性：ニンヒドリン反応、モリッシュ反応、塩化第二鉄
反応 」）物買の性質 中性物質 （２）　ＷＦ２０１５Ｂ ａ》分子量 ４４７［Ｆ＾トＭＳ　　：　ｍ／ｚ　４６９（Ｍ＋Ｎａ
）］ｂ）元素分析 Ｃ　５８．０３：　Ｉ％１．９４．　Ｃｌフ．′・３ｌ
：　０　　２Ｂ．７２　Ｃ差として算出） Ｃ》比旋光度 ｄ） ｅ》 ＵＶ吸収スペクトル 末端吸収（ＣＨＣＩｓ中） ＩＲ吸収スペクトル ＣＨＣＩｓ　　：　３５？０．　３４００，ν ｍａ× ２８２０．　１？１０， １４４０，　１４００， １３００，　１２７０， １０８０，　１０２０． ９１０　ｃｍ−’ ２９１５０， １，６６０． １３８０． １２２０． ９８０． ２９４０，２８７０． １５６０．１４Ｂ０， １３６０，１３４０， １１７０，１１２０， ９６０，９４０， ｆ）　１８　ＮＭＲ（４００Ｍｌｌｚ．ＣＤＣｌｓ）δ
：　６．９９（ＩＩＩ，ｄｄ，Ｊ−５およびｌｓ．！Ｊ
ｚ）　，６．２０（ＩＬ（ｌｄ，Ｊ−２および１５．５
Ｈｚ）　，５．５５（ＩＨ））， ｓ．ｔａ（ｔｏ，霞》． ４．３６（ＩＨ，脂）， ３．９８（ＩＨ，ｄｑ，Ｊ−４および６Ｈｚ）　．３．
８７（１Ｂ，ｄ，Ｊ−ＩＬＨｚ），３．４９　（ＩＨ，
ｄ，Ｊ−１１８２）　．３．３１　（ＩＨ，＋ｓ）　， ３．３０（３Ｈ，ｓ）． ２．９７（ＩＨ，ｔ，ＪＪ．ＳＨ，ｚ）　．２．５６−
２．４０　（２Ｂ，＠）　．２．１７（ＩＬｍ）， ２．０５（ＬＨ，ｓ＋）， １．９０−１．７５　（２Ｈ，ｌ）　．１．７３　（３
Ｈ，ｓ）　． １．６１！（３Ｈ，ｓ）， １．４１（３Ｌｓ）， １．４０（ＩＨ，広いｄ，Ｊ−１４１１ｚ）　，１．２
０（３Ｍ，ｄ，Ｊ−６１１ｚ） ｇ）　”Ｃ　ＮＭＲ　（ｌｏＯＭＨｘ，　ＣＤＣＩｓ）
δ：　１６５．７　（ｓ）　， １４Ｌ３（ｄ）， １３４．８　（ｓ）　． １２２．４　（ｄ）　． １１８．２（ｄ）． ７８．７　（ｄ）　． ？＠．Ｚ　（ａ）　， ７４．５　（ｄ）　． ７０．０（ｄ）， ６６．１（ｄ）， ６４．０　（ｓ）　， ８２．３　（ｄ）　， ５８．７　（ｄ）　， ５０．５　（ｔ）　， ４３．３（ｄ）． ２９．１　（ｔ）　． ２７　．５　（ｔ）　， ２５．８（Ｑ）． ２３．５　（ｔ）　． ２２．２　（ｑ）　． １７．９　（ｑ）　． １７　．６　（ｑ） ｈ）溶解性 可溶：クロロホルム、メタノール、 ン、エタノール 不ｒＪ：ｎ−ヘキサン、水 ｌ》呈色反応 陽性：沃素蒸気との反応 アセト 陰性：ニンヒドリン反応、モリッシェ反応、塩化第二鉄
反応 』》物買の性貿 中性物賞 以上の理化学的性買および別途研究の結果から、Ｗ　Ｆ
　２０１５ＡおよびＢの化学構造は前記のように決定さ
れた． 次に、Ｗ２０１５ＡおよびＢの生物学的な性貢を下記試
験例により説明する． フィブロネクチンで被覆した９６六マイクロタイタープ
レートに、１５％牛胎児血清１００ｕｇ／ｍＩ　ＥＣＧ
Ｓ（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｌａｌ　ｃｅｌｌ　ｇｒｏｗｔｈ
　ｘｕｐｐｌｅ−ｍｅｎｔ）および１０ｕｇ／ｍ′１ヘ
バリンを含むＭＣＤＢ１５１培地を加えた後、一定濃度
のＷＦ２０１５ＡまたはＷＦ２０１５Ｂのメタノール溶
液を加え種々の濃度の希釈液を作製した．さらに、上記
成分を含むＭＣＤＢ１５１培地を用いて人ｍｉｒｅ静脈
内皮細胞液を調製し、２Ｘ１０’個の割合で各穴（ｆｉ
ｎａｌ　ｖｏｌｕｉ＋ｓ２　０　０　μ１）に接種し、
Ｃ’Ｏ．’ｌインキエベーター中で３７℃．５日間培養
した．培養後ＭＴＴ法Ｔ．ＭｏｓｍａｎＨＪ．Ｉｓｍｕ
ｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　６５．５５．１９８３）によ
り細胞増殖度合を測定し、Ｗ　Ｆ　２０１５ＡまたはＷ
Ｆ２０１５Ｂに対する血管内皮細胞の増殖抑制率を算出
した． その結果、Ｗ　Ｆ　２０１５ＡおよびＷ　Ｆ　２０１５
Ｂは血管内皮細胞の増殖に対して強い抑制効果を示し、
それらのＩＣＳ。値は共に２Ｘ１０”ｐｇ／■ｌであっ
た． 溶液２．５μｌと０．１％メチルセルロース水溶液２．
５μｌを混合し、乾燥させて作製したサンプルディスク
を漿尿膜上に置き、再び窓をスキンクロージャでふさい
で３７℃で靜卵を続けた．さらに、３日後に漿尿膜に新
生される血管の発達状態からＷ　Ｆ　２０１５Ａの血管
新生に対する阻害作用を観察した． その結果、Ｗ　Ｆ　２０１５Ａの１０μｇ投与群では、
ほぼ完全な（約１００％）血管新生阻害作用が観察され
た． ３日令の鶏受精卵から無菌的に注射針で卵白を約１■ｌ
抜き取り、歯科用ドリ）レで漿尿膜を傷っけないように
卵殻に傷をつけ、ピンセットで殻を破フて約１　ｃ＋＊
”の窓を開け、スキンクロージャーで窓をふさいで３７
℃で岬卵した．２４時間後に、あらかじめ一定濃度のＷ
　Ｆ　２０１５Ａメタノール１豊正月： 兎角膜内での血管新生作用は、Ｍ．＾，Ｇｉｍｂｒｏｎ
ｅらの方法（Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａ
ｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ５２，４１３．１９７４
）により検討υた．すなわち、兎（ニュージーランドホ
ワイト種、雌９週令）を用いてネンブタール麻酔下、角
膜中央部にメスで約２ｍｍの切れ目を入れ、その切れ目
から眼科用虹彩スバテルで角膜間買部にポケット状構造
を作った．そのポケット底に、あらかじめ作製しておい
た一定量のＷ　Ｆ　２０１５Ａを含むＥｌｖａｘ　（＋
ｔｌｚｙｌｅｎｅｖＩｎｙｌ　ａｃ＠ｔａｔｅ）ペレッ
ト（　１　ｍｍ角）を挿入し、さらにＦ　Ｇ　Ｆ　（　
Ｆｌｂｒｏｂｌａｓｔ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ，
クシ脳由来》１μｇを含有するＥｌｖａｘペレットを続
いて挿入し、角膜輪郎からＦＧＦベレットに向かって延
びてくる新生血管を経日的に（２週間）観察した．　そ
の結果、Ｗ　Ｆ　２ＧＩＳＡはＦＧＦによって新生され
る血管を２００μｇ投与群では完全に（約１００％）阻
害した． Ｗ　Ｆ　２０１５ＡまたはＢの生理食塩水溶液を、１日
１回５日間、ＩＣＲ系マウス５匹（雌性、５週令）の腹
腔内に投与（１回投与量１００■ｇ／ｋｇ　）した．そ
の結果、マウスに異゛常な症状は認められなかった． 以上の試験例から明らかなように、この発明の血管新生
阻害剤は顕著な血管新生阻害作用を有し、血管の異常増
殖によって引き起される疾患、例えば、糖尿病性網膜症
、リュウマチ性関節炎、未熟児網膜症、老人性黄班部変
性等の予防または治療に使用される． この発明の血管新生阻害剤の有効成分は医薬として許容
しうる担体と混合して、例えば、カプセル、錠剤、顆粒
剤、粉剤、口内錠、舌下錠、液剤などの製剤の形でヒト
を含む咄乳動物に経口または非経口的に投与できる． 医薬として許容しうる担体としては、製薬の目的に慣用
される種々の有機または無機担体、たとえば賦形剤（た
とえば、スクロース、でん粉、マンニット、ソルビット
、ラクトース、グルコース、セルロース、タルク、りん
酸カルシウム、炭酸カルシウム等）、結合剤（セルロー
ス、メチルセルロース、ヒドロキシブロビルセルロース
、ポリブロビルビロリドン、ゼ）チン、アラビアゴム、
ポリエチレングリコール、スクロース、でん粉等》、崩
壊剤（たとえば、でん粉、カルボキシメチルセルロース
、カルボキシメチルセルロースカルシク゛ム、ヒドロキ
シブロビルでん粉、グリコールでん粉ナトリウム、重炭
酸ナトリウム、りん酸カルシウム、くえん酸カルシウム
等》．′、滑沢剤（たとえば、ステアリン酸マグネシウ
ム、エーロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等）
、矯味剤（たとえば、くえん酸、メントール、グリシン
、オレンジ粉末等）、保存剤（安息香酸ナトリウム、重
亜硫酸ナトリウム、メチルバラベン、プロビルバラベン
等）、安定剤（くえん酸、くえん酸ナトリウム、酢酸等
）、懸濁化剤（たとえば、メチルセルロース、ポリビニ
ルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等）、分散剤
（たとえば、界面活性剤等）、水性希釈剤（たとえば、
水）、油類（たとえば、ごま油等）、基剤ワックス（た
とえば、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白色ワセ
リン等》等が包含されうる．有効成分の用量は、疾患の
′種類、患者の体重および／または年令、さらには投与
経路等の種々の因子に応じて変更すべきである． Ｗ　Ｆ　２０１５ＡまたはＢの好ましい用量は、通常、
注射の場合には０．Ｏｌ〜１０■ｇ／ｋｇ／日、゛また
経口投与の場合には０．５〜ｓｏｇｅｇ／ｋｇ／日の用
量範囲から適宜選択される． 以下の製造例は、この発明の血管新生阻害剤の有効成分
の具体的な製造法を説明するためのものである． 鼠遺班工 可溶性でん粉２％、とうもろこしでん粉１％、グルコー
ス１％、綿実粉１％、乾燥酵母１％、ペブトン０．５％
、コーンスチーブリカ−０．５％および炭酸カルシウム
０．２％を含有する水性培地（ｐｌ１６．０　）　　（
　１　６　０ｍｌ）を、５００■ｌ容三角フラスコ１９
本に分注し、１２０℃で２０分間滅菌した．スコレコバ
シデイウム・アレナリウムＳｃｏｌｅｃｏｂａ−ｓｉｄ
ｉｕｍ　ａｒｅｎａｒｉｕｍ）　　Ｆ　−　２０１５徴
工研条寄第１５２０号の斜面培養物１白金耳を各培地に
接種し、２５℃で３日間振盪培！！ゝした．得られた培
養物を、あらかじめ１２０℃で２０分間滅菌した２０Ｏ
Ｉｔ容ジャーファーメンター中の可溶性でん粉３％、グ
ルコース１％、小麦の胚芽１％、綿実粉０．５％および
炭酸カルシウム０．２％を含有する水性培地（１２０ｆ
ｔ）に接種し、２５℃で３日間培養した． こうして得た培養液を、珪藻±（　２　０　ｋｇ）を用
いて濾過した．濾液（９５４！）を酢酸エチル（９　５
１）で抽出した．この抽出操作を２回行い、抽出液を合
せた．無水硫酸マグネシウムで脱水後、酢酸エチル層を
減圧下に濃縮した．濃縮物をシリカゲルクロマトグラフ
ィーカラム（１１）に付した．カラムをｎ−へキサン（
３Ａ）およびｎ−ヘキサンー酢酸エチル混液（１：１、
３ＩＬ）で洗った．活性画分を酢酸エチル（４Ａ）で溶
出し、ついで減圧下に濃縮した．これをさらにシリカゲ
ルカラム（４００ｍｌ）に付した．クロロホルム（１．
２４！）およびクロロホルムーメタノール混液（１　０
０　：　１、１．２Ｊｌ！．）でカラムを洗浄したのち
、クロロホルムーメタノー）レ混液（７５：１、５０：
１、および２５：１）で段階的に溶出した．活性画分を
減圧下に濃縮し、残渣を逆相シリカゲルＯＤＳ逆カラム
クロマトグラフィーに付した．カラムをメタノールー水
温液（１：１、３００■ｌ）で洗浄したのち、メタノー
ルー水混液（３；２および７：３、各３００ｍｌ）で段
階的に展開した．活性画分を減圧下に蒸発乾固して、精
製された無色油状のＷ　Ｆ　２０１５Ａ　（　９　２　
ｍｇ）を得た． ■遺旦ユ スコレコバシディウム・アレナリウムＦ　−　２０１５
（徴工研条寄ＩＪ　１５２０号）の斜面培養物の１白金
耳を、可溶性でん粉２％、とうもろこしでん粉１％、グ
リコース１％、綿実粉１％、乾燥酵母１％、ペブトン０
．５％、コーンスチーブリカ一０．５％、ＮａＣ１　　
３％およびＣａＣＯ．．０．２％を含有する穏培地（ｐ
ｎｓ．ｏ　）　　（　１　６　０■１》を２０本の５０
０１容三角フラスコの各々へ分注し常法通り滅菌したも
のに接種し、回転振盪機を用いて２　５　０　ｒｐｉ＋
にて２５℃で７２時間培養した．得られた種培養液を、
ステンレス製２００１ジャー・ファーメンター中に上記
と同じ滅菌培地１６０ＪＬ中へ接種し、ファーメンター
を２０ｏｒｐｍ，２５℃で４８時間攪拌した．こうして
得た種培養９０１を、さらに、可溶性でん粉３％、グル
コース１％、綿実粉０．５％、小麦の胚＃．１％ＮａＣ
Ｉ　　３％およびＣａＣ０，０．２％を含有する４００
０ｆｌｉｌｉ製ファーメンター中の滅菌生産培地３００
０ｆｔに接種した．３ｏｏｏｆＬ／分の通気および１３
０ｒｐ■の攪拌のもとに、２５℃で７２時間培養を行な
った． 培養液《２８５ｏｆＬ》を珪藻土（ａｓｋｇ）ヲ用いて
濾過した．濾液を、活性炭（６００１）のカラムに通し
た．カラムを脱イオン水１８０ｆｔで洗い、８０％アセ
トン水（ｔａｏｇで溶出した．溶出液を減圧下に体積１
７１まで濃縮した．濃縮物を酢酸エチル１８１で抽出し
た．酢酸エチル層を分離し、減圧乾固して、粉末（６１
．３ｇ　）を得た．この粗製粉末をシリカゲル０．３　
１と混合した．混合物をシリカゲル（３′ｊ！）を用い
るカラムクロマトグラフィーに付した．カラムをヘキサ
ンｔｏｊｌで、ついでヘキサンー酢酸エチル（１：１）
ＩＯｊＬで洗浄し、酢酸エチル１０１で溶出した．活性
画分を集め、蒸発乾固して粉末を得、この粉末をシリカ
ゲルと混合した．混合物を、シリカゲル（１１）を用い
るカラムクロマトグラフィーに付した．カラムをクロロ
ホルム３ＩＬ，ついでクロロホルムーメタノール（１０
０：１）３１で展開し、クロロホルムーメタノール（７
５：１）３Ｊ！で溶出した．溶出液を減圧乾固して粉末
（１６．４ｇ　）を得、この粉末を逆相シリカゲルＯＤ
Ｓ３０ｍｌと混合した．混合物を逆相シリカゲルＯＤＳ
（６００＋ｗｌ）カラムにかけ、メタノールー水（１：
１）２．４１で洗浄した．カラムをメタノールー水（３
　：　２）で溶出した．活性画分を集め、減圧下に濃縮
して、油状のＷＦ２０１５Ｂ（３０５ａｇ）を得た．

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ＷＦ２０１５Ａおよび／またはＷＦ２０１５Ｂを有効成
   分として含有する血管新生阻害剤。