JPH02234695A - 抗緑膿菌外毒素ａモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 く産業上の利用分野〉 本発明は緑膿菌外毒素Ａ（以下Ｅｘ−Ａと略する）に対
するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生
ずるセルライン、該モノクローナル抗体が認識する抗原
決定基を含む緑膿菌外毒素Ａのポリペプチド断片、該モ
ノクローナル抗体を含有する緑膿菌感染症の予防・治療
剤、外毒素Ａ産生緑膿菌による感染症の診断薬、および
緑膿菌外毒素Ａの定量用試薬に関する。

本発明のモノクローナル抗体は緑膿菌外毒素Ａに対し強
い細胞毒性中和活性を有し、緑膿菌感染治療剤として有
用である。又、抗原決定基を含む緑膿菌外毒素Ａのポリ
ペプチド断片は、ワクチンとして有用である。さらに、
本モノクローナル抗体は、極微量の緑膿菌外毒素Ａを検
出・定量することが可能で、診断薬や定量用試薬として
用いられ、細菌感染症において、起炎菌が外毒素Ａ産生
緑膿菌であるか否かを、血清を用いて診断できる。

く従来技術および解決すべき課題〉 細菌感染症の治療において問題となる病原菌は、抗生物
質の開発とともに変化している。

すなわち、臨床上用いられる抗生物質の種類の変遷に伴
い細菌感染症を引き起こす細菌、いわゆる起炎菌が交代
してきた。従来、低病原性又は弱毒性と言われた細菌、
なかでも特に緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｕｍｏｎａｓ　ａｅｒ
ｕｇｉｎｏｓａ）による感染例が増加し、緑膿菌は近年
、主要な病原菌の一つとなっている。

緑膿菌感染は、免疫制御剤の投与を受け免疫能の低下し
ている患者、又は癌患者や熱傷患者および新生児などの
免疫不全・低下症の患者において重篤な症状を引き起こ
し死に至らしめる場合が多い細菌感染として知られてい
る。緑膿菌の病原性因子としては、細菌の増殖に伴う内
毒素および緑膿菌の産生する外毒素および外酵素がある
。なかでも外毒素は、ほとんどの緑膿菌臨床分離株にお
いて産生されており、その外毒素Ａは細胞に毒性を示す
のみならず、各種の動物に致死的作用を及ぼす。

細菌感染を予防・治療する方法として、まず第一にあげ
られるのが、抗生物質および合成抗菌剤を用いた化学療
法である。ストレプトマイシン、カナマイシン、ペニシ
リンやセファロスポリンなど幾多の抗生物質が開発され
、その多くはブドウ球菌を代表とするほとんどのダラム
陽性球菌や、大腸菌などのダラム陰性菌に感受性を示し
、著効な臨床効果を示してきた。しかしながら、今日迄
の多くの研究開発にもかかわらず、緑膿菌に感受性を示
す薬剤は依然少ないのが現状であり、しかも、今日、感
受性を示すとされる薬剤でも、そのほとんどが、緑膿菌
に対してその増殖を単に阻害するいわゆる静菌的に作用
するのみで、殺菌力に欠けており、臨床の場において著
効な治療効果を示すに至っていない。又、抗生物質療法
の限界を示すその他の例は、抗生物質は細菌の増殖を抑
制するものの、細菌が産生しその病原性を発揮する毒素
や酵素に対して阻害効果の無いことである。

ところで、細菌由来の毒素や酵素を中和および阻害する
ことにより細菌感染症を予防および治療することができ
る療法として、免疫グロブリン製剤の投与、いわゆる抗
体療法があり、抗生物質療法と併用される、又はそれに
代わるものとして注目されている。ウマやウサギ等の動
物を能動的に免疫することによって抗体価の高い血清を
得ることができ、その血清を投与する抗体療法は、各種
の動物を用いた実験的感染症において著効な治療効果を
示すことが多くの実験にて実証されている。

ヒト以外の動物由来の血清を用いた抗体療法がヒトにお
いても有効性を示すことは、ジフテリア毒素や蛇素の例
で周知のことである。

従来のヒト免疫グロブリン製剤は、健常人又は細菌感染
既応患者から血液を採取し、既知の方法にて免疫グロブ
リン画分を分取・精製した後に、ポリエチレングリコー
ル添加、蛋白分解酵素処理、スルホン化、ＤＥＡＥ一カ
ラムクロマトグラフィー等の凝集物を除去する方法によ
り、筋肉注射用のみならず、静脈注射用に製剤化された
ものである。

これらヒト免疫グロブリン製剤は、いくつかの欠点を持
つ。

第一に、■細菌および細菌由来の毒素・酵素に対する抗
体価が低く、必ずしも充分な治療効果を期待しえない。

第二に、■高力価の免疫グロブリンを大蚤に安定して供
給することが難しい。健常人ボランティアや患者より採
取された血液を材料に製造されており、高い力価の血清
を一定して入手することは極めて難しく、製造ロット毎
に、抗体価が変動することがある。第三に、■任意にヒ
トの血液を材料に製造されることにより、免疫グロブリ
ン製剤にＨＢｓウイルスなどの肝炎ウイルスやＡＴ　Ｌ
Ｖ　（Ａｄｕｌｔ　Ｔ　ｃｅｌｌ　ｌｅｕｋａｅｍｉａ
　ｖｉｒｕｓ）などが混入することがあり得る。

かくして、細菌および細菌由来の毒素・酵素特に、緑膿
菌由来の外毒素に対して高い抗体価を有し、細菌感染症
の治療効果の大きい免疫グロブリンの開発が望まれてい
る。

緑膿菌外毒素Ａは、緑膿菌の産生する外毒素で、６１３
ケのアミノ酸から成る蛋白である。緑膿菌外毒素Ａは、
ＡＤＰリポシルトランスフェラーゼという酵素活性をも
ち、動物細胞の表面に存在するレセプターに結合した後
、細胞内へ侵入し、細胞の蛋白合成を阻害する事により
毒性を発揮する。

緑膿菌外毒素に関して、遺伝子のＤＮＡ配列および外毒
素分子のアミノ酸配列（Ｇ．　Ｌ．　Ｇｒａｙら、Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ，ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
，　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｘｏｔｏｘｉ
ｎ　Ａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｇｅｎｅ　ｏｆ　Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，Ｐｒｏｃｅ
ｅｄｉｎｇ　ｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ
　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅυ．Ｓ．Ａ．，Ｖｏｌ．８１，
Ｐ．２６４５−２６４９　（１９８４））　、および三
次元構造（Ｖ．　Ｓ．　Ａｔ　ｌｕｒｅｄら，　Ｓｔｒ
ｕｃｔｕｒｅ　ｏｆｅｘｏｔｏｘｉｎ　Ａ　ｏｆ　Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　ａｔ　３
．０Ａｎｇｓｔｒｏｍ　ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，　Ｐｒ
ｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅ
ｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｕｃｅ　Ｕ．　Ｓ．　Ａ，　，　
Ｖｏｌ．　８３，　ｐ．　１３２０１３２４（１９８６
））が明らかになっており、緑膿菌外毒素Ａは、ドメイ
ンＩ　（１−２５２および３６５−４０４番目）、ドメ
インＩＩ　（２５３−３６４番目）およびドメインＩ［
　（４０５−６１３番目）で構成される。構造と生理活
性の相関についても一部調べられており（Ｊ．Ｈｗａｎ
ｇら、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｄｏｍａｉｎｓ　ｏｆ　
Ｐｓｅｏｄｏｍｏｎａｓ　ｅｘｏｔｏｘｉｎｉｄｅｎｔ
ｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｄｅｌｅｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉ
ｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｒｄ　ｉｎ
　Ｅ．　ｃｏｌｉ，　Ｃｅｌｌ，　Ｖｏｌ　４８，　ｐ
．　１２９−１３６（１９８７））　、ドメインＩが細
胞への結合に、ドメイン■が酵素活性に関与しているこ
とが示唆されている。ドメイン■の機能はよく分かって
ない。

一方、緑膿菌外毒素に対するモノクローナル抗体の報告
（Ｄ．　Ｒ．　Ｇａｌ　Ｉｏｗａｙら、Ｐｒｏｄｕｃｔ
ｉｏｎ　ａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｇａｔｉｏｎ　ｏ
ｆ　ｍｏｎｏｄｏｎａｌ　ａｘｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｔｏ
ｅｘｏｔｏｘｉｎ　Ａ　ｆｒｏｍ　Ｐｓｅｎｄｏｍｏｎ
ａｓ　ａｅｒｎｇｉｎｏｓａ，Ｉｎｆａｃｔｉｏｎ　ａ
ｎｄ　ＩｍｍａｎｓｔＹ，Ｖｏ１．４４，Ｐ２６２−２
６７（１９８４）　；野口ら、特開昭６１−２０４２０
０；Ｊ．Ｍ．　Ｌａｒｒｉｃｋら、１ｎｖｉｒｔｏ　ｅ
ｘｐａｎｓｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　Ｂｃｅｌｌｓ　
ｆｏｒ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｍ
ｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，　ｉｎ：
Ｈｕｍａｎｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ　ａｎｄ　ｍｏｎｏｃ
ｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＰｌｅｎｕｍＰｒ
ｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　Ｐ１４９−１６５（１
９８５）；Ａ．　Ｗ．　Ａｎｔｈｏｎｙ　ら、ｐｒｏｔ
ｅｃｔｉｖｅ　ｈｕｍａｎ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａ
ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｔｏＰｓｅｕｄｏｍｎｎａｓ　ａ
ｅｒｕｇｉｎａｓａ　ｅｘｏｔｏｘｉｎ−Ａ（Ｐａｔｅ
ｎｔ），ＰＣＴ／ＬＩＳ８６／０１２０４；Ｊ．　Ｋ．
　Ｃｈｉａら、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙｄｉｓｔｉｒ
ｃｔ　ｍｏｎｏｃｌｏｕａｌ　　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
　ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｗｉｔｈｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌ
ｌｙ　ａｃｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｄｏｍ
ａｉｎ　ｏｆＰｓｅｎｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎ
ｏｓａ，　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄＩｍｍｕｎｉｔ
ｙ．　Ｖｏｌ．　５２，　Ｐ７５６−７６２（１９８６
））があるが、抗体療法として実用化されるに至ってい
ない。

また、これらの先行文献には、緑膿菌外毒素Ａの細胞へ
の結合をブロツクすることにより細胞毒性を阻害するモ
ノクローナル抗体（Ａ．　Ｗ．　Ａｎｔｈｏｒ＋ｙら：
Ｊ．　Ｋ．　Ｃｈｉａら）や外毒素Ａのもつ酵素活性を
阻害することにより細胞毒性を阻害するモノクローナル
抗体（Ａ．　Ｗ．　Ａｎｔｈｏｎｙら）に関する記載が
ある。すなわち、細胞毒性中和効果を有する抗体の認識
する抗原決定基が、Ｎ末から１０３番目のアミノ酸配列
を持つポリペプチド部位（ドメイン■）および３８５番
目以後のアミノ酸配列を持つポリペプチド部位（ドメイ
ン■またはドメイン■）に存在している可能性を示唆し
ているが、ドメインＨの細胞毒性中和効果への関与につ
いては示唆していない。

これらのことから、感染防御に関連する真の抗原決定基
の解析および強い治療活性を有するモノクローナル抗体
の生産が望まれている。

〈課題解決の手段〉 こうした状況に鑑み、本発明者らは前述の問題点を改善
すべく鋭意、改良を加え、緑膿菌外毒素Ａに対する多く
のモノクローナル抗体を作製した。

各モノクローナル抗体の治療効果を検討する一方、物理
化学的、免疫化学的および生物学的特性を詳細に解析し
た結果、従来には報告のない新知見を得た。すなわち、
緑膿菌外毒素に対し強い治療効果を有するモノクローナ
ル抗体を得たが、該抗体はイン・ビトロ系において、緑
膿菌外毒素ＡのＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ活性
を阻害しなかった。また、緑膿菌外毒素Ａの細胞への取
込み阻害能については、極めて高い活性を示すことは無
かった。そこで　従来の緑膿菌外毒素の酵素活性（ドメ
イン■）に関与する抗体、あるいは細胞への結合（ドメ
イン■）に関与する抗体とは異なる新規なモノクローナ
ル抗体ではないかと考え、抗原認識部位を同定したとこ
ろ、機能の未知であるドメイン■を認識することが判明
した。この新ｌ２ 知見を基に、緑膿菌外毒素に対し強い細胞毒性中和活性
および治療効果を有するモノクローナル抗体、該抗体を
産生ずるセルライン、該抗体を用いた高力価の免疫グロ
ブリン製剤を作製し、本発明を完成することに至った。

本発明は、下記の免疫化学的・生物学的特性および物理
化学的特性を有する緑膿菌外毒素Ａに対するモノクロー
ナル抗体、該モノクローナル抗体産生セルライン、該モ
ノクローナル抗体を含む感染治療用の免疫グロブリン製
剤、診断薬又は定量用試薬および緑膿菌外毒素の特定の
抗原決定基を構成要素とする感染治療用のワクチン製剤
に関するものである。

すなわち、 ■緑膿菌外毒素Ａに対して特異的に結合する■緑膿菌外
毒素Ａのアミノ酸残基２４１〜２９７番目に相当する部
分を抗原認識部位（エピトープ）として認識する ■イン・ビトロ系において、緑膿菌外毒素ＡのＡＤＰリ
ボシルトランスフェラーゼ活性を阻害しな■細胞培養系
において、緑膿菌外毒素Ａによって惹起される細胞毒性
を中和する ■生体内へ非経口的投与された該モノクローナル抗体は
、緑膿菌外毒素Ａにより誘発される肝臓での蛋白合成伸
長因子２　（ａｌｏｎｇａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　−
　２　；ＥＦ−２）の生体内リボシル化反応を阻害する
■緑膿菌外毒素Ａの関与する緑膿菌感染症において予防
・治療効果を示すことを特徴とし、更に好ましくは■ｐ
Ｈ３．　５−４．　０の酸性条件下においても、抗原結
合活性を保持する　■結合定数が１０８　β／モル以上
であることを特徴とする。

■〜■の効果を判定する際に、以下の方法を用いること
ができる。いずれも、抗体無投与の系（あるいは■■に
おいては■で活性をもたなかった抗体を投与した系）を
対照とし、対照に比べ、有為差をもつ場合に効果有りと
判定される。

■細胞培養系における細胞毒性中和効果の判定一夜培養
したマウス細胞に、精製抗体と外毒素Ａを加え、培養し
、その上清を除く。次いでホルマリン等の固定液を加え
室温にて静置した後、固定液を除去し、色素液を加え、
室温にて静置した後、色素液を除去し、蒸留水で洗浄す
る。洗浄後、抽出液を加えて攪拌後、該溶液のＣＤ５９
，を測定する。

■ＥＦ−２の生体内リボシル化反応の阻害効果の判定 熱傷マウスを作製し、皮下注射により外毒素産生緑膿菌
を感染させる。感染後、抗体を静脈内に投与し、数時間
後、マウスの肝臓を摘出する。マウス肝臓よりＥＦ−２
溶液を調製し、肝臓の蛋白合成能の指標としてＭ，Ｐｏ
ｌｌａｃｋらの方法（Ｊ．　Ｉｎｆｅｃｔ．　Ｄｉｓ，
１４５　６８８−６９５（１９８２）　）に従いＡＤＰ
リボシル化されていない活性の有るＥＦ−２量を測定す
る。サンプルマウスの蛋白合成能を、菌を接種していな
い正常マウスの蛋白合成能の５０％まで回復させる抗体
の投与量（ＥＤ５ｏ）を測定する。■緑膿菌外毒素Ａの
関与する緑膿菌感染症における予防・治療効果の判定 マウスの腹腔内に抗Ｂｘ−Ａモノクローナル抗体精製ｌ
５ 品を投与し、数時間後腹腔内にＥｘ−Ａを接種する。

対照としてＢ　Ｓ　Ａ　（ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　
ａｌｂｕｍｉｎ）を投与したマウスに同様の操作を行う
。Ｅｘ−Ａ接種後７日後の生残率を比較する。

いずれも詳細は実施例を参照する。

このようなモノクローナル抗体の具体例として本発明は
モノクローナル抗体Ｅｘ　−３Ｃ７を提供する。

該モノクローナル抗体の重鎮（Ｈ鎖）および軽鎖（Ｌ鎖
）の抗原抗体結合に関与する超可変領域（Ｈｙｐｅｒ　
ｖａｒｉａｂｌｅ　ｒｅｇｉｏｎ又はＣＤＲ）は請求項
第４項記載のアミノ酸配列を保持する。

緑膿菌外毒素と特異的に反応し、上記の特徴を有するモ
ノクローナル抗体を連続的に産生ずるハイブリドーマは
、以下の方法で取得される。

本発明のハイブリドーマは、免疫、細胞融合、融合細胞
選択、アッセイおよびクローニングの五つの工程から成
る、Ｋｏｈｌｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ　２５６，　４９５
４９７　．　１９７５）の方法によって樹立される。

免疫工程は、動物（ヒトを除く）を目的とする抗原で感
作する工程である。

抗原としては、緑膿菌外毒素精製品又はそのトキソイド
をフロインド完全又は不完全アジュバンドと混和した混
和物をマウス等の動物に１週間〜数か月の間隔で１〜６
回注射することによって感作する。ヒトの場合、外毒素
産生緑膿閑による自然感染がこの免疫に相当する。

緑膿菌外毒素トキソイドとは、ホルマリンを用いた方法
（Ｓ．　Ｊ．　Ｃｒｙｚら、Ｉｎｆｅｃｔ．ａｎｄ　Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．　３２，　Ｐ７５９−７６８
．　（１９８１））あるいは、フォトアフィニティ不活
性による方法（Ｓ．　Ｍａｒｂｕｒｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔ　ｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃ　ｉ　：　ＵＳＡ，　Ｖ
ｏ　ｉ．　８０，　Ｐ２８７０−２８７３．　（１９８
３））により不活性された緑膿菌外毒素を示す。

抗原の投与経路として腹腔内投与、皮下投与、静脈内投
与が考えられるが、特に皮下投与が望ましい。細胞融合
２〜５日前に緑膿菌外毒素精製品またはそのトキソイド
、あるいは変性緑膿菌外毒素を追加感作することが望ま
しい。

変性緑膿菌外毒素とは尿素およびジチオスレイトールで
の処理あるいは凍結融解処理により変性した緑膿菌外毒
素のことをいう。

細胞融合工程は、免疫（感作）された動物やヒトから摘
出した牌臓細胞またはリンパ球Ｂ細胞と骨髄腫細胞とを
融合する工程から成る。リンパ球として血清中抗緑膿菌
外毒素抗体価が高いヒトの末梢血、牌臓、偏桃腺やリン
パ節など由来のリンパ球を用いる事もできる。骨髄腫細
胞としては、ＨＰ　Ｒ　Ｔ　（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎ
ｅ−ｇｕａｎｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔ
ｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）欠損マウス骨髄腫細胞であるＰ
３−Ｘ６３−Ａｇ８−０１（Ｐ３Ｕ１，ＡＴＣＣ　ＣＲ
Ｌ１５９７）、Ｐ３−ＮＳ−１／１−Ａｇ４−１（ＮＳ
−１；ＡＴＣＣ　ＴＩＢ　１８）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ
８−６５３（６５３　；ＡＴＣＣＣＲＬ１５８０）、Ｓ
Ｐ２／０−Ａｇ１４ＣＳＰ２／０；ＡＴＣＣ　ＣＲＬ８
２８７）ＳＨＭＤ３３（ＡＴＣＣ　ＣＲＬｌ６６８）な
どがその代表として用いられるが、その他、細胞工学分
野にて通常用いられる動物およびヒト由来のイムノグ口
プリン非産生または非分泌細胞をも用いることができる
。

融合法としてＨＶＪ法（センダイウイルスを用いる方法
）、ポリエチレングリコール法（ＰＥＧ法）や電気的融
合法等が用いられる。

以下にＰＥＧ法を更に詳しく説明する。

即ち、リンパ球Ｂ細胞と骨髄腫細胞とを１０〜１　：　
１（７）割合ニテ混合し３０〜５０％（Ｗ／Ｖ）　ＰＥ
Ｇｌ０００〜６０００を０．５〜１分間に少量ずつ加え
、１〜ｌＯ分間静置する。その後２〜１０分間に無血清
培地を加え希釈する。

その後更に培地に加え１０５〜１０６細胞／１ｎｌの濃
度で調製し、９６穴マイクロプレートに１穴（ウェル）
当たり２Ｘ１０”〜２Ｘ１０５個の細胞を播種し、５％
ＣＯ２インキュベーター内で３２０Ｃ〜３７℃にて培養
する。ＰＥＧ添加のときに、ジメチルスルフォキサイド
（ＤＭＳＯ）やポリーＬリジンなどを添加することによ
り融合効率を高めることができる。

融合細胞選択工程は、融合細胞のみが生育できる適当な
選択培地中で培養することにより融合細胞を選別する工
程である。ＨＧＰＲＴ欠損骨髄腫細胞を融合親細胞とし
て用いた場合、選択培地としてＨ　Ａ　Ｔ　（Ｈｙｐｏ
ｘａｎｔｈｉｎｅ，　　Ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ．Ｔｈ
ｙｍｉｄｉｎｅ）培地やＨ　Ａ　ｚ（Ｈｙｐｏｘａｎｔ
ｈｉｎｅ，　Ａｚａｓｅｒｉｎｅ）培地を用いる。２〜
４日毎に新鮮な選択培地に交換し１０〜２０日間培養す
る。その他、アクチノマイシンＤ・エメチン併用法、ジ
メチルピロカーボネイト法、ウアバイン法等公知の方法
が用いられる。

アッセイ工程は、融合細胞のなかから、目的とする特異
抗体産生細胞を選別する工程である。通常、培養上清に
含まれる抗体活性を、固相または液相放射性同位元素免
疫測定法（ラジオイムノアッセイ、Ｒ　Ｉ　Ａ　），　
Ｅｎｚｙｍｅ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅ
ｎｔＡｓｓｅｙ（ＥＬＩＳＡ），凝集法および蛍光抗体
法等、免疫学領域で一般に用いられる方法でアッセイす
る。

クローニング工程は、目的の特異抗体産生細胞を一つの
クローンから由来した均一な細胞集団とする工程である
。限外希釈法、軟寒天法、単細胞マニュピレーション（
Ｓｉｎｇｌｅ　ｃｅｌｌ　ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）
法などによって、モノクローン（単一性クローン）から
由来した増殖の迷い緑膿菌外毒素と反応する抗体を産生
ずる安定した細胞株、所謂ハイブリドーマを得る。

・このハイブリドーマを公知の方法、例えば、ＤＮＡ変
異剤などの化学的処理およびＵＶ照射など物質的処理に
より、増殖能や抗体産生能を高めるなどの改良を加えた
ハイブリドーマ子孫細胞を得ることができる。この子孫
細胞が親ハイブリドーマと同じく、本発明に記載の生物
学的・物理学的特性を保持していることは言うまでもな
い。

本発明の抗体は、該ハイブリドーマを試験管内で無血清
培地や血清を含む通常の動物細胞用培地で培養した培養
上清、又はプリスタン（２，　６，　１０，　１４ｔｅ
ｔｒａｍｅｔｈｙｌ　ｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ，　Ａｌ
ｄｒｉｃｈ社）を前投与したマウス等の動物に接種し、
生体内培養することによって得た生体浸出液から精製さ
れる。すなわち得られた培養上清又は生体浸出液を通常
の蛋白精製に用いられる生化学的手法，例えば硫酸アン
モニウムによる沈澱法、イオン交換クロマトグラフィー
法、ゲル濾過法およびマフィニティーク口マトグラフィ
ー法に供することによって精製される。

精製されたモノクローナル抗体は、生物学的製剤の製剤
化に通常用いられる方法によって製剤化される。基本的
には、メンブレンフィルター等による濾過除菌操作の後
に、安定化剤とともに滅菌バイアルに凍結乾燥される。

本モノクローナル抗体製剤は、細菌感染治療・予防剤と
して、緑膿菌外毒素に対する１種類のモノクローナル抗
体より成ることも可能であるが、更に好ましくは、緑膿
菌外毒素分子の異なる抗原決定部位を認識しうる、少な
くとも２種類又はそれ以上のモノクローナル抗体と混合
して用いられる。又は緑膿菌外毒素以外の緑膿菌由来抗
原、例えばエステラーゼ、プロテアーゼなどの緑膿菌外
毒素や外膜蛋白・内毒素構成成分などを認識する従来型
の抗体と混合して使用される。更には、緑膿菌以外の細
菌、ウイルス、真菌、原虫、癌細胞に対する抗体に、本
発明によって得られる緑膿菌外毒素に対するモノクロー
ナル抗体を添加して用いることができる。　従来の免疫
グロブリン製剤に、本発明によって得られるモノクロー
ナル抗体を添加して、外毒素に対する高力価免疫グロブ
リン製剤とされる。

本発明によって得られるモノクローナル抗体は主として
クラスＩｇＧに属するがこれに限定されたものではない
。

本モノクローナル抗体は、前記の特性を持つモノクロー
ナル抗体であれば、マウス抗体、ヒト抗体、マウスーヒ
ト・キメラ抗体、クラス・サブクラス変換抗体など、す
べて含まれる。また、ハイブリドーマ法以外でも、例え
ばＤＮＡ組換え法など既知の抗体作製技術を用いて作製
されたモノクローナル抗体も含まれる。

外毒素Ａ産生緑膿菌による感染症および、その細菌を含
む混合細菌感染症の治療・予防に用いられる時、本モノ
クローナル抗体を少なくとも１種類含む免疫グロブリン
製剤は、重症の場合成人あたり１回１〜１０ｇ、予防や
通常の治療の場合成人あたり１回０．２〜５ｇが投与さ
れる。本モノクローナル抗体そのものとして、１回１０
〜５００■が投与される。

本発明のモノクローナル抗体を利用する緑膿菌外毒素Ａ
の定量および外毒素Ａ産生緑膿菌感染症の診断としては
、通常の抗体を用いる免疫化学的定量法および診断法が
考えられ、当該モノクローナル抗体が利用可能であれば
制限はない。例えば放射性同位元素免疫測定法（ＲＬＡ
）　、酵素免疫測定法（Ｅ　Ｉ　Ａ）および凝集法等が
例示される。

本発明のポリペプチド、ペプチドおよびその塩は、通常
のペプチド化学において用いられる方法に準じて合成さ
れる。

すなわち、液相法、固相法のいずれによっても得ること
ができる。

本発明のポリペプチドまたはその塩は、通常凍結乾燥品
の態様で製剤化されて、経口的または非経口的に投与さ
れる。その剤型は投与ルートに応じて変わり得るが、た
とえば注射剤の場合は、本発明のポリペプチドもしくは
その塩自体または常套の添加剤とともに自体公知の手段
にて調製した凍結乾燥品を、用時注射用蒸留水等に溶解
して用いる態様の製剤とすることが好ましい。

投与方法としては筋注、皮下注、静注などが特に好まし
く、またヒト以外の動物に投与する場合は、飼料に添加
することも可能である。

たとえばワクチンとして使用する場合は、本発明ペプチ
ドまたはその塩自体あるいは蛋白質（たとえば血清アル
ブミンなど）などと結合させた結合体として数回投与す
ることにより作用を発揮させることができる。投与量は
、成人に対しては５〜１００μｇ／１回投与が一般的で
ある。投与回数は、１ケ月の間隔をおいて２回投与し、
予備免疫の後６ケ月〜１年後に追加投与することが好ま
しい。

〈発明の効果〉 本発明によって得られるモノクローナル抗体は、緑膿菌
外毒素Ａの２４１〜２９７番目のアミノ酸部位（　ドメ
イン■）を認識し、同抗原にたいして高い抗体価を有し
、従来のモノクローナル抗体よりも、はるかに優れた治
療効果を示す。

従来知られている、治療効果のあるモノクローナル抗体
は、ドメインエ（レセプター機能をもつ領域）又は、ド
メイン■（酵素活性をもつ領域）を認識するものであっ
た。ドメイン■の機能は充分には解明されておらず、治
療効果への関与について示唆されていなかった。

また、緑膿菌外毒素Ａは、動物、細胞表面のレセプター
と結合後、エンドサイトシスによって細胞内へ取り込ま
れ、リンゾームと融合され、ファゴリソゾームを形成す
ると考えられている。そこでは、リソゾーム由来のプロ
テアーゼ等の分解酵素が酸性条件下で作用し、外毒素Ａ
を分解することによって外毒素ＡのもつＡＤＰホスフォ
リボシルトランスフエラーゼ（酵素）活性が活性化、ひ
いては蛋白生合成因子の一つである伸長因子２　（ＥＦ
−２）がＡＤＰ　’Ｊボシル化され、蛋白合成が阻害さ
れると考えられている。ｐＨ３．　５−４．　０の酸性
下においても抗原結合活性を保持するモノクローナル抗
体は、酸性下において抗原抗体活性複合体を形成するこ
とから、外毒素の細胞への結合・侵入および細胞内輸送
・変換を阻害する活性をもち、外毒素産生性緑膿閑によ
る実験的マウス感染症を治癒することができる。即ち、
外毒素Ａの細胞内毒性発現を押さえ、強い治療効果を有
すると考えられる。

さらに、抗原への結合定数が高いモノクローナル抗体は
、治療効果が高く、定量用試薬としても有用である。緑
膿菌外毒素Ａに対する結合定数が１０８　４／モル以上
と高い結合定数を有するモノクローナル抗体はこれらの
利点をもつものである。

次に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが
、本発明はこれのみに限定されないことは言うまでもな
い。

実施例１　抗体産生細胞の樹立 （１）　　抗原の調製 Ｅｘ−Ａとして、外毒素産生緑膿菌株ＰＡ１０３（ＡＴ
ＣＣ　２９２６０）の培養上清から陰イオン交換樹脂、
ヒドロキシアパタイトを用いて精製された市販品（Ｓｗ
ｉｓｓ　Ｓｅｒｕｍ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，　Ｂｅｒｎ
，　Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用した。市販緑膿菌
外毒素Ａをリン酸緩衝液（ｐＨ７．　２　，組成ＮａＣ
ｌ（８ｇ／　ｉ’　）　、ＫＣＩ（０．２　ｇ／　１’
）、Ｎａ２ＨＰＯｔ　　”　１２Ｈ２０（２．９９ｇ／
　Ａ）およびＫＨ２Ｐ０４（０．　２ｇ／Ｉｌ）：以下
ＰＢＳと略す）に対し透析し免疫原として用いた。

（２）免疫婢臓細胞の調製 ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、初回免疫時４週令、体重約１
５ｇ）を免疫に供した。緑膿菌外毒素Ａを５μｇ／一の
濃度で含有するＰＢＳ　１容とフロイント完全アジュバ
ント１容を常法に従い混和し、マウスー匹あたり混和液
０．２１ｎｌ（緑膿菌外毒素ＡＯ．　５μｇを含有）を
皮下投与することによって初回免疫した。以後、２週間
隔にて４回、フロイント不完全アジュバントと混和した
緑膿菌外毒素Ａを順次２μｇ，１０μｇ，２０μｇ，２
０μｇ皮下投与し、追加免疫を行なった。最後の追加免
疫の約１ケ月後、凍結融解を２０回繰返す事により変性
せしめた緑膿菌外毒素Ａ２０μｇを静脈内投与する事に
より最終免疫した。３日後に牌臓を摘出、イーグルのＭ
ＥＭ培地（半井化学）に懸濁された牌臓細胞を得た。

なお、一部の実験で、４回目の追加免疫の約１ケ月後に
フロイント不完全アジュバントと混和した緑膿菌外毒素
Ａ２０μｇを皮下投与し、計５回の追加免疫を行なった
。

（３）細胞融合 マウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８−６５３（ＡＴＣ
Ｃ　ＣＲＬ１５８０）を１０％ウシ胎児血清ＦＣＳ（Ｇ
ｉｂｃｏ）添加ＲＰＭＩ−１６４０培地（半井化学）中
で培養し、対数増殖期で細胞を集め細胞融合に用いた。

融合方法は、Ｋｏｈｌｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，
　４９５−４９７．　１９７５）の方法に準じた。

即ち、牌臓細胞と骨髄腫細胞とを５＝１の比率で血清不
含のＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁し、ＬＯＯＯｒｐｔ
ｎ　（トミー精工ＣＤ−１０ＯＲ）にて７分間遠心分離
した。沈査に、３７℃に保温された４５％（Ｗ／Ｗ）ポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ）４０００，１０％（ｖ
／ｖ）シメチルスルホキシドの溶液１ｄを１分間かけて
添加し、さらに３７℃にて１分間静置した。次いで、血
清不含ＲＰＭＩ−１６４０培地２ｄを１−／Ｉｍｉｎの
割合で加え懸濁した。更に、血清不含ＲＰＭＩ−１６４
０培地７ｍｌを徐々に加えＰＥＧを希釈した。３７°０
２０分間静置の後１，　ＯＯＯｒｐｍで７分間遠心分離
、その後マウス骨髄腫細胞として６Ｘ１０’／ｍ７！の
細胞濃度が得られるように、１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ−
１６４０培地に再懸濁し、９６穴マイクロプレート（住
友ベークライトＭＳ−３０９６Ｆ）に０．２Ｊ／穴（ウ
エル）ずつ分注した。この融合細胞を５％Ｃ０２におい
て３７℃で培養した。

細胞融合の１日後に、半分量の培地を新たなＨＡＴ培地
（１０−’Ｍヒポキサンチン、４Ｘ１０−’Ｍアミノプ
テリン、１．　６　ＸＩＯ　’Ｍチミジンを含むＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地）と交換した。以後、２日毎にＨＡＴ
培地による半量交換を３回行った。

１０日後には、７０％のマイクロプレート穴で、細胞の
増殖が観察された。

＋４）ＥＬＩＳＡによる抗緑膿菌外毒素Ａ抗体価の測定 抗緑膿菌外毒素Ａ抗体価の測定は以下の方法で行なった
。緑膿菌外毒素ＡをＰＢＳへ０．５μｇ／ｍｌの濃度に
溶解し９６ウェルマイクロプレート（ファルコン＃３９
１２）　　（マイクロプレートと略）に１ウェル当たり
１００μβずつ分注し、４℃で一晩インキユベートした
。マイクロプレートから外毒素Ａ溶液を除去した後３％
ウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡと略称する’）ＰＢＳ
溶液をｌウエルあたり１２０μβずつ分注し３７°Ｃに
て３０分間インキユベートすることにより外毒素Ａの未
吸着部分をブロッキングした。マイクロプレートを抗原
吸着プレートとして以後の操作に用いた。

アッセイ前に抗原吸着プレートを０．ｏ５％Ｔｗｅｅｎ
　２　０含有ＰＢＳ　（以下ＰＢＳＴ略）で３回洗滌し
た。その後ＰＢＳＴを１ウェルあたり５ｏμｌ分注、必
要に応じＰＢＳＴで適宜希釈した試料（血清腹水又は培
養上清）を１ウェルあたり５ｏμβ加え、３７℃で２時
間インキユベートした。

その後試料を除去し、ＰＢＳＴで３回洗浄した。

続いて第２抗体液を１ウェルあたりｌｏｏμｌずつ加え
、３７℃で２時間インキユベートした。第２抗体として
ＰＢＳＴで５００〜１，ｏｏｏ倍希釈したホスファター
ゼ標識アフィニティ精製抗マウス免疫グロブリン抗体（
Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　＆　ＰｅｒｒｙＬａｂ．　Ｉｎ
ｃ．）を用いた。ＩｇＧ，ＩｇＭ抗体価の測定にはそれ
ぞれホスタファーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体、抗マウス
ＩｇＭ抗体を用いた。第２抗体を除去し、ＰＢＳＴで３
回洗滌後、発色基質溶液？３■のＰ−ニトロフェニルリ
ン酸−２−ナトリウム塩を１１ｎｌのＮａＮ３（０．　
２ｍｇ／ＩＪ）ＭｇＣｌ■ａ　６Ｈ２０（０．　１ｍｇ
　／ｍｌ　）を含む１０％ジエタノールアミン緩衝液ｐ
Ｈ９．１に溶解した水溶液）をｌウェルあたり１００μ
ｌずつ加え、３７℃で反応させた。

４５分間反応後のｏＤ．ｏ５をマルチスキャン（Ｔｉ　
ｔｅｒｔｅｋ）で測定した。

アッセイの結果、４２ウェルで特異抗体の産生が認めら
れた。

（５）　　抗体の免疫グロブリンクラスの同定ハイブリ
ドーマの培養上清７５μｌを、オクタロニーの二重免疫
拡散法に基づくモノクローナル抗体タイピッグキット（
生化学工業）に付して、温室（２３土３°Ｃ）にて２４
時間インキユベートし、抗原抗体沈降物を観察し、サブ
クラスを同定した。抗血清としては、マウス免疫グロブ
リンγ１　γ２，　γ２，　γ３，αおよびμに対する
ヒツジポリクローナル抗体（Ｍｉｌｅｓ）を用いた。

代表的なＥＬＩ　ＳＡ陽性例につき培養上清の抗体価お
よび免疫グロブリンクラスを表１に記す。

表１ 抗体産生細胞　グラス・サブクラス　ＥＬＩＳＡ抗体価
（ＯＤ４０５）ｎ．ｔ．　　：ｎｏｔ　　ｔｅｓｔｅｄ
（６）　　腹水化 ４週間前にプリスタン（２，　　６，　　１０．　　１
４−テトラメチルペンタデカン；　　Ａｌｄｒｉｃｈ　
ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．　　Ｉｎｃ．，Ｗｉｓｃｏｎｓ
ｉｎ　）を一匹あたり０，５−にて投与したＢａｌｂ／
Ｃマウスに、クローニング後試験管内培養にて増殖させ
たハイブリドーマ５　Ｘ　Ｌ　Ｏ’細胞を腹腔内へ接種
し、７〜１４日後、マウスの腹腔より腹水を採取した。

（７）精製 マウス腹水をプロテインＡモノクローナル抗体精製シス
テムＭＡ　Ｐ　Ｓ　Ｕ　（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂ；Ｎ
ｅｗ　Ｙｏｒｋ）にて精製した。すなわち腹水と該シス
テムに添付されている結合バッファ−ｐＨ９．０とを１
対ｌに混合し、アフィゲルプロテインＡカラムにアブラ
イト結合バッファーで洗浄した。溶出バッファ一ｐＨ３
．０で溶出後ただちにＰＢＳに対して透析した。

実施例２　　腹水を用いた緑膿菌外毒素Ａに対する抗体
価、細胞毒性中和活性による抗体産生株の選抜および酵
素活性中和能、細胞内取込み阻害活性の尉定（インビト
ロ） （１）ラジオイムノアッセイ（Ｒ　Ｉ　Ａ）による腹水
の抗体価の測定 ９６ウェルマイクロプレート（Ｆａｌｃｏｎ　＃３９１
２Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を洗浄しｌウエ
ルあたり２．００μｌのｌ％ＢＳＡを含むＰＢＳを添加
後３７℃、３０分間インキユベートした。次にｌ％ＢＳ
Ａを含むＰＢＳを除去し３７℃、１０分間乾燥後ＰＢＳ
にて３回洗浄した。洗浄後１％正常マウス血清（以下Ｎ
ＭＳと略す）を含むＰＢＳ（−）にて希釈したマウス腹
水５０−と１％ＮＭＳを含むＰＢＳにて希釈した１２５
Ｉ標識Ｅｘ−Ａ　（約２３，　５００ｃｐｍ）　５０１
ｎｌを各ウェルに添加し３７℃、２時間、更に４℃一夜
インキユベートした。翌日更にＰＢＳにて４倍に希釈し
たウサギ抗マウスＩ　ｇ　（ＣＯＤＥＮｏ．３１９ＭＢ
Ｌ　）４５１ｎｌを各ウェルに添加し３７°ＣＩ時間さ
らに４°ＣＩ時間インキユベートした。

１，５００ＸｇにてｌＯ分間遠心後、上清を除き、各ウ
ェルを分離してγ一カウンターにより放射能量を測定し
た。

その結果を表２に示す。

表２　腹水のＲＩＡ抗体価 Ｅｘ−３Ｃ７，　Ｂｘ−４Ｆ２，　Ｅｘ−８Ｈ５が緑膿
菌外毒素Ａに対し高い抗体価を有していた。

（２）培養細胞を用いた細胞毒性中和試験による細胞毒
性中和活性の測定 培養細胞の蛋白合成能を指標とし、緑膿菌外毒素Ａの細
胞毒性に対するモノクローナル抗体の中和効果を検討し
た。マウスＢａｌｂ／ｃ　３Ｔ３細胞を２．０×１０５
細胞／一の割合で１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地に懸濁
し９６ウェルマイクロプレート（住友ベークライトＭＳ
−３０９６Ｆ）にｌウェルあたり１００μｌずつ播種し
て５％ＣＯ２、３７℃にて一夜培養した。

抗Ｅｘ−Ａマウスモノクローナル抗体の腹水をｌＯ％Ｆ
ＣＳ含有ＤＭＥＭ培地を用い５０倍に希釈し、抗体溶液
とした。緑膿菌外毒素Ａを０．１ｎｇ／ｍ／の濃度に１
０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地に溶解し外毒素Ａ溶液とし
た。抗体溶液と外毒素Ａ溶液を等量ずつ混合し、室温３
０分間中和反応を行った後１００μ１／ウェルの割合で
上記Ｂａｌｂ／ｃ　３Ｔ３細胞に添加した。次に５％Ｃ
Ｏ２、３７℃にて１４時間培養後上清を１００μｌ除去
し、３Ｈ一ロイシン３（０。２５　μｃｉ／ｗｅｌｌ；
Ｉ　Ｃｉ／ｍｇ；Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐｏｒａｔ
ｉｏｎ，Ｉ１１ｉｎｏｉｓ）を添加し、更に２時間培養
した。細胞をＰＢＳ（−）で３回洗浄後０．　１　Ｎ　
ＮａＣＩ｛で細胞をプレートよりはがし、細胞を浮遊さ
せた。あらかじめ４℃に冷却した１０％トリクロ口酢酸
ＣＴＣＡで４℃、３０分間インキュベート後ＴＣＡ不溶
性画分に取り込まれた３Ｈ量を液体シンチレーションカ
ウンター（ベツクマン）で測定した。緑膿菌外毒素Ａに
よる蛋白合成の阻害を５０％以上中和した抗体を中和効
果陽性とした。その結果を表３に示す。

表３　モノクローナル抗体の細胞毒性中和活性Ｅｘ−３
Ｃ７，　Ｅｘ−４Ｆ２，　Ｅｘ−８Ｈ５が緑膿菌外毒素
Ａの細胞毒性に対する中和効果を有していた。

（３）酵素活性中和活性の測定 マウス抗Ｅｘ−Ａモノクローナル抗体が、Ｅｘ−Ａの酵
素活性すなわちｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　
ＩＩ　（以下ＥＦ■と略す）に対するＡＤＰ　ｒｉｂｏ
ｓｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（以下ＡＤＰＲＴａｓ
ｅ）活性を中和するか否かを検討した。

■ＥＦＩＩの精製 Ｄ．　Ｗ．　Ｃｈｕｎｇらの方法（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍ
ｍｕｎ．　１６，　８３２−８４１（１９７７））に従
いＥＦｎを精製した。すなわちｗｈｅａｔ　ｇｅｒｍ　
（Ｓｉｇｍａ）　３　０　ｇにあらかじめ冷却したバッ
フｙ−（５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０．５　０
ｍＭ　ＭｇＯＡｃ，　　０．　１Ｍ　Ｋｃｌ，　４ｍＭ
　ＣａＣＩ２．５ｍＭ２−メルカプトエタノール（２−
ＭＥ）、ｌμｇｌ−フェニルメチルスルフォニルフルオ
ライド）（ＰＭＳＦ）２４（Ｗを加えＷａｒｉｎｇｂｌ
ｅｎａｌｅｒでホモジエナイズした。２１，　ＯＯＯＸ
　ｇ　１５分間更に２５０，　０００　Ｘｇ１時間遠心
分後３０〜５０％飽和硫酸アンモニウムで分画した。透
析バッファ一（５０ｍＭ｝リス塩酸緩衝液ｐＨ７．５、
１ｍＭ　　ＥＤＴＡ，２ｍＭ　　２−ＭＥ、１μｇ／ｉ
ＰＭｓＦ）２４−に溶解し、固バッファーに対して透析
後２０，ＯＯＯＸ　ｇ，　２　０分遠心した。上清にグ
リセロールを５％（Ｖ／Ｖ）、ジチオスレイトール（Ｄ
ＴＴ）を２ｍＭとなるように添加し−７０℃で保存した
。

■　Ｅｘ−Ａの活性化 Ｅｘ−Ａ（０、５ｍｇ／ｍｇ）を４Ｍ尿素、１％（Ｗ／
Ｖ）ＤＴＴ存在下２２℃、１５分間インキユベートする
ことにより活性化した。

■　ＡＤＰＲＴａｓｅ活性の測定 Ｍ．Ｐｏｌｌａｃｋらの方法（Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉ
ｓ　１４５　６Ｂ８６９８（１９８２）　）　に従って
行なった。すなわちｌ′ＣＮＡＤ＋溶液（３．４μＭの
濃度で”Ｃ−ＮＡＤ”　　（アマシャム０．２８７Ｃｉ
　ｌｍｍｏｌ）を２５０μＭ　ＥＤＴＡ，２００ｍＭ　
Ｄ　Ｔ　Ｔ含有５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ　８．２
に溶解した溶液）２５μｌに■で調製したＥＦＨ液２５
μｊｌ’を加え、更に５　０　ｎｇ／ｆａｂｅの■で活
性化したＥｘ−Ａとあらかじめ室温で３０分間インキユ
ベートしたマウス腹水ｌＯμｌを加えることによって反
応を開始した。室温で５分後６０μｌの冷却したｌＯ％
ＴＣＡを加えた後氷上でＩＯ分間放置した。ＴＣＡ不溶
性画分をグラスフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ，　Ｇ　Ｆ
　／　Ｃ　）に集め取り込まれたＩＩｃ量を液体シンチ
レーションカウンター（ベックマン）で測定した。

その結果を表４に示す。

モノクローナル抗体Ｅｘ−２Ａ１０の腹水は、Ｅｘ−Ａ
によるＥＦＩＩＡＤＰリボシル化を強く阻害した。すな
わち、強い酵素活性中和能を示した。一方、Ｅｘ−３０
７は、阻害しなかった。

（４）Ｅｘ−Ａの細胞内取込み阻害活性の測定Ｂｘ−Ａ
の細胞内への取込みに対するモノクローナル抗体による
阻害活性をＭ．　Ｄ．　Ｍａｎｈａｒｔ　らの方（Ｉｎ
ｆｅｃｔ．　Ｉｍｍｏｎ．　４５　５９６−６０３（１
９８４））に従って測定した。

すなわち、マウスＢａｌｂ／ｃ　３Ｔ３細胞を２．　Ｏ
　Ｘ　ｌ　０　５細胞／ｄの割合で１０％ＦＣＳ含有Ｄ
ＭＥＭ培地に懸濁し６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ　
＃３０４６　Ｂｅｃｔｏｎ？Ｄｃｋｉｎｓｏｎ）に１ウ
ェルあたり２ｍｎずつ播種して５％ＣＯ■、３７℃にて
３日間培養した。１００ｎｇ／ｍＩｌの”　Ｉ　−Ｅｘ
−Ａ（　３．　２　ｘ　ｌ　０　６ｃｐｍ／μｇ１００
　Ｃｉ／ｒｎ　ｍｏｌ）と、ＰＢＳで５０倍に希釈した
腹水を混合し、室温３０分間放置後、ｌウェルあたり２
．５ｍｊ２のＰＢＳで３回洗浄後０．　Ｉ　Ｎ　ＮａＯ
Ｈをｌウエルあたり２ｍ　Ｉｌずつ加えて細胞を溶かし
、取り込まれた１２５１量をガンマカウンターで測定し
た。

その結果を表５に示す。

表５　　１２５Ｉ　−Ｅｘ−Ａ取込み阻害活性モノクロ
ーナル抗体Ｂｘ−４Ｆ２およびＥｘ−３Ｃは、２５Ｉ　
−Ｂｘ−Ａの細胞内への取込みを強く阻害した。

Ｂｘ−４Ｆ２の方がＥｘ−３Ｃ７より、阻害活性が強か
った。

実施例３　精製モノクローナル抗体の生物活性の比較検
討（イン・ビトロ） 実施例２で選抜したモノクローナル抗体Ｅｘ−３Ｃ７、
Ｂｘ−４Ｆ２、Ｂｘ−８Ｈ５および対照抗体のＥｘ−２
Ａ１０（あるいは５ｃｌｌ）について精製品を作製し、
精製品について実施例２記載と同様の実験を行なった。

（１１抗体価 精製モノクローナル抗体を用いて実施例２（１）の項記
載の方法により、を測定した。抗体価最大結合量の５０
％の結合を与えるモノクローナル抗体濃度を表６に示す
。

表６　精製品のＲＩＡ抗体価 ロイシンを添加するかわりに、１ウェルあたり　１００
μｌの固定液（１０％ホルマリン）を加え室温にて１０
分間静置した後固定液を除去、１ウエルあたり５０μβ
の色素液（０．　０５％クリスタルバイオレット（半井
化学）を加えた。室温にて３０分間静置した後、色素液
を除去し、１ウェルあたり２５０μｌの蒸留水で３回洗
浄した。

１ウェルあたり１００μｌの抽出液（０．１％酢酸、５
０％メタノール）を加えて５分間攪拌後、ＣＤ５．。を
測定した。その結果を表７に示す。

（２）細胞毒性中和活性 精製モノクローナル抗体を用いて実施例２（２）の項記
載の方法により、細胞毒性中和活性を測定した。

すなわち１ウェルあたり、０．１ｎｇの精製抗体と０，
００１ｎｇのＥｘ−Ａを加え、５％ＣＯ２、３７℃にて
１４時間培養し、その上清を除いた。次いで３ＨＥｘ−
３Ｃ７は高い細胞毒性中和活性を示した。

Ｅｘ−４Ｆ２、Ｅｘ−８８５も中和活性を示したが、Ｅ
ｘ−２Ａ１０には中和活性が認められなかった。

（３）酵素活性中和活性 抗体として腹水のかわりに精製抗体５μｇ／ｔｕｂｅ弘
２ を用い、実施例２（３）の項記載の方法により酵素活性
中和活性の測定を行なった。

結果を表８に示す。

×１００として 酵素活性中和能をパーセント（％）で表示した。

表８　精製品による酵素活性中和活性 で５０倍に希釈した腹水を混合するかわりに、４６ｎｇ
／ｎｕの１２５Ｉ−Ｅｘ−Ａと３　０　〜３　０　０ｎ
ｇ／ｍＡの精製モノクローナル抗体をもちいた。その結
果を表９に示す。

表９　　”　Ｉ　−Ｅｘ−Ａ取込み阻害活性モノクロー
ナル抗体Ｅｘ−２Ａ１０は、ＥＦＩＩ　　ＡＤＰリボシ
ル化を強く阻害した。一方、Ｅｘ−３Ｃ７は、全く阻害
しなかった。

（４）Ｅｘ−Ａの細胞内取込み阻害活性Ｅｘ−Ａの細胞
内への取込みに対するモノクローナル抗体による阻害活
性を実施例２（４）の項記載の方法により行なった。１
　０　０ｎｇ／ｍｌの１２５　　Ｉ　−３ｘ−Ａ（３　
．　　２　ｘ　ｌ　０　６ｃｐｍ／，Ｂ＝１００　Ｃｉ
／ｍ　ｍｏｌ）と、ＰＢＳモノクローナル抗体Ｅｘ−４
Ｆ２およびＥｘ−３Ｃ７は、２５Ｉ−Ｅｘ−Ａの細胞内
への取込みを強く阻害した。

Ｅｘ−４Ｆ２の方がＥｘ−３Ｃ７より、阻害活性が強か
った。

実施例４　精製モノクローナル抗体の生物活性の比較検
討（イン・ビボ） （１）　　ｉｎ　ｖｉｖｏ投与系における毒性中和活性
（治療効果） 抗Ｅｘ−Ａマウスモノクローナル抗体精製品をマウスー
匹あたり２０μｇまたはＢＳＡをマウスー匹あたり５ｍ
ＭをＩＣＲ−ｓｌｃマウス（４週令雄１群１０匹）の腹
腔内に投与し、１時間後腹腔内にＥｘＡを０．　８μｇ
接種した。ＥＸ−Ａ接種後７日後の生残率を表１０に示
す。

表１０　Ｂｘ−Ａ接種７日後の生残率 モノクローナルＥｘ−３Ｃ７は、Ｅｘ−４Ｆ２，　Ｅｘ
−８Ｈ５に比べ、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて強い毒性中和
活性を示した。

（２）マウス実験的緑膿菌感染症における肝臓での蛋白
合成低下に対する抗体の効果 ■マウス熱傷感染実験 背部の毛を刈り取ったＩＣＲ−ｓｌｃマウス（雄４週令
１群１０匹）をベントバルビタールで麻酔し４枚重ねに
したグラスファイバー紙（ワットマンＧＦ／Ｆ）にエタ
ノールを浸み込ませて点火しｌＯ秒間マウスの背部に押
しあてることによって熱傷を作製した。その後無菌生理
食塩水０．３−を腹腔内に投与し、外毒素産生緑膿菌Ｐ
Ａｌ０３の菌液０．２Ｊ　（１．ＯＸ１　０’　ＣＦＵ
）を熱傷部に皮下接種することにより感染させた。感染
２時間後にＰＢＳに溶解した抗体０．　２　−　３　８
　０　ｕ　ｇ／ｈｅａｄを静脈内に投与し、感染２２時
間後断頭によって脱血死させた。開腹、肝臓を摘出し肝
臓の蛋白合成能を測定した。

■肝臓の蛋白合成能の測定 肝臓での蛋白合成能の指標として活性の有る蛋白合成伸
長因子（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ−２，　
Ｅ　Ｆ　−　２　）量を測定した。

Ｂ．　Ｈ．　Ｉｇｌｅｗｓｋｉらの方法（Ｉｎｆｅｃｔ
．Ｉｍｍｕｎ．１５，　１３８−１４４（１９７７））
に従ってマウス肝臓よりＥＦ−２溶液を調製した。すな
わちＩＣＲ−ｓｌｃマウス（雄、５週令）を断頭脱血後
肝臓を採取し臓器重量の４倍重量の０．２５Ｍシヨ糖溶
液を加え、４℃でホモジェナイズした。これ以降４℃で
操作を行なった。ホモジェネート８１ｎｌを遠心チュー
ブにとり２０　μｇＭＤＴＴ含有４Ｍ　ＮａＣｌ　１　
３ｉおよび洗浄した活性炭２．１ｇを加えて１５分振と
うした。

１３５，０００ｘ　ｇ，　３　０分間遠心し、その上清
を−７０℃で保存した。

溶液中の活性の有るＥＦ−２量の測定はＭ．　Ｐｏｌｌ
ａｃｋらの方法（Ｊ．ｌｎｆｅｃｔ．　Ｄｉｓ，１４５
　６８８６９５（１９８２）　）に従って行なった。す
なわち７．５μｇ／一の濃度で反応バッファ一（５００
μＭＢＤＴＡ、１５０ｍＭ　ＤＴＴ，　０．　１％（Ｗ
／Ｖ）　Ｂ　Ｓ　Ａ含有１００ｍＭ　トリス塩酸緩衝液
）に溶解したＥｘ−Ａ溶液０．３−に１４Ｃ−ＮＡＤ　
（マアシャム，ＣＰＡ，４９７．４■／一、３０３ｍ　
Ｃｉ　／ｍｍｏｌ）　１０μ１　，　Ｅ　Ｆ　−　２液
０．１ｍ７！を加え２０℃で３０分間反応を行なった。

あらかじめ冷却しタ１０％　ｆｆ／Ｖ）　Ｔ　Ｃ　Ａ　
０．　４　ｙｄを加えることによって反応を停止し、氷
上で３０分間放置した。

グラスフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ　Ｇ　Ｆ　／　Ｃ　
）にＴＣＡ不溶性画分を集め５０１ｎＩｌの５％ＴＣＡ
で洗浄後乾燥して、液体シンチレーションカウンターで
取り込まれたｌｔｃ量を測定し、肝臓中のＡＤＰリボシ
ル化されていない活性の有るＥＦ−２量、すなわち肝臓
の蛋白合成能の指標とした抗体無投与のマウスでは菌を
接種していないコントロールのマウスと比較して肝臓の
蛋白合成能が１／１０位以下だった。ＥＸ−３Ｃ７，　
ＥＸ−４Ｆ２，　ＥＸ−８Ｈ５は接種した緑膿閑により
産生された外毒素Ａに起因する肝臓での蛋白合成能低下
に対し防御効果が認められた。

方Ｅｘ−２Ａ１０には活性が認められなかった。肝臓の
蛋白合成能をコントロールマウスの５０％まで回復させ
る抗体の投与量（ＥＤ５ｏ）を表１１に示す。

表１１　　肝臓の蛋白合成能低下に対する抗体の効果モ
ノクローナルＥｘ−３Ｃ７は、Ｅｘ−４Ｆ２，　Ｅｘ−
８Ｈ５に比べ高い効果を示した。

実施例５　抗原決定基の同定 （１）　　Ｅｘ−Ａ分子の断片化および抗体との反応性
（１）−１．　　リジルエンドペプチダーゼ処理断行４
０Ｋに対する反応性 Ｅｘ−Ａを４Ｍ尿素を含む５０ｍＭ｝’，ｌス塩酸緩衝
液ｐＨ９．０にｌｍｇ／一になるように溶解し、さらに
５０ｍＭトリス塩酸緩衝液を等量加えＥｘ−Ａ濃度を０
．　５■／一とする。リジルエンドペプチダーゼ（和光
純薬）を８μｇ／一となるように加え、３７℃で２時間
反応させた後等量のリジルエンドペプチダーゼを加え、
さらに３７℃で２時間反応させる。フェニルメタンスル
フォニルフルオリト（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ
ｏｍｐａｎｙ；Ｍｉｓｓｏｉｒｕ　）　５　ｐ　ｇ／一
で反応を停止させる。この反応混液を高速液体クロマト
グラフィーシステム（島津製作所Ｃ−Ｒ５Ａ）を用いて
０．　１％トリフルオロ酢酸を含む１０％アセトニトリ
ルで平衡化した逆相カラム（住化分析センターＡ２１１
　０ＤＳ）にアプライし、アセトニトリルの濃度を９０
分間で１０％から７０％まで直線的に上昇させることに
よって分画し、分子量約４０，　０００の主画分を得た
。

本画分をペプチドシークエンサ−（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ，　４７７　Ａ／　１２ＯＡ）に供し
たところＥｘＡ分子の２４１番目以降に相当した。一方
本画分を用いた（１）に示した方法に従ってＥＬＩＳＡ
　ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｎを行なったところ本画面はＥｘ
−３ｃ７と反応した。

５ｌ （１）−２　　カルボキシペプチダーゼＹ処理断片４０
Ｋに対する反応性 ６Ｍ尿素を含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６
．　０にｌｍｇ／艷に溶解したＥｘ−Ａにカルボキシペ
プチダーゼＹ（宝酒造）を２５μｇ／一になるように加
え、３７°Ｃ，３０分間反応させた。

これを２％ＳＤＳ，５％２−メルヵプトエタノール、ｌ
Ｏ％グリセロールを含む１２５ｍＭ　トリス塩酸緩衝液
ｐＨ６．　８中で１００℃、５分間加熱処理し、ＳＤＳ
／ポリアクリルアミドゲル電気泳動後ゲルをトランスフ
ァーバッフｙ　−　（１　０ｍＭＣＡＰ３　１０％（ｖ
／ｖ）メタ／　一／ｌｚ，ｐＨ　１１．０）　ニ室温で
３０分間浸漬した。メタノールに１分間浸漬した後３０
分間トランスファーバッファーに浸漬したポリビニルジ
フルオリド（ＰＶＤＦ）膜（ミリポア）に４℃で電気的
（５０Ｖ，ｌＯｈ）にトランスファー後２％カゼイン含
有ＰＢＳ（−）で室温３０分間インキユベートすること
によりプロツキングした。

更に２％カゼイン含有ＰＢＳで１，　０００倍に希釈し
たＥｘ−３Ｃ７の腹水を室温、２時間インキュベートし
、０．０５％Ｔｕｃｅｎ　２　０含有ＰＢＳでＰＶＤＦ
膜を３回洗浄後、第２抗体（２％カゼイン含有ＰＢＳＣ
）で１，　０００倍に希釈されたアルカリフォスファタ
ーゼ標識抗マウスイムノグ口ブリンＧ抗体）と３７％、
２時間インキユベートした。同様に０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ　２　０含有ＰＢＳで５回洗浄後、発色基質溶液（０
、５■、４−ブロモー２−クロロインドフェノールリン
酸をｌｍ他、（ＮａＮ３（０．２ｍｇ／Ｊ）　，ＭｇＣ
Ｏ２　　・６Ｈ２０　（０．　１■／一）を含む１０％
ジエタノールアミン緩衝液ｐＨ９、１）とインキユベー
トし、発色させた。

その結果Ｅｘ−３Ｃ７は分子量約４０Ｋの主バンドとは
反応しなかった。

同様にトランスファーしたＰＶＤＦ膜をクマジーブリリ
アントブル−Ｒ　−　２　５　０　（Ｓｅｌｖａ）で染
色後主バンドを切り取り、ペプチドシークエンサー（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ，　４７７Ａ／１２
ＯＡ）に供したところこれはＥｘ−Ａ分子のＮ末より２
９８番目以降に相当した。

以上（１１−　１　，　（２）−　２より、Ｅｘ−３０
７はＥｘ−Ａ分子の２４１〜２９７番目のアミノ酸配列
を認識している事が示された。

同様の実験により、Ｅｘ−４Ｆ２およびＥｘ−８Ｈ５の
抗原決定部位は、それぞれ、Ｅｘ−Ａ分子の５９０番目
付近、５９１〜６１３番目に存在することが判明し、Ｅ
ｘ−３Ｃ７の抗原決定部位と異なった。

実施例６　モノクローナル抗体Ｅｘ−３Ｃ７の性状（１
）分子量 Ｅｘ−３Ｃ７　１０μｇおよび分子量測定マーカー用蛋
白（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ　ｂ，　ＢＳＡ．　ｏ
ｖａｌｂｕｍｉｎ，　ｃａｒｂｏｎｉｃａｎｈｙｄｒａ
ｓｅ　ｔｒｙｐｓｉｎ　ｉｒｎｈｉｂｉｔｏｒ，　ａ−
１ａｃｔａｌｂｕｍ）をそれぞれ２％ＳＤ８１５％２−
メルカプトエタノール，１０％グリセロール，　１２５
ｍＭ　｝リス塩酸緩衝液存在下１００℃、５分間加熱処
理した。ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル電気泳動後ゲ
ルをクマジーブリリアントブルーＲ−２５０（Ｓｅｌｖ
ａ，以下ＣＢＢとする）で染色し、分子量を求めた。Ｈ
鎖は５０Ｋ，Ｌ鎖は２９Ｋであった。

（２）等電点 Ｅｘ−３Ｃ７　　１　０μｇ及び等電点測定マーカー用
蛋白（β−１ａｃｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ＡＸｂｏｖｉ
ｎｅ　ｃａｒｂｏｎｉｃａｎｈｙｄｒａｓｅ　Ｂ　Ｓｈ
ｕｍａｎ　ｃａｒｂｏｎｉｃ　ａｎｈｙｄｒａｓｅ　Ｂ
，ｈｏｒｓｅ　ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ−ａｃｉｏｌｉｃ　
ｂａｎｄ，ｈｏｒｓｅ　ｍｙｏｇｌｏｂｉｎｂａｓｉｃ
　ｂａｎｄ，　　ｌｅｎｔｉｌ　　ｌｅｃｔｉｎ−ａｃ
ｉｄｉｓ　ｂａｎｄ，ｌｅｎｔｉｌ　　ｌｅｃｔｉｎ−
ｍｉｄｄｌｅ　　ｌａｎｄ，　　　ｌｅｍｔｉｌ　　ｌ
ｅｃｔｉｎｂａｓｉｃ　ｂａｎｄ，　ｔｒｙｐｓｉｒｒ
ｏｇ−ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｃ）をアガロースゲル（
１％（Ｗ／Ｖ）　７ガｏ　−　ス１２％　（Ｗ／Ｖ）　
ソルビトール６％（Ｖ／Ｖ）ファルマライト■ｐＩ５−
８）にアプライし、最大１　５　Ｗ，　１５００Ｖで２
時間半泳動した。泳動後ゲルを乾燥しＣＢＢで染色し、
等電点を求めたところ６．７５−６．９０であった。

（３）結合定数 抗体の親和性をＲＩＡ法により決定した。すなわち、２
−（２）の方法において一定量の’　２５Ｉ−ＥＸ−Ａ
（３μＣｉ／　μｇ，　１７，０００ｃｐｍ）と同時に
各種の濃度の非標識Ｅｘ−Ａを加え、抗体へ結合するＥ
ｘ−Ａ量を求めＳｃａｔｃｈａｒｄの方法（Ａｎｎ．　
Ｎ．　Ｙ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　，　５１，　６０
０　−６７２ｐ　１９４９）に従って、親和性を算出し
た。

その結果Ｅｘ−３Ｃ７のＥｘ−Ａへの結合定数は７，■
×１０”　ｎ／ｍｏｌと算出された。

（４１　　Ｅｘ−Ａとの結合のｐＨ依存性ＥＬＩＳＡ法
においてモノクローナル抗体を抗原吸着プレートに結合
させる時のｐＨを変化させてＥｘ−Ａとの結合性のｐＨ
依存性を検討した。結果を第１図に示す。

Ｅｘ−３Ｃ７はｐＨ　５。５付近で最も結合率が高＜ｐ
Ｈ３．５付近まで結合が見られた。ＥＸ−４Ｆ２はｐＨ
７付近で最も結合率が高く、ｐＨ４では結合しなかった
。

Ｅｘ−３Ｃ７のＥｘ−Ａへの結合が酸性においてもみら
れることは、Ｅｘ−Ａが細胞へ結合・侵入し、リソゾー
ムと融合した状態（酸性）で、細胞内輸送・変換される
過程においても抗原抗体複合対を形成し、Ｅｘ−Ａの毒
力発現を阻止することを示唆している。

（５）Ｎ末アミノ酸配列 Ｅｘ−３Ｃ７　　８　４　ｕ　ｇをＳＤＳ／ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動後、ゲルをトランスファーバッフ
ァ−　（１０ｍＭＣＡＰＳ，１　０％（ｖ／ｖ）メタノ
ールｐＨ１１．０）に室温で３０分間浸漬した。メタノ
ールに１分間浸漬した後トランスファーバッファーに３
０分間浸漬したＰＶＤＦ膜に４℃で電気的（５０Ｖ．１
０ｈ）にトランスファー後ＣＢＢで染色した。

Ｈ鎖、Ｌ鎖に相当するバンドを切り取りペプチドシーリ
エンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，　
４７７Ａ／　１２ＯＡ）に供した。

（６）Ｈ鎖およびＬ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲＩ，Ｃ
ＤＲ２，ＣＤＲ３）のアミノ酸配列 ３Ｃ７細胞６Ｘ１０’を１％ドデシル硫酸ナトリウム存
在下２００μｇ／−プロテナーゼＫ（ベーリンガーマン
ハイム）により溶解させ、水飽和フェノールを等量加え
て混合し、水槽を回収し、蛋白を除去した。該溶液に冷
エタノールを等量加えてゆるやかに混合し、析出したＤ
ＮＡを回収した。

このＤＮＡを制御酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造）を加えて切
断し、ファージベクターλｇｔｌｌのＥｃｏＲＩ切断部
位に挿入後（Ｔ４ＤＮＡリガーゼ，宝酒造），ファージ
粒子に取り込ませた（ｉｎ　ｖｉｔｒｏパッケージング
，ストラタジン）。このようにして作製した遺伝子ライ
ブラリーよりマウスＪｌ４４遺伝子をプローブにして、
プラークハイプリダイゼーションによりマウスＶ８遺伝
子をクローニングした。

この遺伝子をｐＵｃ１０（宝酒造）にサブクローニング
後、制限酵素地図を作製し、そのかつＤＮＡ配列を決定
した（シーケンシングキット宝酒造）。これら一連の実
験の詳細な条件は特開昭６３−　２６７２９５に開示さ
れた方法に準拠した。同様の方法で、３Ｃ７ＤＮＡの制
御酵素ＨｉｎｄｎＩ分解物とファージベクターλＬ４７
　（ファルマシア）より遺伝子ライブラリーを作製し、
マウスＪｋ遺伝子をプローブとしてプラークハイプリダ
イゼーションを行ない、マウスＶ遺伝子を得た。この遺
伝子の制御酵素地図、ＤＮＡ塩基配列をＶＨ遺伝子と同
様に決定した。

ＤＮＡ配列により決定されたＨ鎖およびＬ鎖の相補性決
定領域ＣＤＲＩ，ＣＤＲ２，ＣＤＲ３のアミノ酸配列を
以下に示す。

Ｈ鎖・ Ｃ　Ｄ　Ｒ　Ｉ　　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　
ＨｉｓＣ　ＤＲ　２　　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｐｒ
ｏ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　’ＶａｔＳｅｒ　Ｌｙｓ
　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　ＬｙｓＧ
ｌｙ ＣＤＲ　３　　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｔｙ
ｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　ＰｈｅＡｌａ　Ｔｙｒ Ｌ鎖 ＣＤＲ　Ｉ　　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｓｅ
ｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　ＴｈｒＳｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　
Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　ＨｉｓＣＤＲ２　　Ｌｅｕ　
Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　ＳｅｒＣＤ
Ｒ　３　　Ｇｌｎ　Ｈｉｓ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　
Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒモノクローナル抗体Ｅｘ−３Ｃ
７のＮ末アミノ酸配列を第２図に示す。

【図面の簡単な説明】

第１図はモノクローナル抗体Ｅｘ−３Ｃ７のＥｘ−Ａと
の結合のｐＨ依存性を示す。 第２図はモノクローナル抗体Ｅｘ−３Ｃ７のＮ末アミノ
酸配列を示す。Ｘは未同定のアミノ酸残基を示す。 完

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の特性を有するモノクローナル抗体 ［１］緑膿菌外毒素Ａに対して特異的に結合する ［２］緑膿菌外毒素Ａのアミノ酸残基２４１〜２９７番
   目に相当する部分を抗原認識部位として認識する ［３］イン・ヒドロ系において、緑膿菌外毒素ＡのＡＤ
   Ｐリボシルトランスフェラーゼ活性を阻害しない ［４］細胞培養系において、緑膿菌外毒素Ａによって惹
   起される細胞毒性を中和する ［５］生体内へ非経口的投与された該モノクローナル抗
   体は、緑膿菌外毒素Ａにより誘発される肝臓での蛋白合
   成伸長因子２の生体内リボシル化反応を阻害する ［６］緑膿菌外毒素Ａの関与する緑膿菌感染症において
   予防・治療効果を示す
2. （２）モノクローナル抗体の緑膿菌外毒素Ａへの結合特
   性が、ｐＨ５〜６において至適な結合活性を示し、ｐＨ
   ３．５〜４においても結合活性を保持することを特徴と
   する請求項１記載のモノクローナル抗体
3. （３）モノクローナル抗体の緑膿菌外毒素Ａへの緑膿菌
   外毒素Ａへの結合定数が１０＾８ｌ／モル以上である請
   求項１記載のモノクローナル抗体
4. （４）モノクローナル抗体のＨ鎖およびＬ鎖のそれぞれ
   の相補性決定領域（ＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙＤ
   ｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇＲｅｇｉｏｎｓ；ＣＤＲ）のアミ
   ノ酸配列が下記から成る請求項１、２または３記載のモ
   ノクローナル抗体 Ｈ鎖： ＣＤＲ１　ＡｓｎＴｙｒＡｓｎＩｌｅＨｉｓＣＤＲ２　
   ＴｙｒＴｈｒＡｓｎＰｒｏＴｙｒＡｓｎＡｓｐＶａｌＳ
   ｅｒＬｙｓＴｙｒＡｓｎＧｌｕＬｙｓＰｈｅＬｙｓＧｌ
   ｙ ＣＤＲ３　ＰｈｅＬｙｓＡｓｐＧｌｙＴｙｒＳｅｒＳｅ
   ｒＰｈｅＡｌａＴｙｒ Ｌ鎖： ＣＤＲ１　ＡｒｇＡｌａＳｅｒＬｙｓＳｅｒＶａｌＳｅ
   ｒＴｈｒＳｅｒＧｌｙＴｙｒＳｅｒＴｙｒＭｅｔＨｉｓ
   ＣＤＲ２　ＬｅｕＶａｌＳｅｒＡｓｎＬｅｕＧｌｕＳｅ
   ｒＣＤＲ３ＧｌｎＨｉｓＩｌｅＡｒｇＧｌｕＡｌａＴｙ
   ｒＴｈｒ
5. （５）モノクローナル抗体のクラスが、ＩｇＧであるこ
   とを特徴とする請求項１、２、３または４記載のモノク
   ローナル抗体
6. （６）モノクローナル抗体Ｅｘ−３Ｃ７
7. （７）請求項１、２、３、４または５記載のモノクロー
   ナル抗体をそれぞれ産生するセルライン
8. （８）セルラインＥｘ−３Ｃ７（微工研菌寄第１０４６
   ９号）およびその子孫細胞株
9. （９）請求項１、２、３、４、５または６記載のモノク
   ローナル抗体を含有する緑膿菌感染予防・治療剤
10. （１０）請求項１、２、３、４、５または６記載のモノ
    クローナル抗体を含有する外毒素Ａ産生緑膿菌感染症の
    診断薬
11. （１１）請求項１、２、３、４、５または６記載のモノ
    クローナル抗体を含有する緑膿菌外毒素Ａの定量用試薬
12. （１２）緑膿菌外毒素Ａの２４１〜２９７番目に相当す
    るポリペプチド
13. （１３）請求項１２記載のポリペプチドからなる緑膿菌
    感染症予防、治療用ワクチン