JPH0411897A - 抗緑膿菌外毒素ａヒトモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は緑膿菌外毒素へに対するヒトモノクローナル抗
体、該ヒトモノクローナル抗体を産生ずるセルライン、
該ヒトモノクローナル抗体を含有する緑膿菌感染症の予
防・治療剤に関する。本発明のヒトモノクローナル抗体
は緑膿菌外毒素へに対し強い細胞毒性中和活性を有し、
緑膿菌感染症治療剤として有用である。

く従来技術および解決すべき課題〉 細菌感染症の治療において問題となる病原菌は、抗生物
質の開発とともに変化している。すなわち、臨床上用い
られる抗生物質の種類の変遷に伴い細菌感染症を引き起
こす細菌、いわゆる起炎菌が交代してきた。従来、低病
原性又は弱毒性と言われた細菌、なかでも特に緑膿菌（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）によ
る感染例が増加し、緑膿菌は近年、主要な病原菌の一つ
となっている。緑膿菌感染は、免疫抑制剤の投与を受は
免疫能の低下している患者、又は癌患者や熱傷患者およ
び新生児などの免疫不全・低下症の患者において重篤な
症状を引き起こし死に至らしめる場合が多い細菌感染と
して知られている。緑膿菌の病原性因子としては、細菌
の増殖に伴う内毒素および緑膿菌の産生する外毒素およ
び外酵素がある。なかでも外毒素Ａは、はとんどの緑膿
菌臨床分離株において産生されており、その外毒素Ａは
細胞に毒性を示すのみならず、各種の動物に致死的作用
を及ぼす。

細菌由来の毒素や酵素を中和および阻害することにより
細菌感染症を予防および治療することができる療法とし
て、免疫グロブリン裂開の投与、いわゆる抗体療法があ
り、抗生物質療法と併用される、又はそれに代わるもの
として注目されている。ウマやウサギ等の動物を能動的
に免疫することによって抗体価の高い血清を得ることが
でき、その血清を投与する抗体療法は、各種の動物を用
いた実験的感染症において著効な治療効果を示すことが
多くの実験にて実証されている。

ヒト以外の動物由来の血清を用いた抗体療法がヒトにお
いても有効性を示すことは、ジフテリア毒素や蛇毒素の
例で周知のことである。従来のヒト免疫グロブリン製剤
は、健常人又は細菌感染数の患者から血液を採取し、既
知の方法にて免疫グロブリン画分を分取・精製した後に
、ポリエチレングリコール添加、蛋白分解酵素処理、ス
ルホン化、ＤＥＡＥ−カラムクロマトグラフィー等の凝
集物を除去する方法により、筋肉注射用のみならず、静
脈注射用に製剤化されたものである。これらヒト免疫グ
ロブリン製剤は、いくつかの欠点を持つ。第一に、細菌
および細菌由来の毒素・酵素に対する抗体価が低く、必
ずしも充分な治療効果を期待しえない。第二に、高力価
の免疫グロブリンを大量に安定して供給することが難し
い。健常人ボランティアや患者より採取された血液を材
料に製造されており、高い力価の血清を一定して入手す
ることは極めて難しく、製造ロフト毎に、抗体価が変動
することがある。第三に、任意にヒトの血液を材料に製
造されることにより、免疫グロブリン製剤にＨＢｓウィ
ルスなどの肝炎ウィルスやＡＴＬＶ　（Ａｄｕｌｔ　Ｔ
　ｃｅｌｌ　ｌｅｕｋａｅｍｉａ　ｖｉｒｕｓ）　、旧
Ｖ（Ｈｕｍａｎ　ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　
ｖｉｒｕｓ　）、あるいは非Ａ非Ｂ肝炎病原ウィルスな
ど未知の病原体の混入が起こり得る。

かくして、細菌および細菌由来の毒素、酵素、特に緑膿
菌由来の外毒素に対して高い抗体価を有し、細菌感染症
の治療効果の大きい安全な免疫グロブリン製剤の開発が
望まれている。

緑膿菌外毒素Ａは、緑膿菌の産生する外毒素で、６１３
個のアミノ酸残基から成る蛋白質である。緑膿菌外毒素
Ａは、ＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ活性をもち、
動物細胞の表面に存在するレセプターに結合した後、細
胞内へ侵入し、細胞の蛋白合成を阻害する事により毒性
を発揮する。

緑膿菌外毒素に対するモノクローナル抗体の報告は　　
Ｄ、Ｒ，Ｇａｌｌｏｗａｙら、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　
　ａｎｄ　　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ
　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｔｏ
　ｅｘｏｔｏｘｉｎ　Ａ　ｆｒｏｍ　Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ
　ａｎｄ　［ｍｍｕｎｉｔｙ、　Ｖｏｌ、４４．　Ｐ、
２６２−２６７（１９８４）；　　野口ら、特開昭６１
−２０４２００；　Ｊ、Ｍ、Ｌａｒｒｉｃｋら、Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　ｅｘｏｔｏ
ｘｉｎ　Ａ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、　ｔｈｅｉｒ　ｐ
ｒｅｐａｒａｔｉ。

ｎ　ａｎｄ　ｕｓｅ　（Ｐａｔｅｎｔ）、　ＵＳ　４，
６７７．０７０．　Ｊｕｎ、　３０．１９８７　：　Ａ
、Ｗ、Ａｎｔｈｏｎｙ　ら、　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　
ｈｕｍａｎ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ　ｔｏ　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎ
ｏｓａ　ｅｘｏｔｏｘｉｎ　Ａ　（Ｐａｔｅｎｔ）、　
　ＰＣＴ／ＵＳ８６１０１２０４：　Ｊ、に、Ｃｈｉａ
　ら、ＦｕｎＣｔｉｏｎａｌｌｙ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ　
ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｒｅａ
ｃｔｉｖｅ　ｗｉｔｈ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ　
ａｃｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｄｏｍａｉｎ
　ｏｆ　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓ
ａ、　ｔｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　［ｍｍｕｎｉｔｙ
、　Ｖｏｌ、５２．　Ｐ、７５６−７６２（１９８６）
、岩佐ら、特開昭６４−６３３７４があるが、抗体療法
として実用化されるに至っておらず、更に強い毒性中和
効果、治療活性を有するヒトモノクローナル抗体の生産
が望まれている。

一般的に抗毒素抗血清が毒素に対して中和活性を有する
事は良く知られている。毒素分子には数多くの抗原決定
基（エピトープ）があり、それらの中でも毒素の活性発
現に重要な機能を持つ部分、例えば毒素の標的細胞への
結合部分、あるいは毒素の生化学的機能である酵素活性
を有する部分などが中和抗体のターゲットとなるエピト
ープとして特に重要である。抗毒素抗血清には種々のエ
ピトープに対するポリクローナルな抗体が含まれており
毒素分子の様々なエピトープに結合する。毒素の機能発
現に重要な部分にも結合し活性発現を阻害、中和活性を
発揮する。モノクローナル抗体はポリクローナル抗体と
異なり単一のエピトープに対してのみ結合する。従って
、毒素に対するモノクローナル抗体のすべてが中和活性
を有するのではなく、活性の発現に関与するターゲット
として重要なエピトープに対するモノクローナル抗体の
みに中和活性が認められ、他のエピトープに結合するモ
ノクローナル抗体にはなんら中和活性が存在しない。

破傷風毒素に対するモノクローナル抗体の実験で、モノ
クローナル抗体が認識するエピトープと毒素活性の中和
に関し詳細に調べられている。Ｙｏｌｋらは破傷風毒素
の２０個所以上のエピトープに対する５７種類ものモノ
クローナル抗体を得た。それらのなかで少なくとも９種
類は破傷風毒素に対し強い中和活性を示した。これら中
和能を育する抗体は特定のエピトープを認識するものに
限られていた。抗体の毒素活性に対する中和能はその結
合するエピトープと強い相関があり、特定のエピトープ
に特異的な抗体は毒素に対し中和効果を持つが、破傷風
毒素に結合する抗体でも他のエピトープに結合する抗体
はなんら中和活性を有さないことが明らかになった。

以上の例で示される様に緑膿菌外毒素Ａに対するモノク
ローナル抗体が外毒素Ａに対し強い毒性中和効果を持ち
、かつ緑膿菌感染症で治−療活性を有するためには、緑
膿菌外毒素Ａ分子上の特定のエピトープに結合し外毒素
Ａの機能を阻害しなければならない。

緑膿菌外毒素Ａに結合するモノクローナル抗体のすべて
が治療効果を有するわけではなく、ある特定の限定され
たモノクローナル抗体のみが臨床上有効かつ有用性を発
揮するにすぎない。臨床上有効かつ有用な抗体を予見す
る事は極めて難しい。治療効果を与えるモノクローナル
抗体を取得しその認識するエピトープを特定することは
きわめて重要である。

更に治療効果を予想しつる因子として重要なものは、エ
ピトープのほか、結合定数及び結合のｐＨ依存性があげ
られる。ｐＨに関してはジフテリア毒素でその例を見る
が、緑膿菌外毒素Ａでは報告がない。

く課題解決の手段〉 こうした状況に鑑み、本発明者らは前述の問題点を改善
すべく鋭意、改良を加え、緑膿菌外毒素Ａに対する多く
のヒトモノクローナル抗体を作製した。

各ヒトモノクローナル抗体の治療効果を検討する一方、
物理化学的、免疫化学的および生物学的特性を詳細に解
析した結果、緑膿菌外毒素Ａに対し強い中和効果を有し
かつ緑膿菌感染症において抗生物質との併用効果、単剤
での感染治療効果を育するヒトモノクローナル抗体を得
た。この新知見を基に、緑膿菌外毒素Ａに対し強い細胞
毒性中和活性および治療効果を有するヒトモノクローナ
ル抗体、該抗体を産生ずるセルライン、該抗体を用いた
高力価の免疫グロブリン製剤を作製し、本発明を完成す
るに至った本発明は、下記の免疫化学的・生物学的特性
および物理化学的特性を存する緑膿菌外毒素Ａに対する
ヒトモノクローナル抗体、該ヒトモノクローナル抗体産
生セルライン、該ヒトモノクローナル抗体を含む感染治
療用の免疫グロブリン製剤及びこれらの製造方法に関す
るものである。

本発明のモノクローナル抗体１分子は緑膿菌外毒素Ａに
対して特異的に結合するＢＡＬＬ　１細胞を用いた細胞
培養系において、一分子以上の緑膿菌外毒素へによって
惹起される細胞毒性を中和する［ＣＲ−ｓｌｃマウス（
４週齢、♂、２３−２４　ｇ　）の生体内へ非経口的投
与された４　Ｘｌ０−”　ｍｏｌｅ　（１μｇ　）の該
ヒトモノクローナル抗体は１５　ｘｌＯ−”ｍｏｌｅ（
０゜６μｇ）の緑膿菌外毒素Ａにより誘発される致死毒
性を生体内で中和し、５０％以上のマウスを生存させる
。

本発明のヒトモノクローナル抗体は、ＩＣＲ−ｓｌｃマ
ウスを用いた実験的外毒素Ａ産生性緑膿菌感染症におい
て単独投与で感染治療効果を示し、加つるに抗生物質を
併用することにより強い相乗効果を示す。

本発明のヒトモノクローナル抗体は、ｐＨ５以上におい
て最大結合率を示し、かつｐＨ３，０の酸性条件下にお
いても、抗原結合活性を保持する。本発明のヒトモノク
ローナル抗体は、緑膿菌外毒素Ａのアミノ酸残基５９１
〜６１３番目に相当する部分（Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ
−Ｉｌｅ−３ｅｒ−Ａ　１ａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｓ　
ｐ−Ｔｙｒ−Ａ　１ａ−Ｓｅｒ　−Ｇ　Ｉｎ−Ｐｒｏ−
Ｇ　ｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−
Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ）に抗原認識部位（エピトープ
）が存在し抗原部位にＴｙｒ残基か含まれることを特徴
とする。

このようなヒトモノクローナル抗体の具体例として本発
明はヒトモノクローナル抗体器−１Ａ４を提供する。

緑膿菌外毒素と特異的に反応し上記の特徴を有するヒト
モノクローナル抗体を連続的に産生ずるＥＢＶ形質転換
細胞及びハイブリドーマは、以下の方法で取得される。

緑膿菌感染症により緑膿菌外毒素Ａに対し自然感作され
血清中抗体価が高い供血者の８９２３球をエプスタイン
・バー（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウィルス（以下、
ＥＢウィルスと略）と混合することによって感染させ、
連続的に増殖する細胞へと形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒ
ｍａｔｉ。

ｎ）させる。この際サイクロスポリンＡなどの免疫抑制
剤を添加し細胞障害性Ｔ細胞の活性を抑えることが望ま
しい。

次いでクローン化する前の、又はクローン化された形質
転換細胞から、上記の反応特異性を有する抗体を産生ず
る株を選別し試験管内（生体外）にて連続的に細胞増殖
し、かつ上記抗体を連続的に生産する細胞株を樹立する
。選別法としては固相または液相放射性同位元素免疫測
定法（ラジオイムノアッセイ１Ｒ１Ａ）、Ｅｎｚｙｍｅ
　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓ５
ｅｙ（ＥＬ［ＳＡ）等、免疫学領域で一般に用いられる
方法、および細胞障害性中和試験を代表とするｉｎ　ｖ
ｉｔｒｏ外毒素Ａ中和試験などの細胞生物学領域で一般
的に用いられる方法を用いる。

クローニングは、限外希釈法、軟寒天法、単細胞マニュ
ピレーション（Ｓｉｎｇｌｅ　ｃｅｌｌ　ｍａｎｉｐｕ
ｌａｔｉｏｎ）法などにより行う。モノクローン（単一
性クローン）から由来した増殖の速い緑膿菌外毒素Ａと
反応する抗体を産生ずる安定した細胞株、所謂Ｂリンパ
芽球様細胞株を得る。保護細胞の使用、ヒトＩＬ−６な
どリンホカインの添加によりクローニング効率を高める
事ができる。

上記の方法にて樹立された特異抗体を産生ずるＥＢウィ
ルス形質転換細胞を骨髄腫細胞と細胞融合することによ
って増殖性が良好で、かつ上記抗緑膿菌外毒素Ａ特異抗
体を連続的に多量に産生ずる細胞株を樹立する。これら
の樹立株を試験管内培養し、培地に分泌された抗体を精
製することによって抗体を大量に製造する。

上記のＥＢウィルス形質転換細胞及びハイブリドーマの
製造法を以下に詳細に説明する。

本発明に用いるヒトの８９２３球とは、緑膿菌外毒素Ａ
に対する抗体を産生ずるヒトリンパ系細胞で、主として
末梢血液よりリンホプレップ、モノポリ分離液などのリ
ンパ球分離液を用いた遠心分離法によって分離されるが
、各種疾患の診断および治療の目的で摘出されたリンパ
節、膵臓などの臓器や鯛帯血由来の８９２３球を材料に
用いることもできる。緑膿菌による感染症を患ったこと
があり、生体内で感作された既応症のヒト由来の８９２
３球を用いることが望ましい。あらかじめ、血清中の抗
体価を測定することにより適切なリンパ球提供者を選別
することができる。これらのヒトＢリンパ球は、その細
胞表面に抗体分子を有し、ある限られた期間、少量の抗
体を分泌することが可能であるが、無制限に増殖するこ
とはできないことを特徴とする。

抗原感作されたヒトＢリンパ球を無制限、連続的に増殖
可能な細胞株とする方法として、本発明は基本的に二種
類の方法を含む。第一の方法は、抗原感作されたヒトＢ
リンパ球をマーモセット細胞Ｂ９５−８から調製された
ＢＢウィルスと混合培養することによってＥＢウィルス
を８９２３球に感染させる方法である。９６六マイクロ
プレートの１ウエルあたり０．５〜３Ｘ１０’個の細胞
を播種し、あらかじめ選別されたウシ胎児血清を２〜２
０％（Ｖ／Ｖ）にて含むイスコツ培地、ダルベツコ培地
、またはＲＰＭ１１６４０培地などの通常の培地を用い
て５〜ｌＯ％Ｃ０２存在下、３２〜３７°Ｃにて、２〜
５週間培養することによって形質転換細胞（ｔｒａｎｓ
ｆｏｒｍｅｄ　ｃｅｌ１）を得る。培養中２〜４日毎に
培地を半量ずつ交換する。必要に応じて１〜２μｇ／ｄ
！のサイクロスポリンＡ１およびマイコプラズマの汚染
を防ぐ抗生物質や合成抗微生物薬を添加し、またマウス
腹腔浮遊細胞を保護細胞として加える。

形質転換細胞は、感染１０日以降、２０〜２００個の細
胞集団として光学顕微鏡下で観察され、非形質転換細胞
と容易に区別し得る。

充分に増殖した形質転換細胞を含むウェル（ｗｅｌ１）
の培養上清を酵素免疫法（ＥＬＩＳＡ）により特異抗体
価をスクリーニングして特異抗体産生の認められるウェ
ルを選択する。特異抗体が陽性のウェルの培養上清を用
い、ＥＬ［ＳＡにおける競合反応により緑膿菌外毒素Ａ
に対し強く結合する抗体を選別する。更に培養細胞系を
用いｉｎ　Ｖｉｔｒｏで緑膿菌外毒素Ａの細胞障害性に
対し強い中和活性を有する抗体のみを選別し、そのクロ
ーニングを行う。クローニングは、形質転換された細胞
塊（クラスター）を含む溶液をピペットを用いて軽く吸
引・排出する操作を繰り返すことによってクラスターを
ほぐし、培地にて適切な細胞濃度に希釈し０．５〜１０
０個細胞／ウェルとなるように９６穴マイクロプレート
に播種培養するいわゆる限界希釈法（Ｌｉｍｉｔｉｎｇ
　ｄｉｌｕｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ）を用いる。

クローニングの際に、保護細胞としてマウス腹腔内細胞
、ヒト羨帯血リンパ球又はＸ線照射処理したマウス膵臓
細胞を用いることが望ましい。またＩＬ−６等のリンホ
カインを加えることによりクローニングの効率が向上す
る。クローニングされた細胞株の培養上清の抗体価をＥ
ＬＩＳＡ法にて測定し、特異抗体産生量の多い株を更に
選別する。このクローニング、抗体の高産生株の選別を
２〜３回繰り返し、増殖の速い、かつ特異抗体を安定的
、大量に産生ずる形質転換細胞株を選択し樹立する。

第二の方法は、第一の方法で樹立された形質転換細胞株
と骨髄腫細胞とを細胞融合する方法である。

用いられる骨髄腫細胞はＨＰＲＴ（ｈｙｐｏｘａｎｔｈ
ｉｎｅ−ｇｕａｎｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙ
ｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）欠損マウス骨髄腫細胞で
あるＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕｌ（Ｐ２Ｏ３；ＡＴＣＣ
ＣＲＬ１５９７）、Ｐ３−ＮＳ−１／１−Ａｇ４−１　
　（ＮＳ−１；ＡＴＣＣＴＩＢ　ｒ８）、Ｐ３−Ｘ６３
−Ａｇ８−６５３（６５３；ＡＴＣＣＣＲＬ１５８０）
、ＳＰ２１０−Ａｇ１４（ＳＰ２１０；ＡＴＣＣＣＲＬ
８２８７）、ＳＨＭ−Ｄ３３（ＡＴＣＣＣＲＬ１６６８
）などであるが、その他、細胞工学分野にて通常用いら
れる動物およびヒト由来のイムノグロブリン非産生また
は非分泌細胞をも用いることができる。融合法としてＨ
ＶＪ法（センダイウィルスを用いる方法）、ポリエチレ
ングリコール法（ＰＥＧ法）や電気的融合法等が用いら
れる。

ハイブリドーマの培養液の抗体価を前述のＥＬＩＳＡ法
によって測定し、上記の反応特異性を育する特異抗体産
生株を選別する。限界希釈法又は軟寒天法によって、２
〜３回クローニングを繰り返し、増殖の速い、特異抗体
産生量の多い、ＥＢウィルスを含まない安定した細胞株
を得る。

以上、ＥＢウィルス形質転換法（ＥＢ　ｖｉｒｕｓ　ｔ
ｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ）及びＥＢ
Ｖ−細胞融合法（ＥＢＶ−ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ｍｅｔ
ｈｏｄ）を用いて抗原感作ヒトＢリンパ球より樹立され
た細胞株は、連続的に増殖することができること、しか
も特異抗体を安定的に、かつ大量に産生し得ることを特
徴とする。

このＥＢＶ形質転換細胞株、ハイブリドーマを公知の方
法、例えば、ＤＮＡ変異剤などの化学的処理およびυＶ
前照射ど物理的処理により、増殖能や抗体産生能を高め
るなどの改良を加えた子孫細胞を得ることができる。こ
の子孫細胞が親細胞株と同じく、本発明に記載の生物学
的・物理学的特性を保持していることは言うまでもない
。

本発明の抗体は、該細胞株を試験管内で無血清培地や血
清を含む通常の動物細胞用培地で培養した培養上清から
精製される。すなわち得られた培養上清を通常の蛋白精
製に用いられる生化学的手法１例えば硫酸アンモニウム
による沈澱法、イオン交換クロマトグラフィー法、ゲル
濾過法およびアフィニティークロマトグラフィー法に供
することによって精製される。精製されたヒトモノクロ
ーナル抗体は、生物学的製剤の製剤化に通常用いられる
方法によって製剤化される。

本ヒトモノクローナル抗体製剤は、細菌感染治療・予防
剤として、緑膿菌外毒素に対するｌＰ１類のモノクロー
ナル抗体より成ることも可能であるが、更に好ましくは
、緑膿菌外毒素分子の異なる抗原決定部位を認識しうる
、少なくとも２種類又はそれ以上のヒトモノクローナル
抗体と混合して用いられる。

又は緑膿菌外毒素以外の緑膿菌由来抗原、例えばＬＰＳ
、あるいはエラスターゼ、プロテアーゼなどの緑膿菌性
酵素や外膜蛋白・内毒素構成成分などを認識する従来型
の抗体と混合して使用される。更には、緑膿菌以外の細
菌、ウィルス、真菌、原虫、癌細胞に対する抗体に、本
発明によって得られる緑膿菌外毒素に対するヒトモノク
ローナル抗体を添加して用いることができる。

本発明によって得られるヒトモノクローナル抗体は主と
してクラスＩｇＧ、さらにはサブクラスＩｇＧ３に属す
るがこれに限定されたものではない。

本ヒトモノクローナル抗体は緑膿菌外毒素Ａ断片を用い
たｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ法等免疫学的解析によ
り、エピトープとして緑膿菌外毒素Ａ分子のアミノ酸配
列５９１番目以降６１３番目まで（アミノ酸配列：Ｇ　
１ｕ−Ｇ　Ｉｎ−Ａ　Ｉａ−Ｔ　１ｅ−Ｓｅｒ−Ａ　１
ａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａ　ｓ　ｐ−Ｔｙｒ−Ａ　ｌａ　
−３ｅｒ−Ｇ　１ｎ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　１ｙ−Ｌｙｓ　−
Ｐ　ｒｏ−Ｐ　ｒｏ−Ａｒｇ−Ｇ　１ｕ−Ａｓ　ｐ−Ｌ
ｅｕ−Ｌｙｓ）を認識し緑膿菌外毒素Ａに結合している
事が確認される。本性質により本抗体は緑膿菌外毒素Ａ
の細胞毒性、致死毒性に対する中和活性を育し、さらに
は緑膿菌感染症において治療効果を発揮する。

本ヒトモノクローナル抗体の緑膿菌への結合がｐＨ３，
０でも安定である事は以下の方法で確認される。

すなわち、緑膿菌外毒素Ａが化学的に結合したセファロ
ースカラムに吸着した本ヒトモノクローナル抗体がｐＨ
３，０のバッファーでの洗浄では溶出されない事より、
抗原抗体の結合が安定である事を確認する。

本ヒトモノクローナル抗体には、前記の特性を持つモノ
クローナル抗体であれば、ヒト抗体、マウス−ヒト・キ
メラ抗体、ヒト化抗体、クラス・サブクラス変換抗体な
ど、すべて含まれる。また、ＥＢＶ形質転換法、細胞融
合法以外でも、例えばＤＮＡ組換え法など既知の抗体作
製技術を用いて作製されたヒトモノクローナル抗体も含
まれる。

〈発明の効果〉 本発明によって得られるヒトモノクローナル抗体は、緑
膿菌外毒素Ａの５９１〜６１３番目のアミノ酸部位（Ｃ
末付近、Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−１１ｅ−Ｓｅｔ−Ａ
ｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａ　ｌａ−Ｓ
ｅ　ｒ−Ｇ　Ｉｎ−Ｐｒｏ−Ｇ　１ｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒ　
ｏ−Ｐｒ　ｏ−Ａｒ　ｇ−Ｇ　１ｕ−Ａｓ　ｐ−Ｌｅｕ
−Ｌｙｓ）を認識し、同抗原にたいして高い抗体価を有
する。マウス実験的感染症の系で従来のモノクローナル
抗体よりも、はるかに優れた治療効果を示す。

その他、ヒト由来の蛋白であることより、異種蛋白の投
与時にみられるアナフィラキシ−等の副作用の少ないこ
とが期待されるし、特定の細胞より生産・精製される抗
体であることより、不特定多数のヒト血液より製造され
た従来の免疫グロブリン製剤に較べ、未知のバイオハザ
ードが混入してくる可能性の低いことが特徴である。又
、本モノクローナル抗体の製造方法としては、生体外で
、大量に、高力価の特異抗体を安定して製造することが
特徴であり、従来のヒト血液より製造する方法にくらべ
高力価など生物活性の点で、安定的供給ができるなど品
質管理の点て優れる。

〈　９（方勿Ｌ（Ｊりン 次に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが
、本発明はこれのみに限定されないことは言うまでもな
い。

本発明のＥＬＩＳＡ法による抗体価、抗体産生量の測定
は、以下の通りおこなった。

緑膿菌外毒素Ａとして、外毒素Ａ産生縁膜菌株ＰＡ１０
３（ＡＴＣＣ２９２６０）の培養上清から陰イオン交換
樹脂、ヒドロキシアパタイトを用いて精製された市販品
（Ｓｗｉｓｓ　Ｓｅｒｕｍ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、　Ｂ
ｅｒｎ、　５ｗ１ｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用した。市販
緑膿菌外毒素Ａをリン酸緩衝液（ｐＨ７，２；組成Ｎａ
Ｃ１（８ｇ／１）　、ＫＣＩ（０，２ｇｅｌ　）、Ｎａ
＊ＨＰＯ４・１２Ｈ＊ＯＣ２，９９ｇ　／　ｌ！　３お
よびＫ）ｌＩＰＯ４（０，２ｇ　／　ｌ　）　：以下Ｐ
ＢＳと略す）へ５μｇ／−の濃度に溶解し９６ウエルマ
イクロプレート（ファルコン１３９１２）　（マイクロ
プレートと略）に１ウエル当たり１００μｌずっ分注、
４℃で一晩インキユベートした。マイクロプレートから
外毒素Ａ溶液を除去した後３％ウシ血清アルブミン（以
下ＢＳＡと略称する）ＰＢＳ溶液を１ウエルあたり１２
０μｌずつ分注し３７℃にて３０分間インキュベートす
ることにより外毒素Ａの未吸着部分をブロッキングした
マイクロプレートを抗原吸着プレートとして以後の操作
に用いた。

アッセイ前に抗原吸着プレートを０，０５％Ｔｗｅｅｎ
　２０含有ＰＢＳ（以下ＰＢＳＴと略）で３回洗滌した
。その後ＰＢＳＴを１ウエルあたり５０ｇｍ分注、必要
に応じＰＢＳＴで適宜希釈した試料（血清又は培養上清
）をｌウェルあたり５０μｌ加え、３７℃で２時間イン
キュベートした。その後試料を除去し、ＰＢＳＴで３回
洗浄した。続いて第２抗体液をｌウェルあたり１００μ
ｌずつ加え、３７℃で２時間インキュベートした。ヒト
抗体価の測定には第２抗体としてＰＢＳＴで５００〜１
．０００倍希釈したホスファターゼ標識アフィニティ精
製抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　＆　Ｐｅ
ｒｒｙ　Ｌａｂ、　Ｉｎｃ、）をマウス抗体価の測定に
は第２抗体としてＰＢＳＴで５００〜１．０００倍希釈
したホスファターゼ標識アフィニティ精製抗マウス免疫
グロブリン抗体（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　＆　Ｐｅｒｒ
ｙ　Ｌａｂ。

Ｉｎｃ、　）を用いた。マウスＩｇＧ　、　ＩｇＭ抗体
価の測定にはそれぞれホスタフアーゼ標識抗マウス［ｇ
Ｇ抗体、抗マウスＩｇＭ抗体（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　
＆　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂ、　Ｉｎｃ、）を用いた。第２
抗体を除去し、ＰＢＳＴで３回洗滌後、発色基質溶液（
３ｍｇのＰ−ニトロフェニルリン酸−２−ナトリウム塩
を１ｍｌのＮａＮ＊（０，２ｍｇ／ｍｌ　）ＭｇＣ１ｚ
　・６ＨＪ（０，ｌｆｆ１ｇ　／ｄ＞含む１０％ジェタ
ノールアミン緩衝液ｐＨ９，１に溶解した水溶液）をｌ
ウェルあたり１００μｌずつ加え、３７℃で反応させた
。３０分間反応後の０Ｄ４６１をマルチスキャン（Ｔｉ
ｔｅｒｔｅｋ）で演ｑ定した。

また、ＥＬｒＳＡ法によるヒト抗体産生量の測定法とち
以下の方法を用いた。

アフィニティ精製抗ヒト［ｇＧ（γ鎖特異的）抗体（Ｋ
ｉｒｋｅｇａａｒｄ　＆　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂ、　Ｉｎ
ｃ、）を１０ａｇ／−の濃度でＰＢＳに溶解、マイクロ
プレートにｌウェルあたり１００μ１分注し、３７℃に
２時間インキュベートし抗体溶液をマイクロプレートに
吸着させた。マイクロプレートから抗体溶液を除去した
後、３％ＢＳＡ含有Ｐ−ＢＳをｌウェルあたり１２０μ
ｌずっ分注し３７℃にて３０分間インキュベートするこ
とによって抗体の未吸着部分をブロッキングした。この
マイクロプレートを抗体定量用プレートとして抗体産生
量の測定に用いた。抗体量測定の際の標準物質としては
精製ヒトＩｇＧ（Ｍｉ　１ｅｓ）を用いた。ＥＬ［ＳＡ
の方法は上記方法に準じた。

実施例Ｉ　　ＥＢウィルス形質転換法によるヒトモノク
ローナル抗体産生株の樹立 （１）血球提供者の選別 健常人及び緑膿菌感染症患者の血清中の緑膿菌外毒素へ
に対する抗体価を測定し、抗体価が高値であった旧、Ｋ
Ｋ、　ＭＴを血球提供者として選別した。

（２）ヒトＢリンパ球のＥＢＶ形質転換■ＥＢウィルス
液の調製 ＥＢウィルスを産生放出しているマーモセット細胞Ｂ９
５−８を、ウシ胎児血清（以下ＦＣＳと略）　（Ｈｙｃ
ｌｏｎｅ）を容量比として１５％含有するイスコツ培地
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）　６．５
　ｘｌＯ’細胞／−の割合にて懸濁し、培養フラスコＴ
−７５（Ｃｏｒｎｉｎｇ　＃２５１１０）を用いて５％
ＣＯＩ、　３７℃の条件のもと４日間静置培養した。培
養上清を採取し低速遠心機（トミー精工Ｒ５−２０ＢＨ
）を用いて２．００Ｏｒｐｍ　（ｏ−ターＴＳ−７）　
、１０分間遠心分離し、およびそれに引き続いてその上
清を０．４５μｍΦメンブシメンィルター（マイレクス
５ＬＨＡＯ２５ＯＳ）にて濾過した。その濾液をセラム
チューブ（住人ベークライトＭＳ−４５０５）に分注し
、４℃に保存しヒトリンパ球のＥ８ウィルスによる細胞
形質転換（トランスフォーメーシコン）の実験に用いた
。

■ヒト末梢血からのリンパ球の調製 血清中の緑膿菌外毒素Ａに対する抗体価が高かった旧、
ＫＫ、　ＭＴの末梢血各２（１ｍｊ！を採取した。遠心
管（住友ベークライト、５（７容積）に１５−のモノポ
リ分離液（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂ、）を入れ、その上に更に
末梢血２〇−を静かに電層した。低速遠心機（トミー精
よりＳ−２０ＢＨ）を用い２．５０Ｏｒｐｍ　（ｏ−タ
ーＴＳ−７）で室温１５分間遠心分離し赤血球とリンパ
球を分離した。リンパ球を含む部分を回収し、１５％Ｆ
ＣＳ含有イスコフ培地（以下培地と略）で２回洗滌した
後、細胞数を計算した。その結果各々　１−３Ｘ１０’
個のリンパ球を得た。

■Ｅ８ウィルス形質転換法による抗緑膿菌外毒素Ａ抗体
産生株の樹立 ヒト末梢血リンパ球ｌＸｌ０’細胞を２−の培地に懸濁
し前述のＥＢウィルス液ｌＯ−を加え５％ＣＯ！％°３
７℃にて２時間インキュベートした。１１．Ｂウィルス
の感染したヒトリンパ球を２μｇ／−のサイクロスポリ
ンＡを含む培地に懸濁しく約２Ｘ１０’細胞／ｍ／）　
９６穴培養プレートにｌウェル当り０．１−ずつ播種し
た。

実験によっては保護細胞としてマウス腹腔浮遊細胞（約
ｌＸｌ０’細胞／ウエル）を添加した。培養４日後に培
地を０．１ｒｄ／ウェル加え、その後３日毎に半量ずつ
培地と培地交換した。

１０−２１日後に総べてのウェルで細胞の増殖が認めら
れた。ＥＬｒＳＡ法により緑膿菌外毒素Ａに対する特異
抗体を産生ずる細胞株を選別した。特異抗体産生株を表
１にまとめる。

（３）ＥＬｒＳＡにおける競合試験 抗原吸着プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。培養上清
及びｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒとして緑膿菌外毒素Ａを１ウ
エルあたり５０μｌずつ加え、３７℃で２時間インキュ
ベートした。第２抗体との反応以降は通常のＥＬｒＳＡ
法に準じて行った。結果を表２に示す。

表２　　　ＥＬｒＳＡにおける競合試験Ｈｌ−６８１、
Ｈｌ−１Ａ４の固相に吸着した抗原への結合は緑膿菌外
毒素Ａの添加により強く阻害され、緑膿菌外毒素Ａに対
する結合性が強いと考えられた。

（４）培養細胞を用いた細胞毒性中和試験による細胞毒
性中和活性の測定 培養細胞の蛋白合成能を指標とし、緑膿菌外毒素Ａの細
胞毒性に対するヒトモノクローナル抗体の中和効果を検
討した。マウスＢＡＬＢ／ｃ　３Ｔ３細胞を２Ｘ１０’
細胞／１ｎｌの割合で培地に懸濁し９６ウエルマイクロ
プレート（住友ベークライトＭＳ−３０９６Ｆ）にｌウ
ェルあたり５０μｌずつ播種して５％ＣＯ！　、３７℃
にて一夜培養した。

緑膿菌外毒素へを１０ｎｇ／−の濃度に培地に溶解し外
毒素Ａ溶液とした。抗緑膿菌外毒素Ａヒトモノクローナ
ル抗体０．１μｇ／−を含む培養上清抗体溶液２容と外
毒素Ａ溶液１容を混合し、室温３０分間中和反応を行っ
た後１５０μＩ！／ウエルの割合で上記ＢＡＬＢ／ｃ　
３Ｔ３細胞に添加した。次に５％Ｃｏｘ　、３７℃にて
７２時間培養後その上清を除いた。次いで１ウエルあた
り１００μｌの固定液（１０％ホルマリン）を加え室温
にて１０分間静置した後固定液を除去、ｌウェルあたり
５０μｌの色素液（０，０５％クリスタルバイオレット
　（ナカライテスク））を加えた。室温にて３０分間静
置した後、色素液を除去し、１ウエルあたり２５０μｌ
の蒸留水で３回洗浄した。１ウエルあたり１００μｌの
抽出液（１％酢酸、５０％メタノール）を加えて５分間
攪拌後、抽出液のＣＤ５ｍ。を測定した。外毒素Ａ無添
加の対照と比較し生残細胞数の割合を算出した。

Ｈｒ−１Ａ４に強い中和活性が認められた。

（５）ＥＢＶ形質転換細胞株旧−１Ａ４のクローニング
ＨＩ−１Ａ４を、１．０００細胞／−の割合にてヒト！
Ｌ−６を２０００／−含む培地に懸濁し、あらかじめマ
ウス腹腔浮遊細胞（３Ｘ１０’細胞／ウエル）を入れて
おいた９６六マイクロプレ一ト１枚にｌウェルあたり０
．１−ずつ播種しクローニングを行った。培養５日目よ
り３日ごとに半量ずつヒト［Ｌ−６を２０００／ｍｌ含
む培地と培地交換を行った。２週間後に約半数のウェル
で細胞の増殖が認められた。培養上清に含まれる緑膿菌
外毒素Ａに対するヒト抗体価を測定した結果、４ウエル
に抗体価が認められた。これらのウェルの細胞の拡大培
養を行い、その中から安定して比較的多量の抗体を産生
ずる細胞株旧−１Ａ４−Ｄｉを樹立した。抗体産生量は
７μｇ／１０’細胞／日、倍加時間４８時間て、６ケ月
以上安定に抗体産生を継続した。また本細胞株は無血清
培地セルグロッサ−Ｈ（住人製薬）を用いた培養でも血
清培地を用いた時と同様の抗体産生性、増殖性を示した
。

このようにして取得したＥＢＶ形質転換株旧−１Ａ４は
、微工研条寄第３０２２号（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１１００
５）の番号のもとに微生物工業技術研究所に寄託されて
いる。ＩｇＧサブクラスをＥＬＩＳＡ法（Ｈｕｍａｎ　
Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｇ　５ｕｂｃｌａｓｓ
　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　（Ｅ１Ａ）
　Ｋｉｔ　（ＢｉｎｄｉｎｇＳｉｔｅ社））で調べた結
果旧−１Ａ４はサブクラスｒｇＧ３に分類された。

実施例２　細胞融合 マウス・ミエローマ細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（Ａ
ＴＣＣＮｏ。

ＣＲＬ１５８０）を培地で継代しておき、そのうち２．
０Ｘ１０’個の細胞を血清を含まないイスコツ培地（以
下イスコツ培地を記載）にて２回洗浄した。

一方、実施例１記載のＥＢＶ形質転換細胞旧−１Ａ４−
Ｄｌ、２．０Ｘ１０’個をイスコツ培地にて２回洗浄し
、上記のマウス・ミエローマ細胞と融合し、遠心により
細胞を沈査とした。

この沈査に、ｌ−のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
溶液（０，４５ｇ　ＰＥＧ　４０００．　Ｍｅｒｃｋ、
　０．４５ｍＡ’　ＰＢＳ（−））を約１分間かけて遠
沈管を回転しつつ添加し、室温にて１分間静置した。

次に、イスコツ培地を１分間に１−の割合で遠沈管を回
転しつつ添加し、これを２回繰り返した。更に７−のイ
スコツ培地を４分間かけて遠沈管を回転しつつ添加した
。イスコツ培地添加終了後、３７℃にて２０分間静置し
た。静置後、遠心により細胞を沈査として集め、１５％
ＦＣＳ、　　５ｘｌＯ−″Ｍ２−メルカプトエタノール
、１００μＭヒボキサンチン、ｌμｇ／ＷＬｌアザセリ
ン、１０−＠Ｍウワバイン、５％ハイブリドーマクロニ
ングファクターを含む５０ｍ１の培地（以下ＨＡｚ選択
培地と略す）に懸濁して、ｌウェル当たり４．０ｘｌＯ
４個のミエローマ細胞となるように、９６ウエルマイク
ロプレート（Ｆａｌｃｏｎ　＃３０４０）に１００．Ｃ
ＺＡ’ずつ分注した。このマイクロプレートを、５％Ｃ
０２，３７℃にて培養し、２−３日毎にＨＡｚ選択培地
にて半量を培地交換した。１週間ごとにＨＡｚ選択培地
に替えて、ＨＡｚ選択培地よりアザセリン、ウワバイン
を除いたＨ培地にて半量交換した。その後は、ヒポキサ
ンチンを含まない培地にて、２−３日毎に半量を培地交
換した。融合後約３週間の時点で増殖の認められたウェ
ルの培養上清について、緑膿菌外毒素Ａに対する特異抗
体価をＥＬＩＳＡ法により測定した。２６ウエルで融合
細胞の増殖が確認され、いずれのウェルでも特異抗体の
産生が認められた。これらのうち２細胞株、旧−１Ａ４
−５８９、Ｈｒ−１Ａ４−５Ｆ８が安定に増殖、特異抗
体を産生じた。Ｈ［−１Ａ４−５８９の限外希釈法によ
るクローニングを行い、抗体産生量３０μｇ／ｄ、倍加
時間３５時間の細胞株旧−１Ａ４−６Ｇ８を樹立した。

融合細胞株旧−１Ａ４−６Ｇ８は、微工研条寄第３０３
１号（ＰＥＲＭ　ＢＰ−３０３１）の番号のもとに微生
物工業技術研究所に寄託されている。

実施例３　旧−１Ａ４の精製 無血清培地による旧−１Ａ４培養上清を限外濃縮後、イ
オン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過によりヒトモ
ノクローナル抗体旧−１Ａ４を精製した。

旧−１Ａ４を無血清培地セルグロッサ−Ｈ（住人製薬）
中で培養した培養上清を限外濃縮膜ＹＭ３０（アミコン
。

ブレースジャパン）で８４倍に濃縮した。

細胞培養上清をイオン交換カラムＡ　Ｂ　ｘ　（Ｊ、Ｍ
、Ｂａｋｅｒ。

Ｉｎｃ、　）に供し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，
０）で洗浄後０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，８）で濃
度勾配をかけ溶出、分画した。ＥＬＩＳＡ法により緑膿
菌外毒素Ａに対し、結合活性を有する抗体を含む両分を
選別、ＹＭ３０で約８倍に濃縮後ゲル濾過カラムＳ　ｕ
　ｐ　ｅ　ｒ　ｒ　ｏ　ｓ　ｅ　６　（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）に供しＰＢＳ（−）で溶出後、分画した。各面分
を５Ｏ３−ＰＡＧＥにより分析しヒト［ｇＧを含む分画
を選別した。約３００ｍｔ’の培養上清から約１■の旧
−１Ａ４精製品を得た。

実施例４　Ｈｌ−１Ａ４とマウスモノクローナル抗体と
の中和活性の比較 （１）マウスモノクローナル抗体の作製■抗原の調製 市販緑膿菌外毒素ＡをＰＢＳに対し透析し免疫原として
用いた。

■免疫肺臓細胞の調製 ＢＡＬＢ／ｃマウス（♀、初回免疫時４週齢、体重的１
５ｇ）を免疫に供した。緑膿菌外毒素Ａを５μｇ／−の
濃度で含有するＰＢＳＩ容とフロイント完全アジュバン
ト１容を常法に従い混和し、マウス−匹あたり混和液）
０．２ｍｌ　（緑膿菌外毒素ＡＯ９５μｇを含有）を皮
下投与することによって初回免疫した。以後、２週間隔
にて４回、フロイント不完全アジュバントと混和した緑
膿菌外毒素Ａを順次２μｇ、１０μｇ、２０μｇ。

２０μｇ皮下投与し、追加免疫を行なった。最後の追加
免疫の約１４月後、凍結融解を２０回繰返す事により変
性せしめた緑膿菌外毒素Ａ２０μｇを静脈内投与する事
により最終免疫した。３日後に肺臓を摘出、イーグルの
ＭＥ！Ｍ培地（ナカライテスク）に懸濁された膵臓細胞
を得た。なお、一部の実験で、４回目の追加免疫の約１
４月後にフロイント不完全アジュバントと混和した緑膿
菌外毒素Ａ２０μｇを皮下投与し、計５回の追加免疫を
行なった。

■細胞融合 マウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８−６５３（ＡＴＣ
ＣＣＲＬ１５８０）を１０％ウシ胎児血清ＦＣＳ（Ｇｉ
ｂｃｏ）添加ＲＰＭ［−１６４０培地（ナカライテスク
）中で培養し、対数増殖期で細胞を集め細胞融合に用い
た。融合方法は、Ｋｏｈｌｅｒら（Ｎａ　ｔｕｒｅ、２
５６．４９５−４９７．１９７５）の方法に準じた。即
ち、膵臓細胞と骨髄腫細胞とを５＝１の比率で血清不含
のＲＰＭ［−１６４０培地に懸濁し、１．　ＯＯＯｒｐ
ｍ　（）ミー精工ＣＤ−１０ＯＲ）にて７分間遠心分離
した。沈査に、３７℃に保温された４５％（Ｗ／Ｗ）ポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ）４０００．１０％（Ｖ
／Ｖ）ジメチルスルホキシドの溶液１−を１分間かけて
添加し、さらに３７℃にて１分間静置した。次いで、血
清不含ＲＰＭＩ−１６４０培地２−を１ｍｌ＋／ｗｉｎ
の割合で加え懸濁した。更に、血清不含ＲＰＭ１−１６
４０培地７ｒｄを徐々に加えＰＥＧを希釈した。３７℃
２０分間静置の後１．００Ｏｒｐｍで７分間遠心分離、
その後マウス骨髄腫細胞として６Ｘ１０’細胞／−の細
胞濃度が得られるように、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭｔ−
１６４０培地に再懸濁し、９６六マイクロプレート　（
住人ベークライトＭＳ−３０９６Ｆ）に０．２−／ウェ
ルずつ分注した。この融合細胞を５％ＣＯ８において３
７°Ｃで培養した。

細胞融合の１日後に、半分量の培地を新たなＨＡＴ培地
（１０−’Ｍヒボキサンチン、４Ｘ１０−’Ｍアミノプ
テリン、１．６　Ｘｌ０−’Ｍチミジンを含むＲＰＭＩ
−１６４０培地）と交換した。以後、２日毎にＨＡＴ培
地による半量交換を３回行った。１０日後には、７０％
のマイクロプレート穴で、細胞の増殖が観察された。Ｅ
ＬＩＳＡによるアッセイの結果、４２ウエルで特異抗体
の産生が認められた。

代表的なＥＬ［ＳＡ陽性例につき培養上清の抗体価を表
４に記す。

マウスの腹腔より腹水を採取した。

■精製 マウス腹水をプロティンＡモノクローナル抗体精製シス
テムＭＡＰＳ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂ）にて精製した
。すなわち腹水と該システムに添付されている結合バッ
ファーｐＨ９，０とをｌ対ｌに混合し、アフィゲルプロ
ティンＡカラムにアプライし結合バッファーで洗浄した
。溶出バッファーｐＨ３，０で溶出後ただちにＰＢＳに
対して透析した。抗体量はプロティンアッセイキットＩ
（バイオ・ラッド）により測定した。

４週間前にブリスタン（２，６，１０，１４−テトラメ
チルペンタデカン；　　Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ　Ｃｏ、　Ｉｎｃ、）を−匹あたり０．５−にて投
与したＢＡＬＢ／Ｃマウスに、クローニング後試験管内
培養にて増殖させたハイブリドーマ５Ｘ１０”細胞を腹
腔内へ接種し、７〜１４日後、（２）培養細胞を用いた
細胞毒性中和試験による細胞毒性中和活性の測定 マウスＢＡＬＢ／ｃ　３Ｔ３細胞を２Ｘ１０’細胞／−
の割合で１５％ＦＣＳ含有イスコフ培地に懸濁し９６ウ
エルマイクロプレート（住人ベークライトＭＳ−３０９
６Ｆ）にｌウェルあたり１００μｌずつ播種して５％Ｃ
Ｏ！、３７℃にて一夜培養した。

抗緑膿菌外毒素Ａマウスモノクローナル抗体の腹水を１
０％ＦＣ３含＊　ＤＭＥＭ培地を用い５０倍に希釈し、
抗体溶液とした。緑膿菌外毒素Ａを０．１　ｎｇ／−の
濃度にｌＯ％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地に溶解し外毒素Ａ
溶液とした。抗体溶液と外毒素Ａ溶液を等量ずつ混合し
、室温３０分間中和反応を行った後１００μｌ／ウエル
の割合で上記のＢＡＬＢ／ｃ　３Ｔ３細胞に添加した。

次に５％Ｃ０ｔ３７℃にて１４時間培培養土清を１００
μ！除去し、１１−ロイシン（０，２５ｕ　Ｃｉ／ｗｅ
ｌｌ；　Ｉ　Ｃｉ／ｍｇ：Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐ
。

ｒａｔｉｏｎ　）を添加し、更に２時間培養した。細胞
をＰＢＳで３回洗浄後０．　ＩＮ　ＮａＯＨで細胞をプ
レートよりはがし、細胞を浮遊させた。あらかじめ４℃
に冷却した１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で４℃、３
０分間インキュベート後ＴＣＡ不溶性画分に取り込まれ
た３Ｈ量を液体シンチレーションカウンター（ベックマ
ン）で測定した。緑膿菌外毒素Ａによる蛋白合成の阻害
を５０％以上中和した抗体を中和効果陽性とした。その
結果を表５に示す。

Ｅｘ−３Ｃ７、Ｅｘ−４Ｆ２）Ｅｘ−８Ｈ５が緑膿菌外
毒素Ａの細胞毒性に対する中和効果を有していた。

精製モノクローナル抗体を用いて上述方法により、細胞
毒性中和活性を測定した。その結果を表６に示す。

表７　緑膿菌外毒素Ａ接種７日後の生残率Ｅｘ−３Ｃ７
は高い細胞毒性性中和活性を示した。εｘ−４Ｆ２）Ｅ
ｘ−８Ｈ５も中和活性を示したが、εｘ−２Ａ１０には
中和活性が認められなかった。

（３）緑膿菌外毒素Ａｉｎｖｉｖｏ投与系における毒性
中和活性（治療効果） 緑膿菌外毒素Ａに対するマウスモノクローナル抗体精製
品をマウス−匹あたり２０μｇ、またはＢＳＡをマウス
−匹あたり５■を［ＣＲ−ｓｌｃマウス（４週齢、♂、
１群１０匹）の腹腔内に投与し、１時間後腹腔内に緑膿
菌外毒素Ａを０．８μｇ接種した。外毒素Ａ接種機７日
後の生残率を表７に示す。

モノクローナルＥｘ−３Ｃ７は、Ｅｘ−４Ｆ２．　Ｅｘ
−８Ｈ５に比べ、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて強い毒性中和
活性を示した。以上の実験からマウスモノクローナル抗
体の中でＥｘ−３Ｃ７が最も強い毒素中和活性を持つと
判断された。

（４）培養細胞を用いた細胞毒性中和活性の比較ヒトＢ
ＡＬＬ　１細胞を５Ｘ１０’細胞／−の割合で培地に懸
濁し９６ウエルマイクロプレート（住人ベークライト間
Ｓ−３０９６Ｆ）に１ウエルあたり１００μｌずつ播種
した。緑膿菌外毒素人に対するモノクローナル抗体を０
．３μｇ／ｍｌとなるよう培地で希釈し、抗体溶液とし
た。緑膿菌外毒素Ａを０．０４−４μｇ／ｍｌの濃度に
培地に溶解し外毒素Ａ溶液とした。抗体溶液と外毒素Ａ
溶液を各５０μｌ／ウエルの割合で上記ＢＡＬＬ　１細
胞に添加した。次に５％ＣＯ，，３７°Ｃにて５日間培
養後、ＭＴＴ法（ＭＴＴ　ｃｅｌｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ａ
ｓｓａｙ　（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏ
ｎａｌ　Ｉｎｃ、乃を用い生細胞を定量した。結果を図
１に示す。

Ｈ［−１Ａ４はＥｘ−３Ｃ７の数倍の外毒素Ａ中和活性
を有し、抗体１分子で外毒素Ａ１分子以上を中和した。

表８　　ｉｎ　　ｖｉｖｏ抗緑膿菌縁膜素Ａ活性（５）
緑膿菌外毒素Ａ　ｉｎ　ｖｉｖｏ投与系における毒性中
和活性（治療効果） 緑膿菌外毒素Ａに対するモノクローナル抗体をマウス−
匹あたり０．３１−３．１μｇ（Ｈｌ−１Ａ４）　、又
は０．４３−４．３ｕ　ｇ（Ｅｘ−３Ｃ７）またはＢＳ
Ａをマウス−匹あたりｌＯ■をＩＣＲ−ｓｌｃマウス（
４週齢、♂、１群ｌＯ匹）の腹腔内に投与し、１時間後
腹腔内に緑膿菌外毒素へを１μｇ接種した。緑膿菌外毒
素Ａ接種後７日後の生残率を表８に示す。

ヒトモノクローナル抗体旧−１Ａ４はマウスモノクロー
ナルＥｘ−３Ｃ７と比較し２倍程度強い中和活性が認め
られた。

（６）酵素中和活性の測定 抗Ｅｘ−Ａモノクローナル抗体が、Ｅｘ−Ａの酵素活性
すなわちｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　２　（
以下ＥＰ２と略すに対するＡＤＰ　ｒｉｂｏｓｔｌｔｒ
ａｎｓｆｅｒａｓｅ　（以下ＡＤＰＲＴａｓｅと略す）
Ｋ活性を中和するか否かを検討した。

（１’）ＥＦ２の精製 に、　Ｔａｋａｍａｔｓｕらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｏｐｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ、　１３４．１０
１５−１０２１（１９８６乃に従いＥＦ２を精製した。

すなわち６０匹分のラット肝にあらかじめ冷却した３、
３ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオライドを含む
０．２５Ｍショ糖５倍を加え、０−４°ＣにてＷａｒｉ
ｎｇ　ｂｌｅｎｄｅｒでホモジェナイズした。ナイロン
メツシュで組織残渣を濾別した後ホモシュネートを１６
．０００ｘｇ、　２０分間遠心分離した。−上清に１．
５ｍＭとなるようにジチオスライトール（ＤＤＴ）を添
加し、３０−６５％飽和硫酸アンモニウムで沈澱分画し
た。沈澱をバッファーＡ（５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐ
ｈ８．３．２．５ｍＭ　ＤＴＴ　、　５％グリセロール
）に溶解した後バッファーＡに対し透析した。透析内液
をＤＢ−５２カラムに供試カラムをバッファーＡ”ｔ’
洗浄後、０−２．５１　ＮａＣ１を含むバッファーＡに
て直線的濃度勾配の条件下溶出し、ＥＦ２粗精製画分を
得た。粗精製画分３，５−に０．５−の０゜ＩＭ）リス
塩酸緩衝液ｐＨ７，９、１，０−の０．５Ｍ　ＤＴＴ。

２．０艷の５０％グリセロール、３．０ｒｎｌの１０＋
＋ｇ／　ｒｎｌ！ウシ血清アルブミンを加え、−２０℃
似て保存した。

（２）Ｅｘ−Ａの活性化 Ｅｘ−Ａ（０，５■／ＴｒＩｄり　［を４Ｍ　　尿素、
１％（Ｗ／Ｖ）ＤＴＴ存在化２２°Ｃ，１５分間インキ
ュベートすることにより活性化した。

（３）ＡＤＰＲＴａｓｅ活性の測定 Ｍ、　Ｐａｌ　１ａｃｋらの方法（Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、
Ｄｉｓ　１４５　６８８−６９８（１９８２））に従っ
て行った。

すなわち、ＥＦ−ＩＦ溶液（（１）で調節したＥＦ−Ｉ
Ｉ溶液５００μＪに３０１ｔｌの１４Ｃ−ＮＡＤ”　（
ＮＥＮ、４５０ｍＣ１／ｍｍｏ１，２２　ｕＭ　＞２ｔ
ｔ　Ｉ！０２５０ｍＭＥＤＴＡを加える）５０μｆに精
製モノクローナル抗体６００ｎｇとあらかじめ室温で３
０分間インキュベートした（２）で活性化したＥｘ−Ａ
　５０ｎｇを含む溶液５μｌを加えることによって反応
を開始した。

室温で５分後、５５μｌの冷却した１０％ＴＣＡを加え
その後氷上で１０分間放置した。ＴＣＡ不溶性画分をグ
ラスフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ、　ＧＦ／Ｃ）に集め
取り込まれた＋４Ｃ量を液体シンチレーションカウンタ
ー（ベックマン）で測定した。

その結果を表９に示す。

表９　精製品による酵素活性中和活性 外毒素産生緑膿菌５Ｐ９７９１ｂの菌液０．２〜７（３
Ｘｌ０７ＣＦＵ）をｒｃＲ−ｓｌｃ　ｖ　ｆｙ　ス（４
週齢、♂、１群１０匹）　（７）背部皮下接種すること
により感染させた。

感染２時間後にＰＢＳに溶解した旧−ＩＭ４　０．１９
〜６．３ｕ　ｇ　／　ｈｅａｄ、あるいはＥｘ−３Ｃ７
、０，２６〜８．５　ｔｔ　ｇ　／　ｈｅａｄを静脈内
に投与し、感染２４時間後にゲンタミシン４ｍｇ／ｈｅ
ａｄを皮下及び腹腔内に半量ずつ投与した。対照群とし
てＢＳＡ投与群を設定した。７日後の生残率により効果
を判定した。結果を表１Ｏに示す。

×　１００ として、酵素中和能をパーセント（％）で表示した。

モノクローナル抗体Ｈ１−１Ａ４とＥｘ−２Ａ１０は、
ＥＦＩ［ＡＤＰリボシル化を阻害した。

特に、ＨＩ−ＩＭ４は、マウスモノクローナル抗体Ｅｘ
−２Ａ１０と比較して、さらに強い中和活性を示した。

（７）マウス緑膿菌皮下感染実験におけるモノクローナ
ル抗体の治療効果 ＼ ＼ ＼ ＼ ＨＩ−１Ａ４はゲンタミシンと併用の条件では強い感染
治療効果を示し、約２倍量のＥｘ−３Ｃ７と同等の効果
が認められた。また、単独投与においても感染治療効果
が認められるという従来のＩｇＧ抗体にはない新しい性
質を有していた。

実施例５　ヒトモノクローナル抗体器−１Ａ４の性状の
解析 （１）抗原決定基の同定 ■緑膿菌外毒素Ａ分子の断片化および抗体との反応性 ｉ）キモトリプシン処理断片２６Ｋに対する反応性Ｅｘ
−Ａを２■／−の濃度で１０ｍＭ）リス緩衝液（ｐＨ８
，０）に溶解後、等量の８Ｍ尿素水溶液と混和、更にジ
チオスレイトールを最終濃度５ｍＭとなるように添加し
室温２０分間蛋白を変性させた。反応後ＰＤ−１０カラ
ムを用いゲル濾過により１ｍＭ　ＥＤＴＡ含有５０ｍＭ
　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，２）にバッファー交換を
した。ＮＡＤを最終濃度１０ｍＭ加え、ＮＡＤ結合部位
を保護した後、キモトリプシン（１００μｇ／ｍ１）と
２５℃、９０分間反応させ断片化を行った。反応はｌＯ
μｇ／１１ｄｌＰＭｓＦの添加により終了させた。反応
後、反応混液をｉ）に示した方法で高速液体クロマトグ
ラフィーにより分画し、分子量的２６にの分画を得た。

本文面をペブチドシークエンサーに供したところＥｘ−
Ａ分子の３９１番目から６１３番目に相当した。

一方、反応混液を２％ＳＤＳ、　５％２−メルカプトエ
タノール、１０％グリセロールを含む１２５ｍＭトリス
塩酸緩衝液ｐＨｓ、ｐＨ中で１００℃、５分間加熱処理
し、ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル電気泳動後ゲルを
トランスファーバ”／　７７−（ＩＯＩＩＩＭ　ＣＡＰ
Ｓ、１０　％（Ｖ／Ｖ）　メ９　／−ル、ｐＨ１１，０
）に室温で３０分間浸漬した。メタノールに１分間浸漬
した後３０分間トランスファーバッファーに浸漬したポ
リビニルジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（ミリボア）に４
℃で電気的（５０Ｖ、　ｌＯｈ　）にトランスファー後
２％カゼイン含有ＰＢＳで室温３０分間インキュベート
することによりブロッキングした。　更に２％カゼイン
含有ＰＢＳで１．０００倍に希釈したＥｘ−３０７の腹
水を室温、２時間インキュベートし、０．ｏ５％Ｔｗｅ
ｅｎ　２０含有ＰＢＳでＰＶＤＦ膜を３回洗浄後、第２
抗体（２％カゼイン含有ＰＢＳ）で１，０００倍に希釈
されたアルカリフォスファターゼ標識抗マウスイムノグ
ロブリンＧ抗体）と３７％、２時間インキュベートした
。同様に０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０含有ＰＢＳで５回
洗浄後、発色基質溶液（０，５ｍｇ、４−ブロモ−２−
クロロインドフェノールリン酸を１■、（ＮａＮｓ（０
，２ｍｇ／　ｍＡ’）、ＭｇＣ０ｔ　・６ＨｔＯ（０，
１ｍｇ／　ｖＪ　）を含む１０％ジェタノールアミン緩
衝液（ｐＨ９，１）とインキュベニトし、発色させた。

ヒトモノクローナル抗体Ｈ１−１Ａ４はキモトリプシン
処理２６Ｋ（緑膿菌外毒素Ａのアミノ酸配列３９　　番
目以降６１３番目（Ｃ末）まで）と結合し、緑膿菌外毒
素ＡのＣ末側を認識している事が明かとなった。

ｉｉ）エンドペプチダーゼＬｙｓ−Ｃ処理断片４２に、
　４０Ｋに対する反応性 Ｅｘ−Ａを２ｍｇ／ｒｄの濃度でｌｏｍＭ　）リス緩衝
液（ｐＨ８，０）に溶解後、等量の８Ｍ尿素水溶液と混
和、更にジチオスレイトールを最終濃度５ｍＭとなるよ
うに添加し室温２０分間蛋白を変性させた。反応後ＰＤ
−１０カラムを用いゲル濾過により５０ｍＭ　）リス塩
酸緩衝液（ｐＨ９，０）にバッファー交換をし、緑膿菌
外毒素Ａ濃度を０．５ｍｇ／−とした。リジルエンドペ
プチダーゼ（和光純薬）を８μｇ／−となるように加え
、３７℃で２時間反応させた後、更に等量のりジルエン
ドペプチダーゼを加え、さらに３７℃で２時間反応させ
る。フェニルメタンスルフォニルフルオリト（Ｓｉｇｍ
ａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ）　５μｇ／−で
反応を停止させる。

反応混液をｉ）に示した方法でＳＤＳ電気泳動、ｉｎ＋
ｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇＬ、ＨＩ−１Ａ４の結合する
エピトープを検討した。

エンドペプチダーゼＬｙｓ−Ｃによる切断の結果４２に
および４０にの断片が得られた。

４２には緑膿菌外毒素Ａのアミノ酸配列２３４番目ない
し２４１番目以降Ｃ末（６１３番目）まで、４０にはア
ミノ酸配列２４１番目以降５９０番目までと帰属された
。

Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇの結果旧−１Ａ４は分子
量的４２にのバンドとは反応したが４０にのバンドとは
反応しなかった。

従って旧−１Ａ４の抗原決定部位は５９１〜６１３番目
（Ｇｌｕ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ａ　ｌａ−［１ｅ−Ｓｅｒ−Ａ
　１ａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｓ　ｐ−Ｔｙｒ−Ａ　１ａ
−３ｅｒ−Ｇｌ　ｎ−Ｐｒｏ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｌｙｓ−Ｐ
ｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇ　１ｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｙｓ）に存在することが判明した。

１ｉｉ）アミノ酸残基の修飾による抗原決定基の特定緑
膿菌外毒素ＡＡのチロシン残基をヨードで修飾し、Ｈｌ
−１Ａ４の結合に対する修飾の影響を検討した。

緑膿菌外毒素Ａを５ｍＭ）リス緩衝液（ｐＨ８，０）に
１ｔｎｇ　／　ｍｌの濃度で溶解し、等容の０，１Ｍ沃
素、０．１Ｍ　　Ｋｌの水溶液を加え１０分間反応、外
毒素Ａのヨード化を行った。ヨード修飾緑膿菌外毒素Ａ
を用いＥＬＩＳＡの競合反応により修飾の影響を調べた
。旧−１Ａ４の濃度は０．１Ｍｇ／ｍｌ、競合物質の濃
度は５μｇ／−の条件で検討した結果を表１１に示す。

チロシン残基の化学修飾により旧−１Ａ４との反応性は
約６０％減少し、チロシン残基が抗原決定基の一部を形
成している事が示された。緑膿菌外毒素Ａ分子の中で抗
原決定基が存在する部位（アミノ酸配列５９１番目以降
、Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−１１ｅ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−
Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａ　１ａ−Ｓｅｒ−
Ｇ　Ｉｎ−Ｐｒ　ｏ−Ｇ　１ｙ−Ｌｙ　５−Ｐｒ　ｏ−
Ｐｒ　ｏ−Ａｒ　ｇ−Ｇ　１　ｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｙｓ）にはチロシン残基は！残基（６００番目）しか存
在しない。本抗体の抗原決定基は６００番目のチロシン
残基付近である事が判明した。

■緑膿菌外毒素Ａとの結合のｐＨ依存性ＥＬＩＳＡ法に
おいてヒトモノクローナル抗体を抗原吸着プレートに結
合させる時のｐｔ＋を変化させて緑膿菌外毒素Ａとの結
合性のｐＨ依存性を検討した。結果を図２に示す。Ｈｌ
−１Ａ４はｐＨ５以上では緑膿菌外毒素Ａに対し強く結
合するが、ｐＨ４では結合しなかった。

緑膿菌外毒素ＡをＣＮＢｒ−セファロースに結合したＥ
ｘ−Ａ−セファロースカラムを用い、−旦形成されたＨ
［−１Ａ４と緑膿菌外毒素Ａの結合の低ｐＨに対する抵
抗性を検討した。中性領域で旧−１Ａ４をカラムに吸着
させた後、カラムからｐＨ３，０の溶出バッファーで旧
−１Ａ４の溶出を試みたがＨＩ−１Ａ４は溶出されず、
−旦形成された結合はｐＨ３，０においても安定である
事が示された。Ｈｌ−ｌＡ４の緑膿菌外毒素Ａへの結合
が低ｐＨにおいても保持されることは、緑膿菌外毒素Ａ
が細胞へ結合・侵入し、リソシームと融合した状ｔＩ！
（低ｐＨ）で、細胞内輸送・酵素活性を発現する過程に
おいても抗原抗体複合体が破壊されず、緑膿菌外毒素へ
の毒力発現を阻止することを示唆している。

を示す。

第２図は、旧−ｌＡ４の抗原結合のｐＨ依存性を表す。

横軸に抗原抗体反応時のｐＨ１縦軸に抗原吸着プレート
へ結合した旧−ｌＡ４の指標としてＥＬＩＳＡの結果を
吸光度で示す。

以上で述べたように、本発明のヒトモノクローナル抗体
器−１Ａ４は今までにない優れた特性を示すモノクロー
ナル抗体である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｉｎ　ＶｉｔｒＯにおけるＨＩ−ｌＡ４とＥ
ｘ−３Ｃ７の細胞毒性中和活性を表す。横軸に緑膿菌外
毒素Ａの量を示す。縦軸には生細胞の示標として活性ミ
トコンドリアによりＭ　Ｔ　Ｔ　（３−（４，５−Ｄｉ
ｍｅｔｈｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙ１）−２，５−Ｄｉ
ｐｈｅｎｙｌ　Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ　Ｂｒｏｍｉｄ
ｅ）が開裂され生成するホルマザンの吸光度を示す。 ・は旧−ｌＡ４、ＯはＥｘ−３Ｃ７、△は培地のみ添加
の結果第１図 １１１−ｌＡ４．　Ｅｘ−３Ｃ７の細胞毒性中和活性（
ｉｎｖｔｌｒｏ）第２図　旧−ｌＡ４の抗原結合のｐＨ
依存性・：　ｌｌｌ−ｌＡ４　（７５ｎｇ／ｙａ１）Ｑ
　：　Ｅｘ−３Ｃ７（７５ｎｇ／ｌ［）Δ：培地のみ Ｈ

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の特性を有するヒトモノクローナル抗体 １）緑膿菌外毒素Ａに対して特異的に結合する ２）細胞培養系において、一分子のヒトモノクローナル
   抗体が一分子以上の緑膿菌外毒素Ａによって惹起される
   細胞毒性を中和する ３）マウス生体内へ非経口的投与された４×１０＾−＾
   １＾２モルの該ヒトモノクローナル抗体は、１５×１０
   ＾−＾１＾２モルの緑膿菌外毒素Ａにより誘発される致
   死毒性を生体内で中和し、５０％以上の生存を与える ４）緑膿菌外毒素Ａの関与する緑膿菌感染症において予
   防・治療効果を示す ５）緑膿菌外毒素Ａの関与する緑膿菌感染症において抗
   生物質との併用効果が認められる ６）緑膿菌外毒素Ａのアミノ酸残基５９１〜６１３番目
   に相当する部分（Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｓ
   ｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｌ
   ａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ
   −Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ）
   をエピトープとして認識し、抗原部位にはＴｙｒ残基が
   含まれる ７）ヒトモノクローナル抗体のクラスが、ＩｇＧ３であ
   る ８）ヒトモノクローナル抗体の緑膿菌外毒素Ａへの結合
   特性が、ｐＨ５以上において至適な結合活性を示し、そ
   の結合はｐＨ３においても安定に保持される
2. （２）特許請求の範囲第１項記載のヒトモノクローナル
   抗体を産生するセルラインおよびその子孫細胞株
3. （３）特許請求の範囲第１項記載のヒトモノクローナル
   抗体を産生するＥＢＶ形質転換細胞およびその子孫細胞
   株
4. （４）特許請求の範囲第３項記載の細胞株をミエローマ
   細胞株と細胞融合することにより得られ、ヒトモノクロ
   ーナル抗体を産生することを特徴とする融合細胞株およ
   びその子孫細胞株
5. （５）ＥＢＶ形質転換細胞ＨＩ−１Ａ４（ＦＥＲＭＢＰ
   −３０２２）
6. （６）特許請求の範囲第５項記載の細胞株により産生さ
   れるヒトモノクローナル抗体
7. （７）融合細胞株ＨＩ−１Ａ４−６Ｇ８（ＦＥＲＭＢＰ
   −３０３１）
8. （８）特許請求の範囲第７項記載の細胞株により産生さ
   れるヒトモノクローナル抗体
9. （９）特許請求の範囲第１項、第６項あるいは第８項記
   載のヒトモノクローナル抗体を含有する緑膿菌感染予防
   ・治療剤
10. （１０）特許請求の範囲第２項、第５項あるいは第７項
    記載の細胞株を培養することを特徴とするヒトモノクロ
    ーナル抗体の製造法