JPH022356A - マラリア特異性ｄｎａ配列物、それらの発現産物およびそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 マラリアに対するワクチンの開発に向けての重要なステ
ップは、防御的抗原（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅａｎｔｉｇ
ｅｎｓ）の同定である。一般に、防御的と分類される抗
原とは、動物モデル、例えばサイミリ（Ｓａｉｍｉｒｉ
）またはアオタス（Ａｏｔｕｓ）モンキーなどを用いた
インビボ実験において静注投与してプラスモジウム・フ
ァルシパルム（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒ
ｕｍ）感染からの防御を可能とするものをいう。これま
でのところヒトについては不満足な防御実験しか報告さ
れていないが、動物実験においてはプラスモジウム・フ
ァルシパルムのいくつかの＃Ｌ離タンパク質による完全
なまたは部分的な防御効果が示されている。これは、ゲ
ル電気泳動にて精製された７５ｋＤおよび１００ｋＤの
タンパク質区分ならびにゲル電気泳動にて精製された分
子量２００ｋＤ％　１４０ｋＤおよび４１ｋＤのタンパ
ク質バンドの双方に該当する［　Ｌ、　Ｈ，Ｐｅｒｒｉ
ｎら：（１９８４）、Ｃｌ１ｎ、　Ｅｘｐ、　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ、　５６．６７−７２、Ｌ、　Ｈ。

Ｐｅｒｒｉｎら：　（１９８５）、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　
Ｉｎｖｅｓｔ、　７５．１７１Ｂ−１７２１，ＩｗＪ、
　Ａ、　５ｉｄｄｉｑｕｉ　ら二（１９８７）、Ｐｒｏ
ｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、ＩＪｓＡ　８４．
３０１４−３０１８］。メロゾイト（ｍｅｒｏｚｏ　ｉ
　ｔｅ）に特異的であって、かつ今日までにバイオテク
ノロジー的手法で調製されてきたタンパク質のうちで、
サイミリまたはアオタスモンキーを用いた免疫実験にお
ける部分的防御効果は、いわゆるＲＥＳＡ１５５ｋＤメ
ロシイトタンバク質といわれる５゛反復領域（ｒｅｐｅ
ａｔ　ｒｅ３ｉｏｎ）の組換え発現タンパク質によって
、ざらに、２００ｋＤのメロゾイト表面前駆タンパク質
の合成オリゴペプチドによって、および分子量３５ｋＤ
、５５ｋＤおよび２００ｋＤのタンパク質の合成オリゴ
ペプチドの絹合せによって、示されている。遺伝子操作
によって調製され、モンキーを用いるインビボ実験にお
いて防御的効果を示す、上記の抗原の組換えタンパク質
は、マラリアワクチンのための有力な可能性を有してい
る。

本研究の目的は、Ｌ、　Ｐｅｒｒｉｎ　（１９８５、前
出）によって記述された防御的な４１ｋＤ抗原バンドを
コードする配列物を単離すること、それらの配列物の発
現を行うこと、および発現産物の防御効果をモンキーモ
デルにおいて試験することであった。

４１ｋＤ抗原バントに対する特異的抗血清を用いてゲノ
ム発現バンクから１５個のクローンを単離して、これら
の挿入物（１ｎｓｅｒｔｉｏｎｓ）の構造を明らかにし
た。クローン４１−１〜４１−１０および４１−１２〜
４１−１５、さらに４１−１７の配列を表１〜１５に示
す。きわめて強い免疫学的反応を示す二つのクローン（
４１−２および４１−１７）を用いて、スクリーニング
に用いる血清から単一特異性抗体を単離した。これら抗
体は、ウェスタンプロットにおいて４１ｋＤのメロゾイ
ト抗原と特異的に反応する。

サザンブロットにおいて、３．Ｏｋｂ　Ｅ　ｃ　ｏ　Ｒ
Ｉフラグメントおよび２．Ｏｋｂ　Ｓ　ａ　ｕ　３Ａフ
ラグメントを、クローン４１−２の挿入ＤＮＡとハイブ
リダイゼーションさせた。両方のＤＮＡフラグメントを
単離して配列決定した。

５ａｕ３Ａフラグメントは、４１−２遺伝子の完全なコ
ード領域を含んでいる。この領域はイントロンを含まず
、その分子量は２１５１２ダルトンであって、１８４個
のアミノ酸をコードする。この４１−２タンパク質は、
一つのシグナル配列および二つのさらに疎水性の部分を
有している。反復配列は全く存在しない。コード領域の
７０％を含む発現産物に対して調製されたウサギ抗血清
を用いるシゾント（ｓｃｈｉｚｏｎｔ）タンパク質のウ
ェスタンプロット分析によって、２９ｋＤのバンドが得
られた。さらに、１．６ｋｂのｍＲＮＡをノーザンプロ
ット分析によって検出した。

曲刃、クローン４１−７の挿入ＤＮＡは、４１ｋＤのタ
ンパク質をコードする。４１−７の融合タンパク質に対
して調製されたウサギ抗血清は、ウェスタンプロットに
おいて４１ｋＤバンドを明確に認識する。クローン４１
−７の挿入ＤＮＡを用いてゲノムλｇｔ　１１ＥｃｏＲ
Ｉ＊遺伝子バンクをスクリーニングすることによって、
２．３ｋｂのマラリア特異性挿入物（１ｎｓｅｒｔ）を
含むクローンを同定することが可能であった。これを単
離して配列決定した。これは、４１ｋＯタンパク質の完
全なコード領域を含む。遺伝子はシグナル配列はコード
せず、イントロンも反復部分も含まない。ブラスモジウ
Ｊ、・ファルシパルムからの４１ｋＤタンパク質の対応
アミノ酸配列は、哺乳動物の筋肉および肝臓からのアル
ドラーゼおよびトリバノゾーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａ
ｎｏｓｏｍａ　ｈｒｕｃｅｉ）からのアルドラーゼと高
い相同性（６０％以上）を示す。哺乳動物のゲノムと対
照的に、プラスモジウム・ファルシパルムのサザンプロ
ット分析では、ゲノム当り唯一っのアルドラーゼ遺伝子
しか見出されなかった。

クローン４１−Ｌ　２．３．４．５．６．７．８．９．
１０．１２．１３．１４．１５および１７を、４１ｋＤ
タンパク質バンドに対する抗血清との交差反応性に基づ
いて検出した。これらはワクチンの製造に適している。

クローン４１−１〜４１−５および４１−７．４１−１
０および４１−１４の挿入ＤＮＡの発現をベクター１）
ＥＸ−３１において行い、得られた融合タンパク質を精
製した。三つの発現産物（４１−１，４１−２および４
１−３）の免疫学的有効量を組合せて用いることによっ
て、７オタスモンキーをプラスモジウム・ファルシパル
ム感染から防御することができる。

したがって、本発明は、 ａ）クローン４１−１〜４１−１０．４１−１２〜４１
−１５および４１−７、さらに４１−２ｇｅｎおよび４
１−７ｇｅｎ、のＤＮＡ配列の精製単離物、ならびにそ
れらの転写産物、 ｂ）これら配列の全部または部分を含む、ＤＮＡ構造物
およびベクター Ｃ）そのようなりＮＡで形質変換させた原核細胞または
真核細胞、 ｄ）形質変換されたこれら細胞によって発現されたポリ
ペプチドまたはその部分、 ｅ）それらのアミノ酸配列、 ｆ）上記（ｄ）のポリペプチドに対する抗体、ならびに
、能動免疫のため、診断のため、および該ポリペプチド
の精製のための、該抗体の使用、ｇ）上記（ｅ）からの
アミノ酸配列物を単独でまたは絹合せで含む、マラリア
に対するワクチン、ｈ）　　（ｄ）に詳述したポリペプ
チドまたはその部分を遺伝子操作によって調製する方法
、およびＩ）診断のための該アミノ酸配列物の使用、に
関する。

本発明のざらなる態様は、以下の語例およびそれに続く
諸表ならびに特許請求の範囲に詳細に説明される通りで
ある。

例 例１： 単一特異性抗４１　ｋＤ血清を用いろλｇ　＋、　１１
発現バンクのスクリーニング １０６ＰＦＵ（プラーク形成単位）のゲノム入ｇｔ１１
発現バンク（プラスモジウム・ファルシパルム１９９６
株のＤＮＡから調！りを、プラスモジウム・ファルシパ
ルム５ＧＥＱ株からの４１ｋＤ抗原バンド［Ｌ、　Ｈ，
Ｐｅｒｒｉｎら：　（＋９１１１５）、前出］に対する
抗血清を用いて既知の方法［Ｌ、　Ｓ、　０ｚａｋｉ（
１９８６）、Ｊ、　１ｍｍｕｎ、　Ｍｅｔｈｏｄ、　８
９．２１３−２１９、Ｐｒｏｍｅ８ａ　Ｂｉｏｔ、ｅｃ
　（１９８６）、Ｐｒｏｔｏ　Ｂｌｏｔｌｍｍｕｎｏｓ
ｃｒｅｅｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ、　Ｔｅｃｌ＋ｎ１ｃ
ａｌ　Ｍａｎｕａｌ］にてスクリーニングした。このた
めに用いた検出系（ｓｙｓｔｅｍ）は・抗ウサギＩ　ｇ
Ｇ／アルカリホスファターゼ複合物（Ｐｒｏｍｅ３ａ社
製、注文番号Ｐ３７３１）であった。

４１　ｋＤタンパク質バンドに対する抗血清を用いてゲ
ノムλｇｔｌｌ遺伝子バンクをスクリーニングすること
によって、きわめて強く反応する二つのクローン（４１
−２および４１−７）およびより弱く反応する１３個の
他のクローン（４１１，４１−３，４１−４，４１−５
，４１−６，４１−８，４１−９，４１−１０％　４１
−１２．４１１３．４１−１４．４１−１５および４１
−１７）およびきわめて弱く反応する約４０個の他のク
ローンを同定することができた。１５個のクローンの挿
入ＤＮＡ（１４０ｂｐ〜６５０　ｂｐからなる）をＥｃ
ｏＲＩで切り出して、ベクター１）　Ｕ　Ｃ８のＥｃｏ
Ｒ１部位にクローニングして、さらに特徴づけをした。

例２： クローン４１−１〜４１−１０．４１−１２〜４１−１
５および４１−１７の挿入フラグメントの配列決定 挿入ＤＮＡの配列決定を、ブライマーおよび逆（ｒｅｖ
ｅｒｓｅ）ブライマーを用いるジデオキシ法によってｐ
ＵＣ８プラスミドから直接に行った［Ｅ。

Ｙ、　ＣｔｌｅｎおよびＰ、　Ｌ　Ｓｅｅｂｕｒｇ：　
（１９８５）、ＤＮＡ　４．１１３５−１７０１゜表１
−１５に、クローン４１−１゜４１−２．４１−３．４
１−４．４１−５．４１−６．４１−７．４１−８．４
１−９．４１−１０．４１−１２．４１−１３．４１−
１４．４１−１５および４１−１７の可能な転写解読枠
（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ）のみにおける
マラリア特異性ＤＮＡ配列およびそれに対応するアミノ
酸配列が示されている。これら１５個の配列部分には、
重複や相同性は全く認められない。ＵＷＧＣＧ（Ｕｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ讐１ｓｃｏｎｓｉｎ、　Ｇｅｎｅ
ｔｉｃ　ＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ）プログラムを用
いて、これら１５個の配列を、ＥＭＢＬデータバンク内
における相同的配列部分について調べた。これら１５個
の部分配列または比較的大きい相同的部分のいずれにつ
いても今までに記載されたことはない。特許出願ＤＥ−
Ｐ第３，７４１，０５７号明細書に示唆されているよう
に、クローン４１−１０の配列のヌクレオチド１〜１３
４と１４０ｋＤタンパク質遺伝子の又クレオチド２１４
４から２２７４までの部分配列の相同性はわずか７４％
である。クローン４１−１０の配列はまた、プラスモジ
ウム・ファルシパルムタンパク質に典型的な反復配列（
ｒｅｐｅｔｉｔ、ｉｖｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）部分を含
む唯一のものである。このクローンのアミノ酸配列は、
三つのテトラペプチド配列Ｐ「０−５ｅｒ−Ｇｌｕ−５
ｅｒを含んでおり、二番目の反復配列の二番目のセリン
残基はアスパラギン残基によって置換されている。これ
は、Ｇ−Ａ転移によって起きたものである。さらに、ク
ローン４１−７の配列のヌクレオチド５０〜１６３は、
ラットのアルドラーゼｍ　ＲＮ　Ａのヌクレオチド２１
８〜３３１と５６％の相同性を有する［Ｔ、　Ｍｕｃａ
ｉ　ら：　（１９８６）、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ
、　２６１．３３４７−３３５４１゜例３： 発現クローン４１−２および４１−７に対する特異性抗
体を用いての４１ｋＤ抗原の検出 り、　Ｓ、　０ｚａｋｉ　（１９８６、前出）の方法を
用いて、４１ｋＤタンパク質バンドに対する抗血清から
、発現クローン４１−１．４１２．４１−３．４１−７
．４１−８およびλｇｔｌｌ（対照）の産生物に特異性
を示す抗体を単離した。シゾントを得ろために、プラス
モジウム・ファルシパルムをヒト赤血球で培養し［Ｗ、
Ｔｒａ３ｅｒおよびＪ、　Ｂ、　Ｊｅｎｓｅｎ：　（１
９７６）、５ｃｉｅｎｃｅ　＋９３．６７３−６７５１
、ソルビトール処理によって同調（５ｙｎｃｈｒｏｎｉ
ｚｅｄ）させた［Ｃ，ＬａｍｂｒｏｓおよびＪ、　Ｐ、
　Ｖａｎｄｅｒｂｅｒｇ：　（１９７９）、Ｊ、　Ｐａ
ｒａｓｉｔｏｌ。

６５．４１８−４２０１゜シゾントを、Ｇｅ１ａｆｕｎ
ｄｉｎＲ（ブラウンメルズンゲン社製）　　［Ｇ、　Ｐ
ａ５ｖｏｌ　ら：（１９７Ｂ）、Ａｎｎ、　Ｔｒｏｐ、
　Ｍｅｄ、　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、　７２．８７−８８
と同様］に浮遊させることによって約９０％までに濃厚
にした。シゾントを遠心分離し、洗浄し、ＳＤＳ試料緩
衝液で１００℃で５分間加熱し、超音波処理して、等量
づつに分けて凍結した。

シゾント溶解液を上記の特異性抗体のウェスタンプロッ
ト分析に用いた［Ｄ、　Ａ、　、１ｏｈｎｓｏｎら：（
１９８４）、Ｇｅｎｅ　Ａｎａｌ、　Ｔｅｃｈ、　ｌ、
３−８］。ここで、発現クローン４１−２および４１−
７を用いて単離した抗体は、シゾントからの４１ｋＯ抗
原バンドときわめて強く反応した。

例４： クローン４１−２の遺伝子情報を含むＤＮＡフラグメン
トのクローニング シゾント培養液を溶解して、エチジウムプロミド／Ｃｓ
Ｃｌ遠心分離して、プラスモジウム・ファルシパルムＦ
ＣＢＲ株からのゲノムＤＮＡを得ておいた［Ｐ−０ｑｕ
ｅｎｄｏら：　（＋９８６）、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒａｎ
ｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇ
ｙ　１８．８９−１０１］。このＤＮＡの１５７１ｇを
、制限酵素ＥｃｏＲＩにて消化して、遺伝子スクリーン
膜（デュポン社製）に製造者の指示に従ってブロッティ
ングして、次いで１０　”−１０８ｄｐｍ／　１１　ｇ
の比活性（Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｃｔｉｖｉｔｙ）を有す
るクローン４１−２のニックトランスレーションされた
（　ｎ１ｃｋ−ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）挿入ＤＮＡとハ
イブリダイゼーションさせた。フィルターを０．３ｘＳ
ＳＣ（ｌ　ｘｓｓｃ＝ｏ、１５ＭＮａＣ１，０，０１５
Ｍクエン酸ナトリウム）および１％ＳＤＳ　（ソジウム
ドデシルサルフエート）にて６５°Ｃで１時間洗浄した
後、フィルターをオートラジオグラフィーで分析した。

このサザンブロット実験法を用いて、クローン４１−２
の挿入ＤＮＡとハイブリダイズする約３ｋｂの大きさの
ゲノムＥｃｏＲＩフラグメントを同定した。プラスモジ
ウム・ファルシパルムＦＣＢＲ株のＤＮＡを制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩで切断して、その６０μ８を調製ゲルで分画し
て、２．８ｋｂから３．２ｋｂの領域を切りだして電気
溶出した［Ｂ、　Ｐｅｒｂａｌ：　（１９８４）、ＡＰ
ｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ　ＣＩｏｎｉｎ８］。このＤＮＡをＴ、　Ｖ、　１
ｌｕｙｎ＋＋らの方法［ＤＮＡ　ＣＩｏｎｉｎｇＶｏｌ
、　ｌ、Ｄ、　Ｍ、　Ｇｌｏｖｅｒ編集（１０８５）、
４９−８８］にてベクター人ｇｔｌｏζこクローニング
した。

１０５ＰＦＵの得られた遺伝子バンクを、クローン４１
−２のニックトランスレーションされた挿入ＤＮＡにて
既知の方法［Ｔ、　ＭａｎｉａｔｉＳら：（１９８２）
、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ］でスクリーニングした。

その結果、クローン４１−２の挿入ＤＮＡとハイブリダ
イズするいくつかのファージクローンが得られた。これ
らクローンの一つのファージＤＮＡを単離して［Ｒ。

’Ｊ、　Ｄａｖｉｓら：　（１９８０）、Ａ　Ｍａｎｕ
ａｌ　ｆｏｒ　ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
、　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓｌ、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した。３．Ｏｋ
ｂの大きさのＤＮＡフラグメントをゲル電気泳動によっ
て精製して、ベクターｐＵｃ１８のＥｃｏＲＩ制限部位
にサブクローニングした（プラスミドＩ）ＵＣ４１−２
ｇｅｎ）。次いでサザンプロット分析（Ｔ。

Ｍａ旧ａｔｉｓら：前出）を行って、このｐＵＣ４１−
２ｇｅｎの３．０ｋｂ　Ｅｃ　ｏＲＩ　　ＤＮＡフラグ
メントをクローン４１−２の挿入ＤＮＡとハイブリダイ
ゼーションさせた。

例５： クローンｐ　ＵＣ４１−２ｇｅｎの配列分析プラスミド
ＤＮＡｐ　ＵＣ４１−２ｇｅｎの配列決定を、ブライマ
ーおよび逆ブライマーを用いてＥｃｏＲＩ末瑞部位から
行った［Ｅ、Ｙ、　ＣｈｅｎおよびＰ、　Ｈ，５ｅｅｌ
）Ｕｒ３：　（１９８５）、前出］。これによって、３
．０ｋｂＥｃｏＲＩフラグメントのそれぞれの末端から
の約２５０個の塩基の配列決定が可能であった。これら
末端の一つの配列は、クローン４１−２の挿入ＤＮＡと
同一である。制限酵素地図を作出するために、単離され
た３、０ｋｂＥｃｏＲ［ＤＮＡフラグメントの試料の０
．５１１ｇを種々の制限酵素とインキュベートして、ゲ
ル電気泳動にて分画して、ニトロセルロース上にブロッ
ティングして、ニックトランスレーションされたクロー
ン４１−２の挿入ＤＮＡと既知の方法でハイブリダイズ
させた（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ：前出）。

ハイブリダイズされた制限酵素フラグメントの大きざに
よって、種々の制限酵素切断部位のＥｃｏＲＩ切断部位
からの距離を推定することができた。これは、二つのク
ローン４１−２およびｐ　ＵＣ４１−２ｇｅｎに共通し
ている。このようにしで作出された制限酵素地図に基づ
いて、クローン１）　ＵＣ４１−２ｇｅｎの制限フラグ
メントを単離して、配列決定のためにファージベクター
Ｍ１３ｍｐ１８およびＭ　１３　ｍ　ｐ　１９にサブク
ローニングした　［Ｆ、　Ｓａｎｇｅｒら：　　（１９
７７）、Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７４．５４６３−５４６７］。こ
れによって、遺伝子に属するＥｃｏＲＩ制限部位から遺
伝子の５′末端に向かってＤｒａｌ制限酵素切断部位ま
での配列が決定された。表１６は、クローンｐＵＣ４１
−２ｇｅｎの１２３０ｂｐからなるこのＤｒａｌ−Ｅｃ
ｏＲＩＤＮＡフラグメントのＤＮＡ配列および対応する
アミノ酸配列を示したものである。塩基位置１０３６か
ら１２２８までの配列は、４１−２の挿入ＤＮＡと同一
である。クローン４１−２の配列およびクローンｐＵＣ
４１−２ｇｅｎのゲノム配列は異なるプラスモジウム・
ファルシパルム株（タイからのＴ９９６株およびコロン
ビアからのＦＣＢＲ株）に由来することから、少なくと
もこの遺伝子部分はきわめて恒久性が高いとみられる。

この配列の転写解読枠は、塩基位置７８４においてＡＴ
Ｃ開始コードンで始まり、遺伝子内のＥｃｏＲ［制限酵
素切断部位に属するＴＴＣコードンで終結する。この部
分は、タンパク質の１４９個のＮ−末端アミノ酸をコー
ドする。

この遺伝子の部分配列は、反復配列部分を全く有しない
。対応するアミノ酸配列は、１８個のアミノ酸の配列部
分に始まり、そのうちの４個は酸性であり、５個は塩基
性である。この配列部分の後に、酸性アミノ酸残基を両
側に有する１１残基からなる疎水性部分が続く。この疎
水性の領域は、シグナル配列として機能するものかもし
れない。

この推定されるシグナル配列の前方の塩基性および酸性
アミノ酸を有する領域は、比較的に長い。

しかし、同様の長さの領域は、他のプラスモジウム・フ
ァルシパルムタンパク質についても記載されていた［　
Ｔ、　Ｔｒｉｇｌ　ｉａら：　（１９８７）、Ｔｈｅ　
ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　６．１４１３−１４１９１゜
対応するアミノ酸配列を、ＵＷＧＣＧプログラムを用い
て、親水性領域および表面領域、さらに免疫原性エピト
ープである可能性を示す領域について調べた。その結果
、ヌクレオチド配列の位置第８９０〜９０７．１０７９
〜１０９３および１１５１〜１１６８によってコードさ
れるタンパク質の三つの親水性領域が明らかになった。

他のプラスモジウム・ファルシパルム遺伝子についても
記載されているように［Ｊ、Ｌ、Ｗｅｂｅｒ（１９Ｂ？
）、Ｇｅｎｅ　５２．１０３−１０９］、この遺伝子の
５′非コード領域はきわめてＡＴに冨んでいる（ＡＴ含
有量＝８８．８％）。また、この領域は、それぞれの場
合に、三つの解読枠のそれぞれに１５個以上の終止コー
ドンを有する。さらに、可能なＣＡＡＴボックスが位置
２７４に存在しており、可能な’ｒ　Ａ　Ｔ　Ａボック
スがここからヌクレオチド６４個分の下流に位置してい
る。これらの構造は、この遺伝子の可能なプロモーター
領域を特定するものかもしれない。

例６： ４１−２の完全な遺伝子の単離 クローンｐ　ＵＣ４１−２ｇｅｎの配列分析によって、
ＥｃｏＲＩ切断部位から９４７　ｂｐ離れている５ａｕ
３Ａ切断部位が判明した。ゲノムのサザンプロット分析
によって、クローン４１−２の挿入ＤＮＡとハイブリダ
イズする２、Ｏｋｂの大きさの５ａｕ３Ａフラグメント
を同定した（例４を参照されたい）。したがって、この
５ａｕ３Ａフラグメントは、ＥｃｏＲ１部位から３゛方
向に向かっての４１−２遺伝子の約１０５０ｂｐの遺伝
子情報を有するものと考えられる。ＦＣＢＲ株からのＤ
ＮＡを制限酵素Ｓ　ａ　ｕ　３　Ａで切断しておいて、
このＤＮＡの６０μｇを調製ゲル中で分画して、１．８
ｋｂ〜２．２ｋｂのＤＮＡフラグメントを単離した。こ
のＤＮＡを製造者（５ｔｒａｔａ３ｅｎｅ社）の指示に
したがってベクターλＺＡＰのＸｈｏ　ｒ部位にクロー
ニングさせた。１０５ＰＦＵのこの遺伝子バンクを、ニ
ックトランスレーションしたクローン４１−２の挿入Ｄ
ＮＡてスクリーニングして、約４０個のファージクロー
ンを同定した（例４を参照されたい）。５ｔｒａｔａＨ
ｅｎｅ法を用いる自動切り出しによって、これらファー
ジクローンの一つからブルースクリプト（旧ｕｅｓｃｒ
ｉｐｔ）ベクター（ｐ　Ｓ　Ｋ−４１−２３ｅｎ）を単
離した。このプラスミドＤＮＡを制限酵素Ｋ　ｐ　ｎ　
ＩおよびＥｃｏＲＩで切断して、９５０　ｂｐおよび１
０５０ｂρの二つのＤＮＡフラグメントを単離した。こ
のうち９５０ｈｐのフラグメントをサザンプロットにて
クローン４１−２の挿入ＤＮＡとハイブリダイゼーショ
ンさせた。プラスミドｐＳＫ−４１−２ＤＮＡの配列を
、ブライマーおよび逆プライマーを用いて決定した（Ｅ
、　Ｙ、　ＣｈｅｎおよびＰ、　Ｉｌ、　Ｓｅｅｂｕｒ
ｇ：　（１９８５）、前出）。プライマーを用いて決定
した配列は、Ｓ　ａ　ｕ　３　Ａ部位からの３゛方向の
プラスミドｐ　ＵＣ４１−２ｇｅｎの挿入ＤＮＡの配列
と同一である。プラスミドｐ　Ｓ　Ｉ（”−４１−２ｇ
ｅｎの１０５０ｂｐのＥｃｏＲＩ　　ＤＮＡフラグメン
トを、ベクターｐＫＳ＋のＥｃｏＲ１部位にサブクロー
ニングした（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓら：前出）。この
ＤＮＡフラグメントの制限酵素地図を作出した。この地
図に基づいて、制限フラグメントをブルースクリプトヘ
クターにサブクローニングして、５ｓＤＮＡ調製の後に
配列決定した（　Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社説明書）。す
なわち、４１−２遺伝子のＥｃｏＲＩ制限部位からＳ　
ａ　ｕ　３Ａ部位までを３゛方向に完全に配列決定した
。表１６の続きである表１７は、クローンｐ　Ｓ　Ｋ−
４１−２ｇｅｎのこのＥｃｏＲ［−５ａｕ３ＡＤＮＡフ
ラグメントのＤＮＡ配列および対応アミノ酸配列を示し
ており、これは１０５０ｂρからなる。この遺伝子部分
は、ＴＡＧ終止コードンが現れるまでのわずか３５個の
追加のアミノ酸をコードする。遺伝子の３゛非コード領
域はきわめてＡＴに冨んでおり（ＡＴ含有微＝８４．７
％）、三つの各解読枠において１１個以上の終止コード
ンを含んでいる。Ｓ１マツピング法（Ｆ、　Ｍ。

Ａｕ５ｕｂｅｌ　ら：　（１９８７）、Ｃｕｒｒｅｎｔ
　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ、　Ｈａｒｖａｒｄ　Ｍｅｄｉｃａｌ　５ｃ
ｈｏｏｌ。

Ｂｏｓｔｏｎ）によって、この遺伝子のいかなるイント
ロン−エクソン構造の立証も得られなかった。最後に、
ノーザンプロット分析（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓら：前
出）によって、１．６ｋｂの大きさのシゾント段階のｍ
　ＲＮ　Ａを検出した。したがって、４１−２遺伝子は
５５２ｂｐ（ＡＴ含有量＝７３％）の単一のコード部分
のみを有すると仮定することが必要である。後者は、２
１５１２ダルトンの抗原をコードし、これは、シグナル
配列を有する（例５を参照されたい）か、反復部分を有
しない。シグナル配列の他に、この抗原は、ざらに二つ
の疎水性部分をアミノ酸位置７３〜８５および１３０〜
１４７に有しており、これらは膜アンカーとして機能す
るかもしれない。

例７： ベクターｐＥＸ３１におけるクローン４１１〜４１−５
ならびに４１−７．４１１０および４．１−１４の挿入
物の発現 クローン４１−１〜４１−５．４１−７．４１−ＩＯ８
よび４１−１４の挿入フラグメントを制限酵素ＥｃｏＲ
Ｔで切断した後、ゲル電気泳動によって単離し、制限酵
素ＥｃｏＲＩて消化して脱燐酸しておいたｌ＼クターｐ
ＥＸ３１ｂに連結させて［シ＜、　　５ｔｒｅｂｅｌ　
　ら　：　　（１９８６）　、　Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏ
ｆＶｉｒｏｌｏｇｙ　５７．９８３−９９１］、プラス
ミドｐｃｉ８５７を含むコンピテントにしたＣ６００細
菌を形質転換させた［Ｆ、　Ｒｅｍａｕｔら：　（１９
８１）、Ｇｅｎｅ１５．８１−９３コ。それぞれのコロ
ニーを、ＭＳ２ポリメラーゼ融合タンパク質としてのプ
ラスモジウム特異性ＤＮＡ配列の発現について５ＤＳ−
ＰＡＧＥによって調べた。誘導はＩｆ、　Ｋｕｅｐｐｅ
ｒらの方法［Ｖ、　１ｋｅｄａおよびＴ、　ｆ３ｅｐｐ
ｕ　（編集）　：　（＋９８２）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ
３ｓ　ｏｆ　　ｔｌ＋ｅ　Ｆｏｕｒｔｈ　　Ｉｎｔｅｒ
ｎａｔｉｏｎａＳｙｍｐｏｓｉｕｍ　　ｏｎ　　Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ　　ｏｆ　　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ１Ｍｉｃｒ
ｏｏｒｇａｎｉｓ＋ｎｓ　（１９８２）、Ｋｙｏｔｏ、
にｏｄａｎｓｔ＋ａ　Ｌｔｄ、、Ｔｏｋｙｏ］にて温度
を、Ｌ昇させることによって行った。８個のフラグメン
トの全ての発現が高収率で可能であった。

例日： 発現産物の精製 形質転換させた細菌の培養物を、５０７ｚｇ／ｍｌのア
ンピシリンおよび２５μｇ／　ｍｌのカナマイシンを含
むＬＩ３培地１１４ツ）Ｂ中で２８℃で２０時間それぞ
れ激しく娠とうした。４２℃に加温しておいたＬＢ培地
の４リフト１Ｎを加えて、４２℃でさらに４時間振とう
した。細菌を遠心分離して、２００ｍ１の燐酸緩衝生理
食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁させて、機械的に破砕した。

可溶性のタンパク質を遠心分離によって除去して、発現
産物を含む沈澱物をＰＢＳで２回洗浄し、次いで融合タ
ンパク質が溶解するまで尿素濃度を上げながら（ＩＭか
ら約５Ｍまで）繰り返し洗浄した。次いで、尿素濃度が
発現産物の可溶性を保持するに充分な濃度になるまで尿
素濃度を下げながら透析を行った。この工程によって、
純度６０〜８０％が得られた。

例９： ４１−２ｇｅｎによってコードされた抗原の検出クロー
ン４１−２の発現産物に対するウサギ抗血清を使用して
、シゾントタンパク質を用いるウェスタンプロットによ
ってマラリア抗原を明確に検出することは可能ではなか
７た。したがって、遺伝子４１−２のより大きいＤＮＡ
フラグメントを発現させることを試みた。この目的のた
めに、制限酵素Ａ１ｕＩおよびＥｃｏＲＩを用いて、コ
ード領域の７０％を含む４１−２遺伝子の３８８　ｂｐ
のフラグメントを単離した。このフラグメントをプラス
ミドＩ）ＵＣｌＢのＳｍａＩおよびＥｃｏＲ１部位にサ
ブクローニングした。制限酵素ＥｃｏＲＩを用いて、こ
のプラスミドから４０１　ｂｐのフラグメントを単離し
て、これをベクターｐＥＸ３　ｌ　ｂのＥｃｏＲ１部位
にクローニングした。形質転換の後、２６ｋＯの融合タ
ンパク質を発現する細菌コロニーを同定することが可能
であった（例７を参照されたい）。これを精製して（例
８を参照されたい）、ウサギの免疫に用いた。シゾント
タンパク質を用いるウェスタンプロットによって、抗血
清は４１−２遺伝子によってコードされる２９ｋＤの抗
原を認識した。計算によって得られた分子量の２２ｋＤ
とＳＤＳポリアクリルアミドゲルで得られた分子量の２
９ｋＯの違いは、二次的１１套飾によって説明できる。

すなわち、タンパク質は位置１６６のアスパラギン残基
にＮ−グリコシレージョン部位を有している。

クローン４１−２がきわめて小さい抗原をコードするこ
とがノーザンプロット分析によって確認される。したが
って、プラスモジウム・ファルシパルムのシゾント段階
において、クローン４１−２の挿入ＤＮＡとハイブリダ
イズする１、６ｋｂのｍ　ＲＮ　Ａが検出された。ノー
ザンプロット分析は既知の方法で行われた［Ｔ、　Ｍａ
ｎｉａｔｉｓら：前出コ。

例１０： 他のクローンの抗原の対応 クローン４１−１．４１−３．４１−４．４１−５．４
１−７および４１−１０の精製された融合タンパク質に
対する抗血清を用いて、シゾントタンパク質を用いるウ
ェスタンプロット分析によって対応する抗原を同定した
。その結果、クローン４１−１．４１−３および４１−
４の融合タンパク質に対する抗血清では、明確な同定が
できなかった。クローン４１−５の挿入ＤＮＡは、９６
ｋＯの抗原に対応させることができる。プラスモジウム
・ファルシパルムの三つの９６ｋＤ抗原群については、
過去に記載がある［１．　Ｊｏｕｉｎら：　（１９８７
）、Ｉｎｆ、　１ｍｍ、　５５．１３３７−１３９２］
。クローン４１−１０の発現産物に対する抗血清は、１
１３ｋＤおよび１４０ｋＤの二つの抗原を認識する。１
１３ｋＤ抗原との反応は、防御的抗原と同一である５Ｅ
ＲＰ　［抗原（例２を参照されたい）との交差反応とし
て認識された。このように、４１−１０は、プラスモジ
ウム・ファルシパルムの１４０ｋＤタンパク質をコード
する。

遺伝子によってコードされる抗原またはその部分と防御
作用を有する４　１　ｋＤタンパク質バンドに対する血
清とが反応することは、これらすべての遺伝子に共通で
ある。クローン４１−７のみが、クローン４１−２とと
もに４１　ｋＤタンパク質バントに対する抗血清と最強
の反応性を有し、明確に４１ｋＤタンパク質と明確に推
定される。

シゾントタンパク質を用いるウェスタンプロットによっ
て、クローン４１−７の融合タンパク質に対する抗血清
は、４１ｋＤタンパク質バンドを明らかに認識する。こ
れはまた、出発血清によっても認識されている。このよ
うに、このクローンは、４１ｋ［）抗原のサブフラグメ
ントをコードするようである。調べたクローンが種々の
遺伝子の部分配列中に位置していることを、クローン４
１−１．４１−２．４１−３．４１−７．４１−１０１
．）１−１４および４１−１５のサザンブロット分析に
よってさらに確認した。

例１１ニ ゲツムλｇｔｌｌ遺伝子バンクの調製 プラスモジウム・フフルシパルムＦＣＢＲ株からのＤＮ
Ａの２ノ１ｇを、１０ｍＭ）リス−塩酸（１）　Ｈ７，
５）、１０＋ｎＭ　ＭｇＣ１２，１ｍＭジチオスレイト
−ルおよび４０％グリセロール中の１４ユニツトの制限
酵素ＥｃｏＲＩとともに３７℃で一晩培養して、ゲル電
気泳動にて分画した。このような条件で、制限酵素はＥ
　ｃ　ｏ　ＲＩ　＊　（ａｓｔｅｒｉｓｋ）活性を示し
、その結果、約５０ｂρから１０ｋｂのＤＮＡフラグメ
ントを形成する。５００ｂｐから７ｋｂのＤＮＡ領域を
電気溶出して、Ｔ、＼’、　Ｈｕｙｎｈらの方法（１９
８５、ＤＮＡ　ＣＩｏｎｉｎ３　Ｖｏｌ、　Ｉ、Ａ　Ｐ
ｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ、　Ｄ、　Ｍ、　Ｇ
ｌｏｖｅｒ　編集］にてヘクター人ｇｔｌｌにクローニ
ングした。５Ｘ１０５個のキ■換えファージクローンの
遺伝子バンクを調製して、増やした。

例１２： ４１−７遺伝子の単離および配列決定 クローン４１−７は４１　ｋＤタンパク質のサブフラグ
メント（例１０を参照されたい）を実際にコードするの
で、完全な遺伝子を単離することを目的とする。この目
的のために、ゲノム入ｇｔｌｌＥｃｏＲ１木遺伝子バン
ク（例１１を参照されたい）を、既知の方法（Ｔ、　Ｍ
ａｎｉａｔｉｓら：前出）にてクローン４１−７のニッ
クトランスレーションさせた挿入ＤＮＡを用いてスクリ
ーニングした。その結果、制限酵素ＥｃｏＲｆおよび５
ａｌＩを用いて３．３ｋｂの大きさの挿入物をそれから
それぞれ単離できる三つのλｇｔｌｌクローンが得られ
た。

挿入物のマラリア特異性の部分は、２．３ｋｂを占める
。このＤＮＡフラグメントの制限酵素地図を作出した。

これに基づいて、サブフラグメントを、配列決定のため
にブルースクリプトベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社
製）にクローニングした。２．３ｋｂの大きさのこのマ
ラリア特異性フラグメントの完全なりＮＡ配列を明らか
にすることが可能であった。表１８は、４１−７遺伝子
のＤＮＡ配列およびそれに対応するアミノ酸配列を示し
たものである。遺伝子はイントロンを有しない。５′非
コード領域の５２５塩基対が確認され（ＡＴ含有量＝８
４．２％）、同様に３”非コード領域の７７２塩基対も
確認された（ＡＴ含有量＝８４．２％）。

中心部分は、１０８６塩基対からなり（ＡＴ含有量＝６
４．４％）、３６２個のアミノ酸をコードする。この遺
伝子の計算による分子ｆｆ１３９３１４Ｄは、ゲル電気
泳動によって決定された分子機４１ｋＤとよく一致して
いる。この遺伝子を２．４ｋｂの大きさのｍ　ＲＮ　Ａ
に転写し、これを既知の方法（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ
ら：前出）によるノーザンプロット分析によって確認し
た。各プラスモジウム・ファルシパルムゲノムにはこの
遺伝子のコピーが一つだけ存在することを、サザンプロ
ット分析（例４を参照されたい）によって推定すること
が可能であった。さらに、この遺伝子は種々のプラスモ
ジウム・ファルシパルム株（コロンビアからのＦＣＢＲ
、ウガンダからのＰａ１ｏ　Ａｌｔｏ、ザイールからの
５ＧＥ２．フラジルからのＩｔｓ２（’；、およびベト
ナムからのＦＶＯＲ）に保持されていることが明らかに
なった。さらに、クローン４１−７（タイからの１９９
６株）のマラリア特異性ＤＮＡ配列は、ＦＣＢＲ株から
単離された遺伝子の位置４６４から７２９までの部分配
列と同一である。このように、クローン４１−７は、４
１ｋＤタンパク質の８８個のＮ−末端アミノ酸をコード
する。

対応するアミノ酸配列から、４１　ｋＤタンパク質はい
かなるシグナル配列も反復配列も含まないことが明らか
である。ＵＷＣＣＧ　（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆＷ
ｉｓｃｏｎｓｉｎ、　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｃｏｍｐｕｔｅ
ｒ　Ｇｒｏｕｐ）プログラムを用いて、このアミノ酸配
列とＮＢＲＦタンパク質データバンク中のタンパク質と
の相同性を調べた。その結果、４１　ｋＤタンパク質は
、ヒト肝臓アルドラーゼ［Ｍ、　Ｍｕｋａｉ　ら：　（
１９８５）、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ　Ｒｅｓ、　１３
．５０５５−５０６９１と６６％の相同性を、ラット肝
臓アルドラーゼ［に、　Ｔｓｕｔｓａｍｉ　ら：（１９
８４）、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５９．１４
５７２−１４５７５］と６６％の相同性を、ウサギ筋肉
アルドラーゼ［０゜Ｒ，Ｔｏｌａｎら：　（１９８４）
、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５９．１１２７−
１ｔ３１］と６８％の相同性を、およびトリパノゾーマ
・ブルセイ［Ｃ，Ｅ、　Ｃ１ａｙｔｏｎ：　（１９８５
）、ＥＭＢＯＪ、　４．２９９７−３００３１と６１％
の相同性を、それぞれ有することが明らかになった。こ
のように、４１ｋＤタンパク質は、プラスモジウム・フ
ァルシパルムアルトラーゼと思われる。

例１３： 動物モデルにおける実験的防御−アオタス・レムリナス
・グリセイメンブラ（Ａｏｔｕｓ　Ｉｅｍｕｒｉｎｕｓ
３ｒｉｓｅｉｍｅｍｂｒａ）　　（核型■）の免疫この
実験は、記述した発現産物の有効性をプラスモジウム・
ファルシパルム感受性モンキーにおける防御的免疫の誘
起に関して試験するために行った。本実験に用いたワク
チンは、免疫学的に強い反応性を示すクローン４１−１
．４１−２および４１−３の発現産物の組み合わせであ
った。

１、実験内容 ６匹の上記した種のアオタス・モンキー（Ｂｅｈｒｉｎ
ｇｗｅｒｋｅ　ＡＧによって育種された体重１０００〜
１５００ｇの雄および雌）を無差別に３匹ずつの二つの
グループに分けた。

クローン４１−１．４１−２および４１−３の融合タン
パク質を３Ｍ尿素ＰＢＳ溶液に溶解して、１：　１：　
１の比で混合したく最終タンパク質濃度：３００μｇ／
ｍｌ）。３匹を、３週間間隔で各回１ｍｌの混合した融
合タンパク質で３回皮下に免疫した。５０％Ａｌ（ＯＨ
）３／４５％レシチン７５％サポニンからなる混合物を
アジュバントとして１０％濃度で抗原に加えた。

同様に、感染対照グループの３匹には、上記の要領で、
抗原成分を含まない３Ｍ尿素ＰＢＳ＋アジュバントをそ
れぞれ注射した。

動物の実験的プラスモジウム・ファルシパルム感染をで
きるだけ同じ程度にするために、最終免疫の８日後に全
モンキーにＰ！−臓摘出を施した（感受性を高める）。

初回ワクチンから６７日後、全６匹の動物を５Ｘ１０６
個の寄生虫感染赤血球で静注にて感染させた。選択した
チャレンジ株はアオタス赤血球にイノビトロで適応させ
ておいたプラスモジウム・ファルシパルムＰａ１ｏ　Ａ
ｌｔｏ　（ウガンダ）で、これを牌臓摘出供与動物［４
％寄生虫血症 （ｐａｒａｓｉｔｅｍｉａ）］から直接に実験動物に移
した。この株は他のプラスモジウム・ファルシパルム分
離株とはその高い感染性で異なっている。また、この株
は免疫抗原の調製に用いたＴ９９６株（タイ）とは起源
および血清型の点で異種であることも注目される。

生理学的、寄生虫学的、血清学的および臨床化学的パラ
メーターを全観察期間を通して定期的に調べた（免疫前
後およびチャレンジ後）。

２、結果 全免疫期間を通して、検査した生理学的（＠床扉状、体
温、体重）または臨床化学的（赤血球数、ヘマトクリッ
ト、ＥＳＲ，血清酵素ＧＰＴおよびＣ；ＯＴ）なパラメ
ーターのいずれにも病理学的な変化は認められなかった
。さらに、薬剤安全試験（欧州薬局方の規格に基づく、
マウスここおける急性皮下毒性およびモンキーにおける
局部的寛容性試験）の結果は、使用したワクチン調製物
の安全性および寛容性が適当であることを示した。

２．１　　寄生虫血症 誘起される防御効果を評価する主な手段は、実験動物の
末梢血の寄生虫感染赤血球の顕微鏡による検出である。

感染から７〜１０日の早い時期に、僅少（１０００個当
り１個以下）の寄生虫感染した赤血球を、非免疫動物か
らの血液のギムザ染色塗抹物で検出した。免疫した動物
では、寄生虫の出現は感染後１０〜１５日と遅く、寄生
虫血症は最高レベルで１〜２％であり、感染は自然排除
された。

実験途中で動物の１匹が肺炎によって死んだ。

非免疫群の動物の１匹では寄生虫血症を最高レベル４．
５％に抑制することが可能であったが、他の２匹では感
染死を防ぐために寄生虫血症が＞１０％に達した後にメ
フロキン（ｍｅｆｌｏｑｕｉｎｅ、Ｈｏｆｆｍａｎ　Ｌ
ａ　Ｒｏｃｈｅ社製）による治療が必要であった。前の
感染実験において、チャレンジに用いたＰａ１ｏ　Ａｌ
ｔｏ株はクロロキノン耐性であることが証明されていた
。

第１国人は、クローン４１−Ｌ　４１２および４１−３
の融合タンパク質からなる混合ワクチンで免疫した後の
アオタスモンキーにおける寄生虫血症の経過を示し、第
１国有は、その対照（非免疫動物）を示す。

表二１ クローン４１１のマラリア特異性ＤＮＡ挿入物のヌクレ
オチド配列、およびそれに対応するアミノ酸配列 表二λ クローン４１−２のマラリア特異性ＤＮＡ挿入物のヌク
レオチド配列、およびそれに対応するアミノ酸配列 ）ｎＬｙ＝Ｆ′ｈｅＡｓｎＡａｒＩｌ／ａｌＬｅｕＬｅ
ｕ＾ｓｎＬｙｅＧ１ｕｌｌｅＧ１ｎＭｅｔＡｓｐＧ１ｕ
＾５ｎＧｌｎＧ１ｕ＾ｒｇＧ１＊ＰＩｌｅＳｉｒ！１ｅ
ＡＫｑＡ＠ｐｃ）’ＳＬｓ”ｕＭ！ｔＡｓｎＣｙｓＬｅ
ｕＬｙａＨｉｓＡｓｎ＾１ａｓ＊ｒＡｓｎＬｅ“ｊＬｙ
ｓＴｈｒＡ＝ｎＧｌｕＡｓｐＴｙｒＧ１＝＋ＡｒｇＴｓ
＋ｒＣｙｓＡｓｎＧ１ｕＡｔｐＬｙｓ１１ｅＬｅｕ＾ｓ
ｒ＋ＰｒｏＡｓｐ丁ｙｒＬ■＝ＰｙｒＳｅｒＴｙｒ 去二ａ クローン４１−３のマラリア特異性ＤＮＡ挿入物のヌク
レオチド配列、およびそれに対応するアミノ酸配列 法Ｌ１ クローン４１−４のマラリア特異性ＤＮＡ挿入物のヌク
レオチド配列、およびそれに対応するアミノ酸配列 衷」− 表山一 クローン４１−５のマラリア特異性ＤＮＡ挿入物のクロ
ーン４ １−６のマラリア特異性ＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配
列、 およびそれに対応するアミノ ヌクレオチド配列、 およびそれに対応するアミノ 酸配列 酸配列 ｌａ！１ｅ５ｅｒＡｓｎ工よｅＧ４ｕＡＪＪ１１Ｌ＠表
二２ 逸二ａ クローン４ １７のマラリア特異性ＤＮＡ挿入物の クローン４ １８のマラリア特異性ＤＮＡ挿入物の ヌクレオチド配列、 およびそれに対応するアミノ ヌクレオチド配列、 およびそれに対応するアミノ 酸配列 酸配列 ｈｒＬｓｕＰｈｅＧよＩ’１ＬＹ５＾１ｎＧＬｕＡＬａ
ｕＡ７表ヨａ 表二Ｌα クローン４ １−９のマラリア特異性ＤＮＡ挿入物のクローン４１−
１０のマラリア特異性ＤＮＡ挿入物ヌクレオチド配列、 およびそれに対応するアミノ のヌクレオチド配列、 およびそれに対応するアミ 酸配列 ノ酸配列 ｅｒｐｒｏＡｓｎｃｌｕｓｅｒｐｒｏｓｅｒｃｌｕｓｅ
ｒＡｓｐｓｅｒｒｙｒｚｅｕ表」−上 衷」−２ クローン４ ２のマラリア特異性ＤＮＡ挿入物 クローン４ ３のマラリア特異性ＤＮＡ挿入物 のヌクレオチド配列、 およびそれに対応するアミ のヌクレオチド配列、 およびそれに対応するアミ ノ酸配列 ノ酸配列 ５ｎＬａＡｎｉＡｅ１１ｎｒＴ１１ｒｌ’ｎｅ＋ａＬＬ
ＬＡｓｎＦ＋１１！ＬｅｕＬｙＳＡＳｎＧよｎｃｌｎＡ
ｓｎＰｈｅＧｌｕＸｌｅ表１３− クローン４１−１４のマラリア特異性ＤＮＡ挿入物のヌ
クレオチド配列、およびそれに対応するアミノ＠配列 表」−生 クローン４１−１５のマラリア特異性ＤＮＡ挿入物のヌ
クレオチド配列、およびそれに対応するアミノ酸配列 ＡＴ八へＧ入τＡＡＡＴＡＡＴＡＡＴＣＡＴ入ＡＴＪ％
ＡＴＡＴＴＡＴ　ＬＡＡ’ＸＡＡｓｎＭｅ　ｔＸ　ｌ　
ｅＡｓ　品５ｎｘｓｎｘｓ　ｐＡｓｎＡｓｎＩ　１　ｅ
　Ｉ　ｌ　ｅＡｓｎ衷」−五 クローン４１−１７のマラリア特異性ＤＮＡ挿入物のヌ
クレオチド配列、およびそれに対応するアミノ酸配列 表」二旦 クローン４１−２の挿入物によって特定されるプラスモ
ジウム・フフルシパルム（単能ＦＣＢＲ株）遺伝子の５
′末端の、ヌクレオチド配列およびそれに対応するアミ
ノ酸配列 ｒｇｃｘｕｖａｘｖａｌＡｓｎａｉｕｓ＠ｒｓｅｒＡｒ
ｇｎｅｃ−λｙ１ａｅｕ！ｒＯＡｓｐｕＬｕｒｎ雷表二
り旦 （続き） ｖａｌＧｌｕＧＬｙＰｈｅＬｅｕＣｙｓＳｅ【５ｅｒＧ
ｌｕＰｈｓ表１７（続き） −よｉし＾１＾“Ｊ’（ｊＴＡＴＡτＡＴＡＴＴ’ＴＡ
ＴＡτ＾τＡＴＡＧＡＴＣ表」−ヱ クローン４１−２の挿入物によって特定されるプラスモ
ジウム・ファルシパルム（単に−ｉ　Ｆ　ＣＢ　Ｒ株）
遺伝子の３°末端の、ヌクレオチド配列およびそれに対
応するアミノ酸配列 表」二ａ プラスモジウム・ファルシパルムの４１ｋＤタンパク質
の、ヌクレオチド配列およびそれに対応するアミノ酸配
列

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、表１〜１８に示したアミノ酸配列を有するプラスモ
   ジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌ
   ｃｉｐａｒｕｍ）のタンパク質、および抗原活性を有す
   るその部分配列物（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）。 ２、クローン４１−１、４１−２、４１−３、４１−４
   、４１−５、４１−６、４１−７、４１−８、４１−９
   、４１−１０、４１−１２、４１−１３、４１−１４、
   ４１−１５、４１−１７、４１−２ｇｅｎおよび４１−
   ７ｇｅｎの配列物の発現によって得られる、請求項１に
   記載のタンパク質。 ３、請求項１に記載のタンパク質を含む、融合タンパク
   質。 ４、請求項１に記載のタンパク質をコードする、ＤＮＡ
   およびＲＮＡ。 ５、精製および単離した、請求項１に記載のタンパク質
   をコードする、表１〜１８に示したＤＮＡ配列物、なら
   びにそれらと相補的でハイブリダイズしているＤＮＡ配
   列物。 ６、請求項１もしくは２に記載のタンパク質または請求
   項３に記載の融合タンパク質をコードする、ベクターま
   たはＤＮＡ構造物（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）。 ７、請求項５に記載のＤＮＡ配列物を含む、ベクターま
   たはＤＮＡ構造物。 ８、請求項４もしくは５に記載のＤＮＡまたは請求項６
   もしくは７に記載のベクターを含む、宿主細胞。 ９、請求項８に記載の宿主細胞によつて発現される、タ
   ンパク質。 １０、表１〜１８に示したタンパク質をコードするＤＮ
   Ａ配列を原核または真核宿主系で発現させることから成
   る、請求項１または２に記載のタンパク質の製造法。 １１、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質
   に対する、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体。 １２、請求項１〜３のいずれか１項に記載の一つ以上の
   抗原を含んでなる、ワクチン。 １３、クローン４１−１、４１−２および４１−３の発
   現によって得られるタンパク質またはその部分を含んで
   なる、ワクチン。 １４、請求項１１に記載の抗体を含んでなる、免疫予防
   剤。 １５、請求項４〜７のいずれか１項に記載のＤＮＡまた
   はＲＮＡを含んでなる、診断補助物。 １６、請求項１１に記載の抗体を含んでなる、診断補助
   物。 １７、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質
   を含んでなる、診断補助物。 １８、請求項１１に記載の抗体を用いて単離した、タン
   パク質。