JPH022357A - ヘモフィルス・インフルエンゼｂ型主外層膜蛋白質抗原の製造方法および組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 政府は、国立衛生研究所許可（ＮＩＨ）ｉ１７６７１に
拠りこの発明におけるある種の権利を所有し得る。

アメリカ合衆国出願第１３１１４３号（１９８７年１２
月１０日付、現出願中）の内容を引用して説明の一部と
する。

（産業上の利用分野） この発明は、ヘモフィルス・インフルエンゼｂ型（ｒＨ
１ｂＪ）ノ主外層膜蛋白質（ｒＭ　ＯＭ　Ｐ　Ｊ）抗原
の製造に有用な組成物および方法に関するものである。

特に、この発明は、Ｈｉｂ主外層外層膜蛋白質抗原−ド
するＤＮＡセグメント、Ｍ　ＯＭ　Ｐ　　Ｄ　ＮＡ上セ
グメントより形質転換された細胞およびＭＯＭ　Ｐ抗原
組成物の製造におけるこれらの使用に関するものである
。

（発明の背景） ヘモフィルス・インフルエンザ（ｉｌａｅｍｏｐｈｉ　
Ｉｕｓ　ｉｎ４１ｕｅｎｚａｅ、インフルエンザ菌）ｂ
型（Ｈｉｂ）は、幼児および子供における細菌性髄膜炎
および他の侵襲性感染の誘因である。一般に６箇月ない
し４歳の感染し易い年令範囲の子供は、全身Ｈｉｂ疾患
に対する防御抗体の標的であるＨｉｂきよう膜条糖類に
対する抗体をもたない。さらに、２歳未満の子供は、一
般に現今人手可能な多糖顧に基づくワクチン、例えば肺
炎双球菌ワクチンまたはＨｉｂワクチンに対する応答性
が乏しい。このため、きょう膜条糖類のみを含有するワ
クチンは、重症のＨｉｂ感染に関して最も危険性の高い
群である幼い子供の場合には用途が限られてしまう。

子供は一般にきょう膜条糖類のみを含有するワクチンに
対する反応性に乏しいが、この年令群の子供は蛋白質に
基づく免疫原には充分応答を示すこと（１）が報告され
ている。例えば、全身へモフィルス疾患後のＨｉｂ細胞
表面暴露外層膜蛋白質に対する抗体産生（２）の報告に
より実証された通り、Ｈｉｂの外層膜蛋白質は、幼児に
おいて免疫原になると思われる。さらに、研究者らは、
非きょう膜Ｈｉｂ抗原を標的とする抗体の受動的投与が
実験的１（ｉｂ菌血症に対する保護に役立つこと（３）
を報告している。

受動免疫試薬の製造またはワクチンの開発に使用可能な
候補として、これまでに若干のＨｉｂ蛋白質成分が研究
されている。Ｈ４ｂ蛋白質の中には抗原性が不充分であ
るか、またはそれらの対応する抗体に対して非保護的な
ものもあるが（４）、ある種のＨｉｂ蛋白質は当初のあ
る有望性を示した。これらの蛋白質、いわゆる主外層膜
蛋白質または「ＭＯＭＰＪは、Ｈｉｂ外層外層膜フラク
ションして局在化する、すなわちさらに内部の局在蛋白
質の場合よりも抗体結合に関して暴露され易い、または
利用能が高い蛋白質である。特に、リポ多糖類成分に対
する抗体は保護活性を欠くが（３）、１（ｉｂ外層膜蛋
白質に対する抗体はｒ（ｉｂによる腹腔内攻撃後の閉面
症に対して保護性を与えると思われる実験が報告されて
いる。これらの実験では、全細胞放射性免疫沈澱により
幾つかの外層膜蛋白質に対する抗体が保護免疫血清にお
いて検出されたが、これはきょう膜をもつ有機体の表面
におけるこれらの抗原の利用能を示している。

一般に、ワクチン開発の可能性を有し得る現在までに研
究されたヘモフィルス・インフルエンゼｂ型の表面暴露
外層膜蛋白質は、９８に蛋白質、加熱修飾可能であり、
２％ドデシル硫酸ナトリウム中で１００°Ｃ加熱後に４
５−５０にの見かけの分子量を呈するＰ１蛋白質（この
蛋白質はまたプロティンａともいう）、ボリンであり、
３８に−４０にの見かけの分子量を有するＰ２蛋白質（
この蛋白質はまた、プロティンｂ／ｃまたは３９に／３
８に蛋白質ともいう）、および１４に−１６にの見かけ
の分子量を呈するＰ６蛋白質を特徴とし得る。

ワクチン成分または受動免疫療法の観点から見てさらに
興味深いＨｉｂＭＯＭＰ抗原の１つは、３９Ｋ（５）ま
たはＰ２（６）蛋白質の種類として多様に称される抗原
群である。この蛋白質はボリンと同定されており、Ｈｉ
ｂリポ多糖類と非共有結合的複合体（７，）（ａ）を形
成する。事実、Ｐ２蛋白質は、菌株および分子量の測定
に使用される方法により異なるが、約３８に〜４０にの
範囲に及ぶ菌株間のサイズ不均一性を示す。

Ｐ２抗原は、この抗原に対するポリクローナル血清抗体
が幼児ラットをＨｉｂ菌血症から防御し得ること（６）
を試験が立証したという点で特に興味深い。不運なこと
に、この抗原（複数も可）は医薬的および商業的見地か
らは有用で望ましく思われるが、目下入手可能な天然供
給源からのその利用能は限られている。例えば、この蛋
白質はＨｉｂ菌株の膜成分であるが、これらの菌株から
単離した場合その収量は総じて僅かなものである。

すなわち、個々のＨｉｂ蛋白質抗原および特に選ばれた
ＭＯＭＰ抗原、例えばＰ２抗原が得られ、精製され得る
代替供給源が現在要望されている。

理想的には、かかる供給源は、製造および精製の容易さ
に関して改善された抗Ｈｉｂ抗体および免疫原組成物の
製造を可能にすべきであるだけでなく、さらに大量の、
商業的に採算の取れる量での単離を可能にすべきである
。

（発明の開示） 従って、一般的および総括的意味において、この発明は
、ワクチン、即ちきょう膜に基づくワクチンに対して乏
しい応答しか示さない子供および池の個体のワクチン化
における使用に特に適したワクチンの製剤化に使用され
るｌ−ｌ１ｂ蛋白質抗原の製造に有用なりＮＡフラグメ
ントの単離に関するものである。さらに詳しくは、この
発明は、Ｐ２主外層膜蛋白質抗原と呼ばれるＨｉｂ抗原
性蛋白質（′ＰｔＪ、数も可）の特定種類の、組換えＤ
ＮＡ方法による製造に関するものである。

Ｐ２抗原蛋白質（複数もあり得る）の製造は、■４ｉｂ
Ｐ２抗原をコードするＤＮＡセグメントの単離および使
用による本発明方法に従い有利に行なわれる。この発明
のＰ２抗原コード化ＤＮＡセグメントは、組換え技法に
より容易に操作され得る形で、Ｈｉｂ染色体または「ゲ
ノムＤＮＡ全体を含まずに単離されたＤＮＡのセグメン
トとして操作上定義され、これらのＤＮＡセグメントは
Ｐ２または３９／３８Ｋ　ＭＯＭＰ抗原として当技術分
野において様々な名称で知られている蛋白質（複数もあ
り得る）をコードする。従って、この明細書で使用され
ている「実質的に純化（精製）されたＤＮＡセグメント
」なる語は、染色体またはゲノムＤＮＡ全体を含まずに
単離され、組換え技術の実施に有用な状態、例えば別々
に単離されたＤＮＡ断片、またはかかる断片が組込まれ
たベクター（例、プラスミド、ファージまたはウィルス
）の形容が保持されているＤＮＡセグメントを包含する
。

好ましくは、さらにこの発明によるＰ２ＤＮＡ配列は、
選択された組換え宿主において配列を発現させ得る遺伝
制御領域を含む。勿論、使用される制御領域の性質は、
一般に溝想された特定用途（例、クローニング宿主）に
より異なる。例えば、好ましい組換え宿主、ヘモフィル
ス・インフルエンザの場合、好ましい制御領域はその天
然状態での構造遺伝子に含まれる相同制御領域である。

事実、相同制御領域は、この明細書で開示されているあ
る種の好ましい技術を実施することにより直接Ｐ２構造
遺伝子自体と共に単離され得る。

明らかに好ましいとはいえ、この発明による有用なりロ
ーニング宿主はヘモフィルス・インフルエンゼ細胞に限
定されている訳ではない。本発明者らは、恐らくはＰ２
蛋白質のエシェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）指向毒
性故に、機能的ヘモフィルス・プロモーターを含む全Ｐ
２遺伝子のクローニングおよび発現に関してエシェリヒ
ア・コリ（Ｅ、　ｃ。

１ｉ）が好ましくないことを見出した。しかしながら、
エシェリヒア・コリにおいてＰ２配列から得られた個々
の断片をクローニングすることは明らかに可能である。

ヘモフィルス以外の宿主の使用を望む場合、エシェリヒ
ア・コリ以外の系、例えば酵母、ＣＨＯ、アフリカ産す
バンナモンキーベロ（ＶＥＲＯ）等を使用するのが有利
である。勿論、これを企てる場合、一般的には、選択さ
れた代替宿主において機能的な制御配列の制御下にＰ２
遺伝子を導くのが望ましい。適当な制御配列並びにそれ
らの構造および用途は、一般的に当技術分野においてよ
く知られている（さらに詳しく後述する）。

好ましい実施態様において、Ｐ２コード化ＤＮＡセグメ
ントは、特定宿主による隣接配列の複製を可能にする、
機能的に複製開始点または「レプリコン」として当業界
で知られているＤＮＡセグメントをさらに含む。それら
の開始点は、Ｐ２ＤＮＡ配列が連結される、染色体外に
局在した複製キメラセグメントまたは「プラスミド」の
製造を可能にする。さらに好ましい場合、使用される開
始点は、ヘモフィルス・インフルエンザにおいて複製可
能なものである。しかしながら、クローンＤＮＡセグメ
ントの用途を広げるためには、別法として、または追加
的に、その使用が考えられる（例えばシャトルベクター
において）他の宿主系により認識される開始点を使用す
るのが望ましいことらあり得る。例えば、他の複製開始
点、例えばＳＶ４０開始点（幾つかの高度有機体におけ
るクローニングに使用され得ろ）の単離および使用につ
いては公知である。ある実施態様において、この発明は
、選択された制御領域の制御下にＰ２遺伝子配列を適当
な復製開始点と共に含む組換え形質転換ベクターに関し
て定義され得る。一般に好ましいベクターには、ヘモフ
ィルスベクター、例えばｐＨＶＴＩＳｐＤＭ２、ｐＨＣ
Ｖ５またはｐＧＪＢＩ０３があり、これらはへモフィル
ス宿主におけるＰ２配列のクローニングを可能にし、さ
らに抗生物質耐性遺伝子、例えばＡｍｐ　　またはＴｅ
ｔｒを提供するもので、形質転換体の単離を容易にし得
る。

好ましくはへモフィルスＰ２抗原をコードするＤＮＡ配
列の単離は、その抗原製品がワクチン製剤に好ましいこ
とから、病原性Ｈｉｂ菌株により行なわれる。この明細
書に開示された好ましい方法は制限酵素Ｐｓｔｌによる
ＨｉｂゲノムＤＮＡの消化を用いるが、これは、好まし
くはＰｓｔｒ部位にクローニングされる約８〜ｌＯキロ
塩基のＰｓｔＩフラグメントの放出を助ける（例、アン
ピシリン耐性遺伝子に含まれる場合と同様、Ａｍｐ　　
クローニング・ビークルにおいてはβ−ラククマーゼ）
。

しかしながら、この発明が決してＰ≦ｔｌ消化フラグメ
ントに限定される訳ではないことは、当業界の熟練者に
は自明の理である。例えば、ヘモフィルスＤＮＡは、部
分的制限酵素消化の使用により不規則に断片化され得る
。これらの消化が「部分的」である場合、遺伝子の完全
な相補的配列を含むＤＮＡフラグメントを得ることがで
きる。こうして製造されたＤＮＡフラグメントは、「部
分的」制限消化条件下において必ずしも全ての酵素認識
部位が認識および開裂される訳ではないという点で「ラ
ンタ゛ム」である。選択された制限酵素認識部位が例え
ば所望の特定コード配列内に存在し得るという事実は、
ＤＮＡフラグメントの集団の少なくとも一部が特定遺伝
子の完全な未開裂配列を提供するため、ＤＮＡを断片化
する方法としての「部分的」酵素消化の有用性を制限す
るものではない。すなわち、この発明によるヘモフィル
スＤＮＡフラグメントの生成には実質的に全ての制限酵
素が使用可能である。すなわち、ＤＮＡ断片化に使用さ
れる特定制限酵素に対する一般的制限条件は、好ましく
は首記酵素が使用される特定クローニング・ビークルに
存在するクローニング部位と適合し得るべきであるとい
う点のみである。

しかしながら、抗原遺伝子の全コード配列を含むフラグ
メントを生成すべきという一般的必要条件は存在しない
ものとする。必要なことは、抗原性であるポリペプチド
配列をコードするのに充分な長さであるフラグメントを
得ることだけである。

それらが抗原的に「認識」されろ場合、前記ポリペプチ
ドは、少なくとも前記フラグメントを抗原性とするのに
必要な抗原決定基（エピトープ）を含むため、これらの
蛋白質フラグメントはワクチンまたは接種物において有
効に使用され得る。この発明の色図するところでは、完
全な蛋白質配列に由来するものであるにも拘わらず、（
ポリペプチドカり免疫原決定基を含むことにより免疫応
答を提供する際に機能し得るポリペプチドは、完全蛋白
質配列の抗原機能均等物質であると考えられるため、こ
の発明の範囲内に含まれる。

この発明に有用なりローンを同定および単離するために
は、所望のＰ２抗原に関する免疫選択性を有する抗体の
使用による発現スクリーニングの使用を選ぶことができ
る。発現スクリーニングは、それが免疫同定可能な蛋白
質を積極的に発現しているクローンを同定するのみであ
るという利点を呈する。従って、求められたクローンが
最終的に抗原製造に使用されるものである場合には、発
現スクリーニングはある種の利点を提供し得る。

代替的または追加的スクリーニング方法では、クローン
化または合成りＮＡプローブを用いて形質転換体のコロ
ニースクリーニングを行う。勿論、形質転換体クローン
バンクの最も好ましい前記コロニースクリーニング方法
は、この明細書の記載に従いクローンされたプローブの
使用によるものであり、このプローブは、この発明によ
り組換えプラスミドｐＥＪＨ３９−１を有するヘモフィ
ルス菌株の形でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション（ＡＴＣＣ）に寄託されている（ＡＴＣＣ受託
番号６７５７４および６７５７５）。このプラスミドは
、Ｐ２遺伝子および関連した相同制御領域を含む約８〜
ｌＯキロ塩基のＨｉｂ　Ｐｓｔ■フラグメントを含む。

また前記寄託法は、ＨｉｂＰ２抗原をコードするＤＮＡ
セグメントに関してこの発明のさらに好ましい態様を定
義する手段を提供する。すなわち、ある種の有用なりＮ
Ａ上セグメント、選択されたハイブリダイゼーション・
ストリンジエンシーでこのプラスミド（ｐＥＪＨ３９−
１）のＰ２　　ＤＮＡ挿入体とハイブリダイゼーション
され、さらにＰ２配列またはその選択された部分をコー
ドする。

Ｐ２をコードする配列の同定および画定に有用なハイブ
リダイゼーション条件は、一般に約０．１５〜約１．０
モルの範囲の塩濃度条件、約４０℃〜４５°Ｃの温度（
ホルムアミドが含まれる場合）、および好ましくは約２
０％〜４０％の範囲のホルムアミド濃度であり、最も好
ましい条件は２０％ホルムアミドおよび約０８モル塩を
用いた約４２℃の比較的非ストリンノエント的条件であ
る。

従っである態様において、この発明は、Ｐ２遣。

伝子に対応する配列またはその選択された小部分を有す
る核酸分子に関するものであり、前記配列はそれらが抗
原性ペプチドをコードするか否かとは関係無く重要な用
途を有するものと考えられる。

この態様において、例えば、合成または他の方法により
製造されたＰ２遺伝子の短いまたは大きい核酸フラグメ
ントはハイブリダイゼーション・プローブとして使用さ
れ得るものと考えられる。これらのプローブは、選択さ
れた生物学的または臨床的試料、例えば病変部しん出液
、髄液、バイオプシー試料または羊水（ただし、これら
に限定される訳ではない）での病原性Ｈｉｂの検出にお
けるそれらの使用を含めて様々な形式で容易に使用され
得る。有用な適用法およびＤＮＡハイブリダイゼーショ
ン技術については、参考文献、例えば後記参考文献２８
またはアメリカ合衆国特許第４３５８５３５号参照（こ
れらの内容を共に引用して説明の一部とする）。

かかる実施態様において、選択された核酸分子（ＤＮＡ
またはＲＮＡ）は、一般に第６図のＰ２核酸配列の少な
くとも１０ヌクレオチドセグメントを含み、旧記核酸分
子は、全体として、例えば前述または参考文献２８−３
０（これらの内容を弓用して説明の一部とする）に記載
された標準選択的核酸ハイブリダイゼーション条件下で
前記配列と検出可能な安定した二重螺旋を形成すること
ができる。１０塩基より小さいサイズでは、ハイブリダ
イゼーション後の洗浄工程中のハイブリダイゼーション
安定化が問題となり得ることから、１０塩基対サイズを
一般的な最低限度として選ぶ。

この結果、シグナル／雑音比はかなり低くなる。

さらに、プローブの大きさが７未′ｔ４〜８塩基に減少
すると、短い伸縮範囲に亙って相捕的配列を有する遺伝
子との非特異的ハイブリダイゼーションが行なわれ得る
。

この発明のさらに好ましい実施態様は、その構造が第６
図の核酸配列の少なくとも１７ヌクレオチドセグメント
を含む配列を有する核酸分子の製造および使用に関する
ものである。これらの実施態様は、約１０塩基という最
低限度より大きいハイブリダイゼーションプローブがさ
らに特異的で安定した、さらに全体的に信頼性の高いハ
イブリッドを提供することを認めるものである。長いプ
ローブの唯一不利な点は、フラグメントを合成的に製造
する場合に製造費用が幾分高くなり得るということであ
る。しかしながら、ＤＮＡ合成機械およびＰＣＲ科学技
術の出現により（アメリカ合衆国特許、第４６８３２０
２号、この内容を引用して説明の一部とする）、大きな
りＮＡまたはＲＮＡプローブの製造費用を回避すること
は可能である。

この発明のさらに別の態様は、本質的に第６図に示され
たアミノ酸の配列を含むＰ２蛋白質をコードするＤＮＡ
配列に関するものである。この配列は、プラスミドｐＥ
ＪＨ３９−１の組換え挿入体に含まれるＤＮＡＰ２コー
ド配列の決定結果から予言された。予言されたリーディ
ングフレームは長さ約３６１アミノ酸の蛋白質をコード
し、初めの２０アミノ残基は、成熟蛋白質では除去され
るものと信じられているリーダー配列を形成している。

いずれにしても、天然対立遺伝子および関連性のあるＰ
２コード化遺伝子のＤＮＡにおける突然変異体は存在す
ると思われる。例えば、異なる亜種に由来するＰ２蛋白
質は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に付され
た場合、約３５〜約３９にの範囲で分子サイズの明らか
な変動を呈することが知られている。

０η記の関連遺伝子または変異型遺伝子は全て、プラス
ミドｐＥＪＨ３９−１の挿入体に組込まれたＰ２遺伝子
に関して決定された配列と高度の配列類似性を有するも
のと予想される。従って、ｐＥ　Ｊ　Ｉ−１３９−１挿
入配列を用いてプローブ製造に必要な情報を測定するこ
とにより、関連性を有するか、突然変異したか、修飾さ
れたか、または再構築されたＤＮＡセグメントを含む追
加クローンを同定することができる。関連性のある配列
の選択に有用なプローブおよび他の用途、例えばインビ
トロ部位指向性突然変異誘発に有用なプローブの製法は
、当業界において周知であり、ここに開示された情報に
照らして容易に実施され得る。

さらに第６図の配列情報により、完全Ｐ２抗原そのもの
の代わりに抗原組成物において使用され得る別個の抗原
または免疫原ペプチドの製造が可能である。完全Ｐ２蛋
白質の配列内からの適当なペプチドの決定は、親水性分
析または別法として疎水性領域の予想において特に有用
であり得るバイトロバシー（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ）分
析に基づいて実施され得る（参考文献２６および２７参
照）。Ｐ２配列内のこれらの領域、特に親水性領域を確
認することにより、抗原または免疫原組成物に関して特
別の有用性を有する短いペプチジル領域を同定すること
ができる。

従って、さらに別の態様においてこの発明は、Ｐ２抗原
に対して反応性のある抗血清との免疫学的交差反応能を
特徴とする、約１０ないし約３０アミノ酸長を有するポ
リペプチドを含むＰ２蛋白質の抗原／免疫原サブフラグ
メントを提供する。

ここに使用されているｒＰ２抗原に特異的な抗血清との
免疫学的交差反応能を有する」なる語は、一般にヒト、
ウサギまたは他の動物の抗Ｐ２ポリクローナル抗血清ま
たはモノクローナル抗体、好ましくは参考文献１０に記
載されたものとの免疫学的交差反応能に関して用いられ
る。

すなわち、この発明の好ましい態様は、組換え宿主細胞
から誘導されたか、または合成的に製造された第６図の
「合成ペプチド」による抗原／免疫原Ｐ２ペプチド配列
に関するものであり、それらは大体１７５位のアミノ酸
Ｇｉｎから１９７位のアミノ酸Ｇｌｙまでの個々のペプ
チド、２６０位のアミノ酸Ｇｌｙから２７５位のアミノ
酸Ｔｙｒまでのペプチド配列、２９６位のアミノ酸Ｌｙ
ｓから３１１位のアミノ酸Ｇｉｎまでのペプチド配列、
３３３位のアミノ酸Ａｌａから３５３位のアミノ酸Ｖａ
ｌまでのペプチド配列および前記ペプチドの生物学的機
能均等配列に対応する。これらのペプチドは、例えば免
疫学的検出測定における抗原として、またはワクチン形
成における免疫原として共に有用であるものと考えられ
る。

一般に、この明細書で使用されている「生物学的機能均
等」アミノ酸なる語は、この発明が、必ずしら抗原／免
疫原同一性を低減または喪失すること無く、面述のアミ
ノ酸配列において変形（例、自然の遺伝的浮動、菌株も
しくは亜種抗原変形、またはそのＤＮＡ分子の突然変異
による）が行なわれ得ることを考慮するものであるとい
う事実を指している。

例えば、配列は、荷電類似性（例、アミノ酸側鎖基の酸
性または塩基性荷電）、バイトロバシック指数または両
極性スコアに基づく考察を踏まえて改編され得る。一般
に、この発明のこれらの広範な態様は、ある種のアミノ
酸がペプチドの抗体結合能力をそれほど失わずに他の同
様のアミノ酸と置換されるため、抗原性により認識され
得るか、または別法として、抗体形成細胞と相互作用し
て免疫応答を発し得るということが当業界において一般
的に理解されている点に一部基づくものである。アミノ
酸置換の例に関しては後述する。

Ｐ２抗原を製造する場合、抗原生産宿主、例えば染色体
遺伝子のそれ自体の補体からＰ２抗原を自然に生産する
Ｈｉｂ宿主の構築においては、好ましくは様々にクロー
ン化されたＰ２コード化ＤＮＡセグメントを使用する。

かかる宿主をＰ２コードＤＮＡで形質転換することによ
り、染色体および染色体外の両方におけるＰ２配列の転
写を伴う「遺伝子量」効果が観察される。しかしながら
、Ｐ２配列によるＩ−ｒｉｂ宿主の形質転換の結果、２
タイプの形質転換体、即ち高度および低度Ｐ２抗原生産
体の生じることが判った。「低度生産体」の生成は、染
色体外および染色体の両方における２２発現性を有する
「遺伝子量」効果を明らかに打ち消す導入遺伝子の染色
体組込みに起因すると思われる。

従って、高度Ｐ２２生産を同定するためには、例えばＰ
２発現蛋白質のゲル染色強度対野生型Ｈｉｂ宿主の観察
による形質転換体のスクリーニング実施が望ましい。

高度Ｐ２生産形質転換体が得られた後、細胞を成長させ
ると、この明細書に開示された技術を用いてそこからＰ
２抗原がかなりの純度で単離されろ。要するに、Ｈｉｂ
の細胞エンベロープを製造し、ラウリルサルスコシン酸
ナトリウム、次いでデオキシコール酸ナトリウムにより
抽出する。生成した不溶性物質をツビッテルゲント３−
１４緩衝液に懸濁し、生成したＰ２蛋白質含有可溶化物
質をＤＥＡＥセファクリル・カラムによるカラム・クロ
マトグラフィーに付すと、比較的純化された蛋白質が得
られる。勿論、汚染物質ＬＰＳが存在する場合、これを
除去するためにＰ２抗原製品をさらに精製することが望
ましいこともあり得る。しかしながら、非細菌性宿主を
Ｐ２生産に使用する場合には、ＬＰＳ汚染を問題とすべ
きではない。

非経口投与の場合、精製Ｐ２抗原またはさらに短い抗原
性ペプチドはごま油もしくは落花生油、水性プロピレン
グリコールまたは滅菌水溶液において製剤化され得る。

一般的にこれらの溶液は必要ならば適当に緩衝化され、
液体希釈剤をまず充分な食塩水またはグルコースにより
等張化する。

さらに、例えばソルビトールまたは安定化ゼラチン形態
の安定剤も含まれ得る。これらの特定水溶液は、筋肉内
および皮下注射に特に適しており、一般的に抗原製剤を
用いたワクチン化に好まれる。

しかしながら、潜在的抗原性を高めることにより抗原含
有医薬製剤の性能を改良するためには、さらに様々な免
疫アジュバント、例えばフロイントまたは水酸化アルミ
ニウムまたは燐酸アルミニウムアノユバントにより調製
された油中水エマルジョンの含有が望ましいこともあり
得る。軽質鉱油（ベイオール）および乳化剤混合物、例
えばアラセル（ΔまたはＣ）の基礎成分は市販されてい
る。

抗原を免疫原の溶液または懸濁液（不完全フロインドア
ジュバント）により乳化する。さらに、少屯ノマイコパ
クテリウム（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）　［エム・
プチリクム（Ｍ、Ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、エム・ラベル
クロシス（Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ月を懸濁液
に加える（完全フロインドアツユバント）ことにより、
この発明に従い製造される医薬ワクチンの免疫原性はさ
らに向上する。

第１図は、Ｐ２コード配列をコードする組換え挿入体並
びに関連した制御およびプロモーター領域を有するプラ
スミドｐＥＪＨ３９−１の部分的制限酵素地図である。

制限部位間の大体の距離はキロ塩基で与えられている。

太線はベクターＤＮＡを表す。点線は、ｒＮＨ，Ｊによ
り示されたアミノ末端コード端部を伴うＰ２コード領域
の大体の位置を表す。制限部位の省略形は次の通りであ
る。

第２図は、Ｐ２蛋白質をコードする遺伝子に対する放射
性標識合成オリゴヌクレオチドプローブによりプローブ
されたＨｉｂ菌ＤＤＬ４１（レーンＡおよびＣ）および
ＤＬ４２（レーンＢおよびＤ）由来の制限酵素分解染色
体ＤＮＡのサザーン・プロットである。レーンＡおよび
ＢはＰｓｔ１分解によるものであり、レーンＣおよびＤ
はＥｃｏＲＩ分解によるものである。

第３図は、示されたヘモフィルス・インフルエンゼ菌株
由来の全細胞蛋白質のクマシーブルー染色５ＤＳ−１０
％ポリアクリルアミド・スラブゲルを示す。ＤＬ４２は
Ｈｉｂ菌株である。ＤＢＩＩ７は、様々なりローニング
実験において宿主として使用されるヘモフィルス・イン
フルエンゼＲｄ菌株である。レーン標識ＧＪＢは、クロ
ーニングベクターｐＧＪＢ＋０３を含む菌株ＤＢ１１７
を示す。レーン標識ＥＪＨは、組換えプラスミドｐＥ　
、Ｊ　Ｈ３９−１を含むＤＢ１１７を含む。矢印は、３
９キロダルトン分子■の大体の泳動を示す。

第４図は、第３図の５ＤＳ−ポリアクリルアミドにおい
て示された同セットの抗原を抗Ｐ２ネズミモノクローナ
ル抗体９Ｆ５とインキュベーションし、洗浄し、西洋わ
さびペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスおよびウサギ抗
ヤギ免疫グロブリンによりプローブし、４−クロロ−１
−ナフトールを用いて展開することにより得られたウェ
スタン・プロットである。

第５図は、示されたヘモフィルス・インフルエンゼｂ型
菌株から得られた全細胞蛋白質のクマシーブルー染色５
ＤＳ−１０％ポリアクリルアミド・スラブ・ゲルを示す
。

第６図は、ｐＥＪＨ３９−１のＤＮＡ挿入体から決定さ
れたＰ２蛋白質遺伝子のＤＮＡコード配列および予想さ
れるアミノ酸配列を示す。成熟Ｐ２蛋白質のアミノ酸配
列分析に基づいて、第６図に示された最初の２０個のア
ミノ酸、Ｍｅｔ−１〜Ａｌａ−２０はリーダー配列ペプ
チドを構成し、残りのペブチノル部分、Ａｌａ−’２１
　＝Ｐｈｅ　−３６１は成熟またはプロセッシングされ
た蛋白質を表すことが決定された。またＰ２蛋白質のペ
プチジル領域の上に描かれた線は、親水性領域のコンピ
ューターによる同定処理に基づいてＰ２蛋白質の抗原性
サブペプチドであると思われる部分を示す。

前述した通り、この発明は、総括的および全体的色味に
おいて、ヘモフィルス・インフルエンゼｂ型（１−ｊｉ
ｂ）蛋白質抗原および特にある種のＨｉｂ主外層膜蛋白
質（ＭＯＭＰ）抗原をコードする配列を含むＤＮＡセグ
メントの分離および精製に関するものである。この発明
による方法に従い、これらのＤＮＡセグメントは、選ば
れた宿主細胞による個々のＩ（ｉｂ抗原の製造に使用さ
れる有用な組換えベクターに組込まれる。

その重要性およびそのクローニングに伴う特別な難しさ
故に、この開示は、いわゆる３９ＫＭＯＭＰまたはＰ２
抗原遺伝子の分子クローニングによる分離を特に指向す
るものである。この遺伝子をコードする組換えベクター
の構築において遭遇する難しさは、エシェリヒア・コリ
宿主における無傷のポリペプチドの有効な発現達成の失
敗と明らかに関係している。この理由は不明である。

外層膜を通るある種の物質の代謝速度を制御する３９に
蛋白質自体（ボリンである）はエシェリヒア・コリ細胞
に対してかなりの毒性を示し得るということが原因であ
り得る。しかしながら、エシェリヒア・コリは、例えば
Ｐ２コード配列のある部分のみが発現を伴わずにクロー
ン化されている場合、または低いコピー数のベクターが
使用される場合にクローニング宿主として有効に使用さ
れ得ることが信じられている。

少なくとも本発明者らは、Ｐ２抗原遺伝子がエシェリヒ
ア・コリにおいては容易にクローン化され得ず、事実宿
主としてヘモフィルス・インフルエンゼ細胞そのものを
用いることにより好ましくクローン化されることを発見
した。この発見は、宿主指向性Ｐ２毒性の欠如に関して
さらに適した宿主はヘモフィルス・インフルエンゼ自体
であると仮定した発明の開発中にもたらされた。不運な
ことに、宿主細胞がクローン化される遺伝子と同種に属
する場合には、クローン同定の新しい方法が必要とされ
る。

適当に形質転換された組換えコロニーの同定に関するこ
の問題は、ある踵のモノクローナル抗体が、他のヘモフ
ィルス・インフルエンゼ菌味由来の対応する２２種とは
交差反応しないＨｉｂ菌株由来のＰ２抗原に対して生成
され得るという本発明者らの観察により解決された。例
えば、モノクローナル抗体２Ｆ’４はＨｉｂのＰ２蛋白
質とは結合し、ヘモフィルス・インフルエンゼＲｄ菌１
’ＪＤＢ１１７のＰ２蛋白質とは結合しない。すなわち
、味特異的抗Ｐ２抗体の使用により、Ｐ２発現クローン
が生成され、非免疫交差反応性Ｐ２抗原を生産するヘモ
フィルス・インフルエンゼ宿主菌株ヲ用いて陽性クロー
ンが免疫選択される。

以下、Ｐ２　ＭＯＭＰ抗原をコードするクローンの分離
において有効な処理法であることが見出された工程の全
体像を示す。下記工程は本発明者により総じて好まれて
いる工程であるが、当業界の熟練者には、所望によりあ
る種の代替手順が使用され得ることはこの明細書の開示
から明らかなことである。

Ｐ２遺伝子をクローニングする場合、一般的にはまず、
全ＨｉｂゲノムＤＮＡと比へてＰ２ａ伝子配配列豊富な
りＮＡフラクションを得ることが望ましい。決して絶対
必要条件ではないが、クローニング曲にＰ２配列にＨｉ
ｂＤＮＡが豊富に存在すると、陰性コロニーの数が大き
く減少するため、スクリーニングを要するコロニーの全
体数ら減少する。さらに、ここで使用される濃化技術は
、特異的な別々のゲノムＰ２フラグメントが同定および
ゲル分離されるという重要な追加利点を呈する。

要するに、Ｐ２ｉｉｔ伝子フラグメントの濃化は、好ま
しくはまずＨｉｂゲノムＤＮＡを一連の制限酵素で分解
し、こうして製造されたＤＮＡフラグメントを合成オリ
ゴヌクレオヂド・プローブでサザーン・プロット・ブロ
ービングしてＰ２配列を同定することにより行なわれる
。この方法では、Ｐ２遺伝子に関して、好ましくは制御
領域を含むＰ２遺伝子全体を包含するのに充分な大きさ
を有する単一制限フラグメントの同定に必要な程度まで
間接的に制限酵素部位の地図作製を行なう。すなわち、
次に、調製量のゲノムＨｉｂＤＮＡを適当な酵素で分解
し、同定されたＰ２遺伝子制限フラグメントをサイズ分
画化、例えばプレパラティブ・ゲル分離法により分離す
ることができる。

Ｐ２ａ化ＨｉｂＤＮＡフラクションの分離後、好ましく
は次に選択された組換えベクターとβ化ＤＮＡを結合す
る。好ましい宿主はヘモフィルス・インフルエンゼ自体
である。さらに詳細には、この用途の場合、ヘモフィル
ス・インフルエンゼＲｄ菌株、ＤＢ１１７を使用した。

この特定のヘモフィルス・インフルエンゼ菌株は組換え
不能であり、遺伝的特性は染色体ＤＮＡフラグメントの
クローニングを容易にする。

当技術分野では、幾つかの適当なヘモフィルス系プラス
ミドが知られており、例えば実例として、アンプ・プラ
スミドｐＲｓＦ０８８５（１５）またはエシェリヒア・
コリ／ヘモフィルス・インフルエンザ・シャトルベクタ
ーｐＨＣＶ５もしくはｐＨＶＴＩ（８、本明細書に説明
の一部として引用）またはエシェリヒア・コリ／ヘモフ
ィルス・インフルエンザ・ンヤトルベクターｐＤＭ２（
９）が使用され得る。本発明者により使用され、本発明
方法の実施に好ましい特定ベクター、ｐＧＪＢＩ０３は
、プラスミドｐｌ−ＩＶＴＩの修飾バージジンであり、
２．３ｋｂＡｖａｌ／灸吐■部位が欠失され、則１■リ
ンカ−がその未翻訳リーダー領域におけるβ〜ラクタマ
ーゼ遺伝子の５ｓｐ１部位に挿入されている。

ヘモフィルス・インフルエンザのような原核生物に加え
て、真核微生物、例えば酵母培養物もクローニングに使
用され得ることが信じられている。

真核微生物の中でもサツカロマイセス・セレビシェ（Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ま
たは普通のパン酵母が最も一般的に使用されているが、
他の菌株も幾つか市販されている。サツカロマイセスで
発現させる場合、例えばプラスミドＹＲｐ７（１７，１
８）が常用される。このプラスミドは、既にトリプトフ
ァンでの成長能力を欠く酵母の突然変異株、例えばＡＴ
ＣＣ第４４０７６号またはＰＥＰ４−１（＋９）に対す
る選択マーカーを提供するｔｒ２１遺伝子を含む。従っ
て、酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのｔｒｐｌ突然変
異の存在は、トリプトファンの非存在下での成長による
形質転換の検出に有効な環境を与える。

酵母ベクターにおけろ適当なプロモーター配列には、３
−ホスホグリセリン酸キナーゼ（２０）、例えばエノラ
ーゼ、グリセルアルデヒド−３〜燐酸デヒドロゲナーゼ
、ヘキソキナーゼピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホス
ホフルクトキナーゼ、グルコース−〇−燐燐酸イソメラ
ーゼ３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナ
ーゼ、トリオース燐酸イソメラーゼ、ホスホグルコース
イソメラーゼおよびグルコキナーゼのプロモーターがあ
る。転写が成長条件により制御されるという追加利点を
有する他のプロモーターとしては、アルコールデヒドロ
ゲナーゼ２、イソチトクロムｃ１酸性ホスファターゼ、
窒素代謝と関連した分解性酵素、および前述のグリセル
アルデヒド−３−燐酸デヒドロゲナーゼ、並びにマルト
ースおよびガラクトース利用に関与する酵素のプロモー
ター領域がある。酵１号細胞において機能し得るプロモ
ーター、複製開始点および終止配列を含むプラスミドベ
クターであれば全て適していると考えられる。

微生物に加えて、多細胞有機体に由来する細胞の培養物
も有用であり得る。原則として、を椎動物培養物または
無を椎動物培養物のいずれに由来するにせよ、細胞培養
物は全て実行可能である。

しかしながら、を椎動物細胞に対する関心が最ら高く、
培養（組織培養）中のを椎動物細胞の伸長（ｐｒｏｐｏ
ｇａｔ　１ｏｎ）は近年における常用方法となった（２
２）。これらの有用な宿主細胞株の例としては、べｏ（
ＶＥＲＯ）およびＨｅＬａ細胞、チャイニーズ・ハムス
ター卵巣（ｃＨＯ）セルライン並びにＷ２Ｂ５、ＢＨＫ
１ＣＯ９−７およびＭＤＣＫセルラインがある。これら
の細胞の発現ベクターは、通常復製開始点、発現される
べき遺伝子の正面に（装置するプロモーター（必要なリ
ポソーム結合部位があればこれを伴う）、ＲＮＡスプラ
イス部位、ポリアデニル化部位および転写ターミネータ
−配列を含む。

は乳類細胞において使用する場合、発現ベクターに対す
る制御機能はしばしばウィルス性材料により与えられる
。例えば、常用プロモーターはポリオーマ、アデノウィ
ルス２に由来するものであり、最も頻繁にはサルウィル
ス４０（ＳＶ４０）が使用される。ＳＶ４０ウイルスの
初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウィルス性複
製開始点をも含むフラグメントとして両方共ウィルスか
ら容易に得られるため、特に有用である（２３）。ウィ
ルス性？ｌＪ開始点に位置するＨｉｎｄＩ１１部位から
Ｂａ１１部位に向かって伸びる約２５０ｂｐ配列が含ま
れている限り、小形または大形ＳＶ４０フラグメントも
また使用され得る。さらに、制御配列が宿主細胞系と適
合し得る場合は、所望の遺伝子配列に通常伴うプロモー
ターまたは制御配列の利用も可能であり、また望ましい
ことも多い。

複製開始点は、例えばＳＶ４０または池のウィルス性（
例、ポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶ等）供給源か
ら誘導され得る外来性開始点を含ませるべくベクターを
構築することにより提供され得るか、または宿主細胞染
色体複製機構により提供され得る。ベクターが宿主細胞
染色体中に組込まれている場合、後者がしばしば満足す
べき結果をもたらす。

ヘモフィルス・インフルエンゼ細胞を宿主として使用す
る場合、実質的にいかなる菌株でも使用され得、Ｐ２遺
伝子の有効な複製および発現が達成され得る。勿論、最
初のクローン同定の場合について前述した通り、求めら
れている特定のＰ２を生産しない株の使用が望まれる。

受動性または免疫原性の免疫試薬を製造する場合、一般
的にはＨｉｂ菌株由来のＰ２変異体のクローニングが望
ましい。すなわち、クローニング宿主に関しては、その
Ｐ２蛋白質がＨｉｂＰ２の蛋白質と免疫学的に区別され
得る株の使用が望まれる。

一般的に入手可能なｊａｂ菌株、例えばＤＢＩＩ７、お
よびヘモフィルス・インフルエンザの他のｎｄ菌株（例
、ＫＷ２０）が宿主として全く容易に使用され得ること
が判った。これは、ヘモフィルス・インフルエンゼＲｄ
菌株のＰ２蛋白質との反応性は示さないが、Ｈｉｂ菌株
のＰ２蛋白質との反応性は示すモノクローナル抗体（例
、２Ｆ４）が製造され得ることに合致する。従って、モ
ノクローナル抗体２Ｆ４とは非反応性のへモフィルス・
インフルエンザのＲｄ菌株は、Ｈｉｂ菌株のＰ２をコー
ドする遺伝子に関するクローニング実験用の宿主であり
得る。理想的には、Ｒｄ菌株もまたＤＢ＋１７と同様組
換え不能である。クローニング実験用染色体ＤＮＡの供
給源は、そのＰ２蛋白質がモノクローナル抗体２Ｆ４と
の反応性を有するＨｉｂｊ７４株であればよい。本発明
者は、ｌｌ７Ｈｉｂ菌株の１１７がこの特定抗体と反応
することを見出した（ｌＯ）。

組換えプラスミドによる宿主ヘモフィルス・インフルエ
ンゼ細胞の形質転換後、形質転換体を好ましくは発現ス
クリーニング検定法によりスクリニングする。これらの
多くは当業界の熟練各に周知であり、この発明を実践す
る際に使用され得る。本発明者は、培養したコロニーを
まず滅菌吸着／−ト、例えばワットマン＃４０上にｔｍ
ｌｌり込み、特異的免疫（夏合体の形成に適した条件下
、そのノートを所望の抗Ｐ２抗体と接触させる修正発現
スクリーニング技術の使用を好む。洗浄後、シートを標
識第２抗体と接触させ、免疫陽性コロニーをオートラジ
オグラフィーにより同定する。次いで、さらに陽性コロ
ニーは、単一コロニー分離によりスクリーニングされ得
、所望により制限酵素分解および追加確認的免疫検定が
行なわれ得る。

陽性クローンが分離された後、プラスミドＤＮＡは、一
般的なエノエリヒア・コリ・クローニング宿主における
場合と同様多量に製造され、例えばカラム吸着または浮
遊密度遠心分離技術により比較的高純度に単離され得る
。Ｐ２蛋白質製品の生成において使用する場合、活性染
色体および染色体外遺伝子の両面を有するという「遺伝
子量」効果を可能にするため、内生的にＰ２ＭＯＭＰ抗
原を生産するＨ４ｂ宿主においてクローン遺伝子を発現
させるのが好ましい。勿論、この点に関して最も好都合
な宿主は、一般的には出発ゲノムＤＮＡを供給した１−
Ｊｉｂ菌昧菌株は同様の菌株である。

好ましいベクターは、きょう膜条糖類か誘導されるヘモ
フィルス・インフルエンゼ生物である。

−旦選択された生産宿主のこの形質転換が行なわれると
、所望によりＰ２　ＭＯＭＰ抗原の分離体が、全体的に
ムンノン等により記載された単離方法（６）に基づいた
、比較的容易な一連の工程により単離される。要するに
、Ｈｉｂの細胞エンベロープを製造し、ラウリルサルス
コシン酸ナトリウムで抽出し、次いでデオキンコール酸
ナトリウムで抽出する。生成した不溶性材料をツビッテ
ルゲンｈ３−１４１衝液に懸濁し、生成したＰ２蛋白質
含有可溶化材料をＤＥＡＥ−セファクリル・カラムによ
るカラムクロマトグラフィーに付すと、比較的高純度の
蛋白質が得られる。

面性の通り、ある態様において、この発明により提供さ
れたＤＮＡ配列情報（第６図参照）は、Ｐ２遺伝子の遺
伝子配列との特異的ハイブリダイゼーション能を有する
比較的短いＤＮＡ（またはＲＮＡ）配列の製造を可能に
する。これらの態様では、適当な長さの核酸プローブは
、第６図に示された天然配列に関する考察を踏まえて製
造されるか、またはＰ２遺伝子の側面に位置する領域、
例えばプラスミドｐＥＪＨ３９−１に見出される遺伝子
の下流領域から誘導される（第１図および後記実施例２
参照）。これらの核酸プローブは、Ｐ２遺伝子配列との
特異的ハイブリダイゼーション能故に、様々な実施態様
において特定の用途を呈する。最も重要なことに、Ｐ２
誘導プローブは、与えられた試料における病原性生物の
存在検出を目的とする様々な診断測定において使用され
得る。

しかしながら、突然変異種ブライマー、または他の遺伝
子構造の製造に使用されるブライマーの製造を目的とす
る配列情報の使用を含めて両用途共構想される。

この発明に従いある種の利点をもたらすために、ハイブ
リダイゼーション試験または測定に使用される好ましい
核酸配列は、第６図に示された配列の長さ少なくとら１
０〜２０程度の範囲のヌクレオチドに相捕的な配列を含
む。大きさが少なくともｌＯヌクレオチド長であれば、
確実に、フラグメントを安定性および選択性を共に有す
る二重螺旋分子の形成に十分な長さのものとするのに有
効である。しかしながら、ハイブリッドの安定性および
選択性を高めることにより、得られる特異的ハイブリッ
ド分子の量および程度を改善するためには、長さ１０塩
基を越える範囲に及ぶ相捕的配列を有する分子が一般的
には好ましい。すなわち、一般的には、１５〜２０ヌク
レオチド長または所望によりこれより長いＰ２遺伝子相
補的配列を有する核酸分子を設計するのが好ましい。こ
れらのフラグメントは、例えば化学的手段によるフラグ
メントの直接合成、核酸再生科学技術、例えばアメリカ
合衆国特許第４６０３１０２号のＰＣＲ科学技術の適用
、または組換え体生産用の組換えベクターへの選択配列
の導入により容易に製造され得る。

Ｐ２蛋白質が病原性Ｈｉｂ種の指標である点から、この
発明は、臨床試料におけるＰ２特異的ＲＮＡまたはＤＮ
Ａの検出を目的とする診断的／％イブリダイゼーノヨン
検定の基礎成分としての特定用途を提供する。すなわち
、感染症の診断に使用され得る臨床試料の実例には、生
物学的試料または臨床試料等を含めて、病原性Ｈｉｂ核
酸を含み得る試料であれば全て該当する。診断的検定、
例えばファルコウ等、アメリカ合衆国特許第４３５８５
３５号記載の検定法を含め、この発明のハイブリダイゼ
ーション態様に関連して使用され得る様々なハイブリダ
イゼーション技術およびシステムが知られている。

従って、この発明のヌクレオチド配列は、Ｐ２遺伝子の
相補的配列と二重螺旋分子を選択的に形成し得る点に関
して重要である。構想された適用法により異なるが、様
々なハイブリダイゼーション条件を用いて標的配列に対
するプローブの様々な程度の選択性を達成することが望
まれる。高度の選択性を要求する適用法の場合、一般的
には比較的ストリンジエンシー件を用いてハイブリッド
を形成するのが望まれ、例えば、比較的低濃度の塩およ
び／または高温条件、例えば００２モル０．１５モルの
ＮａＣ（！および５０°Ｃ〜７０℃の温度か選択される
。これらの条件は特に選択的であり、プローブおよび鋳
型または漂的鎖間の不適合がある場合、これを殆ど許容
しない。

勿論、適用法次第で、例えば基礎を成す鋳型とハイブリ
ダイゼーションした突然変異プライマー鎖の使用による
突然変異体の製造を望む場合に、ペテロ２本鎖の形成を
可能にするためには、ストリンジエンシーの劣るハイブ
リダイゼーション条件が要求される。これらの環境にお
いては、例えば２０℃〜５５℃の温度範囲で０．１５モ
ル−０゜９モルの塩条件の使用が望まれる。少なくとも
一般的には、高温条件の場合と同様にハイブリッド２本
鎖の不安定化に有効なホルムアミドを多量に加えること
により、条件のストリンジエンシーをさらに高め得るも
のとする。すなわち、ハイブリダイゼーション条件は容
易に操作され得るため、一般的に所望の結果により選択
の異なる方法である。

臨床診断的実施態様において、この発明の核酸配列は、
ハイブリダイゼーション測定に適した手段、例えば標識
と組合わせて使用される。当業界では、検出可能なシグ
ナルを提供し得る、放射性、酵素性または他のりガント
、例えばアビジン／ビオチンを含めて広範な種類の適当
な指示手段が知られている。好ましい診断的実施態様で
は、放射性または他の環境的な望ましくない試薬ではな
く、酵素標識、例えばウレアーゼ、アルカリ性ボスファ
ターゼまたはベルオキンダーゼの使用が望ましいことら
あり得る。酵素標識の場合、比色性指示基質を用いてヒ
トの目または分光光度計に対する可視手段を提供させる
ことにより病原性核酸含有試料との特異的ハイブリダイ
ゼーションを同定することができる方法が知られている
。

一般的に、この明細書に記載されたハイブリダイゼーシ
ョン・プローブは、溶液ハイブリダイゼーションおよび
固相を用いる実施態様の両方における試薬として有用で
あると予想される。固相を用いる実施態様では、疑いの
ある臨床試料、例えばしん出液、体内流体（例、羊水、
髄液）または場合により組織から得られた試験ＤＮＡ（
またはＲＮＡ）は、選択されたマトリックスまたは表面
に吸着または他の方法により付着する。次いで、この付
着した１本鎖核酸を所望の条件下における選択プローブ
との特異的ハイブリダイゼーションに付す。選択される
条件は、要求される特定基準に基づいた特定の環境によ
り冗なる（例えば、Ｇ＋Ｃ含ａｍ、標的核酸のクイズ、
核酸供給源、ハイブリダイゼーノヨノ・プローブの大き
さ等により異なる）。ハイブリダイゼーション表面を洗
浄して非特異的結合プローブ分子を除去後、標識手段に
より特顕的ハイブリダイゼーノヨンが検出または場合に
より定量される。

前述した通り、この発明の特別な利点は、エピトープ性
／免疫原性骨格配列を含む合成ペプチドの製造により実
現され得る。これらのエピトープ性骨格配列は、特定態
様においてＰ２抗原の親水性領域として同定される。こ
れらの領域は、Ｔ細胞またはＢ−細胞刺激を促すことに
より、特異的抗体産生を誘導する可能性が最ら高い領域
を表すことか提案されている。ここにエピトープ性骨格
配列とは、抗Ｐ２抗体の抗原結合部位に「相捕的」であ
るため、それらと結合ずろ比較的長さの短いアミノ酸で
ある。この開示の文脈において、「相捕的」なる語は、
アミノ酸またはペプチドが互いに相手に向かって誘引力
を呈する状態を指すものと理解すべきである。すなわち
、この発明のエピトープ性骨格配列は、Ｐ２抗原と抗Ｐ
２抗血清間の結合と競争するかまたは場合によりこれを
排除する能力に関して操作上定義され得る。

一般的に、ポリペプチド抗原の大きさは、少なくとら同
定された骨格配列（複数も可）を担うのに十分な大きさ
である限り、特に厳密ではないと信じられている。この
開示により同定される最小の骨格配列は、約１５アミノ
酸長を有する配列である。すなわち、この大きさは、一
般的にこの発明に従い製造された最小ペプチド抗原に相
当する。

しかしながら、この発明により同定される特定骨格配列
の大きさは、１５〜２２の範囲のアミノ成長である。す
なわち、抗原の大きさは、それか基本的エピトープ骨格
配列を含む限り、所望によりこれより大きい場合もあり
得る。

従って、コンピューターによるペプチド配列分析プログ
ラム（ドナスター（Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｓ　ｔａｒ）・ソフト
ウェア、ドナスター社、マディソン、ライスコンシン）
の使用により、発明者は、親水性故に、蛋白質の特定エ
ピトープを含むエピトープ性骨格配列を構成すると信じ
られているＰ２抗原の特定親水性ベプヂジル領域を同定
した。これらのエピトープ性骨格配列を第６図により大
体１７５位のアミノ酸Ｇｌｎから１９７位のアミノ酸Ｇ
１ｙまでの個々のペプチド、２６０位のアミノ酸Ｇ１ｙ
から２７５位のアミノ酸Ｔｙｒまでのペプチド配列、２
９６位のアミノ酸Ｌｙｓから３１１位のアミノ酸Ｇｌｎ
までのペプチド配列、３３３位のアミノ酸Ａｌａから３
５３位のアミノ酸Ｖａｌまでのペプチド配列および前記
ペプチドと生物学的に機能均等な配列（下記でさらに詳
細に説明）と対応するものとして説明する。

前記配列または配列内に前記配列を含むペプチドの合成
は、慣用の合成技術、例えば固相法（例、市販されてい
るペプチド・ノンセサイザー、例えばアプライド・バイ
オシステムズ・モデル４３０Ａベプチドノンセサイザー
の使用による）を用いて容易に達成される。次に、この
方法で合成されたペプチド抗原は予定された俄のアリコ
ートに分すられ、常法、例えば水溶液中または場合によ
りさらに好ましくは使用までは粉末らしくは凍結乾燥状
態で貯蔵され得る。

一般的に、この発明のペプチドは比較的安定しているた
め、それらはかなり長期間、所望により例えば６箇月以
下またはそれ以上、水溶液中で容易に貯蔵され得、水溶
液での重大な減成または抗原活性の喪失は実質的には殆
ど有り得ないと信じられている。しかしながら、長い水
性貯蔵を考える場合、一般的には緩衝液、例えばトリス
または燐酸緩衝液を含む薬剤を含ませてｐＨを７．０〜
７５に維持するのが望ましい。さらに、微生物の成長を
阻害する薬剤、例えばアジ化ナトリウムまたはメルチオ
レート（＋１１ｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ、商標）の添加が
望ましいこともあり得る。水溶液中で長く貯蔵する場合
、４℃の溶液またはさらに好ましくは冷凍状態で貯蔵す
るのが望ましい。勿論、ペプチド（度数も可）を凍結乾
燥状態で貯蔵する場合、それらは実質的に無期限で、例
えば使用前に予め定められた量の水（好ましくは蒸留水
）または緩衝液により再水化され得る一定量のアリコー
トで貯蔵され得る。

前述した通り、Ｐ２抗原またはその抗原性／免疫原性部
分の構造において様々な修飾および変形が為され得、さ
らに同様または別の望ましい特徴を有する分子も得られ
るものと考えられる。

例えば、ある種のアミノ酸は、相補的構造、例えば抗体
の抗原結合領域（または例えばレセプター分子の結合部
位）との相互作用的結合能の重大な喪失を伴わずに蛋白
質構造において他のアミノ酸と置き換えられ得る。すな
わち、抗原性ペプチド配列において、それらの抗体結合
またはＰ２抗原競争活性の重大な喪失を伴わずに様々な
変形が為され得ることを本発明者は仮定している。

蛋白質に対する相互作用的生物学的機能の付与における
アミノ酸のバイトロバシック（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ
）指数の重要性は、カイト等により総括的に記載されて
いる（２７）。その文献では、ある種のアミノ酸は類似
したバイトロバシック指数または骨格を有する他のアミ
ノ酸と置き換えられ得、その後もまだ類似した生物学的
活性を保持し得ることが記載されている。下表に示す通
り、アミノ酸に対し、それらの疎水性および荷電特性に
基づいてバイトロバシック指数を定める。アミノ酸の相
対的ハイドロパシヅク特性が、生成される蛋白質の第２
構造を決定し、他方、基質分子と蛋白質の相互作用を決
定することが考えられる。

第１表 バイトロバシック指数 ４．５ ４．２ ２．５ アミノ酸 イソロイシン バリン ロイシン フェニルアラニン システィン／シスチン メチオニン アラニン グリシン トレオニン トリブトファン セリン チロチン プロリン ヒスチジン グルタミン酸 グルタミン アスパラギン酸 アスパラギン リジン アルギニン −０．４ 一〇７ ０．９ 一〇８ １．３ −３，２ −３．５ −３．５ ４．５ すなわち、例えば、バイトロバシック指数＋４５のイソ
ロイシンを、バリン（＋４．２）またはロイシン（＋３
．８）と置き換えても類似した生物学的活性を保持する
蛋白質を得ろことができる。他方、目盛りの他端の場合
、リジン（−３，９）をアルギニン（−４，５）と置き
換えても同様に可能である。従って、これらのアミノ酸
置換は、一般に例えば大きさ、親電子特性、電荷等に関
するＲ基置換基の相対的類似性に基づいている。

部位突然変異は、基礎ＤＮＡの特異的突然変異による、
Ｐ２配列から誘導された個々のペプチドまたは生物学的
機能均等蛋白質もしくはペプチドの製造に有用な技術で
ある。さらにこの技術は、例えば、１つまたはそれ以上
のヌクレオチド配列変形をＤＮＡに導入することにより
、前記考察の１つまたはそれ以上が組入れられた配列変
異体の容易な製造および試験を可能にする。部位突然変
異は、所望の突然変異を示すＤＮＡ配列をコードするオ
リゴヌクレオチド配列および十分な数の隣接ヌクレオチ
ドの使用による突然変異体の製造を可能にし、その結果
十分な大きさおよび十分な配列複合性を有するプライマ
ー配列が提供されることによりトラバースされている欠
失ジャンクションの両端に安定した２本鎖を形成させる
ことができる。−船釣には、長さ約１７〜２５ヌクレオ
チドのブライマーが好ましく、配列のジャンクションの
両側の約５〜１０残基が改編される。

−船釣に、部位突然変異技術は、例えば参考文献３１（
この内容を引用して説明の一部とする）などの出版物に
具体的に記載されており、当業界においては周知である
。その記載によると、この技術は、一般に１本鎖および
２本鎖の両形態で存在するファージ・ベクターを使用す
る。部位指向性突然変異に有用な代表的なベクターには
、例えば参考文献３２（この内容を引用して説明の一部
とする）により開示された例えばＭ１３ファージベクタ
ーがある。これらのファージは市販されており、それら
の用途は、−船釣に当技術分野の熟練者にはよく知られ
ている。

一般に、この発明による部位指向性突然変異は、まずそ
の配列内にＰ２抗原をコードするＤＮＡ配列を含む１本
鎖ベクターを得ることにより行なわれる。所望の突然変
異配列を担うオリゴヌクレオチド・ブライマーは、−船
釣に例えば参考文献３３の方法により合成的に製造され
る。次に、このブライマーを１本鎖ベクターとアニーリ
ングし、ＤＮＡ合成酵素、例えばエシェリヒア・コリ・
ポリメラーゼ１クレノウ・フラグメントの触媒作用に付
すことにより、突然変異配列を有する鎖の合成を完了す
る。すなわち、一方の鎖が元の非突然変異配列をコード
し、第２の鎖が所望の突然変異を担っているペテロ２本
鎖が形成される。次いて、このヘテロ２本鎖ベクターを
用いて適当な細胞、例えばエシェリヒア・コリ細胞を形
質転換し、突然変異配列を有する組換えベクターを含む
クローンを選択する。

この発明のＰ２抗原性ペプチドは、ワクチン開発と関連
した免疫原として、または抗Ｐ２抗原反応性抗体の検出
を目的とする免疫検定における抗原としての用途を有す
ることが提案されている。

まず免疫検定については、それらの最も単純で直接的な
意味において、この発明の好ましい免疫検定としては、
当業界で公知の様々なタイプの固相酵素免疫測定法（Ｅ
ＬＩＳＡ）がある。しかしながら、用途はそれらの検定
法に限定されている訳ではなく、有用な具体例としては
ＲｒＡおよび他の非酵素結合抗体結合検定法または手順
もあることは容易に想到し得ることである。

好ましいＥＬ　Ｉ　ＳＡ検定の場合、Ｐ２抗原配列が組
込まれたペプチドを選択された表面、好ましくは蛋白質
アフィニティーを呈する表面、例えばポリスチレン・マ
イクロタイタープレートのウェルに固定する。不完全吸
着材料を洗浄除去後、望ましくは非特異的蛋白質、例え
ばうし血清アルブミン（ＵＳＡ）またはカゼインを、試
験抗血清に関して抗原的に中性であることが知られてい
るウェルに結合またはコーティングさせる。これにより
固定表面上の非特異的吸着部位がブロッキングされるた
め、表面と抗血清の非特異的結合に起因する基底値は減
少する。

ウェルに抗原性材料を結合させ、非反応性材料で被覆す
ることにより基底値を減少させ、非結合材料を洗浄によ
り除去後、免疫複合体（抗原／抗体）形成を導く方法で
、固定化表面を試験すべき抗血清または臨床または生物
学的抽出物と接触さ仕る。それらの条件は、好ましくは
抗血清を希釈剤、例えばＢＳＡ、うしガンマグロブリン
（ＢＧＧ）および燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）／トゥイー
ン（Ｔｗｅｅｎ）で希釈することを含む。またこれらの
加えられた薬剤は、非特異的基底値の減少を助長しやす
い。次いで、層状抗血清を２〜４時間好ましくは２５°
〜２７℃の温度範囲でインキュベーションする。インキ
ュベーション後、抗血清接触表面を洗浄することにより
非免疫複合材料を除去する。

好ましい洗浄方法には、例えばＰＢＳ／トウィーン溶液
、またはほう酸緩衝液による洗浄がある。

試験試料および結合抗原間の特異的免疫複合体の形成お
よび後続の洗浄後、免疫複合体形成の発生および場合に
より量が、第１抗体に対する特異性を有する第２抗体に
関して同手順を行うことより測定され得る。検出手段を
与えるために、第２抗体は、好ましくは適当な発色性基
質とインキュベーションすると発色を呈する関連酵素を
有する。

すなわち、例えば、免疫複合体形成の発生に適した期間
および条件下で抗血清結合表面をウレアーゼまたはペル
オキシダーゼ−コンツユゲートＩｇＧと接触およびイン
キュベーションするのが望ましい（例、ＰＢＳ含有溶液
、例えばＰＢＳ−トウイーン中、室温で２時間インキュ
ベーション）。

第２酵素標識抗体とインキュベーションし、続いて非結
合材料を洗浄により除去後、酵素標識がペルオキシダー
ゼの場合、発色性基質、例えば尿素およびブロモクレゾ
ール・パープルまたは２２′−アジノージ−（３−エチ
ル−ベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）［ΔＢＴＳ］
およびＨ２０ｔとのインキュベーションにより標識の量
を定量する。

次いて、例えば可視スペクトル分光光度計を用いて発色
の程度を測定することにより定量化を行う。

ワクチンとしての使用に適した免疫原組成物は、曲記方
法で精製されたＰ２抗原から最も容易に直接製造され得
る。例えば、組換えＨｉｂ蛋白質のゲル排除クロマトグ
ラフィーにより誘導されたＰ２抗原製品を用いた免疫原
組成物の製剤化が望まれることもあり得る。さらに好ま
しい実施態様では、）−［１ｂＰ２蛋白質を単独ではな
く、Ｈｉｂきよう膜条糖類または池の細菌性きよう膜条
糖類と共有結合した状聾で含ませることにより、ワクチ
ン製剤における前記きょう膜条糖類の免疫原性を高めて
いる（２５）。

有効成分としてペプチド配列を含有するワクチンの製法
は、当業界では一般的によく理解されている。例えば、
アメリカ合衆国特許第４６０８２５１号、同第４６０１
９０３号、同第４５９９３２１号、同第４５９９２３０
号、同第４５９６７９２号および同第４５７８７７０号
参照（これらの内容を引用して説明の一部とする）。−
船釣には、これらのワクチンは、注射可能物質、例えば
液体溶液または懸局液として製造され、注射面に液体に
溶かして溶液または＠濁液を形成するのに適した固体形
態もまた製造され得る。製剤はまた乳化され得る。有効
免疫原成分は、医薬的に許容し得、有効成分と適合し得
る賦形剤としばしば混合される。適当な賦形剤は、例え
ば水、食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノー
ル等およびそれらの組合わせである。さらに、所望によ
り、ワクチンは、少量の補助物質、例えば湿潤もしくは
乳化剤、ｐＨ１衝剤またはワクチンの効力を高めるアジ
ュバントを含有し得る。

蛋白質は、天然または塩形態としてワクチンに製剤化さ
れ得る。医薬的に許容し得る塩類には酸付加塩類（ペプ
チドの遊離アミノ基により形成された）が含まれ、それ
らは例えば無機酸、例えば塩酸らしくは燐酸、または有
機酸、例えば酢酸、しゅう酸、酒石酸、マンデル酸等に
より形成される。また遊離カルボボール基により形成さ
れた塩類は、無機塩基、例えばナトリウム、カリウム、
アンモニウム、カルシウムまたは鉄の水酸化物および有
機塩基、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン
、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロ力イ
ン等からも誘導され得る。

これらのワクチンは、治療上有効かつ免疫原となる量で
投与製剤と適合し得る方式により投与される。投与され
る量は、処置される対象、個々の免疫系の抗体合成能力
および望まれる防御の度合により異なる。投与されるべ
き有効成分の正確な必要量は担当医の判断に左右され、
各個体ごとに異なる。初回投与およびブースター注射に
適した様式もまた変化し得るが、初回投与後続いて接種
または池の投与を行うのが代表的である。

ワクチンにおけるアジュバント効果を達成する様々な方
法には、燐酸援衝食塩水中０．０５〜Ｏｌパーセント溶
液として常用される、例えば水酸化または硫酸アルミニ
ウム（明ばん）薬剤の使用、０．２５パーセント溶液と
して使用される糖の合成ポリマー（カルボボール）との
混合、または３０秒〜２分間７０°〜ｔ　ｏ　ｉ　’ｃ
の温度範囲での加熱処理によるワクチンにおける蛋白質
のアグリゲーションが各々含まれる。アルブミンに対す
るペプンン処理（Ｆａｂ）抗体を用いた再活性化による
アグリゲーション、細菌細胞、例えばシー・パルブム（
ｃ，ｐａｒｖｕｍ）またはダラム陰性閑の内生毒素らし
くはリボ多糖類成分との混合、生理学的に許容し得る油
性賦形剤、例えばマンニドモノオレエート（アラセルＡ
）によるエマルジョン、またはブロック物質として使用
される過ふり化炭化水素（フルオシ−ルーＤＡ）の２０
パーセント溶液によるエマルジョンもまた使用され得る
。

多くの場合、ワクチンの複合投与、普通は６種を越えな
いワクチン接種、さらに普通は４種を越えないワクチン
接種、および１種またはそれ以上、通常少なくとも約３
種のワクチン接種を行うのが望ましい。ワクチン注射は
、通常２〜１２週間隔、さらに普通は３〜５週間隔で行
なわれる。ｌ−５年、通常３年の間隔で定期的ブースタ
ー注射を行うことにより抗体の防御レベルを推持するの
が望ましい。免疫化の経過は、上清抗原に関する抗体検
定により追跡され得る。これらの検定は、常用標識、例
えば放射性核種、酵素、蛍光物質等で標識することによ
り実施され得る。これらの技術は公知であり、これらの
タイプの検定法の説明は、広い範囲の特許、例えばアメ
リカ合衆国特許第３７９１９３２号、同第４１７４３８
４号および同第３９４９０６４号に記載されている。

以下、実施例により、ＨｉｂのＰ２遺伝子のクローン化
および発現を目的として本発明者が用いた技術および方
法論をさらに詳しく立証する。これらの実施例は単なる
例に過ぎず、また以下の開示を考慮すれば当業界の熟練
者にとって同じ目的を達成する種々の可能な方法につい
ては明白なことであるものとする。例えば、制限酵素Ｐ
ｓｔＩを用いてＰ２遺伝子を含む約８−１０キロ塩基の
Ｈｉｂ染色体ＤＮＡフラグメントを生成したが、この発
明はこのフラグメントに限定される訳ではないことは明
白である。明らかに、Ｈ４ｂゲノムＤＮＡが「部分的に
分解されて」ランダムに「仕ん断された」フラグメント
を生じ得る限り、実質的に全ての公知制限酵素が有効に
使用され得る。多くの他の修飾も同様に明らかなことで
あると思われ、それらの修飾も全てこの発明の精神およ
び範囲内に含まれるものとする。

［実施例］ 実施例１ Ｈｉｂ蛋白質Ｐ２遺伝子フラグメントの同定。

（細菌株） 明細書で詳述した実験の大部分では２種の異なるｌ−１
ｉｂ株、ＤＬ４１およびＤＬ４２を使用した。

これらの菌株は両方ともＨｉｂ髄膜炎の幼児から単離さ
れた。クローニング宿主として使用されたＤＢｌｌ’ｌ
は、組換え不能のヘモフィルス・インフルエンゼＲｄ菌
株である（２４）。ヘモフィルス・インフルエンゼ株に
適した培地および生長条件は、テトラサイクリン塩酸塩
（５μ９／ｆｆ□がある種の実験用の生長培地中に含ま
れた点を除き、ホールマンス等による記載と同様であっ
た（１１）。

（ＨｉｂゲノムＤＮＡの分離） 全般的にブリツカ−等の方法に従いゲノムＤＮＡを昧Ｄ
Ｌ４１およびＤＬ４２から分離した（１２）。簡単に述
べると、Ｈｉｂ細胞をドデシル硫酸ナトリウムにより溶
解した。リゼイトをプロナーゼにより分解し、フェノー
ル・クロロホルム、次いでクロロホルムで抽出し、リボ
ヌクレアーゼ処理し、前回と同様再び抽出し、染色体Ｄ
ＮＡをエタノールにより沈澱させた。

（ＨｉｂゲノムＤＮＡフラグメントのザザーン・プロッ
ト・スクリーニング） Ｐ２遺伝子配列をコードするｔｌ　ｉｂＤ　Ｎ　Ａフラ
グメントを同定するために、ＨｉｂゲノムＤＮＡをまず
選択された制限酵素で分解し、制限フラグメントをアガ
ロースゲル電気泳動により分離し、ゲル分画化フラグメ
ントをニトロセルロースにプロットし、生成したサザー
ン・プロットをＰ２遺伝子由来のアミノ末端ＤＮＡ配列
に対応する標識オリゴヌクレオチド・プローブによりプ
ローブした。

Ｐ２蛋白質のアミノ末端配列を得るために、Ｉ］ｉｂ菌
株ＤＬ４２のＰ２蛋白質をムンソン等の方法により比較
的等質に単離した（６）。この蛋白質のＮ　Ｈを−末端
アミノ酸配列は、ＮＨ，−Ａ１、Ａ−ＶＡＬ−ＶＡＬ−
ＴＹＲ−ＡＳＮ−ＡＳＮ−ＧＬＵＧＬＹ−ＴＨＲ−ＡＳ
Ｎ−ＶＡＬ−ＧＬＵ−ＬＥＵ−ＧＬＹ−ＧＬＹ−ＡＲＧ
−ＬＥＵ−ＳＥＲＩ　ＬＥ−ｒＬＥであることか決定さ
れた。３９に蛋白質のＮ　Ｈ，−末端からこれらの最初
の２０アミノ酸をコードする５９塩基から成るオリゴヌ
クレオチド・プローブは、エソエリヒア・コリ・コドン
使用割り当てを用いて設計され、合成された。このオリ
ゴヌクレオチドプローブのヌクレオチド配列は、ＧＣＴ
　　ＧＴＴ　　ＧＴＴ　ＴＡＴ　　ＡＡＣＡＡＣＧＡＡ
　　ＧＧＴ　　ＡＣＣＡＡＣＧＴＴＧＡＡ　　ＣＴＧ　
　ＧＧＴ　　ＧＧＴ　　ＣＧＴ　　ＣＴＧＴＣＴ　　Ａ
ＴＣＡＴであった。

サザーン・プロットを製造する場合、ＤＬ４２およびＤ
Ｌ４１から得た約３μりのゲノムＤＮＡをＰｓｔｌまた
はＥｃｏＲＩで完全に分解し、分解生成物を水平電気泳
動ソステムにおいて１％アガロースゲル電気泳動で分画
した。次いで、ザザーン法（１３）によりゲルをニトロ
セルロースに移し換え、生成したニトロセルロース・プ
ロットを、サザーンにより記載され（１３）スワンカッ
ト等により修正された（１４）’″Ｐ−標識オリゴヌク
レオチ）・・プローブとのハイブリダイゼーションに付
した。

この実験結果を第２図に示す。ＤＬ４１およびＤＬ４２
の両味において、合成ハイブリダイゼーション・プロー
ブは約１０キロ塩基の見かけの長さを有するＰｓｔｌフ
ラグメント（カラムＡおよびＢ１各々ＤＬ４１およびＤ
Ｌ４２）および約１．５キロ塩基のＥｃｏＲＩフラグメ
ント（カラムＣおよびＤ１各々ＤＬ４１およびＤＬ４２
）を認識したしのとする。Ｐｓｔｌフラグメントはサイ
ズが大きいため、クローニングの標的にされた。

実施例２ Ｐ２遺伝子配列のクローニングおよび分離。

ｌＯキロ塩基のＰｓｔｌ　　Ｐ２遺伝子フラグメントを
クローンするため、３７°Ｃで２時間約１０００単位の
Ｐｓｔｌで３７５μりのＤＮＡを分解することにより、
Ｈｉｂ株Ｄ１．．１１２染色体ＤＮＡの完全なＰｓｔ１
分解物を調製した。次いで、分解されたＤ　Ｎ　Ａを１
％アガロース・スラブゲルにより電気泳動させた。サイ
ズ・マーカーの使用により、長さ約８〜１５キロ塩基の
ＤＮＡフラグメントに対応するゲルの領域を除去し、ア
ガロース・ストリップをホモジネートし、５５°Ｃで希
トリス−ＥＤＴＡを用いてゲルフラグメントからＤＮＡ
を溶離さ仕た。

溶離したＤＮＡをＮＡＣＳカラム（ベゼスダ・リサーチ
・ラブダ、ベゼスダ、メリーランド）に通すことにより
精製し、Ｐｓｔｌ線状プラスミドｐＧＪＢ１０３（前述
のｐｒ−ｔｖ’ｒ＋の誘導体、参考文献８参照）と連結
（ライゲーション）した。要するに、一定の大きさのＤ
ＮＡフラグメント１．５μ９を０４３μ９のＰｓｔｌ切
断およびアルカリ性ホスファターゼ処理ｐＧＪＢ１０３
プラスミド、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリガーゼとインキ
ュベーションすることによりライゲーションを達成した
。ライゲーション後、ＤＮＡをエタノール沈澱させ、最
少量の滅菌ＰＢＳに可溶化することにより濃縮した。

この混合物を用いてＤＢ１１７細胞を以下の要領で形質
転換した。第１白目に、大きな培養管中レヒンクール塩
基（５）を捕った脳心臓しん出液（ＢＨＩ　ｓ）のブロ
ス１０ｍｆｆにＤＢＩ１７を接種し、午後遅く水浴スタ
ーターに入れた。氷水および培養管を含むトレイを３７
０インキユベーター室に置いた。水浴スターターを用い
て培養物を夜中まで冷却状態に保った。次いで氷が解け
、培養の温度か３７℃に上昇することにより急速な生長
が行なわれた。翌朝、１　、　ＯｒｎＱの水浴スタータ
ー培ｊｔ物をサイドアームフラスコ中１９．０ｘ（！の
Ｂ１１１ｓに接種し、クレット比色計の水数９５単位（
グリーンフィルター）に対応する細胞密度が観察される
まで（ブランク−２５単位）、３７°で振り混ぜた。

次いで１０ｘ＆の細胞を１７Ｘ１００ｚｍスナップキャ
ノププラスチノク管にピペットで移し入れ、さらに７５
分間振り混ぜずに３７°でインキュベーションした。次
いでこれらの細胞０　、２　ｍ（ｌを新しいスナップキ
ャップ管に移し、９００μ９７ｍσラクテート含有ｐＢ
Ｓ（ｐＨ７，２）ｌ　、８ｍ１２を加え、混合物をさら
に６５分間３０℃で振り混ぜずにインキュベーションし
た。

次いで全ＤＮＡライゲーンヨン混合物を穏やがてはある
が完全に混合しながら加えた。次いで、これを振り混ぜ
ずに３０℃で３０分間インキユベーソヨンした。３０分
後、１．３５ｉ（！の暖められた（３７℃）８０％グリ
セリンを十分混合しながら加え、室温で１０分間放置し
た。次いで、全混合物を１２５７Ｉ＋２フラスコ（３７
℃に予熱）中１０＋（７のＢＨＩｓにピペットで移し入
れ、フラスコを３７℃で３時間振り混ぜた。この時点で
、全培養物を滅菌遠心分離管にピペットで移し入れ、４
°Ｃで１０分間６７００ｘｇで回転させた。生成した沈
澱を１ｔＩＱのＢＨＩｓに再懸濁し、このＯ、Ｉ　ｍＱ
分量を５μｇＩＲＱテトラサイクリン塩酸塩含有ＢＨＩ
ｓ寒天プレート１０枚に広げることにより、プラスミド
含有形質転換体に関して選択し、これらのプレートを１
８−２０時間キャンドル・エクスティンクンヨン・ジャ
ー中３７℃でインキュベーションした。

前述の形質転換実験により合計３６４のテトラサイクリ
ン耐性コロニーを得、次いでこれらのコロニーに対して
発現スクリーニングを行うことにより以下の要領でＰ２
発現形質転換体を同定した。

滅菌ワットマン＃４０ろ紙デイスクを除かれた培養コロ
ニー上に被せ、３７°で１時間風乾した（次いでプレー
トを冷蔵庫に貯蔵してヘモフィルス・インフルエンゼ細
胞の生存能力を維持した）。次いで風乾したフィルター
を２％正常うさぎ血清含有ＰＢＳに４°Ｃで１時間穏や
かに揺すりながら浸すことにより、ろ紙上の非特異結合
部位をブロックした。

浸した後、フィルターを約１３ｘＣのモノクローナル抗
体２Ｆ４培養上清で覆い、冷室で２時間穏やかに揺すり
ながらインキュベーションした。このモノクローナル抗
体は、このクローニング実験で宿主として使用された、
ＤＬ４２（およびＤＬ４１）細胞由来のＰ２抗原を特異
的に認識するが、ＤＢ１１７細胞由来の対応する抗原に
ついては認識しない。２Ｆ４モノクロ一ナル抗体の製法
お上び特徴は、グリラグ等による参考文献１０記載され
ている（この内容を引用して説明の一部とする）。

要するに、この抗体は、現在までに試験された１１７Ｈ
ｉｂ株の１１７のＰ２蛋白質におけるエピトープは認識
するが、ヘモフィルス・インフルエンゼ株ＤＢＩ＋７の
Ｐ２蛋白質については認識しない。

２時間のインキュベーション後、抗体混合物を分離し、
ろ液を２％正常子うし血清を用いたＰＢＳ中４Ｘ３０’
洗浄液で洗浄した。次いで洗浄したフィルターをアフィ
ニティー精製した放射性ヨウ素化やぎ抗マウスＩｇＧと
冷室で一夜穏やかに揺すりながらインキュベーションし
、さらにＰＢＳ−２％子うし血清を用いて４回洗浄した
（各々３０゛）。次いでフィルターを乾燥し、ラジオオ
ートグラフィーを行った。

スクリーニングされた合計３６４のコロニーから、■０
コロニーがＨｉｂＰ２特異的モノクローナル抗体との反
応性を有するものとして同定された。次に、これらの１
０コロニーを単一コロニ分離により精製用に再び画線状
にし、上記モノクローナル抗体２Ｆ４を用いたコロニー
・プロット・ラジオイムノアッセイで再試験した。全コ
ロニーが再試験の結果陽性であった。

ＤＢ　Ｉ　１７（ｐＥＪＨ３９−１）と称するＩクロー
ンを選択してさらに試験を行うと、８−１０キロ塩基Ｐ
ｓｔｌ挿入体を含むことが見出された。この挿入体は全
Ｐ２遺伝子を含むことが判明した。

プラスミドｐＥＪＨ３９−１に対し、制限酵素分析を行
うと、第１図に示す制限酵素地図が得られた。さらに、
プラスミドｐＥＪＩ（３９−１により運ばれるＰ２遺伝
子のコード配列（第１図では点線で示す）に対してＤＮ
Ａ配列分析を行うことにより、得られた結果を第６図に
示す。以下の実施例では、確認実験およびｐＥＪＨ３９
−１発現用宿主としてのＤＬ４２の使用による高レベル
のＰ２生産株の構築を提供する。

クローンＤＢＩ　１７（ｐＥＪＨ３９−１）は、ブダペ
スト条約の規定に従い、１９８７年１２月８日（こアメ
リカン・タイプ・カルヂャー・コレクンヨンに寄託され
、受託番号６７５７４が与えられた。

実施例３ ＤＢ　１１７（ｐＥＪＨ３９−１）によるＰ２の発現。

ＤＢ　ｌ　１７（ＰＥＪＨ３１−１）が実際にＰ２配列
そのものを生産することをさらに確認するために、一連
の確認実験を行った。それらの−実験は、共にクマシー
ブルー染色された、様々な株の５ＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル・プロフィールの比較および抗Ｐ２モノクロー
ナル抗体を用いたウェスタン・プロッティングを含むも
のであった。

第３図は、ＤＬ４２、ＤＢ１１７、ＤＩ３１１７（ｐＧ
ＪＢＩＱ３）およびＤＢ　ｌ　ｌ　７（ｐＥＪＨ３９１
）細胞の全細胞蛋白質のクマシーブルー染色５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル・パターンを示す。これらの実験
で使用されたゲル系は、Ｂ−メルカプトエタノールが使
用されなかったこと以外はグリラグ等により記載（５）
されたものである。

病原性ＤＬ４２およびＤＢ　１　！　？（ｐＥＪＨ３９
−１）形質転換実験Ｈｉｂ株は共に、非形質転換ＤＢ＋
１７またはｐＧＪＢ１０３形質転換ＤＢ１１７では見出
されない３９に蛋白質（矢印）を生産することか判る（
ＤＢ１１７において見られる３９にでの微かな帯はＨｉ
ｂＰ２とは異なる。第４図参照）。

クマシーブルー・パターンが示す結果を確認するため、
同一ゲルをニトロセルロースにプロットし、全体的にト
ウビン等の方法（１６）に従いウェスタン・プロットを
プローブした。ニトロセルロース膜への電気泳動後、膜
をモノクローナル抗体９Ｆ５と反応させた。抗体２Ｆ４
とは対照的に、この抗体はＨｉｂ株およびヘモフィルス
・インフルエンゼＲｄ株の両方から得られたＰ２と反応
する。

第４図で示す通り、このモノクローナル抗体は、ＤＬ４
２（矢印）ではＨｉｂ３９ＫＰ２種のみを認識したが、
ＤＢ１１７およびＤＢ　Ｉ　Ｉ　７（ｐＧ、ＪＢ１０３
）では共に３７にのヘモフィルス・インフルエンゼＲｄ
Ｐ２変異体のみが認識される。しかしながら、ｐＥＪＨ
３９−１形質転換ＤＢ１１７では、明らかにＰ２の両度
異体が生産されている。

実施例４ ＤＬ４２からのＰ２の製造（ｐＥＪＨ３９−１）。

生産株形質転換体を製造するために、出発ゲノムＤＮＡ
が得られたＨｉｂ株、ＤＬ４２をＰ２ベクターｐＥＪＨ
３９−１により形質転換しｔこ。要するに、これは、上
記実施例に記載した乳酸−グリセリン・ショック形質転
換方法を用いてプラスミドＩ）ＥＪＨ３９−１により行
なわれた。テトラサイクリン含有ＢＨＩｓ寒天において
形質転換体が選択された。

全細胞蛋白質の５ＤＳ−ＰＡＧＥクマシーブルー染色に
より測定したところ、この実験から２種の異なるタイプ
の形質転換体が得られた。第５図は、４株の全細胞蛋白
質プロフィールを示す。レーン標識ＤＬ４２は野生型宿
主株である。レーン標識ＤＬ４２ｐＧＪＢは、ベクター
プラスミドｐＧＪＢ１０３を含むＤＬ４２である。レー
ン標識ｐＥＪＨ３９−１＃１は、野生型ＤＬ４２株の場
合よりも顕著にＰ２蛋白質を合成するｐＥＪ　Ｈ３９−
１形質転換体を示す。レーン標識ｐＥ　Ｊ　Ｈ３９−１
＃２は、野生型ＤＬ４２の場合と同様Ｐ２蛋白質をあま
り合成しない形質転換体を含む。ただし、重要なのは、
形質転換体株ＤＬ４２（ｐＥＪＨ３９−１）＃１が野生
型ＤＬ４２株の場合よりも多くの精製用Ｐ２蛋白質を提
供することである。

＃ｌおよび＃２形質転換体は、組換えＰ２遺伝子が染色
体に組込まれている（＃２）か、または保持され、組換
え宿主細胞内の染色体外に転写されている（＃ｌ）形質
転換体を示すものと仮定する。

株ＤＬ４２（ｐＥＪＨ３９−１）＃　１は、ブダペスト
条約の規定に従い、１９８７年！２月８日にアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、受託
番号６７５７５が与えられた。

蛋白質Ｐ２は、次の方法によりＨｉｂ株ＤＬ４２（ｐＥ
ＪＨ３９−１）＃ｌから精製され得る。この手順は、ム
ンソン等の方法（６）から修正されている。簡単に述べ
ると、２−４リツトルのブロス培養から得たＨｉｂ株Ｄ
Ｌ４２（ｐＥＪＨ３９−１）＃ｌ細胞を４℃で２分間１
１０４００ｘの遠心分離により回収する。細胞沈澱物を
一７０℃で少なくとら１８時間冷凍する。次いで、細胞
を解凍し、５０ｔｔｔＱの５０ミリモルＮ−２−ヒドロ
キシエチルピペラジン−Ｎ１−２−エタンスルホン酸、
ｐＨ７゜４（ＨＥＰＥＳ緩衝液）に懸濁する。

音波処理期間中５分間隔で５０％効率（５分間２回）を
用いて、最大電力で稼動する特別丈夫なチップを備えた
ソニケータ−（ブランソン・ソニック・パワー社、モデ
ル３５０）の使用により細胞を破壊する。終始水浴に浸
すことにより、懸濁液を冷たく保つ。未破壊細胞を４℃
で２０分間１９００Ｘ９の遠心分離により除去し、細胞
エンベロープを４℃で６０分間４６０００ｘ９の遠心分
離により採取する。

細胞エンベロープを一７０℃で一夜冷凍する。

翌日、細胞エンベロープをＨＥＰＥＳ緩衝液中でホモジ
ネートして１０１９／ＩＱの最終蛋白質濃度にする（ロ
ウリー検定により測定）。等ｍの２％（重量／体積）ラ
ウリルサルコシン酸ナトリウム含有ＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ　
ａ街液を細胞エンベロープホモジネートに加え、懸濁液
を室温で３０分間撹はんする。

次いで、懸濁液を４℃で６０分間１０５０００Ｂの遠心
分離にかける。外層膜濃化沈澱物を１．５倍体積（細胞
エンベロープホモジネートの最初の体積と比べて）のデ
オキシコール酸緩衝液（５０ミリモルのトリス−ＨＣ（
！１ｐＨ８，０，２％（重量／体積）デオキシコール酸
ナトリウム、０．２モルＮａＣＱおよび５ミリモルＥＤ
ＴＡ含有）中でホモジネートする。懸濁液を室温で３０
分間撹はんし、次いで室温で６０分間１０５０００ｘ９
の遠心分離にかける。新たな沈澱物を前記と同様にデオ
キシコール酸緩衝液１０＋σ中でホモジネートし、遠心
分離を行う。

生成した沈澱物をＺ３−１４緩衝液（２５ミリモルのイ
ミダゾール、ｐＨ６，５，０，４％（重量／体積）ツビ
ッテルゲント３−１４含有）によりホモジネートして約
２ｘｔｉ／ｍＱの蛋白質濃度にする（ロウリー検定によ
り測定）。懸濁液を室温で３０分間撹はんし、室温で６
０分間１０５０００ｘｌの遠心分離にかける。生成した
上清にトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ　−１００を加えて
０．５％（体積／体積）の最終濃度にする。次いで、溶
液を、０．５％（体積／体積）トリトンＸ−１００含有
Ｚ３−１４媛衝液により予め平衡状態にしておいたＤＥ
ＡＥ−セファクリル・カラム（カラム容積＝試料中の蛋
白質１ｘｇに対しセファクリル！屑のに通す。通過後、
０．５％トリトンＸ−１００および０．０５モルＫＣａ
を含むＺ３−１４緩衝液５０ｍσでカラムを洗浄する。

Ｐ２蛋白質は、０．０５モルＫＣＱから０４モルＫＣＣ
に増加する一次勾配でカラムから溶出する（勾配容積＝
７Ｘカラム容積）。

１０ｘＱ容積のフラクションを集め、２８０ｎｍでの吸
光度をモニターして蛋白質を検出する。蛋白質含有フラ
クションをプールし、２倍容積の９５％（体積／体積）
エタノールを加えることにより蛋白質を沈澱させ、次い
で一夜−２０℃で貯蔵する。精製３９に蛋白質を含有す
る沈澱を４℃で３０分間２７０００ｘｙての遠心分離に
より集め、窒素気流に暴露することにより乾燥し、蒸留
水に懸濁し、−７０°Ｃで冷凍する。

本発明者によりこの発明の実践に好ましい方法を含むこ
とが発見または提案された実施態様によりこの発明の説
明を行った。当業界の熟練者であれば、この開示に基づ
いて、この発明の対象範囲から逸脱することなく多くの
修正および変形が実施態様においてなされ得ろことは自
明の理である。

例えば、コドン重複性故に、蛋白質配列に影響を与える
ことなく基礎ＤＮＡ配列において改編がなされ得る。さ
らに、生物学的機能均等性を考慮すると、生物学的作用
の種類または債に影響を与えることなく蛋白質構造にお
いて変形がなされ得る。

これらの修正も全て特許請求の範囲内に包含されるもの
とする。

以下、列挙する参考文献は、説明の一部としてこの明細
書に引用されたものである。

参考文献 （１）ティラーおよびバックレイ、（１９７Ｂ）、［ジ
ャ−ナル・オブ・ペディアトリックスＪ（Ｊ、　Ｐｅｄ
ｉａｔｒｉｃｓ）、９２：３４７−３５３゜ （２）グリラグ等、（＋　９８２）、［インフェクト・
イミュンＪ’（Ｉｎｆｅｃｔ、　　Ｉｍｍｕｎ、）、３
７：８２−８８゜（３）シェネップ等、（１９８３）、
「インフェクト・イミュンＪ（Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕ
ｎ、）、４２：２５７−２６３゜ （４）グラノフ等、（１９８６）、「ジエイ・インフェ
クト・ディスＪ（Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、）、
＋５３：４４（５）グリラグ等、（１９８２）、「イン
フエクト・イミュン１（Ｉｎ「ｅｃｔ、　　Ｉｍｍｕｎ
、）、３７：８２−８８゜（６）ムンソン等、（＋９８
３）、「ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティ
ゲーションＪ（Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、）、
７２：６７７−６８４゜（７）バチョン等、（１９８５
）、［ジャーナル・オブ・バクテリオロジーＪＱ、　Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ、）、１６２９１８−９２４゜ （）（ａ）グリラグおよびハンセン、（１９８５）、「
インフェクト・イミュンｊ（！ｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕ
ｎ、）、４９８１９−８２７゜ （８）ダナー等、（１９８２）、「ジーンＪ（Ｇｅｎｅ
）、１８：１０１−１０５゜ （９）マツカーシー等、（１９８２）、「ジャーナル・
オブ・バクテリオロジーＪ（Ｊ、　Ｂ６ｃｔｅｒｉｏ１
．）、１５１：１６０５−１６０７゜ （ｌＯ）グリラグ等、（１９８３）、「インフェクト・
イミュンＪ（Ｉｎｆｅｃｔ、　　Ｉｍｍｕｎ、）、４２
：５１６−５２４゜ （１１）ホールマンス等、（１９８５）、［インフェク
ト・イミュンＪ（Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、）、５
０：２３６−２４２゜ （１２）ブリツカ−等、（１’Ｊ８３）、「プロシーデ
ィングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・
サイエンシーズＪ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、
　Ｓｃｉ、）、８０：２６８１−２６８５゜ （１３）サザーン、（１９７５）、［ジャーナル・オブ
・モレキュラー・バイオロジーＪ（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂ
ｉｏｌ、）、９８：５０３−５１７゜ （１４）スワンカット等、（１９８６）、「インフェク
ト・イミュンＪ（Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、）、５
２：１１０１１９゜ （１５）デグラーフ等、（１９７６）、「ジャーナル・
才ブ・バタテリオロジーＪ（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
、）、１２６：４３９−４４６゜ （１６）　）ウビン等、（１９７９）、「プロシーデイ
ングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ
イエンシーズＪ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、Ａｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ、）、７６：４３５０−４３５４゜ （１７）ステインチコウム等、（１９７９）、［ネイチ
ャー　Ｊ（Ｎａｔｕｒｅ）、２８２：３９゜（１８）チ
ェンペル等、（１９８０）、「ジーンＪ（Ｇｅｎｅ）１
０：１５７゜ （１９）ジョーンズ、（１９７７）、［ジエネテイツク
スＪ（Ｇ　ｅｎｅｔｉｃｓ）、８５：１２゜（２０）ヒ
ッツェマン、（＋９８０）、「ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリーＪ（Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、）、２５５：１２０７３゜ （２１）ホーランド等、（１９７Ｂ）、［バイオケミス
トリーＪ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１７：４９０
０゜（２２）［ティッシュ−・カルチャー　Ｊ（Ｔｉｓ
ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ）、アカデミツク・プレス、ク
ルーズおよびパターソン、編集（１９７３）。

（２３）フィアーズ等、（１９７８）、［ネイチャーＪ
（Ｎａｔｕｒｅ）、２７３：１１３゜ （２４）セットロウ等、（１９６８）、「ジャーナル・
オブ・バクテリオロジーＪ（Ｊｒｎｌ、　Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ、）、９５：５４６−５５８゜ （２５）ルボウ等、（１９Ｅ１７）、［ジエイ・インフ
エクト・ディスＪ（Ｊｒｎｌ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉ
ｓ、）、１５６：５９１−５９６゜ （２６）ホップおよびウッズ（１９８１）。アミノ酸配
列からの蛋白質抗原決定基の予測。「プロシーディング
ズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエ
ンシーズ・オブ・ニーニスエイｊ（Ｐｒｏ（。

Ｎａｔ　、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）、７８：３
Ｂ２４−３８２８゜ （２７）カイトおよびトウーリトル（１９８２）。蛋白
質のバイトロバシック特性の簡単な表示方法。「ジャー
ナル・オブ・モレキュラー・バイオロジーＪ（ＪＭｏ１
．　Ｂｉｏｌ、）、１５７：１０５−１３２゜（２８）
ホーン、ライブ、ハマー、バルマーおよびファルコウ（
１９８６）。性行為感染成分の検出における核酸プロー
ブの使用。［ダイアグ、マイクロパイオル・インフエク
ト、ディスＪ（Ｄｉａｇ、　Ｍｉｃｒｏｂｉ。

１、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、）、４：１０１Ｓ−１
０９Ｓ。

（２９）モーズレイ、ツク、アリム、ソウ、スマドポウ
ーモタレビおよびファルコウ（１９８０）。ＤＮＡコロ
ニー・ハイブリダイゼーションによる腸毒素原性エシェ
リヒア・コリの検出。［ジエイ・インフェクト・ディス
Ｊ（Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、）、１４２：８９
２−８９８゜ （３０）ブライアン、ルス、スミスおよびルボン（１９
８６）。合成オリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーシ
ョン・プローブによる臨床試料の診断、１１２−１１６
頁。ライブ（編）、［マイクロバイオロジー（Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌｏｇｙ）　−１９８６゜アメリカン・ソサエ
ティー・フォー・マイクロバイオロジーワシントン、デ
イ−シー （３１）アーデルマン等、（１９８３）、ｒＤＮＡＪ２
：１８３゜ （３２）メッシング等、高分子および組換えＤＮＡに関
する第３回クリーブランド・シンポジウム、編集者パル
トン、エルゼバイア、アムステルダム（１９８１）。

（３３）フレア等、（１９７８）、［プロシーディング
ズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエ
ンシーズ・オブ・ニーニスエイＪ（Ｐｒｏｃ、　１（ａ
ｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）、７５：５７６
５゜

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ｐ２コード配列をコードする組換え挿入体並
びに関連した制御およびプロモーター領域を有するプラ
スミドｐＥＪＨ３９−１の部分的制限酵素地図である。 第２図は、Ｐ２蛋白質をコードする遺伝子に対する放射
性標識合成オリゴヌクレオチドプローブによりプローブ
されたＨｉｂ菌株ＤＬ４１（レーンＡおよびＣ）および
ＤＬ４２（レーンＢおよびＤ）由来の制限酵素分解染色
体ＤＮＡのサザーン・プロットである。 第３図は、示されたヘモフィルス・インフルエンゼ菌株
由来の全細胞蛋白質のクマシーブルー染色５ＤＳ−１０
％ポリアクリルアミド・スラブゲルを示す。ＤＬ４２は
Ｈｉｂ菌株である。 第４図は、第３図の５ＤＳ−ポリアクリルアミドにおい
て示された同セットの抗原を抗Ｐ２ネズミモノクローナ
ル抗体９Ｆ５とインキュベーションし、洗浄し、西洋わ
さびペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスおよびウサギ抗
ヤギ免疫グロブリンによりプローブし、４−クロロ−１
−ナフトールを用いて展開することにより得られたウェ
スタン・プロットである。 第５図は、示されたヘモフィルス・インフルエンゼｂ型
菌株から得られた全細胞蛋白質のクマシーブルー染色５
ＤＳ−１０％ポリアクリルアミド・スラブ・ゲルを示す
。 第６図は、ｐＥＪＨ３９−１のＤＮＡ挿入体から決定さ
れたＰ２蛋白質遺伝子のＤＮＡコード配列および予想さ
れるアミノ酸配列を示す。 特許出願人　ボード・オブ・リージェンツ、ザ・ユニバ
ージティー・オブ・テキ サス・システム 代理　人弁理士　青　山　葆　はかＩ名ワ面の浄書（内
容に変更なし） ｆａｇ、Ｓ ；＝＝−−−− ｉｂ ＧＪＢ ｐＥノＨ３９−１ ２３，１ｋｂ ７′＃！５Ｐ２ ＯＬ４２０Ｂ ＪＢ ＥノＨ

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヘモフィルス・インフルエンゼ（Ｈａｅｍｏｐｈ
   ｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）Ｐ２抗原またはその生
   物学的機能均等物質をコードするＤＮＡ配列を含む実質
   的に純化されたＤＮＡセグメント。
2. （２）さらに、組換え体宿主において抗原ＤＮＡ配列を
   発現させ得る制御領域を含む、請求項１記載のＤＮＡセ
   グメント。
3. （３）さらに、第６図に示されたアミノ酸配列を有する
   Ｐ２抗原またはその生物学的機能均等物質をコードする
   ＤＮＡ配列を含む、請求項１記載のＤＮＡセグメント。
4. （４）少なくとも第６図のアミノ酸配列の抗原部分また
   は前記配列の生物学的機能均等物質をコードするＤＮＡ
   セグメントを含むＤＮＡセグメントであって、次のＤＮ
   Ａセグメント、すなわち、 （ａ）２１位のアミノ酸Ａｌａから３６１位のアミノ酸
   Ｐｈｅまでのアミノ酸配列をコードするＤＮＡセグメン
   ト、 （ｂ）１７５位のアミノ酸Ｇｌｎから１９７位のアミノ
   酸Ｇｌｙまでのアミノ酸配列をコードするＤＮＡセグメ
   ント、 （ｃ）２６０位のアミノ酸Ｇｌｙから２７５位のアミノ
   酸Ｔｙｒまでのアミノ酸配列をコードするＤＮＡセグメ
   ント、 （ｄ）２９６位のアミノ酸Ｌｙｓから３１１位のアミノ
   酸Ｇｌｎまでのアミノ酸配列をコードするＤＮＡセグメ
   ント、または （ｅ）前記アミノ酸配列のいずれか１つの生物学的機能
   均等配列をコードするＤＮＡセグメントの１つまたはそ
   れ以上から選ばれるＤＮＡセグメント。
5. （５）本質的に、第６図の核酸配列の少なくとも１０ヌ
   クレオチドセグメントを構成成分とする核酸分子。
6. （６）請求項１、４または５による核酸分子を含む組換
   えベクター。
7. （７）Ｐ２蛋白質に対して反応性のある抗血清との免疫
   学的交差反応能を特徴とする、長さ約１０ないし約３０
   のアミノ酸を有するポリペプチドを含む抗原。
8. （８）抗原が、次のアミノ酸配列、すなわち、 （ａ）第６図のアミノ酸配列のアミノ酸１７５〜１９７
   に対応するアミノ酸の配列、 （ｂ）第６図のアミノ酸配列のアミノ酸２６０〜２７５
   に対応するアミノ酸の配列、 （ｃ）第６図のアミノ酸配列のアミノ酸２９６〜３１１
   に対応するアミノ酸の配列、 （ｄ）第６図のアミノ酸配列のアミノ酸３３３〜３５３
   に対応するアミノ酸の配列、または （ｅ）前記アミノ酸配列のいずれか１つと生物学的機能
   が等しいアミノ酸の配列 の１つまたはそれ以上を有するポリペプチドを含む、請
   求項７記載の抗原。
9. （９）ヘモフィルス・インフルエンゼＰ２抗原をコード
   する染色体外ＤＮＡセグメントを含む組換え細胞。
10. （１０）ヘモフィルス・インフルエンゼＰ２抗原の製造
    に有用な形質転換ヘモフィルス・インフルエンゼ細胞の
    製造方法であって、 （ａ）ヘモフィルス・インフルエンゼＰ２抗原をコード
    するＤＮＡ配列を含む組換えベクターによりヘモフィル
    ス・インフルエンゼ宿主細胞を形質転換し、 （ｂ）ＤＮＡ配列によりコードされた抗原を発現する形
    質転換体を選択する ことを含む方法。
11. （１１）（ａ）請求項１０記載のヘモフィルス・インフ
    ルエンザエＰ２抗原の製造に有用な形質転換ヘモフィル
    ス・インフルエンゼ細胞を製造し、 （ｂ）有効な方法で前記形質転換体を培養することによ
    り、前記抗原の発現を達成し、 （ｃ）そこから前記抗原を得、 （ｄ）抗原を医薬的に許容し得る希釈剤またはアジュバ
    ントと混合する 段階を含む免疫原組成物の製造方法。
12. （１２）（ａ）ヘモフィルス・インフルエンゼＰ２抗原
    をコードするＤＮＡ配列を含む組換えベクターにより宿
    主細胞を形質転換し、 （ｂ）ＤＮＡ配列によりコードされた抗原を発現する形
    質転換体を選択する ことを含む、ヘモフィルス・インフルエンゼＰ２抗原の
    製造に有用な組換え細胞の製造方法。