JPS61274687A - 豚ミコプラスマの組換表面抗原およびワクチン並びにそれらに基づく診断法 - Google Patents

豚ミコプラスマの組換表面抗原およびワクチン並びにそれらに基づく診断法

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JPS61274687A
JPS61274687A JP61066116A JP6611686A JPS61274687A JP S61274687 A JPS61274687 A JP S61274687A JP 61066116 A JP61066116 A JP 61066116A JP 6611686 A JP6611686 A JP 6611686A JP S61274687 A JPS61274687 A JP S61274687A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の要約〕 たとえば組換ＤＮＡ法により作成される抗原のような豚
ミコプラスマの表面抗原、この種の抗原に基づく豚ミコ
プラスマワクチン、この種のワクチンを使用して風土病
肺炎を防止するための豚の処置方法および豚の群におけ
る豚ミコプラスマ感染の存在を検出するための発生した
抗原もしくは抗体に基づく診断試験、並びにこの種の抗
原をコードするＤＮＡ配列につき開示する。
〔発明の属する技術分野〕
本発明は豚ミコプラスマの表面抗原、組換ＤＮＡ法によ
り作成されるこの種の抗原、この種の抗原に基づく豚ミ
コプラスマワクチン、この種のワクチンを使用する風土
病肺炎を防止するための豚の処置方法並びに豚の群にお
ける豚ミコプラスマ感染の存在を検出するための発生し
たこれら抗原もしくは抗体に基づく診断試験に関するも
のである。
〔従来技術とその問題点〕
世界中で最も重要な豚の病気であるミコプラズマ・ヒオ
ニウモニア（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｈｙｏｐｎｅｕｒ
ａｏｎｔａ　）は、豚における風土病肺炎を引き起す原
因となる。これは全ゆる年−の豚に影響を及ぼす慢性の
非致命的病気である。感染した豚は咳と熱との極く軽い
症状を示す。しかしながら、感染の経済的影響は顕著で
ある。何故なら、飼料効率が低下しかつ体重増加が低下
し、その結果小さい豚が出荷されかつ相当な経済的損失
をもたらすからである。現在まで、ワクチンにより或い
は病原のない豚の群を確立することにより、この唐気を
抑制する努力は成功を収めていない。
ミコプラスマと宿主細胞表面との物理的結合が風土病肺
炎の発生および持続性の基礎となる。
〔発明の目的〕
宿主細胞への結合を媒介するミコプラズマ・ヒオニウモ
ニアの表面蛋白成分、特に感染の過程で中和性抗体を誘
発するものを同定しかつ特性化することにより、風土病
肺炎に対するワクチンのための基礎および風土病肺炎に
対する診断試験を提供することが本発明の目的である。
〔発明の要点〕
上記表面蛋白をコードするＤＮＡ配列の同定は、適当な
発現ビークルを使用して組換ＤＮＡ分子を生成させかつ
これら組換ＤＮＡ分子により適当な宿主（たとえば原核
もしくは真核宿主）を形質転換させることを可能にする
。次いで、形質転換宿主を培養すれば、これらの宿主は
ＤＮＡ配列を発現すると共に所望のミコプラスマ表面蛋
白質を産生ずることが可能となる。
産生されかつ次いで単離された表面蛋白質、その活性成
分またはその組合せを抗体の形成を誘発させるのに充分
な量で豚に投与すれば（たとえば注射により）、ミコプ
ラズマ・ヒオニウモニア感染に対する豚の免疫化手段が
得られる。
この種のワクチンに有効なキャリヤおよび適当な投与方
式は獣医学的分野の当業者に周知されている。
さらに本発明の表面抗原は、ミコプラズマ・ヒオニウモ
ニア惑染につき豚の群を試験するのに有用な診断用キッ
トの基礎を構成する。たとえば、本発明の表面抗原の１
種もしくはそれ以上に対し発生した抗体に基づく診断用
キットを゛　使用することにより、群における１０頭も
しくは２０頭の豚のうち１頭をミコブラスマ感染の存在
につき定期的かつ頻繁に試験することができるであろう
。次いで、陽性の試験結果は、本発明の抗原を全群に早
期にワクチン接種してミコプラスマの蔓延を防止するこ
とができるであろう。
さらに本発明は、ミコプラズマ・ヒオニウモニアの細菌
性表面蛋白の部分でありかつ豚に投与した際ミコプラズ
マ・ヒオニウモニアに結合する抗体の形成を誘発するよ
うなポリペプチドもしくはペプチドにも関するものであ
る。
好適ポリペプチドは、配列 ｍ化幻α； ＬＩｒ、５Ｈ１ｔαＱ■ＸＥＶＩＥＮＧＱＫＩＡＩ■Ｌ
ＧＥ；ＮＳＫＭＳｒ、Ｋｆｌ’ＥＰＮＦＦＶＧＩＹＥＫ
ＡＩＤＫＲＦＳＬＩＤＫＩＫＩ　；Ｎ５ＴＶＳＥＴＲＤ
ＦＩＱＫＦＤｒＦ′ＹＱＥＮＶＧＫＩＫＥＤＬＤＦＡ工
ＡＰＳＦＩＳｒ、、Ｓｒ、Ｉ　５ＫＳＬＴＫＫＩΣＩＡ
ＡＱ匹５ＱＦＤＳＧＡＦＴＧＩＪＳα虱ＱＤＬＧπ…エ
フ　　　およびＮ５ＧＰＶＹＧＰＦ′ＬＰＧＥＤＫＲＥ
ｒ、ＮＰ　ＩＶＡＫＳＡＮＳ　ｒＴＩＤΔＩＩ、Ｓｒ工
ｍ５ＥＲＶＡＡＬｓＲＶＥＦ。
よりなる群から選択される。
上記で使用した１文字のアミノ酸コードにより示される
アミノ酸は次の通りである：Ｐｈｅ：　Ｆ　　Ｌｅｕ：
　Ｌ　　Ｉｌｅ：　Ｉ　　Ｍｅｔ：　ＭＶａｌ　：　Ｖ
　　Ｓｅｒ：　Ｓ　　Ｐｒｏ：　Ｐ　　Ｔｈｒ：　Ｔへ
ｌａ：　　Ａ　　Ｔｙｒ：　　Ｙ　　１ｌｉｓ：　　Ｈ
Ｇｉｎ：　　Ｑ本発明の表面抗原は、天然のミコブラス
マ・ヒオニウモニア表面抗原の抗原性を示す種類のポリ
ペプチドおよびペプチドからなっている。
したがって、本発明の表面抗原には、これら表面抗原を
コードするＤＮＡ配列により形質転換された宿主で産生
される組換ポリペプチドがある。勿論、これらのポリペ
プチドはミコプラズマ・ヒオニウモニアに関係ない残部
をも含みうろことを了解すべきである。たとえば、本発
明の組換ポリペプチドは、発現ベクターもしくはその他
の源泉から誘発された蛋白部分と、ミコブラスマ・ヒオ
ニウモニアから誘導された蛋白部分とを含有する融合蛋
白とすることもできる。
これら組換ポリペプチドおよびその融合体も出発メチオ
ニンを含みうる。唯一の必要とされることは、最終ポリ
ペプチドが上記のような天然のミコプラズマ・ヒオニウ
モニア表面抗原の抗原性を示すことである。
さらに本発明の表面抗原には、上記ポリペプチドのペプ
チド断片、合成体または組換体も含まれる。これらペプ
チドは、これら表面抗原を特性化する表面抗原部位の１
つもしくはそれ以上を特徴とする。これらの部位は種々
の方法で決定することができ、かつこれらを含有するペ
プチドを各種の方法で産生させることもできる。
たとえば、ヨーロッパ特許出願第８３３０１５８９．４
号（１９８３年１０月５日公開の特許公開第００９０５
８１号）並びに「単一アミノ酸の分割に対するエピドー
ム用のウィルス抗原を試験するためのペプチド合成の使
用、Ｈ，Ｍ、ゲイセン等、プロシーディング・ナシヨナ
ル・アカデミ−・サイエンス、ＵＳＡ、第８１巻、第３
９９８−４００２頁（１９８４）を参照することができ
、その開示をここに参考のため引用する。
本発明の表面抗原は、さらに上記ペプチドもしくはポリ
ペプチドの突然変異種をも包含する。
ＤＮＡレベルまたはアミノ酸レベルのいずれかにおける
これら突然変異種を使用して、抗原の収率、免疫性もし
くは抗原性または各種精製法との適合性、アジュバント
および投与方式を改善することもできる。
最後に、本発明の表面抗原は、同一化合物における或い
は化合物の混合物における抗原または抗原部位の組合せ
とすることもできる。勿論、これらの組合せも、本発明
による上記種類の表面抗原のいずれかから誘導すること
ができる。
次に、第１図〜第５図を参照すれば、ここには本発明の
規定した範囲内における各種の表面抗原が示されている
。たとえば、これら図面のそれぞれは、発現ベクターと
そのリンカ−とから誘導される部分と、Ｍ、ヒオニウモ
ニアから誘導された部分とからなる融合蛋白を示してい
る。しかしながら、各融合蛋白は、本発明による表面抗
原の所要の抗原性を示す。さらに、これら融合蛋白のＭ
、ヒオニウモニア部分のみでもこの種の抗原特性を示し
、本発明の範囲内であることを了解すべきである。した
がって、周知の組換技術または合成波’ｐｈｉにより作
成されたごの種のポリペプチドも本発明の１部である。
これらポリペプチドにより担持された抗原部位に基づく
同様なペプチドも、本発明の範囲を逸脱することなく作
成しかつ使用することができる。最後に、第１図〜第５
図に示したミコプラスマＤＮＡ配列（下線部分）は、ミ
コプラズマ・ヒオニウモニアに対する他の表面抗原をコ
ードするＤＮＡ配列を選択しかつ図示したアミノ酸配列
が１部を占める抗原をコードする完全なまたは少なくと
もより完全なりＮＡ配列を選択するため、本発明にした
がいハイブリッド化試料として有用である。次いで、こ
れらＤＮＡ配列を第１図〜第５図のＤＮＡ配列とほぼ同
様に使用して、本発明の表面抗原を作成することができ
る。すなわち、第１図乃至第５図に示したＤＮＡ配列の
それぞれ、これら配列の下線部分のそれぞれ、およびこ
れらにより選択されるＤＮＡ配列は本発明の範囲内であ
る。
ミコプラズマ・ヒオニウモニアの表面抗原をコードする
ＤＮＡ配列をクローン化しかつ発現するに際し、広範な
種類のベクターを使用することができる。たとえば、こ
れらは染色体、非染色体および合成のＤＮＡ配列の断片
よりなるベクター、たとえば種々公知のＳＶ４０の誘導
体、公知の細菌プラスミド、たとえばｃｏｔＥｌ、ｐｃ
Ｒｌ、ｐＢＲ３２２，ｐＭＢ９およびその誘導体を包含
するイー・コリからのプラスミド、より広い宿主範囲の
プラスミド、たとえばＲＰ４．ファージＤＮＡ、たとえ
ばファージλの多数の誘導体、たとえばＮＭ９８９およ
びその他のＤＮＡファージ、たとえばＭ１３および繊維
状−重鎖ＤＮＡファージ、たとえば２μプラスミドもし
くはその誘導体のような酵母プラスミド、並びにプラス
ミドとファージＤＮＡとの組合せから誘導されるベクタ
ー、たとえばファージＤＮＡもしくはその他の発現制御
配列を使用するよう改変したプラスミドを包含する。
それぞれ特異的なりローン化用または発現用ビークルに
は、本発明のＤＮＡ配列を挿入するため種々の部位を選
択することができる。一般に、これらの部位は、これを
切断する制限エンドヌクレアーゼにより命名され、当業
者に周知されている。これら部位にＤＮＡ配列を挿入し
て組換ＤＮＡ分子を生成させるための種々の方法も周知
されている。これらはたとえばｄＧ−ｄＣもしくはｄＡ
−ｄＴ末端処理、直接結合、合成リンカ−、エンドヌク
レアーゼおよびポリメラーゼ結合１キ浚反応に続く結合
、またはＤＮＡポリメラーゼによるＤＭＡ鎖の延長およ
び適当な一事鎖雛型の作成に続く結合を包含する。勿論
、本発明に有用なりローン化もしくは発現ビークルは選
択ＤＮＡ断片を挿入するための制限エンドヌクレアーゼ
部位を有する必要がないことを了解すべきである。寧ろ
、このビークルは他の手段によって断片に結合させるこ
とができる。
本発明のＤＮＡ配列を発現するため、これらのＤＮＡ配
列を発現ベクターにおける１個もしくはそれ以上の発現
制御配列に作用結合させる。
選択ＤＮＡ配列をクローン１ヒビ−クル中に挿入する前
または後に行ないうろこの種の作用結合により、これら
発現制御配列は挿入されたＤＮＡ配列の発現を制御しか
つ促進することができる。
広範な種類の発現制御配列（ＤＮＡ配列に作用結合され
た際その発現を制御する配列）のいずれかをこれらベク
ター中に使用して、本発明のＤＮＡ配列を発現させるこ
とができる。この種の有用な発現制御配列は、たとえば
ＳＶ４０の早期および後期プロモータ、ｌａｃ系、ｔｒ
ｐ系、ＴＡＣもしくはＴＲＣ系、ファージλの主オペレ
ータおよびプロモータ領域、ｆｄコート蛋白の制御領域
、３−ホスフォグリセレートキナーゼもしくはその他の
糖類分解酵素のプロモータ、酸ホスファターゼのプロモ
ータ、たとえばＰｂｏ２．酵母α一連携因子のプロモー
タ、並びに原核もしくは真核細胞またはそのウィルスの
遺伝子の発現を制御することが知られたその他の配列、
並びにこれらの各種組合せを包含する。哺乳動物細胞に
おいては、さらにこの遺伝子をデヒドロホレートレダク
ターゼをコードしかつ支那ハムスター卵細胞宿主に対し
選択性を与える遺伝子′に結合させることにより発現単
位を増幅することもできる。
ベクターもしくは発現ビークル、特に本発明に使用する
選択ＤＮＡ断片および発現制御配列を挿入するようこれ
らに選択した部位は、各種の因子、たとえば特定の制限
酵素に感受性の部位の個数、発現すべき蛋白の寸法、た
とえばベクター配列に対する開始コドンおよび停止コド
ンの位置のような発現特性、および当業者に知られた他
の因子によって決定される。ベクター、発現制御配列お
よび特定ホスホリパーゼ阻止蛋白配列に対する挿入部位
の選択はこれら因子のバランスによって決定され、必ず
しも全ての彦沢が所定の場合に同等に有効であるとは限
らない。
本発明の好適具体例においては、バタテリオファージλ
　（ＰＬ）、細菌プラスミドｐＥｘ２９、ｐＢＲ３２２
の誘導体、およびＥｃ　ｏＲ１部位から誘導された発現
制御配列を使用して、本発明のＤＮＡ配列をプラスミド
中に挿入し、クローン１ヒと発現とを行なう。
次いで、発現制御配列に作用結合された所望の１ｆｉｌ
云子を含む組換ＤＮＡ分子を使用して、広範な種類の適
当な宿主を形質転換させ、この種の宿主（形質転換体）
に遺伝子またはその断片を発現させると共に、ハイブリ
ッドＤＮＡがコードするポリペプチドまたはその１部を
産生させることができる。さらに、組換ＤＮＡ分子を使
用して宿主を形質転換させることにより、複製に際しこ
の宿主が他の組換ＤＮＡ分子をミコプラズマ・ヒオニウ
モニア遺伝子およびその断片の源泉としてさらに産出す
ることを可能にする。
さらに、本発明の抗原およびＤＮＡ配列を産出するには
広範な種類の宿主が有用である。これら宿主は、たとえ
ばイー・コリ、バチルスおよびストレプトミセスのよう
な細菌類、たとえば酵母のような真菌類、並びにｃｕｏ
＃Ｅ胞のような動物細胞、並びに組織培養における植物
細胞を包含する。
これら用途のいずれかに対する適当な宿主め選択は、当
業者で知られた多くの因子により管理される。これらは
、たとえば選択ベクターに対する適性、同時生成物の毒
性、所望ポリペプチドの回収の容易さ、発現特性、生物
安全性およびコスト等を包含する。これら因子のいずれ
かだけにより、特定組換ＤＮＡ分子またはポリペプチド
につき完全に宿主を選択することはできない。寧ろ、こ
れら因子のバランスを考慮して、必ずしも全ての宿主が
特定組換ＤＮＡ分子の発現に対し同等に有効ではないこ
とを認識せねばならない。本発明の好適具体例において
、プラスミドｐｃＩ８５７、すなわちカナマイシンに対
する耐性をコードする遺伝子およびλｃｌに対する温度
感受性リプレッサを含むイー・コリＧＣＩを使用した。
上記したように、クローン化用もしくは発現用ビークル
の選択部位に庫入されるＤＮＡ配列は、所望のポリペプ
チドをコードする実際の遺伝子の１部でないヌクレオチ
ドを包含し、或いはこの蛋白の全遺伝子の断片のみを包
含しうることを了解すべきである。どの種のＤＮＡ配列
を使用しても、形質転換された宿主が本発明のペプチド
を産生ずることのみが必要とされる。
たとえば、本発明のＤＮＡ配列を本発明の発現ベクター
における同じ解読枠において、少なくとも１種の真核も
しくは原核キャリヤ蛋白をコードするＤＮＡ配列または
少なくとも１種の真核もしくは原核信号配列をコードす
るＤＮＡ配列またはその組合せの１部に融合させること
ができる。この種の構造は、所望のＤＮＡ配列の発現に
役立ち、宿主細胞からの所望ポリペプチドの精製を改善
させ、或いはその分泌および好ましくは熟成を可能にす
る。或いは、ＤＮＡ配列はＡＴＧ開始コドンを単独で或
いは所望ポリペプチドの第１アミノ酸をコードする配列
に直接融合された他のコドンを一緒に含むこともできる
。この種の構造は、たとえば本発明の１部であるメチオ
ニルもしくはその他のペプチジルポリペプチドの産生を
可能にする。次いで、このＮ−末端メチオニンもしくは
ペプチドを各種公知の方法により菌体内または菌体外で
切断することができ、或いはこのポリペプチドをこれに
結合されたメチオニンまたはその他の融合体と一緒に本
発明の組成物および方法で使用することもできる。
本発明のミコプラズマ・ヒオニウモニアの抗原性を示す
ポリペプチドおよびペプチドは、豚の群におけるミコプ
ラズマ・ヒオニウモニア感染の存在を検出するよう設計
した方法およびキットに使用することができ、したがっ
てこのウィルスにより感染された群における豚を識別し
て、この感染に対して豚の群の早期ワクチン接種を可能
にする。
たとえば、本発明の組換ＤＮＡ分子により形質転換され
た宿主により産生される表面抗原或いはこれに対して発
生した抗体を、これらの目的で放射線免疫分析またはＥ
ＬＴＳＡ（酵素結合免疫収着分析）に使用することがで
きる。１種の放射線免疫分析の場合、実験動物（たとえ
ばウサギ）で発生した本′発明の１種もしくはそれ以上
の表面抗原に対する抗体を固相（たとえば試験管の内側
）にけ着させる。次いで、表面抗原を試験管に加えて、
抗体と結合させる。それぞれ１０〜２０頭の豚よりなる
群のうち１頭から採取した豚血清の試料を放射性同位元
素（たとえば放射性沃素）で標識された既知量の表面抗
原抗体と一緒に、抗原−抗体の錯体で被覆された試験管
に加える。豚血清における任意の表面抗原（Ｍ、ヒオニ
ウモニア感染に対する標＆ｌｋ）抗体は、抗原−抗体の
錯体における遊離結合部位に対し標識抗体と競合する。
血清を反応させた後、過剰の液体を除去し、試験管を洗
浄しかつ放射能の量を測定する。陽性の結果、すなわち
試験した豚の血清がＭ、ヒオニウモニア抗体を含有する
場合は、低い放射能カウントで示される。
１種のＥＬＩＳＡ試験の場合は、微量測定板を本発明の
１種もしくはそれ以上の表面抗原で被覆し、これに同じ
＜１０頭もしくは２０頭の豚群における１頭から採取し
た豚血清の試料を加える。所定時間培養して血清中に存
在する抗体と抗原とを反応させた後、この測定板を洗浄
しかつ実験動物で発生して酵素標識に結合している表面
抗原抗体のｒＡ１ｉ！！物を添加し、これを培養して反
応を生ぜしめ、次いで、測定板を再び洗浄する。その後
、微小測定板に酵素基質を添加して、酵素を基質に対し
作用させる時間にわたり培養し、そして最終調製物の吸
光度を測定する。吸光度における大きい変化は、陽性結
果、すなわち試験した豚血清がＭ、ヒオニウモニアに対
する抗体を有しかつこのウィルスにより感染されたこと
を示す。
豚に投与するための本発明のワクチンを製造するに際し
、当業者に知られた標準法を使用することができる。た
とえば、選択したポリペプチドを滅菌塩水溶液に溶解さ
せることができる。
長時間保存するには、このポリペプチドを凍結乾燥させ
、次いで投与の直前に滅菌塩水溶液で再編成することが
できる。凍結乾燥前に、たとえば容積を増すような保存
量およびその他の標準的添加物、たとえばグリシンまた
は塩化ナトリウムを添加することもできる。さらに適当
なアジュバントをワクチンと共に投与することもできる
。
さらに本発明によるワクチンは、たとえば兎のような実
験動物において、本発明のポリペプチドに対し発生した
抗体を使用して作成することもできる。この「受動的」
ワクチンを次いで豚に投与して、ミコプラズマ・ヒオニ
ウモニア感染から保護することもできる。
本発明のワクチンは、好ましくは滅菌塩水溶液中に溶解
して、豚１頭当り数■のペプチドの投与量にて注射によ
り投与される。好ましくは、ワクチンは１〜２週令で投
与され、好ましくはそれに続いて４〜５週令にて再ワク
チン接種またはブースタを行なう。
〔実施例〕
ミコブラスマ・ヒオニウモニアＡＴＣＣ２７７１９をア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手
した。この微生物をフリイス培地（Ｎ、Ｆ、　フリイス
、Ｎｏｒｄ、Ｖｅｔ、Ｍｅｄ。
第２７巻、第３３７−３３９頁（１９７５））中で３７
℃にて増殖させた。−７０℃で保存した培養保存物を使
用して、この培地に１：１０の希釈率で接種した。培地
が僅かに橙黄色に変化して判る対数増殖の中期（２〜５
Ｘ１０　　菌体／ｍｌ）にて、ミコプラスマを収穫した
。この培養物を１２，５００Ｘ　ｇにて４℃で１５分間
遠心分離し、ＰＢＳ（１５０ｍＭのＮａＣ１１，１０ｍ
Ｍの燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，４）で２回洗浄し
かつ初期容積の１／１００のＰＢＳに懸濁させた。
ミコプラスマ蛋白の標識 Ｍ、　　！＝オニウモニア表面蛋白のラクトペルオキシ
ダーゼ触媒による沃素化をＪ、Ｊ、メルシャロニス等〔
バイオケミストリー・ジャーナル、第１２４巻、第９２
１−９２７頁（１９７０））の方法で行なった。対数増
殖の中期の培養物２０ｒｔｒｌをＰＢＳで２回洗浄し、
かつ０．６　ｍｌのＰＢＳに懸濁させた。この懸濁物０
．３　ｍｌを音波処理（５Ｘ１５ｓ）で予備処理し、こ
れを比較として使用した。全菌体および音波処理した菌
体の標識は次の量および順序にて試薬（ＰＢＳ中に熔解
したもの）を添加して行なった；５μβのＫｌ（５Ｘ１
０−５Ｍ、メルク社）、１０μβのラクトペルオキシダ
ーゼ（０，２■／ｍｌ、シグマ社）、５０μＣｉのキャ
リヤを含まない■１２５（二ニー・イングランド・ヌク
レア・コーポレーション社）および３μｌのＨ２Ｏ２（
９×１０−“Ｍ）。５分後、さらに３μ！のＨ２Ｏ２を
加え、反応をさらに５分間続けた。次いで、放射能沃素
化試料に試料緩衝液を加えた後、ゲル電気泳動にかけた
。
Ｓ　−メチオニンによる全ミコブラスマ蛋白の標識は、
２５０μＣｉの５３２−メチオニン（アメルシャム社）
の存在下でフリイス培地中で増殖させた２０ｐｌの培養
物を用いて行なった。菌体を対数増殖の中期に収穫し、
前記と同様に蛋白抽出物を作成した。
ＤＮＡ単離 真核細胞からＤＮＡを単離するため、ゲノムＤＮＡをプ
リンおよびスタッフオードにより実質的に記載された〔
ヌクレイツク・アシッド・リサーチ、第３巻、第２３０
３−２３０８頁（１９７６））Ｍ、ヒオニウモニアの培
養物から単離した。
１　　イー・コリ抽出物またはミコブラスマ溶解物をレ
ムリの方法〔ネイチャー、第２２７巻、第６８０−６８
５頁（１９７０））によってＰＡＧＥにかけた。ウェス
タンプロット法はトウビン等〔プロシーディング・ナシ
ョナル・アカデミ−・サイエンス・ＵＳＡ、第７６巻、
第４３５０−４３５４頁（１９７９））にしたがって行
なった。ゲルで分離された蛋白を電気泳動によりニトロ
セルロース紙に移しく１９２ｍＭのグリシン、２５ｍＭ
のトリス−ＨＣｌ　　（ｐＨ８，３）および２０％のメ
タノールにおいて６０　Ｖｌｏ、３Ａにて４℃にて１晩
）、その際トランスプロット装置（ビオラド社）を使用
し、抗血清および放射能沃素化蛋白Ａで同定した。
抗血清の作成 ミコプラスマ感染してない１０週令の豚に、新たに増殖
させたＭ、ヒオニウモニア培１？＋（各免疫化につき２
Ｘ１０７個の菌体）を３ケ月間にわたり２〜４週間の間
隔で鼻孔内接種した。各接種の１週間前に血清を集め、
第６回の接種後に採取した抗血清（抗血清１９）を後記
の免疫学的スクリーニングに使用した。同様に１０週令
の第２の豚には、フロイント完成アジュバントに乳化さ
せた２　Ｘ　１０７個の菌体を筋肉内に１回注射した。
その後、３週間で採取した抗血清（抗血清２０）をも免
疫学的スクリーニングに使用した。
ミコプラスマ表面抗原に対するこれら抗血清の特異性を
分析するためウェスタンプロット法を使用した。先ず、
全ミコプラスマ蛋白を上記のようにＰＡＧＥによって分
離し、ニトロセルロース紙に移し、かつ抗血清１９およ
び２０並びにこれら両者に対する免疫前の抗血清で処理
した。それらの結果を第６表に示す（レーンｌ：抗血清
１９に対する免疫前の血清；レーン２：抗血清１９；レ
ーン３：抗血清２０に対する免疫前の血清；レーン４：
抗血清２０；レーン８：クーマシーブルーで染色した全
ミコプラスマ蛋白）。第６図に示したように、これら抗
血清は全ミコプラスマ蛋白から約１１種の蛋白の明確な
１群のみを識別した。
これら抗血清により特異的に識別されるミコプラスマ蛋
白が細胞表面に位置することを示すため、全ミコプラス
マ蛋白のウェスタンプロットをラクトペルオキシダーゼ
法により沃素化した完全ミコプラスマの１１２５−標識
蛋白の放射能写真と比較した。何故なら、この種の沃素
化は細胞表面蛋白に限られるからである（第６図、レー
ン５）。第６図のレーン５に示したように、ウェスタン
プロットにおける両抗血清と反応した蛋白の多くは完全
細菌で沃素化された蛋白と一緒に移動した。これは、本
発明の抗血清が細胞表面蛋白に対し特異性であることを
示している。
さらに、完全ミコプラスマの沃素化を、音波処理した細
胞抽出物（第６図、レーン６）または生体内でｓ　３５
−メチオニンで標識した全ミコブラスマ蛋白（第６図、
レーン７）の沃素化と比較した。限られた数の蛋白のみ
が標識された（約１０１固）完全細胞の標識に比べ、細
胞抽出物の沃素化および全細胞蛋白の標識はクーマシー
プルーで染色された全ミコブラスマ蛋白と同様なパター
ンを有する多数の蛋白の標識を与えた（第６図、レーン
８）。したがって、本発明による抗血清は、主として細
胞表面成分に向けられ、かつ主としてミコプラスマ膜の
外側に結合したと結論される。
ミコプラスマＤ　Ｎ　Ａ断片のクローン化本発明による
ミコプラスマＤＮＡを発現ベクター中へ直接にクローン
化させ、次いで得られた保存物を上記で作成した抗体に
よりミコプラスマ表面抗原の発現につきスクリーニング
した。
２０μｇのミコプラスマゲノムＤＮＡ　（上記のように
作成）を、３３ｍＭのトリス−ＨＣＩ（ｐＨ７，６）と
１０ｍＭのＭｎＣｌ２と１ｍＭのβ−メルカプトエタノ
ールとを含有する２００μｌの緩衝液中で２ｎｇのＤＮ
Ａ酵素■　（べ一リンガー、マンハイム社）により室温
にて５分間切断して、長さ約１００〜１０，０Ｏｂｐ（
平均約３００ｂｐ）の断片を生成させた。これら断片の
末端にイー・コリポリメラーゼ■を充填した後、Ｐ３２
−標識したＥｃｏＲＩリンカ−を加えた。次いで、ミコ
プラスマＤＮＡをＥｃ。
ＲＴで切断しかつ発現ベクターｐＥｘ２９のＥＣＯＲ１
部位に結合させた。
発現ベクターｐＥｘ２９　　（Ｅ、ベック、成績未公開
）はｐＰＬｃ２４の誘導体である（Ｅ。
レムート等、ジーン、第１５巻、第８１−９３頁（１９
８１）：Ｅ、　　レムート等、ジーン、第２２巻、第１
０３〜１１３頁（１９８３））。
第６図に示したようにｐＥｘ２９は、ｐ　ＰＬｃ２４と
比較してＰＬとＭＳ２領域との間の初期ＥｃｏＲＩ部位
（ＩＱＯＮ−末端アミノ酸をコードする）が欠失してお
り、かつポリリンカーがＢａｍＨ１部位とＢｉｎｄ部位
とに導入されている。ｐＰＬｃ２４のような発現ベクタ
ーはβ−ラクタマーゼをコードする遺伝子を有する（ア
ンピシリン耐性）。
１ｐモルのベクターに結合した１ｐモルのＤＮＡ　（添
加リンカ−の放射能から計算）は、約５×１０　個の形
質転換体をもたらし、クローンの約７５％が挿入物を有
した。
イー・コリ菌株ｃｃ１　（Ｔ、Ｆ、マイヤー、セル、第
３０巻、第４５〜５２頁（１９８２）（Ｔ、Ｆ、マイヤ
ーにより寄贈）を２８℃にて４〜７×ｌＯ菌体／ｍｌの
密度まで増殖させ、Ｄ、ハナハンの方法〔ジャーナル・
モレキュラ・バイオロジー、第１６６巻、第５５７〜５
８０頁（１９８３））に従って形質転換用に調製した。
プラスミドｐｃ１８．５７とカナマイシン耐性標識を有
するプラスミドと温度感受性λｃ［リプレッサ遺伝子と
により形質転換され（Ｅ。
レムート等、ジーン、第２２巻、第１０３〜１１１頁）
〕、ＰＬプロモータからの発現を調節するこの菌株を、
次いで本発明のミコプラスマＤＮＡ挿入物を有するｐＥ
ｘ２９のためのクローン化用および発現用宿主として使
用した。
この発現ベクターにおける本発明のミコプラス？ＤＮＡ
の発現はｐｃ１８５７の存在下に２８℃で生ずる一方、
誘発は培養物を４２℃で培養して達成される。ｐＥｘ２
９における翻訳開始は、リポソーム結合部位によりＭＳ
２ポリメラーゼから行なわれる（第６図参照）。ｐＥｘ
２９のＥＣｏＲＩ部位に挿入されたＤＮＡの発現は融合
蛋白を生ぜしめ、この蛋白はＭＳ−２からの１００Ｎ−
末端アミノ酸と、リンカ−によりコードされたアミノ酸
と、相同の停止コドン前に存在するＤＮＡ挿入物により
コードされたアミノ酸と、挿入ＤＮＡ中に停止コドンが
存在しなければ次のリンカ−および最初の相同停止コド
ンの前のベクター配列によりコードされた他の全てのア
ミノ酸とで構成される。
ゲノム保存物の免疫スクリーニング ２０枚の２５ｃｎ＋Ｘ２５ｃｍ寒天板上で２８℃にて直
径１顛のコロニーまで増殖させた約３×１０５個の形質
転換体をニトロセルロース濾紙に移した。この移動直後
に、これら濾紙を予備加温された寒天板に載せて、４２
℃で２時間培養した。
コロニーをクロロホルム蒸気に１５分間露呈して溶菌さ
せた。次いで、濾紙を３０分間風乾し、２％ＢＳＡ（牛
血清アルブミン）を含有するＰＢＳ中に２時間浸漬し、
かつ抗血清１９（ＰＢＳ、１％Ｂ　Ｓ　ＡＳＯ，０１％
ＮＰ４０でｌ：５００に希釈）と共に一晩培養した。培
養前に、この抗血清にはイー・コリ抽出物を吸収させて
、コロニーの下地染色を減少させた。濾紙を０．０５％
ＮＰ４０含有のＰＢＳで洗浄し、■１２５〜標識蛋白Ａ
と共に４時間培養した後、０．０５％ＮＰ４０含有のＰ
ＢＳで激しく洗浄した。放射能写真で陽性信号を示した
クローンを二重に釣り上げ、同様な手順で再スクリーニ
ングした。
約４０種のクローンが、種々異なる強度の陽性信号を示
した。これらクローンのうち１０種を最終的に選択し、
これが全合成蛋白の１０〜２０％までの量にて蛋白を発
現するかどうか再分析した。残余のクローンは、少量（
〈１０％）しか合成しないか或いは不安定である融合体
を与えた。したがって、これらクローンについてはさら
に特性化しなかった。勿論、他方の選択した種類はミコ
プラスマ細胞表面抗原をコードするＤＮＡ配列を含有す
ることを了解すべきである。したがって、本発明の方法
により選択されたものは全て、本発明の一部を構成する
。後の分析のため、これら種類を上記選択の１０種と同
様に処理することができる。さらに、これらを選択種類
と比較するため配列決定し、各種の発現ベクター中に使
用して、これらによりコードされる抗原を産生させるこ
とができる。
イー・コリにおける融合蛋白の発現 上記１０ｆｔの選択クローンを、５０μｇ／ｍ＋のアン
ピシリンと２５μｇ／ｙａｋのカナマイシンとを含有す
るＬＢ培地にて２Ｘ１０９菌体／ｍｌの密度まで２８℃
にて増殖させた。次いで、この培養物（予備加温した培
地で１：５に希釈）を激しく通気しながら４２℃にて２
時間培養することにより発現を誘発させた〔ジェネチッ
クス・オブ・インダストリアル・マイクロバイオロジー
の第４回国際シンポジウム予稿集、第２２２〜２２６頁
（１９８２）、Ｈ，キュツバ−３、０，５ｍｌの細菌試
料（２Ｘ１０８菌体に相当）をペレット化させ、等容量
の試料緩衝液〔４％ＳＤＳ　（ドデシル硫酸ナトリウム
）、１２５ｍＭ）リス−ＨＣｌ　　（ｐＨ６，８）　、
１０％β−メルカプトエタノール、１０％グリセリンお
よび０．０２％ブロムフェノールブルー〕に懸濁させ、
５分間煮沸し、そして１２．５％５ＤＳ−ポリアクリル
アミドゲルにて分析した（Ｕ、　Ｋ。
レムリ、ネイチャー、第２２７巻、第６８０〜６８５頁
（１９７０））。
第８　（Ａ）図は、これら１０種の選択イー・コリクロ
ーンの全菌体抽出物におけるクーマシーブルー染色した
ゲルを示している。この図はさらに、ＭＳ２ポリメラー
ゼのＮ−末端に対応するＩＩＫ蛋白を発現する精製プラ
スミドｐＰ１ｃ２４自身からのクーマシーブルー染色し
た抽出物をも示している。第８　（Ｂ）図は、上記のよ
うに抗血清１９と■１２５−標識蛋白Ａとを用いた選択
菌体抽出物のウェスタン・プロットを示している。第８
（Ｂ）図に示したように、融合蛋白は種々の強度で抗血
清と反応した。より多量のこれら蛋白を作成するため、
２゛８℃にて一晩増殖させた培養物２０ｍ！を１８０ｍ
１の培地で希釈し、激しく振とうしながら４２℃にて２
時間培養した。菌体をペレット化させ、３０ｍ１の５０
ｍＭ）リス−ＨＣｌ　　（ｐｌ＋８　＞および１００ｍ
ＭのＮａＣ１で洗浄し、１．６　ｍｌの１０％蔗糖およ
び５０ｍＭのトリス−ＨＣ１（ｐｌ＋８　）に再懸濁さ
せた。０．４　ｍｌのりゾチーム（５ｗ／ｍｌ）と０．
４　ｍｌの０．５Ｍ　　ＥＤＴＡとを添加した後、菌体
を３７℃にて３０分間培養した。その後、４ｍｌのトリ
トン溶菌混合物（０，１％トリトンＸ−【００．５ｍＭ
トリス−ＭＣＩ（＋）Ｈ８）、７２．５ｍＭ　　ＥＤＴ
Ａ）を加え、混合物を氷上に１５分間保った後、さらに
３７℃で３０分間培養した。次いで、菌体を音波処理し
く４Ｘ１５Ｓ）、そして２０，０ＯＯＸ　ｇで３０分間
遠心分離した。ペレットを先ず５ｎ＋１の１Ｍ尿素中に
懸濁させかつ３７℃にて３０分間抽出し、次いで遠心分
離し、さらに５ｍｌの７Ｍ尿素で抽出した（３０分間、
３７℃）。次いで、７Ｍ尿素の上澄液中に溶解した融合
蛋白を１２．５％調製用５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ルにて精製した。
融合蛋白バンドは、クーマシープル−（０，０６％クー
マシー・ブリリアント・ブルー、５０％メタノールおよ
び１０％酢酸）で１０分間染色して可視化させ、切除し
た。このゲルを圧潰し、蛋白を０．１％ＳＤＳ含有のＰ
ＢＳにより４２℃で一晩溶出させた。ポリアクリルアミ
ドを遠心分離により元蛋白から分離し、かつ融合蛋白を
含有する上澄液を１■／ｍｌまで濃縮した。２０Ｉｌｌ
の一晩培養物からの平均収量は蛋白０．２〜１■であっ
た。
上記ＭＳ２Ｓ２−ミコブラスマ蛋白に対する抗血清を兎
で生成させた。全部で２００〜５００μｇのゲル精製蛋
白を２〜３週の間隔で３回の皮下注射することにより各
動物に投与した。最初の注射はフロイント完成アジュバ
ントで行なった。次の注射はフロインド不完全アジュバ
ントを使用した。３ケ月後、抗血清を集めてウェスタン
プロット分析に使用した。得られた各抗血清のタイター
はＥＬＩＳＡ試験において、ｌ；１０３〜１：１０　で
あった。
これら抗血清を、特異性ミコブラスマ蛋白に対する抗体
の存在につき、Ｍ、ヒオニウモニア全細胞蛋白のウェス
タンプロット分析によって試験した。第９図は４種の調
製した抗血清、すなわち９０，０００の分子量に応じ主
としてｐ９０と呼ぶ蛋白と反応するＡｎｔｉ−１９２２
；主として２種の蛋白ｐ６Ｂおよびｐ２６　（それぞれ
分子量６８，０００および２６，０００）と反応するＡ
ｎｔｉ−２４１３；ｐ５０　（分子量５０．０００）を
識別するＡｎｔ　１−４４２　；ｐ３０と呼ぶ分子量３
０，０００を有する蛋白を識別するＡｎｔｉ−１９２１
の結果を示している。Ａｎｔｉ−１９２５も同じ分子量
の蛋白と反応する（第９図に示さず）。
これら全ての蛋白は、抗血清１９により強度に染色され
たミコプラスマバンドと一緒に移動しく図面では矢印で
示す）、ただしｐ２６のみは小バンドに関係する。各種
の融合蛋白で免疫化される兎からの免疫前血清はミコプ
ラスマ蛋白を染色しなかった（第９図に示さず）。これ
らの結果は、本発明のミコプラスマ抗原が個々のＭ、ヒ
オニウモニア細胞表面抗原と反応しうる特異性抗体を誘
発させたことを示している。
さらに、上記表面抗原に対し作成した抗体により識別さ
れるミコプラスマ表面蛋白を、トリプシン切断に対し感
受性であり、したがって恐らくミコプラスマ細胞表面に
存在すると思われるものと相関させた。
比較として、先ず２０ｍ１の新鮮ミコブラスマ培養物を
作成した。次いで、この培養物を遠心分離し、ＰＢＳで
１回洗浄し、そしてこれを２ｏｗｌのＰＢＳに懸濁させ
た。この懸濁物１ｎ＋１を５０℃ｇのトリプシンと共に
培養した。比較として使用した残余１ｍｌにはトリプシ
ンを加えなかった。室温にて１０分間培養した後、両チ
ューブ内の菌体を遠心分離し、ＰＢＳで１回洗浄し、ペ
レットを試料緩衝液中に懸濁させた後、ポリアクリルア
ミドゲルに加えた。分離した蛋白をクーマシーブルーで
染色するか、或いはニトロセルロース紙に移してウェス
タンプロットにかけた。それらの結果を第１０図に示す
。
第１０図（ＣＢ）で示したように、数種の高分子量蛋白
は、トリプシン切断により低分子量まで選択的に分解さ
れた。さらに第１０図（ＷＢ）で示したように、トリプ
シン切断は、本発明の表面抗原に対する抗血清により特
異的に識別される表面蛋白に関連した抗原を除去する。
したがって、これら抗血清により識別される蛋白は細胞
表面に局在し、より多くのトリプシン感受性部位が外部
に露出される。Ａｎｔ、１−１９２５　（第１０図）と
Ａｎｔｉ−１９２１（図示せず）とにより識別される他
の２種の蛋白ｐ３０、およびＡｎｔｉ−２４１３により
識別されるｐ２６は、トリプシン切断に対し感受性がな
かった。トリプシンに対するｐ３０およびｐ２６蛋白の
この非感受性は、これら蛋白が非表面蛋白であることを
必要としない、何故なら、規程かの表面蛋白はトリプシ
ン切断に利用しうる部位を持たないよう細胞膜中に組み
込みうるからである。さらに、ｐ３０は沃素化表面蛋白
とは一緒に移動しない。ここでも、これはｐ３０が表面
蛋白でないという明瞭な証明とならない。何故なら、ｐ
３０は少ない表面成分であり、すなわち良好に標識され
るチロシン残部中に少な過ぎるからである。
Ａｎｔｉ−１９２１とＡｎｔ　１−１９２５との両者は
ｐ３０を識別する。サウザンプロットは、ｐＭＥ１９２
１および１９２５のＤＮＡ挿入物が異なる制限断片に属
することを示している。これら２種のクローンのＤＮＡ
配列は配列の同一性を持たないので、これらクローンは
同一遺伝子の異なる領域に対応するか、或いは同分子量
の蛋白をコードする２種の異なる遺伝子に対応する。　
　　　・ 他方、ｐ２６は沃素化蛋白と共に電気泳動し、抗血清１
９により弱（識別される。したがって、これは細胞表面
上に存在すると思われる。さらにｐ２６は２種の蛋白の
一方であり、他方はｐ６８であってＡｎｔｉ−２４１３
により識別される。これら蛋白は共通の抗原決定子を有
する２種の無関係の蛋白であるか、或いはｐ６８はｐ２
６の先駆体であろう。この後者の考えはサウザンプロッ
ト分析により支持され、一方のゲノム断片のみがｐＭＥ
２４１３ミコプラスマ挿入物にハイブリッド化すること
を示した。
クローン化抗原の表面局在に関する一層直接的な証明は
、ミコプラスマを特異性抗体によりその場で標識して得
られる。
凍結した薄断片化および抗体標識をＧ、グリフイス等〔
メソッズ・イン・エンチモロジー、第９６巻、第４６６
〜４８５頁（１９８３））に従って行なった。１０ｍ１
培養物からのミコプラスマ細胞ペレットを４％ホルムア
ルデヒドで固定化し、２．３Ｍ蔗糖を注入して液体窒素
中で凍結させた。断片化はガラスナイフで行なった。
薄いセクションを解凍させ、ホルムバール／炭素被覆さ
れた１００メツシユの銅格子に移し、１０μｌのＩｇＧ
フラクション（ＰＢＳ中の１％子牛血清で１＝１０に希
釈）の上に浮遊させ、そして室温で３０分間培養した。
これら格子をＰＢＳにより全体で３０分間にわたり５回
洗浄し、次いでＰＢＳ中の１０％子牛血清で１：３０に
希釈された金−蛋白Ａの溶液５μｌに移した。
反応を室温で２０分間生ぜしめた。再び格子をＰＢＳで
３０分間にわたり５回洗浄し、最後に蒸留水で５分間か
けて４回洗浄した。次いで、格子を２％酢酸ウラニルで
染色し、１．５％メチルセルロース溶液中に浸漬した。
次いで、これらセクションを電子顕微鏡で観察した。電
子顕微鏡写真は、ミコプラスマの膜に対する抗血清１９
の結合およびより少ない程度のへｎｔｉ−１９２２の結
合を示した。
ミコプラスマ細胞表面抗原の特性化 本発明の細胞表面抗原をさらに特性化するため、慣用の
ＤＮＡ配列決定法を用いて５Ｍのクローン（ｐＭＥ１９
２１，１９２２，１９２５゜２４１３および４４２）を
配列決定した。得られたＤＮＡ配列およびそれらから生
じたアミノ酸配列をそれぞれ第１〜５図に示す、これら
図面のそれぞれは発現ベクターおよびリンカ−から生じ
た発現ＤＮＡ配列の１部（およびこれによりコードされ
るアミノ酸配列）、並びにＭ。
ヒオニウモニア（下線）およびその発現生成物から得ら
れたＤＮＡ配列を示している。たとえば、第１図におい
てヌクレオチド１〜３２（ｐＭＥ　１９２１）はベクタ
ーおよびリンカ−から生じたものであり、ヌクレオチド
３３〜１２５はミコプラスマから生・じたものである。
しかしながら、８個のみのミコプラスマ・アミノ酸しか
発現されない。何故なら、相内に停止コドンが存在する
からである（ヌクレオチド５７〜６０、第５図）。他方
、ｐＭＥ１９２２においては全ミコプラスマ挿入物が発
現される。何故なら、最初の相内の停止４コドンがベク
ター配列中にこのクローンのミコプラスマ挿入物のカル
ボキシ末端で生ずるからである。
これら５種のクローンのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列
を種々の方法で使用して、本発明により他の表面抗原を
作成することができる。たとえば、特定のミコプラスマ
コード化配列またはその断片を各クローンから単離し、
これら配列を他の発現ベクターに使用して、これらによ
りコードされる抗原を融合蛋白として或いはミコプラス
マ由来の蛋白のみとして産生させることができる。これ
らコード配列またはその断片を使用して、ＤＮＡ試料を
作成したり（合成またはクローン自身から）或いは池の
ＤＮＡ保存物（ｃＤＮＡまたはゲノム）をスクリーニン
グするのに使用する試料を作成することもでき、他の関
連ミコプラスマ表面抗原をコードする本発明のクローン
またはＤＮＡ配列によって既にコードされている抗原を
一層完全にコードするほぼ同圧のＤＮＡ配列につきハイ
ブリッド化でスクリーニングすることもできる。たとえ
ば、λｇｔｌｏもしくはλｇｔｌｌのようなベクターで
作成された、より長いＤＮＡ挿入物のゲノム保存物をス
クリーニングして、これら表面抗原をコードする全長遺
伝子を選択することもできる。次いで、これら遺伝子を
上記のように使用して、これらにより広範な種類の宿主
および発現ベクター中でコードされる抗原を発現させる
こともできる。
最後に、本発明のＤＮＡ配列から生じたアミノ酸配列を
使用して、抗原部位または細胞表面抗原の部位を有する
合成ペプチドを作成することもできる。たとえば１９８
３年１０月５日イ寸は公開のヨーロンパ特許出願第８３
３０１５８９．４号（公開第００９０５８１号）、並び
にＨ，Ｍ、ゲイセン等、プロシーディング・ナショナル
・アカデミ−・サイエンス　ＵＳＡ、第８１巻、第３９
９〜４００２頁（１９８４）を参照することができる。
次いで、これら合成ペプチドを、上記で実質的に記載し
たようにワクチンおよび診断用キットに使用することが
できる。
本発明によるＤＮＡ配列、組換ＤＮＡ分子および形質転
換宿主は１９８５年３月１９日付けで西ドイツ国、ゲッ
チンゲン所在のドイツチェ・ザンムルンク・フォノ・ミ
クロオルガニスムのカルチャーコレクションに寄託した
下記の各種微生物によって例示される： ＋１）　　イー・コリＧＣＩ　　（ｐｃ１８５７）（ｐ
ＭＥｌ　９２１）、０３Ｍ３２７１として寄託；（２）
イー・コリＧＣＩ　（ｐＣＩ８５７）（１）ＭＥ１９２
２）、ＤＳＭ３２７２として寄託；（３）イー・コリＧ
ＣＩ　　（ｐｃ１８５７）（ｐＭＥ１９２５）、０５Ｍ
３２７３として寄託；（４）　　イー・コリＧＣＩ　　
（ｐｃＴ８５７）（ｐＭＥ２４１３）、ＤＳＭ３２７４
として寄託；（５）　　イー・コリＧＣＩ　　（ｐｃＴ
８５７）（ｐＭＥ８　　４４２）、ＤＳＭ３２７５とし
て寄託；本発明を多くの実施例につき記載したが、この
基本構成を変更して本発明の方法および組成物を利用す
る他の実施態様を提供しうることも了解されよう、した
がって、本発明は例示した特定実施例のみに限定されず
、本発明の範囲内において多くの改変をなしうろことが
了解されよう。
【図面の簡単な説明】
第１図は組換ＤＮＡ分子ＰＭＥ　１９２１の翻訳ＤＮＡ
配列の適切な部分を示し、さらに１文字のアミノ酸コー
ドを用いてＰＭＥ１９２１の発現に際し産生される融合
蛋白のアミノ酸配列における適切な部分をも示し、これ
らＤＮＡ配列とアミノ酸配列との両者の下線部分はミコ
ブラスマ・ヒオニウモニアから特異的に誘導される部分
を示し、第１図に示した残余のＤＮＡおよびアミノ酸配
列はミコプラスマ配列をクローン化するのに使用した発
現ベクターおよびリンカ−から誘導され、かつ第１図は
さらにここで使用する１文字のアミノ酸コードをも示し
、第２図は組換ＤＮＡ分子ＰＭＥ　１９２２の翻訳ＤＮ
Ａ配列における適切な部分を示し、さらにこの適切なり
ＮＡ配列により発現に際しコードされるアミノ酸配列を
も示し、また下線はミコプラズマ・ヒオニウモニアから
誘導されるＤＮＡおよびアミノ酸配列の部分を示すため
に使用し、残余の配列は発現ベクターおよびリンカ−か
ら誘導され、 第３図は組換ＤＮＡ分子ＰＭＥ１９２５の翻訳ＤＮＡ配
列における適切な部分を示し、さらにこの通切なりＮＡ
配列により発現に際しコードされるアミノ酸配列をも示
し、さらに下線はミコプラズマ・ヒオニウモニアから誘
導されるＤＮＡおよびアミノ酸配列の部分を示すために
使用され、残余の配列は発現ベクターおよびリンカ−か
ら誘導され、 第４図＋ヨ組換ＤＮＡ分子ＰＭＥ２４１３の翻訳ＤＮＡ
配列における通切な部分を示し、さらにこの適切なりＮ
Ａ配列により発現に際しコードされるアミノ酸配列をも
示し、また下線はミコブラスマ・ヒオニウモニアから誘
導されるＤＮＡおよびアミノ酸配列の部分を示すために
使用され、残余の配列は発現ベクターおよびリンカ−か
ら誘導され、 第５図は組換ＤＮＡ分子ＰＭＥ　４４２の翻訳ＤＮＡ配
列における適切な部分を示し、さらにこの適切なりＮＡ
配列により発現に際しコードされるアミノ酸配列をも示
し、また下線はミコプラズマ・ヒオニウモニアから誘導
されるＤＮＡおよびアミノ酸配列の部分を示すために使
用され、残余の配列は発現ベクターおよびリンカ−から
誘導され、 第６図は豚抗血清１９および２０の特異性を示し、ミコ
プラスマ蛋白はＰＡＧＥにより分離され、ニトロセルロ
ース紙に移されかつ次の血清で処理され〔抗血清１９（
レーン２）、抗血清２０（レーン４）、それぞれ抗血清
１９および２０に対する免疫前の血清（レーン１および
３）〕、これらを完全ミコプラスマが■１２５で標識さ
れた蛋白ゲル（レーン５）、試験管内にて１１２５で標
識された音波処理したミコブラスマ抽出物（レーン６）
、および生体内で５３５−メチオニンで標識した全ミコ
プラスマ蛋白（レーン７）の放射能写真と比較し、クー
マシーブルーで染色した全ミコブラスマ蛋白をレーン８
に示し、分子量（１０３）を分子量標準（シグマ社）を
用いて右側に示し、 第７図は本発明の好適ゲノム保存物を作成するのに使用
した発現ベクターｐＥｘ２９を示し、これは発現ベクタ
ーｐＰ１ｃ２４の誘導体であり、ＰＬプロモータとＭＳ
２領域（１０ＯＮ−末端アミノ酸をコードする）との間
の初期Ｅｃ。 Ｒ１部位が欠失しかつ図示したようにポリリンカーがＴ
３　ａ　ｍ　Ｈ＋およびＨｉｎｄＩ［［部位に導入され
ており、複数のオリジン（ｏ　ｒ　ｉ）とβ−ラクタマ
ーゼをコードする領域（Ａｍｐ）が示され、 第８図はイー・コリで発現された融合蛋白の特異性を示
し、（Ａ）保存物の免疫スクリーニングから選択された
１０種のクローンの全細胞抽出物をＰＡＧＥにより分析
しかつクーマシーブルーにより染色し、ｐＰ１ｃ２４自
身はＭＳ２ポリメラーゼのＮ−末端に対応するＩＩＫ蛋
白を発現しく最も右側）、（Ｂ）上記ＰＡＧＥにより全
細胞抽出物を分別した後、分別蛋白をニトロセルロース
濾紙に移して抗血清１９と共に培養し、結合した抗体を
■１２５−蛋白Ａで検出すると共に放射能写真にかけ、
これら融合蛋白は明らかに合成された融合蛋白の量とは
、無関係で異なる強度にて抗血清と反応し、Ｃ−標識し
た分子量標準（ＮＥＮコーポレーション社）を左側に示
し、 第９図は特定の抗血清を使用したミコプラズマ・ヒオニ
ウモニア蛋白のウェスタンプロットを示し、第１図に示
したように作成したニトロセルロース紙を種々の抗血清
で処理し、抗血清１９で染色されたミコプラスマの輪郭
を基準として使用し、本発明の各種表面抗原に対し発生
した抗血清により識別されるミコプラスマ蛋白を矢印で
示し、その大凡の分子量を分子量標準（左側）との比較
に基づき右側に示し、第１０図は本発明のクローン化表
面抗原のトリプシン感受性を示し、全ミコブラスマ細胞
（１ｍ１の培養物に対応）をトリプシンの不存在下また
は存在下（５０μｇ／ｍｌ）にて培養しかつその後に蛋
白をＰＡＧＥにより分離しかつクーマシーブル−（ＣＢ
）で染色するか、またはウェスタンプロット分析（ＷＢ
）用のニトロセルロース濾紙に移し、これらプロットを
上記各種のクローン化抗原に対し発生した抗血清と共に
培養し、矢印は抗血清により識別された蛋白の位置を示
している。 ＦＩＧ　　６ 図面の浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、　７ ＦＩＧ、８ ：：： 】ロー ＩＬコーーー、１．。 ＦＩＧ　、　９ ♀

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）配列 【遺伝子配列があります】； 【遺伝子配列があります】； 【遺伝子配列があります】； 【遺伝子配列があります】； および 【遺伝子配列があります】。 よりなる群から選択されるＤＮＡ配列。
  2. （２）（ａ）ＤＮＡ配列： 【遺伝子配列があります】； 【遺伝子配列があります】； 【遺伝子配列があります】； 【遺伝子配列があります】； および 【遺伝子配列があります】； （ｂ）前記ＤＮＡ配列のいずれかにハイブリッド化しか
    つ発現に際しミコプラズマ・ヒ オニウモニアの表面抗原をコードするＤＮＡ配列； （ｃ）前記ＤＮＡ配列のいずれかにより発現に際しコー
    ドされるミコプラズマ・ヒオニ ウモニアの表面抗原を発現に際しコードす るＤＮＡ配列 よりなる群から選択されるＤＮＡ配列からなる組換ＤＮ
    Ａ分子。
  3. （３）ＤＮＡ配列が組換ＤＮＡ分子における発現制御配
    列に作用結合している特許請求の範囲第２項記載の組換
    ＤＮＡ分子。
  4. （４）発現制御配列が早期および後期プロモータＳＶ４
    ０、￥ｌａｃ￥系、￥ＴＡＣ￥系、￥ＴＲＣ￥系、￥ｔ
    ｒｐ￥系、ファージλの主オペレータおよびプロモータ
    領域、ｆｄコート蛋白の制御領域、３−ホスホグリセレ
    ートキナーゼもしくはその他の糖類分解酵素のプロモー
    タ、酸ホスファターゼのプロモータ、酵素α−連携因子
    のプロモータ、および原核もしくは真核細胞またはその
    ウィルスの遺伝子の発現を抑制する他の配列よりなる群
    から選択される特許請求の範囲第３項記載の組換ＤＮＡ
    分子。
  5. （５）ｐＭＥ１９２１、ｐＭＥ１９２２、ｐＭＥ１９２
    ５、ｐＭＥ２４１３およびｐＭＥ４４２よりなる群から
    選択される特許請求の範囲第３項記載の組換ＤＮＡ分子
    。
  6. （６）特許請求の範囲第２項乃至第５項のいずれかに記
    載の組換ＤＮＡ分子により形質転換された宿主。
  7. （７）イー・コリ、シュードモナス、細菌類、酵母類も
    しくは他の真菌類の菌株、ネズミ、豚もしくはその他の
    動物または植物宿主およびヒト組織細胞よりなる群から
    選択される特許請求の範囲第６項記載の形質転換宿主。
  8. （８）イー・コリがイー・コリＧＣ１である特許請求の
    範囲第７項記載の形質転換宿主。
  9. （９）宿主がイー・コリＧＣ１（ｐｃ I ８５７）（ｐ
    ＭＥ１９２１）、イー・コリＧＣ１ （ｐｃ I ８５７）（ｐＭＥ１９２２）、イー・コリＧ
    Ｃ１（ｐｃ I ８５７）（ｐＭＥ１９２５）イー・コリ
    ＧＣ１（ｐｃ I ８５７）（ｐＭＥ２４１３）、および
    イー・コリＧＣ１（ｐｃ I ８５７）（ｐＭＥ４４２）
    よりなる群から選択される特許請求の範囲第８項記載の
    形質転換宿主。
  10. （１０）豚に投与した際ミコプラズマ・ヒオニウモニア
    に結合する抗体の形成を誘発するポリペプチドを産生す
    るに際し、特許請求の範囲第３項乃至第５項のいずれか
    に記載の組換ＤＮＡ分子により形質転換された宿主を培
    養することを特徴とするポリペプチドの産生方法。
  11. （１１）宿主がイー・コリ、シュードモナス、細菌類、
    酵母類もしくは他の真菌類の菌株、ネズミ、豚もしくは
    他の動物または植物宿主およびヒト組織細胞からなる特
    許請求の範囲第１０項記載の方法。
  12. （１２）特許請求の範囲第１０項または第１１項記載の
    方法により産生されるポリペプチド。
  13. （１３）特許請求の範囲第１２項記載のポリペプチドの
    いずれかにおけるアミノ酸配列からなる合成もしくは半
    合成のポリペプチド。
  14. （１４）配列 【アミノ酸配列があります】； 【アミノ酸配列があります】； 【アミノ酸配列があります】； 【アミノ酸配列があります】； および 【アミノ酸配列があります】。 よりなる群から選択されるポリペプチド。
  15. （１５）免疫学的反応を誘発するのに有効な量の特許請
    求の範囲第１２項乃至第１４項のいずれかに記載の少な
    くとも１種のポリペプチドと医薬上許容しうるキャリヤ
    とからなる、豚をミコプラズマ・ヒオニウモニアから保
    護するためのワクチン。
  16. （１６）特許請求の範囲第１５項記載のワクチンの有効
    量を豚に投与することを特徴とするミコプラズマ・ヒオ
    ニウモニアに対する豚の免疫化方法。
  17. （１７）特許請求の範囲第１２項乃至第１４項のいずれ
    かに記載の少なくとも１種のポリペプチドまたはこれら
    ポリペプチドの１種もしくはそれ以上に対し発生した少
    なくとも１種の抗体を使用することを特徴とする、豚に
    おけるミコプラズマ・ヒオニウモニア感染の検出方法。
  18. （１８）特許請求の範囲第１２項乃至第１４項のいずれ
    かに記載の少なくとも１種のポリペプチドまたはこれら
    ポリペプチドの１種もしくはそれ以上に対し発生した少
    なくとも１種の抗体を含むことを特徴とする、豚におけ
    るミコプラズマ・ヒオニウモニア感染を検出するための
    検出用キット。
JP61066116A 1985-03-27 1986-03-26 豚ミコプラスマの組換表面抗原およびワクチン並びにそれらに基づく診断法 Pending JPS61274687A (ja)

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