JPH022360A - デンソヌクレオシスを生ぜしめる新規なプラスミド、その取得方法、及び加害性昆虫の生物学的撲滅におけるその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、デンソヌクレオシスを生ぜしめる新規なプラ
スミド、その取得方法、及び加害性昆虫の生物学的撲滅
におけるその使用に関するものである。

［従来の技術］ デンソヌクレオシスは、デンソウィルスにより生ずる多
数の無を椎動物（主として昆虫）に影響を及ばず病気で
ある。デンソヌクレオシスと言う用語は、デンソウィル
スが増殖する核に特徴的な肥大を反映する。天然の条件
下で、１００％に達する死滅率が４日若しくは５日以内
に達せられる。

デンソウィルス属に分類されるこれらのウィル又は、を
椎動物のパルボウィルスである２種のパルボウィルス属
及びデイペンドウィルス属と共にバルホビリデー科を構
成する。

デンソウィルスは小型アイツメ１〜リンクウイルスであ
って、包封されておらず、ＤＮＡを有し、かつこれらが
最初に売出された経済的に重要な多くの種類の加害性昆
虫（特に鱗翅目）に対し強力に病原性である。天然環境
において、これらはその宿主の集団調節に効果的に関与
する伝染病の原因となる。現在まで、約２０種のデンソ
ウィルスが、地球の仝ゆる地域に由来する種々異なる群
の昆虫：すなわち鱗翅目、双翅目、直翅目、鞘翅目の昆
虫から分離されている。

したがって、デンソウィルスは経済的重要性を有する昆
虫（特に鱗翅目）に対して使用するための極めて興味お
る可能性を与え、微生物学的撲滅と言うこの新規な手段
は化学的撲滅に代替することができ或いはこれを補充す
ることができる。

ざらに、昆虫に対するその極めて激しい作用にも拘らず
、予備的試験及び永年にわたる実験室的試験はヒ１〜に
おいて何らの病理学的作用をも示さなかったことを強調
することも重要である。

たとえばバキュロウィルスのＪ：うな他の昆虫病理性ウ
ィルスに基づく製剤が現在市販されている。

多量に飼育された昆虫の感染に依存するこれらウィルス
の工業的生産方法は、高い生産コスｌ〜を伴う。細胞培
養でこれらウィルスを大量生産する試みも同じコスト問
題に直面している。

バキュロウィルスに関し、デンソウィルスの増殖は一般
に幼虫で得られ［アナーレン・レビュー・エン１〜モロ
ジー（１９乃）、第２４巻、第１３〜１６頁１゜このこ
とは高い生産コストを暗示する。

ざらに、多くの種類のデンソウィルスは、工業的飼育に
必要な人工培地を確立する際に遭遇する大きい困難性を
考慮すれば、その宿主にて増殖させることができない。

したがって、宿主における増殖の介入を必要とせずに感
染性物質を製造する他の方法を見出すことに大きな興味
が持たれる。その可能性は、遺伝子工学によりこのデン
ソウィルスを生産することにある。事実、そのゲノムの
寸法は細菌プラスミドに挿入するのに適する一方、たと
えばバキュロウィルスのような極めて高い分子量のゲノ
ムを有するウィルスについてはこれは実現しえない。

［発明が解決しようとする課題］ したがって本発明の課題は、感受性昆虫にデンソウィル
ス感染を生せしめるデンソウィルスの二本鎖若しくは一
本鎖ＤＮＡの完全若しくは部分配列を含有することを特
徴とする大腸菌にて複製しつる新規な組換プラスミドを
提供することにある。

本発明のプラスミドにＤＮＡの完全若しくは部分配列が
含有されている全てのデンソウィルスは「インターパイ
ロロジー」、第２３巻、第６１〜７３頁（１９８５）に
挙げられている。

最も多く研究されている加害性鱗翅目昆虫のデンソウィ
ルスはジュノニア（Ｊｕｎｏｎ＋ａ　）　、ガレリア（
Ｇａｌｌｅｒｉａ）及びアグラウリス（Ａｇｒａｕｌｉ
ｓ）デンソウィルスである。

［課題を解決するための手段１ したがって本発明は、特にジ１ノニア、ガレリア若しく
はアグラウリスのデンソウィルスにおける完全若しくは
部分二本鎖若しくは一本鎖ＤＮＡ配列を含有することを
特徴とするプラスミドに関し、殊にジュノニアのデンソ
ウィルス（＝Ｊ−ＤＮＶ＞における二本鎖若しくは一本
鎖ＤＮＡの完全若しくは部分配列を含有することを特徴
とするプラスミドに関するものである。これらプラスミ
ドを、本明細書中では以下ｐＪと呼７５″Ｘ。

デンソウィルスのゲノムは、５０００〜６０００塩基の
ＤＮＡの線状−重鎖分子によって構成される。ウィルス
形態形成の際、デンソウィルスのピリオンは士連鎖及び
一連鎖を無差別に包封するが、常に別々にかつ当モル比
率で包封する。この種のウィルス集団から生ずる高いイ
オン力（０，ｌ５ＳＣ）の条件下にあけるＤＮＡの抽出
は、補完連鎖の対形成によって２成分（ｂｉｃａｔｅｎ
ａｒｙ）分子の形成をもたらす［トルフォート等（１９
６７）　、＾ｒｃｈ、　Ｇｅｓ。

ＶｉｒＵＳｆＯｒＳＣｈ、　１第２１巻、第４６９〜４
７４頁、並びにＡ、Ｈ，パルビス及び１．０．つを−カ
ー（１９７０）　、Ｆ　Ｅ　ＢＳレタース、第６巻、第
１３〜１６頁１゜かくして、これらのゲノムは、その低
分子量及び２成分連鎖を形成するその性質により、プラ
スミド中に一体化するのに特に好適である。ピリオンか
ら抽出された２成分ＤＮＡは、感受性昆虫の幼虫をトラ
ンスフェクトさせて得られる細胞培養物におけると丁度
同程度に感染性である［ジューセット、フランス微生物
学会、第１回会議、ツールース（フランス国）　、１９
８６年４月、ＣＰ５９、第４４頁、及びジューセット、
無脊椎動物病理学会（１９８６）　、第１２１頁、無を
椎動物の項目、ベルトホーベン（オランダ国）　、１９
８６年８月］りジュノニアのデンソウィルスにおける２
成分ＤＮＡのクローン化がかくして実現され、後記実験
の部に詳細に説明する。

このようにして得られたクローン化ゲノムの配列は常法
にしたがって決定される［サンガー等（１９７７）　、
プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエン
ス・ＵＳＡ、第７４巻、第５４６３頁；Ａ、Ｍ、マキサ
ム及びＷ、ギルバー１−（１９８０）、メソッズ・エン
チモロジー、第６５巻、第４９９頁］。

したがって本発明はざらに、第１図に示したデンソウィ
ルスＪ−ＤＮＶのウィルスゲノムの完全配列をその主題
とする。

特に本発明は、２つの末端ｒＸＪ及びｒＺＪが除去され
ている第１図に示した配列に対応するデンソウィルスＪ
−ＤＮＶのウィルスＤＮＡの完全配列に関する。

したがって本発明は、特に第１図に示したデンソウィル
スＪ−ＤＮＶのウィルスゲノムの完全配列を含有するこ
とを特徴とするプラスミドに関するものである。ざらに
本発明は、特にガレリアのデンソウィルスにおける二本
鎖若しくは一本鎖ＤＮＡの完全若しくは部分配列を含有
することを特徴とするプラスミドをその主題とする。こ
れらプラスミドを、本明細書中に以下ｐＧと呼ぶ。上記
ｐＪベクターのうち、ベクターｐＢＲＪが好適なもので
める。

このプラスミドは２つの末ＤＭｒＸＪ及び「Ｚ」か除去
されている第１図に示した配列に対応するクローン化デ
ンソウィルスＪ　−Ｄ　Ｎ　Ｖのウィルス１つＮＡの完
全配列を含有することを特徴とし、このプラスミドの作
成原理を本明細書中に後記しかつその作成を実験の部に
詳述する。

本発明によるプラスミドの作成は、この分野で用いられ
る通常の技術を要求する。これらの技術は、たとえばマ
ニアデス、モレキュラ・クローニング：Ａ−ラボラトリ
−・マニュアル、コールド・スプリング・ハーバ−・ラ
ボラトリ−（１９８２）或いは「分子生物学における基
礎的方法」、デービス−デイブナ−・バットネーエルセ
ビール（１９８６）に記載された技術である。

本発明によるプラスミドの作成に用いる出発ベクターは
好ましくはｐＢＲ３２２であるが、たとえばベクターＰ
ＵＣ１ｅ［Ｊ、ノランダー等、ジイーン、第２６巻、第
１０１〜１０６頁（１９８３）　］又はベクターｐＡＴ
１５３　［Ａ、Ｊ、ライラグ及びり、シ１ラット、ネイ
チャー、第２８３巻、第２１６〜２１８頁（１９８０）
　］のような他の任意の古典的クローン化ベクターも使
用することができる。

出発ベクターは、好ましくは独特な部位で必るクローン
化部位にて１種若しくはそれ以上の制限酵素により切断
される、。

この部位の選択は、デンソウィルスにおけるウィルスゲ
ノムの地図化に関する従来の知識に基づいている。たと
えば、従来規定されたＤＪプラスミドは、遊離末端を生
ぜしのるたとえばＥ　Ｃｏ　ＲＶ　若しくはＮｒＵＩの
ような酵素により或いは付着性末端を生せしめるたとえ
ばＰＳｔＩのような酵素により切断して出発ベクターｐ
ＢＲ３２２から作成することができる。

これら各種の可能性は、第２図に示したウィルスゲノム
Ｊ−ＤＮＶの地図化に基づいている。

勿論、同じクローン化技術を本発明の他のプラスミド、
たとえば制限酵素ＰＳｔＩを用いて作成される従来規定
されたｐＧプラスミドにも適用することができる。

本発明の好適プラスミド（すなわちｐＢＲＪプラスミド
）の作成を第３図に詳細に説明する。ウィルスＤＮＡは
、ジュノニアウィルスから抽出及び精製の公知技術にし
たがって得られている。精製されたＤＮＡは、ポリメラ
ーゼで処理した後に、線状化ｐＢＲ３２２の独特な部位
ＥＣｏＲＶにて一体化される。

大腸菌にて形質転換させた後、アンピシリン耐性かつテ
トラサイクリン感受性のコロニーのみを選択する。

組換細菌の微小分解を行なって、ゲノムＤＮＡに近い寸
法の断片が挿入されたプラスミドを含有するコロニーの
みを保持する。

ｐＢＲＪの作成経路を第３図に示す。

ざらに本発明は、大腸菌にて複製しうる組換プラスミド
により形質転換された大腸菌宿主細菌にも関するもので
あり、これらは感受性昆虫にデンソウィルス感染を生せ
しめるデンソウィルスの二本鎖若しくは一本鎖ＤＮＡの
完全若しくは部分配列を含有することを特徴とする特に
本発明は１）Ｊプラスミドにより、特にｐＢＲＪプラス
ミドにより形質転換された細菌に関する。

上記した全てのプラスミド（特にｐＪプラスミド、殊に
プラスミドｐＢＲＪ）を用いて加害性昆虫を撲滅するこ
とができる。

実験の部に記載した試験は、スボドプテラ（５ｐｏｄｏ
ｐｔｅｒａ　）の幼虫の面リンパにおけるｐＢＲＪプラ
スミドの注射によるトランスフェクションがピリオン又
はウィルスＪ　　ＤＮＡの接種によって生ずるものと同
じデンソウィルス感染を再用させうろことを作用的に示
している。

ｐＢＲＪに対ツる同じ感受性が、たとえばデルウメ１−
リンのような化学的殺虫剤に対し耐性のスボドプテラの
種類につき示されている。

したがって本発明は、加害性昆虫を生物学的に撲滅する
ための本発明のプラスミド、待にｐＪプラスミド、殊に
プラスミドｐＢＲＪの使用に関するものでおる。

この種の用途に関する経済上重要な昆虫は、成る種の医
学的及び獣医学的に興味間る双翅目ベクター並びに食物
生産及び工業的培養物（綿、トウモロコシ、大豆、油椰
子、バナナ）を浸蝕する鱗翅目及び鞘翅目の昆虫でおる
。

ざらに本発明は、この種の用途に適した全ての殺虫性組
成物をも包含する。

適する組成物は、本発明のプラスミドによりＤＮＡを波
音しうるようなものである。このＤＮＡを被覆する小胞
は次の数種の基準に合致せねばならない： 充分な直径を有する親水性内部キャビティ；腸管内のプ
ラスミドのＤＮＡを保護しうろこと；たとえば中腸のよ
うな標的細胞にてその内容物を放出すること。

たとえばこの種の小胞はニオソーム、リポソーム或いは
ぎラチン又は水溶性重合体若しくはアクリルアミドのマ
イクロカプセル或いはその他任意の種類の上記基準に適
合するマイクロカプセルでおる。Ｍ１３型の単成分ファ
ージにおけるカプセル化の形態も実現することができる
。

［実施例］ 以下、限定はしないが実験例により本発明をざらに説明
する。

ｐ　Ｂ　ＲＪプラスミドの作成 （１）ウィルスのＤＮＡの精製。

（２）ウィルスのＤＮＡのクローン化。

（３）ウィルスのＤＮＡの配列決定。

（４）ｐＢＲ３２２にてクローン化した若しくはしてな
いデンソウィルスのＤＮＡによるスボドプテラ・リトラ
リス（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｌＩｔ［ｏｒａｌｌｓ　
）の幼虫にあけるトランスフェクションの結果。

ジュノニアのデンソウィルスが感染した２０〜３０匹の
スボドプテラ・リトラリス幼虫を０．１ＭトリスＨＣε
のｐｌ−（７，４アスコルビン酸２％緩衝液にてボッタ
ー皿に接種した。生成物をｔｏ、ｏｏｏｇにて１０分間
遠心分離することにより清澄させた。次いで、ピリオン
を４℃における５Ｗ４１型ロータで３５　、００Ｏｒｐ
ｍにて９０分間遠心分離することにより凝集させた。残
留物を採取しかつレッグラフイン２０〜７６％のスラン
トに付着させ、そして３　Ｗ４１０−夕にて３５　、０
ＯＯｒ、ｐｍで１５時間遠心分離した。スラントの下部
１／３に位置するウィルスのバンドを回収し、次いで緩
衝液下Ｅ　（１０ｍｌリスＨＣｌ２．１　ｍ）ＩＥ　Ｄ
　Ｔ−△、ｐＨ８，０＞　ニ対し、１２１ｍにＭ衝液を
交換しながら３日間透析した。ウィルス懸濁物の純度を
、次いで電子顕微鏡及びＵＶ分光光度測定により検査し
た。その濃度は、２６　Ｑ　ｎ　ｍにあける光学密度の
測定によって推定した。２６０ｎｍにおける１単位の光
学密度は、１ｍ１当りピリオンｉｏｏμ９に相当する。

（ｂ）ＤＮＡの抽出 ウィルス懸濁物の緩衝剤を４ｍ）ｌのＥＤＴＡ、１ｄ当
りにプロテナーゼ１００μ９及び２％のサルコシルに調
節した。３７°Ｃにて２時間培養した後、懸濁物をＴＥ
緩衝液で飽和された同容積のフェノールにより３回抽出
した。水相を回収し、次いでＴＥ緩衝液に対し透析した
。次いでＤＮＡを、最終０．２Ｍの酢酸ナトリウム若し
くは塩化リチウムと２倍容積のエタノールとの添加によ
り一２０°Ｃにで１２〜１６時間かけて沈澱させた。

ＤＮＡ残留物を７０％アルコールで３回濯ぎ、次いで王
Ｅ緩衝液に溶解させた。ＤＮＡウィルス溶液の純度を検
査し、かつその濃度をＵＶ分光光度測定により測定した
。

ウィルスの末端を、イー・コリ・クレノー断片のＤＮＡ
ポリメラーゼににって修復させた。

ウィルスのＤＮＡ３μ９を７５μでの容積にてイー・コ
リのＤＮＡポリメラーゼ［ベーリンガ・マンハイム・バ
＼イオケミカルス社、ＢＭＢカタログＮｏ。

１０１４５３１　］の７，５Ｕによって修復させた。こ
の修復緩衝剤はデオキシアゾンシンとデオキシアゾンシ
ンとグアノシンとチミジンとを４０μＭの濃度で含有し
、かつ５ｍＭのＭ　Ｑ　ＣＱ　２と１０ｍＭのβ−メル
カプトエタノールと１００μ！ｊ／ｄの牛アルブミン血
清とＩ　Ｑ　ｍＭのトリスＨ（ｌとを含有した（１）８
７．５）。

反応物を２５°Ｃにて１時間培養した。６５°Ｃにて１
時間後、反応物をフェノール飽和された０、１Ｍのトリ
ス（ｐ＋−ｒｙ、５）で抽出（）、次いで１容早の０．
３Ｍ酢１ｍと２倍容積の１００エタノールとの存在下で
沈澱させた。

（ｂ）　ｐＢＲ３２２ベクターのＤ　Ｎ　Ａの作成ｐＢ
Ｒ３２２のＤＮＡをマニアデス及びコールにより記載さ
れた方法［モレキュラ・クローニング：Ａ、ラボラトリ
−・マニュアル、コールド・スプリング・ハーバ−・ラ
ボラトリ−（１９８２）　］にしたがって作成した。Ｄ
ＢＲ３２２のＤＮＡ２．５μ９を、ＢＭＢ供給業者によ
り説明された条件下で５０μｅの容積における酵素のＤ
ＮＡ１８Ｕ／μ９を用いてｔ１１限酵索ＥＣ０ＲＶによ
り３７°Ｃで４時間切断した。ＤＮＡの切断を１％アガ
ロースゲルで証明した。次いで、ＤＮＡを子牛の腸から
得たアルカリホスファターゼによって脱燐酸した。次い
で２μｅのアルカリホスファターゼＢＭＢカタログＮ。

７１３０２３　（２２Ｕ　／μρ）を添加した。３７°
Ｃにて１時間培養した後、６５°Ｃにて４５分間培養す
ることにより反応を停止させた。フェノール飽和された
Ｑ、　１Ｍトリス（１）Ｈ７，５＞で抽出した後、水相
を０．３Ｍ酢酸塩の存在下にエタノールで沈澱させた。

（Ｃ）制限酵素ＥｃｏＲＶにより線状化させた沈澱及び
乾燥の後、ベクターのＤＮＡを４０ｎｃ＋／μρの濃度
で溶解させ、ウィルスのＤＮＡを１μ９／μｅの濃度で
溶解させた。結合は、製造業者にューイングランド・ビ
オラプス社）により説明された条件下で容積２５μｅに
て操作した。４℃にて１晩培養した後、混合物は大腸菌
（ＭＣ１０６１）を形質転換した［Ｍ、Ｊ、カサバダン
、メンッズ・イン・エンチモロシー（１９８３）　、第
１００巻、第２９３〜３０８頁］。

（ｄ＞競合細菌の形質転換 ハナハンにより記載された手順［マニアデス（１９８２
）　］にしたがって競合細菌を作成し、かつ２００μρ
づつのフラクションとして一７０’Ｃで保存した。３７
°Ｃで解凍した競合〒ｌ（Ｉ菌１００μｅへ、ウィルス
のＤＮＡとベクターｐＢＲ３２２とを含有する首記溶液
１μｅをＯ′Ｃを越えないように添加した。

Ｏ′Ｃにて１５分間培養し、次いで５〜３７°Ｃの熱シ
ョックを加えた後、９００μ２のＬＢ培地［１ｊ当りバ
クｌ−トリプトン（デイフコ社）　１０ｑと酵母抽出物
（７４７１社）５ｇとＮａ０４５ｇとよりなり、１２０
°Ｃにてオートクレーブ処理したちの］を添加した。組
換細菌は、１００μ９／ｒｎｌｌのアンピシリンを含有
するＬＢ寒天培地の皿で選択した。アンピシリン耐性の
２５３個のコロニーから、テトラυイクリン感受性の５
０個のコロニーを選択した。

（ｅ）組換細菌の微小分解及びＩ）ＢＲＪの取得テトラ
サイクリン感受性のこれら組換細菌のうち、１種のみが
ＥＣｏＲＶ部位にクローン化ウィルスのＤＮＡを有した
。各組換クローンのＬＢ培地における培養物（１，５ｍ
Ｍ＞から出発して、プラスミドＤＮＡをアルカリ法［マ
ニアデス、１９８２］にしたがって作成した。各ＤＮＡ
を制限酵素ＥＣＯＲ［によって切断した。１個のみのコ
ロニーが、クローン化の際に加害されたＥＣ０ＲＶに挿
入されたジュノニアデンンウィルスを有するｐＢＲ３２
２のＤＮＡに相当するプラスミドＤＮＡを有した。対応
のｐＢＲＪプラスミドを、水酸化す１〜リウム及びドデ
シル硫酸す１ヘリウムを用いる方法［マニアデス、１９
８２］によりＬＢ培地にて飽和培養物１ｅから多量に作
成した。制限酵素Ｂａｍｆ−１１、ｐｖｕ　　２　　、
　Ｂｉ２　　、　Ｎ、ｒｕ　　１　、ＡＣ；Ｃ１、ＰＶ
Ｌｌｌ、ＢＳｔＥ２．５ｐｈ１、ＥｃｏＲｌ、Ｈｉ　ｎ
ｄ３、ＲｓａＬ　ＢＱ（！　１による切断は、デンソウ
ィルスのＤＮＡが第３図に示した配向でクローン化する
際に破壊されたＥＣｏＲＶ部位に挿入されたことを証明
することができた。

（３）ジュノニア・デンソウィルスのＤＮＡの配列決定 ウィルスのＤＮＡの配列をサンガー法［サンガ、１９７
７］により大部分決定した。ｐＢＲ３２２の＠　ｉ　ｎ
ｄ３部位の側におけるウィルス１）ＢＲ３２２の接合は
、マキサム及びギルバートの方法によって配列決定した
。

（ａ）サンガー法 （１）ランダムクローン化 酵素法 ランダムクローン化を制限酵素：５ａｕ３ａ１、Ｘｈｏ
２、Ａ１２ｕ１、Ｈａｅ３、ＡＣＣｌで行なった。ウィ
ルスのＤＮＡは、ジ１ノニア・デンソウィルスのＤＮＡ
を頻繁に切断するこれらの制限酵素により切断して、１
０００ｐｂにて１００対の塩基（ｐｂ）の程度の断片を
得た。得られた断片を、酵素ＢａｍＨ１（Ｓａｕ３Ａ、
Ｘｈｏ２の切断）、酵素Ｓｍａ１（／１Ｌ１１、Ｈａｅ
３（７）切断）及ヒ酵素ＡＣＣ１（Ａｃｃｌの切断）に
より切断されたベクターＭ１３ｍｐ８及びＭ１３ｍｐ９
　［Ｊ。

メッシング及びビエラ、ジーン、第１９巻、第２５９〜
２６８頁（１９８２）　］でサブクローン化した。

音波法 ウィルスのＤＮＡを、５００ρｂの程度の断片が得られ
るまで音波処理した。得られた断片をイー・コリ・クレ
ノー断片のＤＮＡポリメラーゼにより上記方法で修復さ
せた。次いて、得られた断片を、酵素Ｓｍａ１により切
断されたベクターＭ１３ｍｒ）８及びＭ１３ｍｌでサブ
クローン化した。

（２）制限地図化により同定された断片のサブクローン
化 制限酵素で切断して得られた寸法２０００ｐｔ）未満の
同定された制限断片（第２図にあける制限地図化）につ
きザブクローン化を行なった。用いた制限酵素は次の通
りである：ＢａｍＨ１、ＥＣ０Ｒ１、Ｈｉ　ｎｄ３−Ｂ
ｓｔＥ２、ＢＳｔＥ２−ＢａｍＨｌ、ｆ３ｓｔＥ２−＠
　ｉ　ｎｄ３．１−１ｉｎｄ３−Ｐｖｕ２、Ｘｂａｌ−
ＢｓｔＥ２、Ｘｂａｌ、＠ａｅ３、ｐｖｕ２−Ｈａｅ３
、ＥｃｏＲｌ−Ｘｂａｌ、Ｘｂａｌ−ＢｓｔＥ２、Ｈａ
ｅ３−ＥｃｏＲｌ、Ｈａｅ３−ｘｂａｌ、ＥＣ０ＲＩ−
ＰＶＬＩ２、Ｈａｅ３−ＢＳｔＥ２゜上記制限酵素での
切断により得られた分子量１１０ｐｂ〜２０００ｐｂを
有する断片をサブクローン化させ、次いでプライマを用
いて順次に配列決定した［サンガ−（１９７７）　、プ
ロシーディング・ナショナル・アカデミ−・１ノ−イエ
ンス・ＵＳＡ、Ｍ７４巻、第５４６３頁；ヒギン（１９
８３）　、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−
・サイエンス・ＵＳＡ、第８０巻、第５４６３頁］。

（ｂ）マキサム及びギルバートの方法 ｐＢＲ３２２のＥＣｏＲｌ部位に近い３７５ｐｂの＠　
ｉ　ｎｄ３及び３ｓｔｅｌＩの断片は、サンが一法を用
いて配列決定しえないことが判明した。この断片の配列
は、Ｔ４ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ及びＡＴＰ３
２ｐでの標識又はＤＮＡポリメラーゼ・クレノー断片及
びＣｊＴ下ｐ３２ｐ若しくはｄＣＴＰＰ３２での標識［
マキサム及びキルバー１−］によりｔ」１ｎｄ３部位及
びＢＳｔＥ２部位から得た。反応物を４０％のホルムア
ミドの存在下にアクリルアミド変性ゲル（尿素）上で移
動ざぜた［サンガー及びカーボン（１９７８）　、ｌ−
、Ｅ、　Ｂ、　Ｓ。

レタース、第８７巻、第１０７頁］。

（Ｃ）配列の組織化 得られた配列をミクロパックス２型コンピユータに入力
した。これらをＲ，スタテンにより記載されたＤＢシス
テムのプログラムを用いて比較した［ヌクレイツク・ア
シッド・す！ナーヂ、第１２（１）巻、１９８７年６月
、第３８７〜３９５頁１゜ＶＡＸ／ＶＭＳの下で編集プ
ログラムＥ、ＤＩＴにより配列を編集した後、これら配
列をスタテンのＤＢＣＯＭＰプログラムによって比較し
、次いでこれらをプログラムＤＢＵＴＩ　Ｌによって組
織化した。ｊｑられた配列を第１図に示す。

テラ・リトラリス幼虫のトランスフェクション結果 （ａ）接種によるトランスフェクションの方法ＤＮＡ　
　Ｊ若しくはｐＢＲＪの種々異なる濃度を、ＤＥＡＥ−
デキストラン（發終２ｍｇ／ｍｌ）が添加された１Ｅ緩
衝液（１０ｍ旧〜リス１−（Ｃｆ２．１ｍＨＥＤＴＡ、
ｐＨ８，０）にてスポドプテラ・リトラリスの若い幼虫
（段階２若しくは３）に接種した。

（ｂ）幼虫の１ｉ！察 ｉ〜ランスフエクトした幼虫及び比較幼虫を個々に無菌
培地上で２５°Ｃにて培養した。

毎日二死滅幼虫を除去し、 ：ニンホシスの日を記録し、 ：ニンホシスの６日後に幼虫を取出した。

（Ｃ）トランスフェクト昆虫の管理 各個体をそれぞれ１ｄのＰＢＳ＋２％の窒化ナトリウム
に接種した。接種物を清澄化させ、かつウィルスの存在
をネズミにて作成されたジュノニア・デンソウィルス及
びペルオキシダーゼで標識したネズミの抗ＩｇＧに対し
測定された抗体を用いる間接的ＥＬＩＳＡ法により上澄
液で検査した。

成る種の試料については電子顕微鏡で検査した。

（ｄ）薩里 幼虫１匹当り３０ｎｇのＡＤＮ−Ｊ及び幼虫１匹当り５
６ｎｇのｐＢＲＪの濃度にてＤＮＡＪ若しくは１）ＢＲ
ＪのＤＮＡを接種することによるスポドプテラ・リトラ
リスの若い幼虫のトランスフェクションは、これら２種
の場合に８０％以上の感染比率をもたらした。デルタメ
トリン耐性のマダカスカン種のスポドプテラ・リトラリ
スの幼虫を］ヘランスフエク１−ｖることにより、匹敵
する結果が得られた。

ざらに、抽出緩衝剤ＴＥ又はＤＮＡ ｐＢＲ３２２のいずれかを３０ｎｇ〜１ｎｇ／幼虫１匹
の濃度で接種した比較ロットでは、感染が現われなかっ
た。殺虫性組成物の例 次の塩基を有するリポソーム： ホスファチジルコリン・・・・・・・・・５ｍｇホスフ
ァチジルセリン・・・・・・・・・５ｍｇコレステロー
ル・・・・・・・・・・・・・・・・・・２．５ｍｑ１
）ＢＲＪ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
・・・・・・・・・・・・・・・・・・２８μ９右呈に
する水・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
・・・・・・・・・・・・・・１ｍ１Ｋｐｎ１、Ｐｓｔ
ｌ、ＰｖｕＬ　　Ｓａ（！１、Ｓｍａｌ）によるジュノ
ニアのデンソウィルスにおけるゲノムの制限地図であり
、 制限酵素Ａｐａ　１．８ｇ１２、Ｃｌａ　１、Ｋｐｎ　
１　、　Ｐｓｔ　１、Ｐｖｕ　Ｉ　Ｘ５ａｌｉ　＆　Ｓ
ｍａ　１はジュノニアのデンソウィルスのゲノムに切除
部位を持たない。

第３図はｐＢＲＪの作成経路図である。

ゲノムの完全ヌクレオチド配列を示し、第２図は各種の
制限酵素（Ｈｉｎｄ３、ＰＶＵ２、Ｈａｅ２．１３ｓｔ
ｅ２、Ｂ　ａ　ｍ　ｌ−（。

ト１＋ｎｃ２　　、　　ＥＣ０Ｒ１、Ｈａｅ３　　、　
　Ｉ−１ｐ　ａ　　２　　、Ｈｈａｌ、Ａｐａ’ｌ、Ｂ
Ｑｆ２２、ＣＱａ、　１、第１Ａ図 ＡＡＡＴＡＴＣＴｒＧ　母り■Ｊ仇仏ＴＴＣＡＣＴＴＡ
ＡＣＡＧＡＧＧＴＣＭＣ（ＴＡＣＴＡＡＴＣＡＡＡＴＡ
ＧＡＣＧＡＡ　ＧＡＣＧＣＴＡＡＧＧ　ＡＡＣＡＣＧＡ
ＣＧＡ　ＡＧＣＡＴＡＣＧＡＴ　ＡＡＡＧＣＧＡＡＭＴ
ＡＡＴＡＡＴＩＴｒ　ＧＡＡＧＧＡＡＴＡＣＡＡＴｒＡ
ＣＣＡＧＡ　ＧＧＡＣＴＴＴＴＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡＡ
Ｃ第１Ｃ図 ＧＴＡＴＣＣＣＡＴＡ　ＡＣＣＡｍＡＴｒ　ＡＡＡＡＴ
ＧＴＡＡＴ　ＡＴｒＡＴＡＴ口’Ａ　ＣＴＣＭＴＡＡＡ
ＡＧＣＡＡＡＡＡ丁ＧＴ　ＣＡＴｒＧＧＡＴＧＴ　ＧＧ
ＴＴｒＣＡＡＴｒ　ＣＡＴＡＡＴＣＣ丁Ｔ　ＴＡＡＧＡ
ＡＴＧＧＣＧＣＡＧＣＡＴＴＣＣＡ（ＴｒＧＴＡＴｒＧ
　ＡＡＴＡ、ＡＴｒ（７ＡπＷπＡＡＡＡＧ　ＣＡＧＴ
ＴＴＣＡＴＡＧＣＣＡＴＡＴＡＴｒ　ＣＡＡＡＧＴＴＴ
Ｔ’ＣＴＴＧＡ（ＪｒＴＩ７　ＴｒＴＧＣＡＡＴＧＣＴ
ＧＧＣＣＡＴｒＧＴ第１Ｂ図 ＡＡＡ（ＴＣＴＴＴＣＡＧＡＴｒＣＡＣＣＧ　ＡＴＧＴ
ＣＡＧＡＧＧ　ＧＡＡＣＡＡＡＡＣＧ　ＴＡＡＡＥｒＣ
ＡＴＡＴｒＣＣＣＡＣＴＧ　ＣＴＡＣＴＡＧＴＧＣＡＣ
ＣＡ、ＩＡＡＴＡＴ　ＧＡＡＣＣＴＡＴＡＡ　ＣＴ、Ｇ
ＴＡＣＣＡＣＡＴｒＧＴＡＣＧＧＴ　ＡＡＴＧＧＡＩＩ
、ＩＡ　０ＣＴＴＧＧＴＡＡ　ＣＧ’１ＴｒＡＡＡＴＡ
　ＡＡＡＣＡＡＴＡＡＴ第１Ｄ図 ＡＴＡＴＡＡＣＴＧＧ　ＡＡＡＧＧＴＡＡ丁ＣＴＧＴＴ
ＴｒＧＴｒＴ　ＴＧＴＣＣＡＡＴＣＣＣＡＧＴＧ丁丁Ｃ
ＴＡＡＴｒｌ：ＴｒＣＣＡＴ　ＡＧＣＴＡＡＡＧＴＡ　
ＴＧＡＴ＋πＡＴＧＴσ口’ＣＴＣＣＡＣＡ　ＡＧＣＡ
ＡＴＡＡＴＣｍＧｃＡＴＧｃＴ　ＡＴ（ＴＣｍＹｒＡ　
（ＴＣＡＴＡＴＴ’ＧＣＴＡＴ（ＴＣＧＣＴＣＴＡＡＣ
ＡＧＴＴＧＣＧＴＡＴｒＧＣＣ（Ｚｌ　。

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. （１）感受性昆虫にデンソウィルス感染を生ぜしめるデ
   ンソウィルスの二本鎖若しくは一本鎖ＤＮＡの完全若し
   くは部分配列を含有することを特徴とする大腸菌にて複
   製しうる組換プラスミド。
2. （２）ジュノニア、ガレリア若しくはアグラウリスのデ
   ンソウィルスにおける二本鎖若しくは一本鎖ＤＮＡの完
   全若しくは部分配列を含有することを特徴とする請求項
   １記載のプラスミド。
3. （３）ジュノニアのデンソウィルス（＝Ｊ−ＤＮＶ）に
   おける二本鎖若しくは一本鎖ＤＮＡの完全若しくは部分
   配列を含有することを特徴とする請求項１記載のプラス
   ミド。
4. （４）Ｊ−ＤＮＶデンソウイルスにおけるウィルスゲノ
   ムの完全配列： 【遺伝子配列があります】 ［配列中、Ｘ及びＺはＡ若しくはＣ若しくはＧ若しくは
   Ｔ塩基を示し、ｎ及びｐはそれぞれ１〜５０及び１〜１
   ３０の間で変化しうる整数を示し、この数値は塩基Ｘ及
   びＺを考慮せず、Ｍは塩基Ａ若しくはＣを示し、かつＹ
   は塩基Ｃ若しくはＴを示す］。
5. （５）２つの末端「Ｘ」及び「Ｚ」が除去された請求項
   ４記載の配列に対応するクローン化デンソウィルスＪ−
   ＤＮＶにおけるウィルスＤＮＡの完全配列。
6. （６）請求項４記載のデンソウィルスＪ−ＤＮＶにおけ
   るウィルスゲノムの完全配列を含有することを特徴とす
   る請求項１記載のプラスミド。
7. （７）ガレリア・デンソウィルスの二本鎖若しくは一本
   鎖ＤＮＡの完全若しくは部分配列を含有することを特徴
   とする請求項１記載のプラスミド。
8. （８）プラスミドｐＢＲＪ。
9. （９）請求項１、２、３又は７記載のプラスミドにより
   形質転換されたことを特徴とする大腸菌宿主細菌。
10. （１０）請求項６記載のプラスミドにより形質転換され
    たことを特徴とする大腸菌宿主細菌。
11. （１１）ｐＢＲＪにより形質転換されたことを特徴とす
    る大腸菌宿主細菌。
12. （１２）加害性昆虫を生物学的に撲滅するための請求項
    １、２、３又は７記載のプラスミドの使用。
13. （１３）加害性昆虫を生物学的に撲滅するための請求項
    ６記載のプラスミドの使用。
14. （１４）加害性昆虫を生物学的に撲滅するためのプラス
    ミドｐＢＲＪの使用。
15. （１５）請求項１、２、３又は７記載のプラスミドを含
    有する殺虫性組成物。
16. （１６）請求項６記載のプラスミドを含有する殺虫性組
    成物。
17. （１７）プラスミドｐＢＲＪを含有する殺虫性組成物。