JPH022374A - アルカリプロテアーゼ遺伝子 - Google Patents
アルカリプロテアーゼ遺伝子Info
- Publication number
- JPH022374A JPH022374A JP63279401A JP27940188A JPH022374A JP H022374 A JPH022374 A JP H022374A JP 63279401 A JP63279401 A JP 63279401A JP 27940188 A JP27940188 A JP 27940188A JP H022374 A JPH022374 A JP H022374A
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- alkaline protease
- dna
- gene
- rna
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、アルカリプロテアーゼ遺伝子に関する。
〔従来の技術］
従来、黄麹菌の１種であるアスペルギルス・オリゼー（
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のアルカ
リプロテアーゼ遺伝子の構造については、全く未知であ
り、また、該遺伝子の単離すらされていないのが実情で
ある。
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のアルカ
リプロテアーゼ遺伝子の構造については、全く未知であ
り、また、該遺伝子の単離すらされていないのが実情で
ある。
アルカリプロテアーゼは、蛋白質又はその部分加水分解
物に作用して、ペプタイド結合を分解する加水分解酵素
であって、医薬、飲食品、洗剤等広範に用いられている
。
物に作用して、ペプタイド結合を分解する加水分解酵素
であって、医薬、飲食品、洗剤等広範に用いられている
。
本発明は、アルカリプロテアーゼ遺伝子を提供すること
を目的とするものである。
を目的とするものである。
〔課題を解決するための手段］
そこで、本発明者等は、アスペルギルス・オリゼー由来
のアルカリプロテアーゼ遺伝子について種々検討した結
果、アスペルギルス・オリゼー由来のアルカリプロテア
ーゼ遺伝子を初めて単離及び構造決定することに成功し
、本発明を完成した。
のアルカリプロテアーゼ遺伝子について種々検討した結
果、アスペルギルス・オリゼー由来のアルカリプロテア
ーゼ遺伝子を初めて単離及び構造決定することに成功し
、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、アスペルギルス属に属する微生物
に由来し、下記の制限酵素開裂地図で規定されるアルカ
リプロテアーゼ遺伝子であり、（式中、ＥはＥｃｏＲＩ
、ＡはＡｆｌｌｌ、 ＫはＫｐｎｌ。
に由来し、下記の制限酵素開裂地図で規定されるアルカ
リプロテアーゼ遺伝子であり、（式中、ＥはＥｃｏＲＩ
、ＡはＡｆｌｌｌ、 ＫはＫｐｎｌ。
ＸはＸｍｎ［、Ｓは５ａｉｌを示す）また本発明は第３
図に示されるアミノ酸配列をコードするアルカリプロテ
アーゼ遺伝子である。
図に示されるアミノ酸配列をコードするアルカリプロテ
アーゼ遺伝子である。
以下、本発明の詳細な説明する。
先ず、本発明の遺伝子のドナーとして用いられるアスペ
ルギルス・オリゼーとしては、例えば、アスペルギルス
・オリゼー（ＡＴＣＣ２０３８６）等が挙げられる。
ルギルス・オリゼーとしては、例えば、アスペルギルス
・オリゼー（ＡＴＣＣ２０３８６）等が挙げられる。
次いで、上記微生物を、特公昭４８−３８８７３号公報
記載の方法と全く同様にして培養し、培養物を得、該培
養物から常法、例えば、；慮過、遠心分離処理等により
アスペルギルス・オリゼーの菌体を得る。
記載の方法と全く同様にして培養し、培養物を得、該培
養物から常法、例えば、；慮過、遠心分離処理等により
アスペルギルス・オリゼーの菌体を得る。
上記アスペルギルス・オリゼーの菌体よりｍ−ＲＮＡを
調製するには、例えば、菌体の破砕の際、ガラスピーズ
及びフェノールを用いる以外は、例えば、モレキュラー
・クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）
、第１９６頁、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボ
ラトリ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ １（ａｒｂｏｒ
Ｌａｂ。
調製するには、例えば、菌体の破砕の際、ガラスピーズ
及びフェノールを用いる以外は、例えば、モレキュラー
・クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）
、第１９６頁、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボ
ラトリ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ １（ａｒｂｏｒ
Ｌａｂ。
ｒａ ｔｏｒｙ） （１９８２）及び分子遺伝学実験法
、小関冶男、志村令部、第６６〜６７頁（１９８３）記
載の方法等により得ることができる。
、小関冶男、志村令部、第６６〜６７頁（１９８３）記
載の方法等により得ることができる。
得られたｍ−ＲＮＡよりアルカリプロテアーゼをコード
するｍ−Ｒｆ’ＪＡ（以下、アルカリプロテアーゼｍ−
ＲＮＡという）を濃縮するには、例えば、バイオメディ
カル・リサーチ（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ）、第３巻、第５３４〜５４０頁（１９８２）記載
の方法により行なうことができる。
するｍ−Ｒｆ’ＪＡ（以下、アルカリプロテアーゼｍ−
ＲＮＡという）を濃縮するには、例えば、バイオメディ
カル・リサーチ（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ）、第３巻、第５３４〜５４０頁（１９８２）記載
の方法により行なうことができる。
なお、この際、アルカリプロテアーゼに対する抗アルカ
リプロテアーゼ血清を使用するのであるが、該血清は、
例えば、免疫化学、山村雄−１第４３〜５０頁（１９７
３）記載の方法により得ることができる。
リプロテアーゼ血清を使用するのであるが、該血清は、
例えば、免疫化学、山村雄−１第４３〜５０頁（１９７
３）記載の方法により得ることができる。
アルカリプロテアーゼｍ−ＲＮＡよりｃ−ＤＮＡを合成
するには、例えば、モル・セル・ハイオル（Ｍｏ１．Ｃ
ｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、）、第２巻、第１６１頁（１９８２
）及びジーン（Ｇｅｎｅ）、第２５巻、第２６３頁（１
９８３）記載の方法により行なうことができる。
するには、例えば、モル・セル・ハイオル（Ｍｏ１．Ｃ
ｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、）、第２巻、第１６１頁（１９８２
）及びジーン（Ｇｅｎｅ）、第２５巻、第２６３頁（１
９８３）記載の方法により行なうことができる。
次いで、このようにして得られたｃ−Ｄ Ｎ Ａをヘク
ターＤＮＡ、例えば、プラスミドｐＵｃ１１９ Ｄ Ｎ
Ａ（宝酒造・社・製）等に組み込み、種々の組み換え
体プラスミドＤＮＡを得、該ＤＮＡを用いて例えば、大
腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ） Ｄ Ｈ１（ＡＴＣＣ３３８４９
）、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ） ＨＢ １０１ （ＡＴＣ
Ｃ３３６９４）等をハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）の方法
〔ディーエヌエイ・クローニング（Ｄ Ｎ Ａ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ） 、第１巻、第１０９〜１３５頁（１９８５
） ）により形質転換し、種々の形質転換株を得る。
ターＤＮＡ、例えば、プラスミドｐＵｃ１１９ Ｄ Ｎ
Ａ（宝酒造・社・製）等に組み込み、種々の組み換え
体プラスミドＤＮＡを得、該ＤＮＡを用いて例えば、大
腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ） Ｄ Ｈ１（ＡＴＣＣ３３８４９
）、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ） ＨＢ １０１ （ＡＴＣ
Ｃ３３６９４）等をハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）の方法
〔ディーエヌエイ・クローニング（Ｄ Ｎ Ａ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ） 、第１巻、第１０９〜１３５頁（１９８５
） ）により形質転換し、種々の形質転換株を得る。
上記の種々な形質転換株よりアルカリ土類金属−ゼをコ
ードするｃ−ＤＮＡ（以下、アルカリプロテアーゼｃ−
Ｄ Ｎ Ａという）を検出するには、ハイブリダイゼー
ション・セレクション〔モレキュラー・クローニング（
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ） 、第３２９〜
３３３頁及び第３４４〜３４９頁、コールド・スプリン
グ・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
ｌ＋ａｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ） （１９８２年
川に上り検出することができる。
ードするｃ−ＤＮＡ（以下、アルカリプロテアーゼｃ−
Ｄ Ｎ Ａという）を検出するには、ハイブリダイゼー
ション・セレクション〔モレキュラー・クローニング（
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ） 、第３２９〜
３３３頁及び第３４４〜３４９頁、コールド・スプリン
グ・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
ｌ＋ａｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ） （１９８２年
川に上り検出することができる。
次いで、不完全なアルカリプロテアーゼｃ−ＤＮＡを１
２ｐを用いニックトランスレーション法（モレキ、ラー
、クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
）、第１０９〜１１２ 頁、コールド・スプリング・ハ
ーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｔｔ
ａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２年）、及
びジエイ・モル・パイオル（Ｊ、Ｍｏｌ。
２ｐを用いニックトランスレーション法（モレキ、ラー
、クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
）、第１０９〜１１２ 頁、コールド・スプリング・ハ
ーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｔｔ
ａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２年）、及
びジエイ・モル・パイオル（Ｊ、Ｍｏｌ。
Ｂｉｏｌ、）、第１１３巻、第２３７〜２５１頁（１９
７７） ）により標識したのち、該ｃ−ＤＮＡをプロー
ブとしてコロニーハイブリダイゼーション法［蛋白質、
核酸、酵素、第２６巻、第５７５〜５７９頁（１９８１
） ）によりプラスミドρＵＣ１１９ＤＮＡをベクター
として作成したｃ−ＤＮＡのシーンバンクのライブラリ
ーより１．１Ｋｂのアルカリプロテアーゼｃ−Ｄ Ｎ
Ａを含有するプラスミドＤＮＡを得ることができる。
７７） ）により標識したのち、該ｃ−ＤＮＡをプロー
ブとしてコロニーハイブリダイゼーション法［蛋白質、
核酸、酵素、第２６巻、第５７５〜５７９頁（１９８１
） ）によりプラスミドρＵＣ１１９ＤＮＡをベクター
として作成したｃ−ＤＮＡのシーンバンクのライブラリ
ーより１．１Ｋｂのアルカリプロテアーゼｃ−Ｄ Ｎ
Ａを含有するプラスミドＤＮＡを得ることができる。
そして、このようにして得られた組み換え体プラスミド
ＤＮＡよりアスペルギルス・オリゼー由来のアルカリプ
ロテアーゼをコードする遺伝子（以下、アルカリプロテ
アーゼ遺伝子という）を含有するＤＮＡを得るには、該
プラスミドＤＮＡに、制限酵素、例えばＥｃｏＲＩを温
度３０〜４０°Ｃ１好ましくは３７゛Ｃで１〜２４時間
、好ましくは２時間作用させ、得られた反応終了液を、
アガロースゲル電気泳動法〔モレキュラー・クローニン
グ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第１５０
頁、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ） （１９Ｂ２）記載）によりアスペルギルス・
オリゼー由来のアルカリプロテアーゼ遺伝子を含有する
ＤＮＡを得ることができる。
ＤＮＡよりアスペルギルス・オリゼー由来のアルカリプ
ロテアーゼをコードする遺伝子（以下、アルカリプロテ
アーゼ遺伝子という）を含有するＤＮＡを得るには、該
プラスミドＤＮＡに、制限酵素、例えばＥｃｏＲＩを温
度３０〜４０°Ｃ１好ましくは３７゛Ｃで１〜２４時間
、好ましくは２時間作用させ、得られた反応終了液を、
アガロースゲル電気泳動法〔モレキュラー・クローニン
グ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第１５０
頁、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ） （１９Ｂ２）記載）によりアスペルギルス・
オリゼー由来のアルカリプロテアーゼ遺伝子を含有する
ＤＮＡを得ることができる。
そして、このアルカリプロテアーゼ遺伝子の塩基配列の
決定を実施例の第９項目に示すような方法によって行な
い（第２図参照）、ついで、前記塩基配列を有する遺伝
子によって翻訳されるポリペブタイドのアミノ酸配列を
確定する（第３図参照）。
決定を実施例の第９項目に示すような方法によって行な
い（第２図参照）、ついで、前記塩基配列を有する遺伝
子によって翻訳されるポリペブタイドのアミノ酸配列を
確定する（第３図参照）。
このようにして確定されたアミノ酸配列をコードする遺
伝子が本発明の遺伝子である。
伝子が本発明の遺伝子である。
上述したことから明らかな如く、本発明によれば、本発
明アルカリプロテアーゼ遺伝子の組み込まれた組み換え
体ＤＮＡを含む、例えば微生物を培地に培養することに
より、極めて短期間のうちに、アルカリプロテアーゼを
効率よく得ることができ、また上記遺伝子は、蛋白質工
学用試料と用いることができるので本発明は産業上極め
て有用なものである。
明アルカリプロテアーゼ遺伝子の組み込まれた組み換え
体ＤＮＡを含む、例えば微生物を培地に培養することに
より、極めて短期間のうちに、アルカリプロテアーゼを
効率よく得ることができ、また上記遺伝子は、蛋白質工
学用試料と用いることができるので本発明は産業上極め
て有用なものである。
以下、本発明を実施例を挙げて更に詳細に説明する。
実施例
黄麹菌アスペルギルス
由来のアルカリプロテアーゼｃ− Ｄ Ｎ Ａのクロー
ニング １、菌体の取得 黄麹菌アスペルギルス・オリゼー（ＡＴＣＣ ２０３８
６）の胞子（１．２ｘｌＯ” ＠）を、アルカリプロテ
アーゼ生産培地〔３％（Ｗ／Ｖ）加熱、加圧膨化処理し
た脱脂大豆、３％（Ｗ／Ｖ）Ｋ）１２ＰＯ４ ） ５０
ｍｌに接種し、恒温振盪機（大洋科学工業・社・製，Ｍ
−１００’）を用いて１２Ｏｒ．ｐ．ｍ． 、温度３０
゛Ｃで４５時間振盪培養を行ない培養物を得、常法によ
りこの培養物を濾過して菌体Ｌｏｇを得た。
ニング １、菌体の取得 黄麹菌アスペルギルス・オリゼー（ＡＴＣＣ ２０３８
６）の胞子（１．２ｘｌＯ” ＠）を、アルカリプロテ
アーゼ生産培地〔３％（Ｗ／Ｖ）加熱、加圧膨化処理し
た脱脂大豆、３％（Ｗ／Ｖ）Ｋ）１２ＰＯ４ ） ５０
ｍｌに接種し、恒温振盪機（大洋科学工業・社・製，Ｍ
−１００’）を用いて１２Ｏｒ．ｐ．ｍ． 、温度３０
゛Ｃで４５時間振盪培養を行ない培養物を得、常法によ
りこの培養物を濾過して菌体Ｌｏｇを得た。
２、ｍ−ＲＮＡの取得
項目１で得られた菌体１０ｇを、２０ｍｌのグアニジン
イソチオシアネート溶液（６Ｍグアニジンイソチオシア
ネート／３７．５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７、０
）１０．７５％（Ｗ／Ｖ） Ｎ − ラウｌ：ｌ イｔ
Ｌｔサルコシンナトリウム１０． １５Ｍ βーメルカ
プトエタノール〕に添加したものを、カップ型ブレンダ
ー（日本精機製作所・社・製）に入れ、更に、１０ｇの
ガラスピーズ（直径０．５ｍｍ）を添加し、１０，００
０ｒ，ｐ．ｍ，で５分間処理したのち、また更に、１０
ｍｌの水飽和フェノールを添加し、１０．００Ｏｒ．ｐ
．ｍ，で１０分間処理して菌体を破砕処理し、破砕物を
得た。
イソチオシアネート溶液（６Ｍグアニジンイソチオシア
ネート／３７．５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７、０
）１０．７５％（Ｗ／Ｖ） Ｎ − ラウｌ：ｌ イｔ
Ｌｔサルコシンナトリウム１０． １５Ｍ βーメルカ
プトエタノール〕に添加したものを、カップ型ブレンダ
ー（日本精機製作所・社・製）に入れ、更に、１０ｇの
ガラスピーズ（直径０．５ｍｍ）を添加し、１０，００
０ｒ，ｐ．ｍ，で５分間処理したのち、また更に、１０
ｍｌの水飽和フェノールを添加し、１０．００Ｏｒ．ｐ
．ｍ，で１０分間処理して菌体を破砕処理し、破砕物を
得た。
このようにして得られた破砕物を冷却遠心機（日立１機
・社・製、１８ＰＲ−５２）を用いて５，０ＯＯｒ、ｐ
。
・社・製、１８ＰＲ−５２）を用いて５，０ＯＯｒ、ｐ
。
ｍ、で１０分間遠心分離処理して、菌体破砕液２０−を
得た。
得た。
次いで、超遠心分離機用チューブ（日立１機・社・製）
４木に、予め１，２−の５．７Ｍの塩化セシウム溶液を
夫々重層し、その上に、上記菌体破砕液を重層するよう
に夫々分注し、超遠心分離機（日立１機・社・製、５Ｃ
Ｐ５５Ｈ）を用いて温度１５°Ｃ１３０、００Ｏｒ、ｐ
、ｍ、で１６時間遠心分離して沈澱物を得た。
４木に、予め１，２−の５．７Ｍの塩化セシウム溶液を
夫々重層し、その上に、上記菌体破砕液を重層するよう
に夫々分注し、超遠心分離機（日立１機・社・製、５Ｃ
Ｐ５５Ｈ）を用いて温度１５°Ｃ１３０、００Ｏｒ、ｐ
、ｍ、で１６時間遠心分離して沈澱物を得た。
得られた沈澱物を、冷７０％（Ｖ／Ｖ）エタノールを用
いて洗浄したものを、１０ｍＭ ）リス緩衝液（１０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）１５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ／ １％ドデシル硫酸ナトリウム〕４ｒｎｌに懸濁し
たものに、同量のｎ−ブタノール及びクロロフォルムを
４対１（容量比）となる如く混合したものを添加して抽
出し、常法により３．０００ｒ、２０ｍ、で１０分間遠
心分離し、水層及び有機溶媒層に分離し、この有機溶媒
層に上記１０ｍＭ ）リス緩衝液４Ｕｉを添加し、上記
抽出及び分離操作を行なう操作を２回繰り返して得られ
た水層に、１７１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，
２）及び２倍量の冷エタノールを添加したものを温度−
２０°Ｃで２時間放置したのち、常法により８．０００
ｒ、ｐ、ｍ、で２０分間遠心分離し、ＲＮＡを沈澱させ
、得られたＲＮＡを４−の水に溶解し、上記エタノール
沈澱操作を行なったのち、得られたＲＮＡを１ｍｆの水
に溶解し、１２ｍｇのＲＮＡを得た。
いて洗浄したものを、１０ｍＭ ）リス緩衝液（１０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）１５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ／ １％ドデシル硫酸ナトリウム〕４ｒｎｌに懸濁し
たものに、同量のｎ−ブタノール及びクロロフォルムを
４対１（容量比）となる如く混合したものを添加して抽
出し、常法により３．０００ｒ、２０ｍ、で１０分間遠
心分離し、水層及び有機溶媒層に分離し、この有機溶媒
層に上記１０ｍＭ ）リス緩衝液４Ｕｉを添加し、上記
抽出及び分離操作を行なう操作を２回繰り返して得られ
た水層に、１７１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，
２）及び２倍量の冷エタノールを添加したものを温度−
２０°Ｃで２時間放置したのち、常法により８．０００
ｒ、ｐ、ｍ、で２０分間遠心分離し、ＲＮＡを沈澱させ
、得られたＲＮＡを４−の水に溶解し、上記エタノール
沈澱操作を行なったのち、得られたＲＮＡを１ｍｆの水
に溶解し、１２ｍｇのＲＮＡを得た。
このＲＮＡ中よりｍ−ＲＮＡを選択するために、１２ｍ
ｇのＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）−セルロースにューイン
グランドバイオラボ・社・製）カラムクロマトグラフィ
ーにかけた。
ｇのＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）−セルロースにューイン
グランドバイオラボ・社・製）カラムクロマトグラフィ
ーにかけた。
カラムとして２．５−テルモシリンジ（テルモ・社・製
）を用い、樹脂０．５ｇは、溶出緩衝液（１０ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐ Ｈ７，６） ／ １ｍＭ ＥＤＴ
Ａ／ ０．１％（Ｗ／Ｖ） ドデシル硫酸ナトリウム
］で膨潤させたのち、カラムに充填し、結合緩衝液（１
０ｍＭ ）リス塩＃（ｐＨ７，６）／ １ｍＭ ＥＤＴ
Ａ／ ０．４ Ｍ ＮａＣ１／ ｏ、 １％ドデシル硫
酸ナトリウム〕で平衡化したものである。
）を用い、樹脂０．５ｇは、溶出緩衝液（１０ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐ Ｈ７，６） ／ １ｍＭ ＥＤＴ
Ａ／ ０．１％（Ｗ／Ｖ） ドデシル硫酸ナトリウム
］で膨潤させたのち、カラムに充填し、結合緩衝液（１
０ｍＭ ）リス塩＃（ｐＨ７，６）／ １ｍＭ ＥＤＴ
Ａ／ ０．４ Ｍ ＮａＣ１／ ｏ、 １％ドデシル硫
酸ナトリウム〕で平衡化したものである。
１２■のＲＮＡに、同量の緩衝液〔１０ｍＭトリス塩酸
（ｐＨ７，６） ７１ｍＭ ＥＤＴＡ／ ０．８ Ｍ
ＮａＣ１／ ０．１％ドデシル硫酸ナトリウム〕を添加
し、温度６５゛ｃで１０分間加熱処理し、水中で急冷し
、オリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムにかけたのち、結
合緩衝液で樹脂を洗浄し、未結合のｒ−ＲＮＡ及びｔ−
ＲＮ Ａを完全に洗浄し、更に、溶出緩衝液でｍ−ＲＮ
Ａを溶出し、９０ｕｇのｍ−ＲＮ Ａを得た。
（ｐＨ７，６） ７１ｍＭ ＥＤＴＡ／ ０．８ Ｍ
ＮａＣ１／ ０．１％ドデシル硫酸ナトリウム〕を添加
し、温度６５゛ｃで１０分間加熱処理し、水中で急冷し
、オリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムにかけたのち、結
合緩衝液で樹脂を洗浄し、未結合のｒ−ＲＮＡ及びｔ−
ＲＮ Ａを完全に洗浄し、更に、溶出緩衝液でｍ−ＲＮ
Ａを溶出し、９０ｕｇのｍ−ＲＮ Ａを得た。
３６アル力リプロテアーゼｍ−ＲＮＡの濃縮次に、ショ
糖密度勾配遠心分離法によりアルカリプロテアーゼｍ−
ＲＮＡを濃縮した。
糖密度勾配遠心分離法によりアルカリプロテアーゼｍ−
ＲＮＡを濃縮した。
１０〜２５％（Ｗ／Ｖ）のシーＩＦｕ密度勾配は、ベッ
クマン・社・製のローターＳ Ｗ４１用ポリアロマチュ
ーブに４０％（Ｗ／Ｖ）ショ糖液（５０ｍＭ ）リス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）／２０ｍＭ ＮａＣ１７１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ／４０％（Ｗ／Ｖ）ショ糖）０．５＋ｍｃ
を入れ、その上に２．４ｄずつ２５％（Ｗ／Ｖ） 、２
０％（Ｗ／Ｖ） 、１５％（Ｗ／Ｖ）及び１０％（Ｗ／
Ｖ）のショ糖液を重層し、温度４°Ｃで２４時間放置す
ることにより作製した。このショ糖密度勾配に、ｍＲＮ
Ａ５Ｑμｇを重層し、べ７クマン・社・製の５Ｗ４１０
−ターを用い、常法により３０．００Ｏｒ、ｐ、ｍ、、
温度１８°Ｃで１８時間遠心分離を行なった。遠心分離
操作ののち、０．５ ｍｌずつ分画し、エタノール沈澱
法によりｍ−ＲＮＡを回収し、１０μｌの水に溶解した
。
クマン・社・製のローターＳ Ｗ４１用ポリアロマチュ
ーブに４０％（Ｗ／Ｖ）ショ糖液（５０ｍＭ ）リス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）／２０ｍＭ ＮａＣ１７１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ／４０％（Ｗ／Ｖ）ショ糖）０．５＋ｍｃ
を入れ、その上に２．４ｄずつ２５％（Ｗ／Ｖ） 、２
０％（Ｗ／Ｖ） 、１５％（Ｗ／Ｖ）及び１０％（Ｗ／
Ｖ）のショ糖液を重層し、温度４°Ｃで２４時間放置す
ることにより作製した。このショ糖密度勾配に、ｍＲＮ
Ａ５Ｑμｇを重層し、べ７クマン・社・製の５Ｗ４１０
−ターを用い、常法により３０．００Ｏｒ、ｐ、ｍ、、
温度１８°Ｃで１８時間遠心分離を行なった。遠心分離
操作ののち、０．５ ｍｌずつ分画し、エタノール沈澱
法によりｍ−ＲＮＡを回収し、１０μｌの水に溶解した
。
次に、ｍ−ＲＮＡにコードされている蛋白質を調べるこ
とにより、アルカリプロテアーゼｍ−ＲＮＡが濃縮され
ている両分の同定を行なった。分画したＲＮＡＩμ！、
ウサギ網状赤血球ライセード（アマジャム・社・製）９
μ！及び（ｆｆｓ３）メチオニン１μｍ（アマジャム・
社・製）を混合し、温度３０°Ｃで３０分間反応させた
ものに、１５０μｉＯＮ Ｅ Ｔ ｉｌｌ液液１５０ｍ
Ｍ ＮａＣ１１５ｍＭ ＥＤＴＡｌｏ、０２％（匈／Ｖ
）ＮａＮ：＋／ ２０ｍＭ ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７，４）１０゜０５％（Ｗ／Ｖ）ノニデットＰ−４０（
ベセスダリサーチラボラトリー・社・製、界面活性剤）
〕を添加し、更に、１μｌの抗アルカリプロテアーゼ血
清（後述のようにして調製したもの。）を添加し、温度
４°Ｃで１８時間放置したものに、１０ ｍｇのプロテ
ィンＡセファロース（ファルマシア・社・製）を添加し
、温度２０°Ｃで３０分間放置したものを、常法により
１２，０ＯＯｒ、ｐｏｍ、で１分間遠心分離処理し、樹
脂、すなわち、上記プロティンＡセファロースを回収し
た。
とにより、アルカリプロテアーゼｍ−ＲＮＡが濃縮され
ている両分の同定を行なった。分画したＲＮＡＩμ！、
ウサギ網状赤血球ライセード（アマジャム・社・製）９
μ！及び（ｆｆｓ３）メチオニン１μｍ（アマジャム・
社・製）を混合し、温度３０°Ｃで３０分間反応させた
ものに、１５０μｉＯＮ Ｅ Ｔ ｉｌｌ液液１５０ｍ
Ｍ ＮａＣ１１５ｍＭ ＥＤＴＡｌｏ、０２％（匈／Ｖ
）ＮａＮ：＋／ ２０ｍＭ ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７，４）１０゜０５％（Ｗ／Ｖ）ノニデットＰ−４０（
ベセスダリサーチラボラトリー・社・製、界面活性剤）
〕を添加し、更に、１μｌの抗アルカリプロテアーゼ血
清（後述のようにして調製したもの。）を添加し、温度
４°Ｃで１８時間放置したものに、１０ ｍｇのプロテ
ィンＡセファロース（ファルマシア・社・製）を添加し
、温度２０°Ｃで３０分間放置したものを、常法により
１２，０ＯＯｒ、ｐｏｍ、で１分間遠心分離処理し、樹
脂、すなわち、上記プロティンＡセファロースを回収し
た。
回収した樹脂を、２００μｌのＮＥＴｌ！街液で３回洗
浄し、この樹脂に、４０μ！の５ＤＳ−ＰＡＧＥ用サン
プル緩衝液（６２，５ｍＭ ）リス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ６，８） ／１０％（Ｖ／Ｖ）グ’Ｊ セロ）Ｌｔ／
２ ％ （Ｗ／Ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム１５％（
Ｖ／Ｖ）メルカプトエタノール１０．０２％（Ｗ／Ｖ）
ブロムフェノールブルー〕を添加し、温度１００°Ｃで
３分間煮沸し、常法により１２．００Ｏｒ、ｐｏｍ、で
１分間遠心分離処理し、上清を回収し、全量を１２％（
Ｗ／Ｖ） ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア
ミドゲルに乗せた。
浄し、この樹脂に、４０μ！の５ＤＳ−ＰＡＧＥ用サン
プル緩衝液（６２，５ｍＭ ）リス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ６，８） ／１０％（Ｖ／Ｖ）グ’Ｊ セロ）Ｌｔ／
２ ％ （Ｗ／Ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム１５％（
Ｖ／Ｖ）メルカプトエタノール１０．０２％（Ｗ／Ｖ）
ブロムフェノールブルー〕を添加し、温度１００°Ｃで
３分間煮沸し、常法により１２．００Ｏｒ、ｐｏｍ、で
１分間遠心分離処理し、上清を回収し、全量を１２％（
Ｗ／Ｖ） ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア
ミドゲルに乗せた。
ゲル電気泳動は、ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）の方法（
ネーチュアー（Ｎａ ｔｕｒｅ）、第２２７頁、第６８
０頁（１９７０，） ）で行ない、泳動したのちのゲル
は、１０％（Ｖ／Ｖ）の酢酸に３０分間浸漬し、蛋白質
を固定したのち、水に３０分間浸漬し、更に、１Ｍサリ
チル酸ナトリウム溶液に３０分間浸漬し、乾燥して乾燥
ゲルを得、Ｘ線フィルム （フジ写真フィルム・社・製
、ＲＸ）を用いてフルオログラフィーを行なった。
ネーチュアー（Ｎａ ｔｕｒｅ）、第２２７頁、第６８
０頁（１９７０，） ）で行ない、泳動したのちのゲル
は、１０％（Ｖ／Ｖ）の酢酸に３０分間浸漬し、蛋白質
を固定したのち、水に３０分間浸漬し、更に、１Ｍサリ
チル酸ナトリウム溶液に３０分間浸漬し、乾燥して乾燥
ゲルを得、Ｘ線フィルム （フジ写真フィルム・社・製
、ＲＸ）を用いてフルオログラフィーを行なった。
以上の操作により、アルカリプロテアーゼｍ−ＲＮＡの
存在する画分のＲＮＡを用いた場合にのみ、アルカリプ
ロテアーゼ蛋白質のバンドがＸ線フィルム上に認められ
、アルカリプロテアーゼｍ−ＲＮＡの濃縮されている両
分が同定できた。
存在する画分のＲＮＡを用いた場合にのみ、アルカリプ
ロテアーゼ蛋白質のバンドがＸ線フィルム上に認められ
、アルカリプロテアーゼｍ−ＲＮＡの濃縮されている両
分が同定できた。
４、抗血清の調製
精製アルカリプロテアーゼに対するウサギの抗アルカリ
プロテアーゼ血清は、以下の方法により調製した。
プロテアーゼ血清は、以下の方法により調製した。
４０ｍｇ／ｍｆ濃度のアルカリプロテアーゼ溶液０．７
−を、等量のフロイント（Ｆｒｅｕｎｄ）完全アジュバ
ントで懸濁したもの２８■を、抗原として体重２ ｋｇ
の日本内色種ウサギの指軍部に投与し、飼育２週間経過
したのち、初回と同量の抗原を背部皮肉へ投与し、更に
、飼育１週間経過したのち、同様の操作を行ない、また
更に、飼育１週間後全採血を行なった。
−を、等量のフロイント（Ｆｒｅｕｎｄ）完全アジュバ
ントで懸濁したもの２８■を、抗原として体重２ ｋｇ
の日本内色種ウサギの指軍部に投与し、飼育２週間経過
したのち、初回と同量の抗原を背部皮肉へ投与し、更に
、飼育１週間経過したのち、同様の操作を行ない、また
更に、飼育１週間後全採血を行なった。
そして、得られた血液を、温度４°Ｃで１８時間放置し
たものを、常法により３．００Ｏｒ、ｐｏｍ、で１５分
間遠心分離し、上滑として抗アルカリプロテアーゼ血清
を得た。
たものを、常法により３．００Ｏｒ、ｐｏｍ、で１５分
間遠心分離し、上滑として抗アルカリプロテアーゼ血清
を得た。
５、ｃ−ＤＮＡρ合成
ｃ−ＤＮＡの合成は、アマジャム・社・製キットを用い
て行なったものである。
て行なったものである。
上述の如くして得られたｍ−ＲＮ Ａ １．６μｇを用
いてアマジャム社の指示するモル・セル・パイオル・（
Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ Ｒ４ｏｔ、）、第２巻、第１６１頁
（１９８２）及びジーン（Ｇｅｎｅ）、第２５巻、第２
６３頁（１９８３）記載の方法に従い行なった結果、１
６０ｎｇの２本ｊＪｃ−ＤＮＡが得られた。
いてアマジャム社の指示するモル・セル・パイオル・（
Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ Ｒ４ｏｔ、）、第２巻、第１６１頁
（１９８２）及びジーン（Ｇｅｎｅ）、第２５巻、第２
６３頁（１９８３）記載の方法に従い行なった結果、１
６０ｎｇの２本ｊＪｃ−ＤＮＡが得られた。
このようにして得たｃ−Ｄ Ｎ Ａ １６０ｎｇに、ア
マジャム・社・製ｃ−Ｄ Ｎ Ａクローニングキッドを
用い、アマジャム社の指示する方法により制限酵素Ｅｃ
。
マジャム・社・製ｃ−Ｄ Ｎ Ａクローニングキッドを
用い、アマジャム社の指示する方法により制限酵素Ｅｃ
。
Ｒ１切断部位のメチル化を行ない、更にｃ−Ｄ Ｎ Ａ
の両端にＥｃｏＲＩ リンカ−を付着させた。
の両端にＥｃｏＲＩ リンカ−を付着させた。
６、ｃ−ＤＮＡバンクの作製
プラスミドｐＵｃ１１９ＤＮＡ （宝酒造・社・製）１
００ｎｇを、８μρの水に溶解したものに、１μｌのＭ
ｅｄ緩衝液（１００ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，５）／１００ｍＭ ＭｇＣＩｚ／１０ｍＭジチオ
スレイトール１５００ｍＭ ＮａＣ１：１を添加したの
ち、更に、これに、１０ユニツト （１μｌ）の制限酵
素１並Ｒ１（宝酒造・社・製）を添加し、温度３７°Ｃ
で２時間切断処理を行なった。
００ｎｇを、８μρの水に溶解したものに、１μｌのＭ
ｅｄ緩衝液（１００ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，５）／１００ｍＭ ＭｇＣＩｚ／１０ｍＭジチオ
スレイトール１５００ｍＭ ＮａＣ１：１を添加したの
ち、更に、これに、１０ユニツト （１μｌ）の制限酵
素１並Ｒ１（宝酒造・社・製）を添加し、温度３７°Ｃ
で２時間切断処理を行なった。
次いで、この切断処理物に、１μｌのＩＭ トリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ８，０）及び０．３ユニツト （１μｌ
）のアルカリフォスファターゼ（宝酒造・社・製）を添
加し、温度６５°Ｃで１時間酵素反応処理し、切断処理
物の両端の脱リン酸化を行ない、これに、１２μｌの水
飽和フェノールを添加して除蛋白を行なったのち、回収
した水層に、１μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，８
）及び２６μｌの冷エタノールを夫々添加し、温度−７
０″Ｃで１５分間放置し、微量遠心機〔■トミー精工、
ＭＲＸ−１５０１を用い、１２．００Ｏｒ、ｐ、ｍ、で
５分間遠心分離処理を行ないＤＮＡを回収した。
酸緩衝液（ｐＨ８，０）及び０．３ユニツト （１μｌ
）のアルカリフォスファターゼ（宝酒造・社・製）を添
加し、温度６５°Ｃで１時間酵素反応処理し、切断処理
物の両端の脱リン酸化を行ない、これに、１２μｌの水
飽和フェノールを添加して除蛋白を行なったのち、回収
した水層に、１μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，８
）及び２６μｌの冷エタノールを夫々添加し、温度−７
０″Ｃで１５分間放置し、微量遠心機〔■トミー精工、
ＭＲＸ−１５０１を用い、１２．００Ｏｒ、ｐ、ｍ、で
５分間遠心分離処理を行ないＤＮＡを回収した。
このようにして得られた制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、
かつ両端を脱リン酸化したプラスミドベクターｐＵｃ１
１９ＤＮＡ １１００ｎと、項目５で調製したＣ−Ｄ
Ｎ Ａ １６０μｇを混合したものを、８μｌの水に懸
濁したのち、これに、１μ尼のライゲーション緩衝液（
２０ｍＭ ＭｇＣ！、／６６ｍＭ ）リス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７，６）／ １ ｍＭ ＡＴＰ／１５ｍＭジチオ
スレイトール）を添加したものに、１ユニツト （１ｕ
℃）のＴ４ＤＮＡリガーゼ（全酒造・社・製））を添加
し、温度１６°Ｃで１６時間放置し、プラスミドベクタ
ーＤＮＡ及びｃ−ＤＮＡのライゲーションを行ない反応
物を得た。
かつ両端を脱リン酸化したプラスミドベクターｐＵｃ１
１９ＤＮＡ １１００ｎと、項目５で調製したＣ−Ｄ
Ｎ Ａ １６０μｇを混合したものを、８μｌの水に懸
濁したのち、これに、１μ尼のライゲーション緩衝液（
２０ｍＭ ＭｇＣ！、／６６ｍＭ ）リス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７，６）／ １ ｍＭ ＡＴＰ／１５ｍＭジチオ
スレイトール）を添加したものに、１ユニツト （１ｕ
℃）のＴ４ＤＮＡリガーゼ（全酒造・社・製））を添加
し、温度１６°Ｃで１６時間放置し、プラスミドベクタ
ーＤＮＡ及びｃ−ＤＮＡのライゲーションを行ない反応
物を得た。
この反応物を用いて、ハナハン（Ｉｌａｎａｈａｎ）の
方法〔ディーエヌエイ・クローニング（ＤＮＡ Ｃ１゜
ｎｉｎｇ） 、第１巻、第１０９〜１３５頁（１９８５
） ）により大腸菌ＤＨＩ株（ＡＴＣＣ３３８４９）を
形質転換し、プラスミドｐＵｃ１１９ Ｄ Ｎ Ａをベ
クターとしたｃ−ＤＮＡバンクを作製した。
方法〔ディーエヌエイ・クローニング（ＤＮＡ Ｃ１゜
ｎｉｎｇ） 、第１巻、第１０９〜１３５頁（１９８５
） ）により大腸菌ＤＨＩ株（ＡＴＣＣ３３８４９）を
形質転換し、プラスミドｐＵｃ１１９ Ｄ Ｎ Ａをベ
クターとしたｃ−ＤＮＡバンクを作製した。
７、アルカリプロテアーゼｃ−Ｄ Ｎ Ａの断片の検索
ハイブリダイゼーション・セレクション〔モレキュラー
・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
）、第３２９ 頁、コールド・スプリング・ハーバ−・
ラボラトリ−（１９８２） ）に従ってアルカリプロテ
アーゼｃ−Ｄ Ｎ Ａの検索を行なった。以下に、詳述
する。
ハイブリダイゼーション・セレクション〔モレキュラー
・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
）、第３２９ 頁、コールド・スプリング・ハーバ−・
ラボラトリ−（１９８２） ）に従ってアルカリプロテ
アーゼｃ−Ｄ Ｎ Ａの検索を行なった。以下に、詳述
する。
項目６で得られたｃ−ＤＮＡバンクより任意な大腸菌７
０株を選び夫々について以下の操作を行なった。モレキ
ュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ１Ｃ１
ｏ−ｎ１ｎ 、第８６Ｅ４、コールド・スプリング・バ
ーバー・ラボラトリ−（１９Ｂ２）記載の方法により、
ｃ−ＤＮＡバンク中の大腸菌から組み換え体プラスミド
ＤＮＡ５００μｇを夫々得た。このうち１００μｇを、
水２００μ！に溶解し、温度１００°Ｃで１０分間放置
したのち、水中に移して急冷したものに、２００μ２の
１Ｍ水酸化ナトリウムを添加し、室温にて２０分間放置
し、組み換え体プラスミドＤＮＡの変性液を得た。
０株を選び夫々について以下の操作を行なった。モレキ
ュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ１Ｃ１
ｏ−ｎ１ｎ 、第８６Ｅ４、コールド・スプリング・バ
ーバー・ラボラトリ−（１９Ｂ２）記載の方法により、
ｃ−ＤＮＡバンク中の大腸菌から組み換え体プラスミド
ＤＮＡ５００μｇを夫々得た。このうち１００μｇを、
水２００μ！に溶解し、温度１００°Ｃで１０分間放置
したのち、水中に移して急冷したものに、２００μ２の
１Ｍ水酸化ナトリウムを添加し、室温にて２０分間放置
し、組み換え体プラスミドＤＮＡの変性液を得た。
次いで、このようにして得た変性液に、２００μｌの中
和液〔１Ｍ塩化ナトリウム１０．３Ｍクエン酸ナトリウ
ム１０．５Ｍ１−リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８゜０）／Ｉ
Ｍ塩酸〕をすばやく添加、混和したのち、氷中へ移して
急冷した。この溶液を、直径５ ｍｍの円形ニトロセル
ロースフィルター（ミリポア・社・製、カタログナンバ
ー１（ＡＷＰ ０２５００）を用いて濾過し、変性した
組み換え体プラスミドＤＮＡをニトロセルロースフィル
ター上に吸着させたものを、常法により風乾したのち、
６ Ｘ５ＳＣ（０，９Ｍ塩化ナトリウム１０．０９Ｍク
エン酸ナトリウム）を用いて洗浄し、更に常法により風
乾したのち、温度８０″Ｃに保った真空オーブン中で２
時間放置し、組み換え体プラスミドＤＮＡをニトロセル
ロースフィルターへ固定させた。
和液〔１Ｍ塩化ナトリウム１０．３Ｍクエン酸ナトリウ
ム１０．５Ｍ１−リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８゜０）／Ｉ
Ｍ塩酸〕をすばやく添加、混和したのち、氷中へ移して
急冷した。この溶液を、直径５ ｍｍの円形ニトロセル
ロースフィルター（ミリポア・社・製、カタログナンバ
ー１（ＡＷＰ ０２５００）を用いて濾過し、変性した
組み換え体プラスミドＤＮＡをニトロセルロースフィル
ター上に吸着させたものを、常法により風乾したのち、
６ Ｘ５ＳＣ（０，９Ｍ塩化ナトリウム１０．０９Ｍク
エン酸ナトリウム）を用いて洗浄し、更に常法により風
乾したのち、温度８０″Ｃに保った真空オーブン中で２
時間放置し、組み換え体プラスミドＤＮＡをニトロセル
ロースフィルターへ固定させた。
次いで、１０μｉのハイブリダイゼーション溶液（１０
０ｕｇ／ｍｅ ｍ−ＲＮＡ （項目２で３ＩＩ製したも
の）７６５％（Ｖ／Ｖ）脱イオン化したホルムアミド／
２０ｍＭ１゜４−ピベラジンジエタンスルホン［Ｊ （
１） Ｈ６，４）１０．２％ドデシル硫酸ナトリウム１
０．４Ｍ塩化ナトリウム／１１００ｕ ／ｌｒｉ酵母ｔ
−ＲＮ Ａ ）に、上記の如くして得た組み換え体プラ
スミドＤＮＡを固定したニトロセルロースフィルターを
浸し、温度５０°Ｃにて３時間放置し、フィルター上の
組み換え体プラスミドＤＮＡとｍ−ＲＮＡとのハイブリ
ダイゼーションを行なった。反応終了したフィルターを
取り出し１のｄ洗浄液１ （１０ｍＭ）リス−塩酸緩衝
液（ｐＨ７，６）１０．１５Ｍ塩化ナトリウム／１ｍＭ
ＥＤＴＡｌｏ、 ５％ドデシル硫酸ナトリウム］で９
回洗浄したのち、１ｍｌの洗浄液Ｕ （１０ｍＭ）リス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）／ ０．１５ Ｍ塩化ナト
リウム／１ｍＭ ＥＤＴＡ ）にて２回洗浄を行ない、
フィルター上に固定したプラスミドＤＮＡとハイブリダ
イズしていないｍ−ＲＮＡを除去した。
０ｕｇ／ｍｅ ｍ−ＲＮＡ （項目２で３ＩＩ製したも
の）７６５％（Ｖ／Ｖ）脱イオン化したホルムアミド／
２０ｍＭ１゜４−ピベラジンジエタンスルホン［Ｊ （
１） Ｈ６，４）１０．２％ドデシル硫酸ナトリウム１
０．４Ｍ塩化ナトリウム／１１００ｕ ／ｌｒｉ酵母ｔ
−ＲＮ Ａ ）に、上記の如くして得た組み換え体プラ
スミドＤＮＡを固定したニトロセルロースフィルターを
浸し、温度５０°Ｃにて３時間放置し、フィルター上の
組み換え体プラスミドＤＮＡとｍ−ＲＮＡとのハイブリ
ダイゼーションを行なった。反応終了したフィルターを
取り出し１のｄ洗浄液１ （１０ｍＭ）リス−塩酸緩衝
液（ｐＨ７，６）１０．１５Ｍ塩化ナトリウム／１ｍＭ
ＥＤＴＡｌｏ、 ５％ドデシル硫酸ナトリウム］で９
回洗浄したのち、１ｍｌの洗浄液Ｕ （１０ｍＭ）リス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）／ ０．１５ Ｍ塩化ナト
リウム／１ｍＭ ＥＤＴＡ ）にて２回洗浄を行ない、
フィルター上に固定したプラスミドＤＮＡとハイブリダ
イズしていないｍ−ＲＮＡを除去した。
次いで、このニトロセルロースフィルターを、１００μ
！の水中へ移し、１０μｇの酵母ｔ−ＲＮＡを添加して
、１分間１００’Ｃの湯中へ放置し、ドライアイスで冷
却したエタノール中へ移したのち、室温中で放置し溶解
した。このようにしてハイブリダイズしたｍ−ＲＮＡを
ニトロセルロースフィルターより剥離した。得られた水
溶液に、１０μρの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，２）
及び３００ μＩの冷エタノールを添加し、温度−７０
°Ｃにて１時間放置し、エタノール沈澱を行なったのち
、微量遠心機〔■トミー精工、ＭＲＸ−１５０）を用い
て１２，０ＯＯｒ、ｐ、ｍ、で５分間遠心分離処理して
上記ハイブリダイズしたｍ−ＲＮＡを回収した。
！の水中へ移し、１０μｇの酵母ｔ−ＲＮＡを添加して
、１分間１００’Ｃの湯中へ放置し、ドライアイスで冷
却したエタノール中へ移したのち、室温中で放置し溶解
した。このようにしてハイブリダイズしたｍ−ＲＮＡを
ニトロセルロースフィルターより剥離した。得られた水
溶液に、１０μρの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，２）
及び３００ μＩの冷エタノールを添加し、温度−７０
°Ｃにて１時間放置し、エタノール沈澱を行なったのち
、微量遠心機〔■トミー精工、ＭＲＸ−１５０）を用い
て１２，０ＯＯｒ、ｐ、ｍ、で５分間遠心分離処理して
上記ハイブリダイズしたｍ−ＲＮＡを回収した。
次いで、項目３に記載したと同様にして、回収した上記
ｍ−ＲＮＡにコードされている蛋白質を合成し、項目４
で得られた抗アルカリプロテアーゼ血清を用いて、合成
した蛋白質がアルカリプロテアーゼか否かを分析した。
ｍ−ＲＮＡにコードされている蛋白質を合成し、項目４
で得られた抗アルカリプロテアーゼ血清を用いて、合成
した蛋白質がアルカリプロテアーゼか否かを分析した。
その結果７０株中１株についてポジティブな結果が得ら
れた。この株の保有する組み換え体プラスミドＤ Ｎ
Ａ （ｐＯＡＰ３と命名）にはアスペルギルス・オリゼ
ー（ＡＴＣＣ２０３８６）由来のアルカリプロテアーゼ
ｃ−ＤＮＡの断片が挿入されていると結論できる。
れた。この株の保有する組み換え体プラスミドＤ Ｎ
Ａ （ｐＯＡＰ３と命名）にはアスペルギルス・オリゼ
ー（ＡＴＣＣ２０３８６）由来のアルカリプロテアーゼ
ｃ−ＤＮＡの断片が挿入されていると結論できる。
次いで、組み換え体プラスミドｐＯＡＰ３ ＤＮＡ １
μｇを項目６に記載の方法により制限酵素ＥｃｏＲＩで
処理しアガロースゲル電気泳動法により移動度パターン
を分析し、得られたパターンとプラスミドｐＢＲ３２２
Ｄ Ｎ Ａ （宝酒造・社・製）を制限酵素Ａｌｕｌに
より消化して得られたＤＮＡ断片の標準パターンと対比
することにより、組み換え体プラスミドｐＯＡＰ３ＤＮ
Ａに挿入されているアルカリプロテアーゼｃ−Ｄ Ｎ
Ａ断片の大きさは７５０ｂｐであることが判明した。
μｇを項目６に記載の方法により制限酵素ＥｃｏＲＩで
処理しアガロースゲル電気泳動法により移動度パターン
を分析し、得られたパターンとプラスミドｐＢＲ３２２
Ｄ Ｎ Ａ （宝酒造・社・製）を制限酵素Ａｌｕｌに
より消化して得られたＤＮＡ断片の標準パターンと対比
することにより、組み換え体プラスミドｐＯＡＰ３ＤＮ
Ａに挿入されているアルカリプロテアーゼｃ−Ｄ Ｎ
Ａ断片の大きさは７５０ｂｐであることが判明した。
８、大きなアルカリプロテアーゼｃ−ＤＮＡの検索項目
７で得られたアガロースゲルより７５０ｂｐのアルカリ
プロテアーゼｃ−ＤＮＡ断片を含むアガロースゲルを切
り出し、透析チューブに入れたものに、５００μｆのＴ
Ｅ緩衝液（１０ｍＭ ｌ−リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，
０）／ １ ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加したのち、透析チ
ューブをシールし、電気泳動により、ゲル中より緩衝液
中にＤＮＡを溶出して得た溶液に、等容量の水飽和フェ
ノールを添加して撹拌し、水層を回収し、常法に従って
エタノール沈澱により１１００ｎのＤＮＡを回収した。
７で得られたアガロースゲルより７５０ｂｐのアルカリ
プロテアーゼｃ−ＤＮＡ断片を含むアガロースゲルを切
り出し、透析チューブに入れたものに、５００μｆのＴ
Ｅ緩衝液（１０ｍＭ ｌ−リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，
０）／ １ ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加したのち、透析チ
ューブをシールし、電気泳動により、ゲル中より緩衝液
中にＤＮＡを溶出して得た溶液に、等容量の水飽和フェ
ノールを添加して撹拌し、水層を回収し、常法に従って
エタノール沈澱により１１００ｎのＤＮＡを回収した。
この１１００ｎのアルカリプロテアーゼｃ−ＤＮＡを、
（α−”Ｐ ） ｄＣＴＰ （アマジャム・社・製）ヲ
用いてニックトランスレーション法により標識した。ニ
ックトランスレーションは、宝酒造・社の指示するジェ
イ・モル・パイオル（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）、第１
１３巻、第２３７〜２５１頁（１９７７）及びモレキュ
ラー・クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎ
ｇ）、第１０９〜１１２頁（１９８２）記載の方法に従
った。このようにして調製した３２ｐで標識したアルカ
リプロテアーゼｃ−ＤＮＡ断片をプローブとして用い、
項目６で得たｃ−ＤＮＡバンクに対しコロニーハイブリ
ダイゼーション法〔蛋白質・核酸・酵素、第２６巻、第
５７５〜５７９頁（１９８１） ）より検索し、アルカ
リプロテアーゼｃ−ＤＮＡを有するコロニーを得た。そ
のうち１個のコロニーの有する組み換え体プラスミドＤ
ＮＡをｐＯＡＰ ５と命名し、項目７に従い組み換え体
プラスミドＤＮＡを調製した。
（α−”Ｐ ） ｄＣＴＰ （アマジャム・社・製）ヲ
用いてニックトランスレーション法により標識した。ニ
ックトランスレーションは、宝酒造・社の指示するジェ
イ・モル・パイオル（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）、第１
１３巻、第２３７〜２５１頁（１９７７）及びモレキュ
ラー・クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎ
ｇ）、第１０９〜１１２頁（１９８２）記載の方法に従
った。このようにして調製した３２ｐで標識したアルカ
リプロテアーゼｃ−ＤＮＡ断片をプローブとして用い、
項目６で得たｃ−ＤＮＡバンクに対しコロニーハイブリ
ダイゼーション法〔蛋白質・核酸・酵素、第２６巻、第
５７５〜５７９頁（１９８１） ）より検索し、アルカ
リプロテアーゼｃ−ＤＮＡを有するコロニーを得た。そ
のうち１個のコロニーの有する組み換え体プラスミドＤ
ＮＡをｐＯＡＰ ５と命名し、項目７に従い組み換え体
プラスミドＤＮＡを調製した。
該組み換え体プラスミドＤＮＡを含有する大腸菌を大腸
菌（Ｅ、ｃｏｌｉ） Ｄ Ｈ１（ｐＯＡＰ ５ ）
と命名した。
菌（Ｅ、ｃｏｌｉ） Ｄ Ｈ１（ｐＯＡＰ ５ ）
と命名した。
なお、該形質転換株は、工業技術院微生物工業技術研究
所に、微工研菌寄第９８７０号（ＦＥＲＭ Ｐ−９８７
０）として寄託されている。
所に、微工研菌寄第９８７０号（ＦＥＲＭ Ｐ−９８７
０）として寄託されている。
組み換え体プラスミドｐＯＡＰ５ＤＮＡを項目６に記載
の方法と同様にして制限酵素ＥｃｏＲＩで処理し、アガ
ロースゲル電気泳動を行なったところ、挿入ＤＮＡ断片
の大きさは１．１００ｂｐであることが判明した。そし
て、項目８記載の方法と同様にしてこの１，１００ｂｐ
のアルカリプロテアーゼｃ−Ｄ Ｎ Ａを含むＤＮＡ断
片０．１μｇを分離、精製した。組み換え体プラスミド
ｐＯＡＰ５ＤＮＡを制限酵素地図■、１並Ｒ１，，ＫＬ
■、狂■及び又訓Ｉの単一または二重消化を行ない、項
目７に記載したと同じ方法にて、現われた断片の大きさ
を分析することにより、組み換え体プラスミドｐＯＡＰ
５ＤＮＡの制限酵素地図を作製し、該地図を第１図に示
した。
の方法と同様にして制限酵素ＥｃｏＲＩで処理し、アガ
ロースゲル電気泳動を行なったところ、挿入ＤＮＡ断片
の大きさは１．１００ｂｐであることが判明した。そし
て、項目８記載の方法と同様にしてこの１，１００ｂｐ
のアルカリプロテアーゼｃ−Ｄ Ｎ Ａを含むＤＮＡ断
片０．１μｇを分離、精製した。組み換え体プラスミド
ｐＯＡＰ５ＤＮＡを制限酵素地図■、１並Ｒ１，，ＫＬ
■、狂■及び又訓Ｉの単一または二重消化を行ない、項
目７に記載したと同じ方法にて、現われた断片の大きさ
を分析することにより、組み換え体プラスミドｐＯＡＰ
５ＤＮＡの制限酵素地図を作製し、該地図を第１図に示
した。
９、アルカリプロテアーゼｃ−ＤＮＡの塩基配列の決定
項目８で得られた夫々のアルカリプロテアーゼｃ−Ｄ
Ｎ Ａ断片を、同−又は同一ののりしろの制限酵素によ
り切断したプラスミドｐＵｃ１８及びｐＵｃ１９ＤＮＡ
（宝酒造、・社・製）にクローニングした。
Ｎ Ａ断片を、同−又は同一ののりしろの制限酵素によ
り切断したプラスミドｐＵｃ１８及びｐＵｃ１９ＤＮＡ
（宝酒造、・社・製）にクローニングした。
シーフェンシングは、プラスミドＤＮＡを４４の方法〔
ベクターＤＮＡ、第７０頁、講談社（１９８６年）〕に
従ってアルカリ変性させたのち、Ｍ１３シークエンスキ
ット（宝酒造・社・製）を用いて常法によりダイデオキ
シ・チェーン・ターミネーション法で行なった。
ベクターＤＮＡ、第７０頁、講談社（１９８６年）〕に
従ってアルカリ変性させたのち、Ｍ１３シークエンスキ
ット（宝酒造・社・製）を用いて常法によりダイデオキ
シ・チェーン・ターミネーション法で行なった。
このようにしてアスペルギルス・オリゼー（ＡＴＣＣ２
０３８６）由来のアルカリプロテアーゼｃ−ＤＮＡ断片
の塩基配列を決定し、得られた塩基配列のうち、マチュ
アーなアルカリプロテアーゼに対応する塩基配列を第２
図に、また、前記第２図に示す塩基配列を有する遺伝子
から翻訳されるポリペブタイドのアミノ酸配列を第３図
に夫々示した。
０３８６）由来のアルカリプロテアーゼｃ−ＤＮＡ断片
の塩基配列を決定し、得られた塩基配列のうち、マチュ
アーなアルカリプロテアーゼに対応する塩基配列を第２
図に、また、前記第２図に示す塩基配列を有する遺伝子
から翻訳されるポリペブタイドのアミノ酸配列を第３図
に夫々示した。
このアミノ酸配列をコードする遺伝子が本発明の遺伝子
である。
である。
このＤＮＡ塩基配列より推測されるアミノ酸配列のＮ末
端には精製したアルカリプロテアーゼのＮ末端のアミノ
酸配列１６個（Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌ
ｕＬｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｔｒｐ Ｇｌｙ
Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｉｌｅ ５ｅｒ）が確認され
た（第３図下線部）。
端には精製したアルカリプロテアーゼのＮ末端のアミノ
酸配列１６個（Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌ
ｕＬｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｔｒｐ Ｇｌｙ
Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｉｌｅ ５ｅｒ）が確認され
た（第３図下線部）。
以上の知見より第２図に示した塩基配列は、マチュアー
なアルカリプロテアーゼのＮ末端部分よりＣ末端部分宿
をコードしていると結論できる。
なアルカリプロテアーゼのＮ末端部分よりＣ末端部分宿
をコードしていると結論できる。
第１図は、組み換え体プラスミドｐＯＡＰ５ＤＮＡの制
限酵素地図を示す図であり、第２図は、実施例の９項目
に記載のマチュアーなアルカリプロテアーゼに対応する
遺伝子の塩基配列を示す図であり、また、第３図は、第
２図に示す塩基配列を有する遺伝子から翻訳されるポリ
ペブタイドのアミノ酸配列を示す図である。 出願人 食品産業酵素機能変換技術研究組合代理人 弁
理士 平 木 祐 輔 第２図 ＧＧＣ ＡＧ ＴＧ ＧＧＣ ＣＴ ＧＧＣ ＧＧＣ ＡＣ ＡＧ ＡＣ ＡＧ ＴＣ ＧＴ ＡＣ ＧＧＣ ＡＣ ＧＧＣ ＣＴ ＧＧ ＧＴ ＧＴ ＧＧＣ ＴＧ ＧＧＣ ＧＧＣ ＧＧＣ ＴＴ ＧＧＣ ＡＣ ＡＧ ＧＧＣ ＡＧ ＡＣ ＣＴ
限酵素地図を示す図であり、第２図は、実施例の９項目
に記載のマチュアーなアルカリプロテアーゼに対応する
遺伝子の塩基配列を示す図であり、また、第３図は、第
２図に示す塩基配列を有する遺伝子から翻訳されるポリ
ペブタイドのアミノ酸配列を示す図である。 出願人 食品産業酵素機能変換技術研究組合代理人 弁
理士 平 木 祐 輔 第２図 ＧＧＣ ＡＧ ＴＧ ＧＧＣ ＣＴ ＧＧＣ ＧＧＣ ＡＣ ＡＧ ＡＣ ＡＧ ＴＣ ＧＴ ＡＣ ＧＧＣ ＡＣ ＧＧＣ ＣＴ ＧＧ ＧＴ ＧＴ ＧＧＣ ＴＧ ＧＧＣ ＧＧＣ ＧＧＣ ＴＴ ＧＧＣ ＡＣ ＡＧ ＧＧＣ ＡＧ ＡＣ ＣＴ
Claims (2)
- （１）アスペルギルス属に属する微生物に由来し、下記
の制限酵素開裂地図で規定されるアルカリプロテアーゼ
遺伝子。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＥはＥｃｏＲ I 、ＡはＡｆｌII、ＫはＫｐｎ
I 、ＸはＸｍｎ I 、ＳはＳａｌ I を示す） - （２）アルカリプロテアーゼ遺伝子が下記に示されるア
ミノ酸配列をコードすることを特徴とする請求項１記載
のアルカリプロテアーゼ遺伝子。 【遺伝子配列があります】
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63279401A JPH0817709B2 (ja) | 1988-03-07 | 1988-11-07 | アルカリプロテアーゼ遺伝子 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63-51777 | 1988-03-07 | ||
| JP63051777 | 1988-03-07 | ||
| JP63279401A JPH0817709B2 (ja) | 1988-03-07 | 1988-11-07 | アルカリプロテアーゼ遺伝子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH022374A true JPH022374A (ja) | 1990-01-08 |
| JPH0817709B2 JPH0817709B2 (ja) | 1996-02-28 |
Family
ID=26392340
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63279401A Expired - Lifetime JPH0817709B2 (ja) | 1988-03-07 | 1988-11-07 | アルカリプロテアーゼ遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0817709B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5254470A (en) * | 1990-03-23 | 1993-10-19 | Japanese Research And Development Association For Improvement Of Enzyme Function In Food Industry | Alkaline protease, alkaline protease gene, recombinant DNA, DNA fragment for the expression of gene, and process for the production of alkaline protease |
| JP2007515923A (ja) * | 2003-11-07 | 2007-06-21 | カウンシル オブ サイエンティフィク アンド インダストリアル リサーチ | 深海菌からのアルカリプロテアーゼの製造法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63279402A (ja) * | 1987-05-11 | 1988-11-16 | Sharp Corp | Ｖｔｒのダビング装置 |
-
1988
- 1988-11-07 JP JP63279401A patent/JPH0817709B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63279402A (ja) * | 1987-05-11 | 1988-11-16 | Sharp Corp | Ｖｔｒのダビング装置 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5254470A (en) * | 1990-03-23 | 1993-10-19 | Japanese Research And Development Association For Improvement Of Enzyme Function In Food Industry | Alkaline protease, alkaline protease gene, recombinant DNA, DNA fragment for the expression of gene, and process for the production of alkaline protease |
| JP2007515923A (ja) * | 2003-11-07 | 2007-06-21 | カウンシル オブ サイエンティフィク アンド インダストリアル リサーチ | 深海菌からのアルカリプロテアーゼの製造法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0817709B2 (ja) | 1996-02-28 |
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