JPH03272684A - アルカリプロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ、アルカリプロテアーゼの製造法、及び遺伝子発現用ｄｎａ断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、アルカリプロテアーゼ、アルカリプロテアー
ゼ遺伝子、新規な組み換え体ＤＮＡ、アルカリプロテア
ーゼの製造法、及び遺伝子発現用アルカリプロテアーゼ
遺伝子のプレプロ領域に関する。

〔従来の技術〕

従来、黄麹菌の１種であるアスペルギルス・オリゼー（
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）由来のアルカ
リプロテアーゼ遺伝子の構造については、全く未知であ
り、また、該遺伝子の単離すらされていないのが実情で
ある。

アルカリプロテアーゼは、蛋白質又はその部分加水分解
物に作用して、ペプタイド結合を分解する加水分解酵素
であって、医薬、飲食品、洗剤等広範に用いられている
。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明は、野生型アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列
の４０位において、バリンがロイシンまたはイソロイシ
ンに変異されているアルカリプロテアーゼ、上記アミノ
酸配列をコードするアルカリプロテアーゼ遺伝子、該遺
伝子をベクターＤＮＡに挿入した新規な組み換え体ＤＮ
Ａ、上記アルカリプロテアーゼの製造法、及び遺伝子発
現用ＤＮＡ断片を提供することを目的とするものである
。

〔課題を解決するための手段〕

先に、本発明者等は、アスペルギルス・オリゼー由来の
アルカリプロテアーゼ遺伝子について種々検討した結果
、アスペルギルス・オリゼー由来のアルカリプロテアー
ゼ遺伝子及びプレプロ型アルカリプロテアーゼ遺伝子を
初めて単離し、その構造を決定することに成功した（特
開平２−２３７４号、特開平２−２３７５号、特願昭６
３−２８０３７０号及び特願昭６３−２８０３７１号）
。

その後、本発明者等は、プレプロ型アルカリプロテアー
ゼ遺伝子を用い、アルカリプロテアーゼを効率よく生産
すべく種々検討した結果、アスペルギルス・オリゼー由
来のプレプロ型アルカリプロテアーゼ遺伝子をプラスミ
ドベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、
アルカリプロテアーゼ生産能を有するサツカロマイセス
・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｓｙｃｅｓ　ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ）を培地に培養すれば、該酵母菌体外に効
率よくアルカリプロテアーゼが分泌生産されること等の
知見を得た（特願昭６３−２８０３７２号及び特願昭６
３−２８０３７３号）。

更にその後、本発明者等は、アルカリプロテアーゼ遺伝
子を用い、蛋白質工学手法のうち部位特異的変異により
アルカリプロテアーゼの活性を増強すべく種々検討した
結果、野生型アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列の４
０位において、バリンがロイシンまたはイソロイシンに
変異させたアミノ酸配列をコードするアルカリプロテア
ーゼ遺伝子を得、更に該遺伝子をベクターＤＮＡに挿入
した組み換え体ＤＮＡを含み、アルカリプロテアーゼ生
産能を有するサツカロマイセス属に属する微生物を、培
地に培養すれば、野生型アルカリプロテアーゼの活性に
比し、約１．６〜１．７倍程度酵素活性が増強されたア
ルカリプロテアーゼを効率よく得られること等を見い出
し、また更に、アルカリプロテアーゼ遺伝子のプレプロ
領域を用いて、野生型アルカリプロテアーゼ遺伝子に替
えて、野生型アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列の４
０位において、パ°リンがロイシンまたはイソロイシン
に変異されているアルカリプロテアーゼのアごノ酸配列
をコードするアルカリプロテアーゼ遺伝子等を発現させ
ても充分に上記遺伝子が発現されること等の知見を得、
本発明を完成した。

なお、上記野生型アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列
は特開平２−２３７４号公報に記載している。

すなわち本発明は、野生型アルカリプロテアーゼのアミ
ノ酸配列の４０位において、バリンがロイシンまたはイ
ソロイシンに変異されていることを特徴とするアルカリ
プロテアーゼであり、また、本発明は、野生型アルカリ
プロテアーゼのアミノ酸配列の４０位において、バリン
がロイシンまたはイソロイシンに変異されているアミノ
酸配列をコードするアルカリプロテアーゼ遺伝子であり
、更に本発明は、野生型アルカリプロテアーゼのアミノ
酸配列の４０位において、バリンがロイシンまたはイソ
ロイシンに変異されているアミノ酸配列をコードするア
ルカリプロテアーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した
ことを特徴とする新規な組み換え体ＤＮＡであり、更に
また本発明は、野生型アルカリプロテアーゼのアミノ酸
配列の４０位において、バリンがロイシンまたはイソロ
イシンに変異されているアミノ酸配列をコードするアル
カリプロテアーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した組
み換え体ＤＮＡを含み、アルカリプロテアーゼ生産能を
有するサツカロマイセス属に属する微生物を、培地に培
養し、培養物よりアルカリプロテアーゼを採取すること
を特徴とするアルカリプロテアーゼの製造法であり、そ
してまた本発明は、下記のアミノ酸配列をコードするポ
リペプチド遺伝子発現用ＤＮＡ断片であり、前記ポリペ
プチドとしてアルカリプロテアーゼが挙げられる。

Ｍｅｔ　　Ｇｉｎ　　５ｅｒ Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｌａ Ａｌａ　　Ｐｒｏ　　Ｖａｔ Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｐｒ。

Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ Ｈｉｓ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ １１ｅ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ １１ｅ　　Ｌｅｕ　　Ｐｒ。

Ｇｌｎ　　Ｇｌｕ　　Ｔｈｒ Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ Ｇｌｙ　　Ｉｌｅ　Ａｓ１） Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｐｒ。

Ｌｙｓ　　Ｉｌｅ　Ａｓｎ Ｔｂｒ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ Ａｌａ　　Ｖａｔ　　Ｌｅｕ Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ Ｔｙｒ　　Ｉｌｅ　Ｖａｌ Ｇｌｕ　　Ａｌａ　Ｌｙｓ Ａｌａ　　Ｔｈｒ　　Ａｓｎ Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ Ｖａｌ　　Ｇｌｙ　　１１ｅ Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ａｌａ Ａｓｐ 以下、本発明の詳細な説明する。

先ず、本発明に用いられるアルカリプロテアーゼ遺伝子
のドナーとして用いられるアスペルギルス・オリゼーと
しては、例えば、アスペルギルス・オリゼー（ＡＴＣＣ
２０３８６）等が挙げられる。

次いで、上記微生物を、特公昭４Ｂ−３８８７３号公報
記載の方法と全く同様にして培養し、培養物を得、該培
養物から常法、例えば、濾過、遠心分離処理等によりア
スペルギルス・オリゼーの菌体を得る。

上記アスペルギルス・オリゼーの菌体より−ＲＮＡを調
製するには、例えば、菌体の破砕の際、ガラスピーズ及
びフェノールを用いる以外は、例えば、「モレキュラー
・クローニングＪ　（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎ
ｇ）、第１９６頁、コールド・スプリング・ハーバ−・
ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ
　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ）　（１９８２）及び「分子
遺伝学実験法」、小関治男、志村令部、第６６〜６７頁
（１９８３）記載の方法等により得ることができる。

得られたｍ−ＲＮＡよりアルカリプロテアーゼをコード
するーＲＮＡ（以下、アルカリブロチアーゼ−ＲＮＡと
いう）を濃縮するには、例えば、「バイオメディカル・
リサーチＪ　（ＢｉｏｇｅｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃ
ｈ）、第３ｔＬ、第５３４〜５４０頁（１９８２）記載
の方法により行うことができる。

なお、この際、アルカリプロテアーゼに対する抗アルカ
リプロテアーゼ血清を使用するのであるが、該血清は、
例えば、「免疫化学」、山村ａ−第４３〜５０頁（１９
７３）記載の方法により得ることができる。

アルカリプロテアーゼ■−ＲＮＡよりｃ−ＤＮＡを台底
するには、例えば、「モル・セル・パイオル」（Ｍｏ１
．　Ｃｅ１１　Ｂｉｏｌ、）、第２巻、第１６１頁（１
９８２）及び「ジーンＪ　（Ｇｅｎｅ）、第２５巻、第
２６３頁（１９８３）記載の方法により行うことができ
る。

次いで、このようにして得られたｃ−ＤＮＡをベクター
ＤＮＡ、例えば、プラスミドｐＵｃ１１９ＤＮＡ（宝酒
造社製）等に組み込み、種々の組み換え体プラスミドＤ
ＮＡを得、該ＤＮＡを用いて例えば、大腸菌（Ｅ、ｃｏ
ｌｉ）ＤＢ　１　（ＡＴＣＣ３３８４９）、大腸菌（Ｅ
、ｃｏｌｔ）ＨＢＩＯＩ（ＡＴＣＣ３３６９４）等をハ
ナハン（Ｈａｎａｈａｎ）の方法〔「ディーエヌエイ・
クローニングＪ　　（ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ）、第１巻
、第１０９〜１３５頁（１９８５）　）により形質転換
し、種々の形質転換株を得る。

上記の種々な形質転換株よりアルカリプロテアーゼをコ
ードするｃ−ＤＮＡ（以下、アルカリプロテアーゼｃ−
ＤＮＡという）を検出するには、ハイブリダイゼーショ
ン・セレクション〔「モレキュラー・クローニングＪ　
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　、第３２９
〜３３３頁及び第３４４〜３４９頁、コールド・スプリ
ング、ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎ
ｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）　（１９８２
年）〕により検出することができる。

次いで、不完全なアルカリプロテアーゼｃ−ＤＮＡを２
ｔｐを用いニックトランスレーシーン法〔「モレキュラ
ー・クローニングＪ　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ）、第１０９〜１１２頁、コールド・スプリング
・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　
Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２年）
、及び「ジェイ・モル・パイオルＪ　（Ｊ、Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、）　、第１１３巻、第２３７〜２５１頁（１
９７７）　）により標識したのち、該ｃ−ＤＮＡをプロ
ーブとしてコロニーハイブリダイゼーシッン法〔「蛋白
質・核酸・酵素」、第２６巻、第５７５〜５７９頁（１
９８１）　）によりプラスミドｐＵｃ１１９ＤＮＡをベ
クターとして作成したｃ−ＤＮＡのシーンバンクのライ
ブラリーより１．５）［ｂのアルカリプロテアーゼｃ−
ＤＮＡを含有するプラスミドＤＮＡを得ることができる
。

そして、このようにして得られた組み換え体プラスミド
ＤＮＡよりアスペルギルス・オリゼー由来のアルカリプ
ロテアーゼをコードする遺伝子においてプレプロ領域を
有するもの（以下、プレプロ型アルカリプロテアーゼ遺
伝子という）を含有するＤＮＡを得るには、該プラスミ
ドＤＮＡに、制限酵素、例えばＥｃｏＲＩを温度３０〜
４０°Ｃ１好ましくは３７”Ｃで１〜２４時間、好まし
くは２時間作用させ、得られた反応終了液を、アガロー
スゲル電気泳動法〔「モレキュラー・クローニングＪ　
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第１５０頁
、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃ
ｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ）　（１９８２）記載〕によりアスペルギルス・オ
リゼー由来のプレプロ型アルカリプロテアーゼ遺伝子を
含有するＤＮＡを得ることができる。

そして、このプレプロ型アルカリプロテアーゼ遺伝子の
塩基配列の決定を実施例の第（１１）項目に示すような
方法によって行い（第５図参照）、次いで、前記塩基配
列を有する遺伝子によって翻訳されるポリペブタイドの
アミノ酸配列を確定する（第６図参照）。

次いで、ベクターＤＮＡに、制限酵素、例えばＥｃｏＲ
Ｉ　　（宝酒造社製）を温度３０〜４０℃、好ましくは
３７”Ｃで１〜１６時間、好ましくは２時間作用させて
、該ベクターＤＮＡを切断したものに、上記のようにし
て得たプレプロ型アルカリプロテアーゼ遺伝子を含有す
るＤＮＡ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）等のＤ
ＮＡリガーゼを添加して常法により連結させて組み換え
体ＤＮＡを得る。

上記ベクターＤＮＡとしては如何なるものでもよく、例
えば、プラスミドＭＡＳ６　ＤＮＡ　（ワシントン・リ
サーチ・ファウンデーションより入手）等が挙げられる
。

そして、このようにして得られた組み換え体ＤＮＡを用
いて、サツカロマイセス属に属する微生物例えば、サツ
カロマイセス・セレビシェ５）ＩＹ　１（ＡＴＣＣ４４
７６９）等を、ベッグス（Ｂｅｇｇｓ）の方法〔「ネー
チュアーＪ　（Ｎａｔｕｒｅ）、第２７５．ｉ！、第１
０４〜１０９頁（１９７８）　）により形質転換して、
プレプロ型プルカリプロテアーゼ遺伝子をベクターＤＮ
Ａに挿入した組み換え体ＤＮＡを含みアルカリプロテア
ーゼ分泌生産能を有するサツカロマイセス属に属する微
生物を得る。

このようにして得たサツカロマイセス属に属する微生物
より、純化された新規な組み換え体ＤＮＡを得るには、
例えば「ブロク・ナトル・アカド・サイＪ　（Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）第６２巻、第
１１５９〜１１６６頁（１９６９）記載の方法等により
得ることができる。

上述の如くして得られた新規な組み換え体ＤＮＡを用い
、野生型アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列の４０位
のバリンに相当する遺伝子である１１８〜１２０位のコ
ドンＧＴＧを、ロイシンまたはイソロイシンに相当する
コードすなわちＡＴＴまたはＣＴＧに部位特異変異させ
るには、例えば、アマジャム社製オリゴヌクレオチド−
ダイレクチイツト・イン・ビトロ・ごユータジエネシス
・システム・バージ２ン２　（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏ
ｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒ。

ｓ＋ｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｓｙｓｔｅｍ　ｖｅｒｓｉ
ｏｎ２）を用いて行うことができる。

次いで、野生型アルカリプロテアーゼ遺伝子中のバリン
に相当するコドンを、ロイシンまたはイソロイシンに相
当するコードに部位特異変異されたアルカリプロテアー
ゼ遺伝子を含む組み換え体プラスミドＤＮＡを、制限酵
素例えば、シｄ■及びＡｆｌＩ［を用い通常の方法によ
り処理して切断し、部位特異変異されたアルカリプロテ
アーゼ遺伝子を夫々得る。

一方、プロモーター、例えばザイゴサツカロマイセス・
ル−キシ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｒｏ
ｕｘｉｉ）由来グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素
酵素（以下、ＧＡＰＨと省略する）のプロモーター（広
島大学東江教授より入手）、ターミネータ−（前記同教
授より入手）、上述のプレプロ型アルカリプロテアーゼ
ｃ−ＤＮＡ及びベクターＤＮＡを、常法により例えばＴ
４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）等のＤＮＡリガーゼを
用いて連結させて組み換え体ＤＮＡを得る。

上記ベクターＤＮＡとしては、如何なるものでもよく、
例えば、後述の実施例記載の組み換え体プラスミドｐＯ
ＡＰ１０６Ｂ　Ｄ　Ｎ　Ａ等が挙げられる。

次いで、上記の組み換え体ＤＮＡを、制限酵素、例えば
、シ吐■及びＡｆｌＩ［を用いて常法により切断したも
のに、上記の如くして得られた部位特異変異されたアル
カリプロテアーゼ遺伝子及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒
造社製）等のＤＮＡリガーゼを添加して常法により連結
させて組み換え体ＤＮＡを得る。

そして、このようにして得られた組み換え体ＤＮＡを用
いて、サツカロマイセス属に属する微生物例えば、サツ
カロマイセス・セレビシェＮＡ３７−１１＾（大阪大学
大嶋泰治教授より入手）等を、ベッグス（Ｂｅｇｇｓ）
の方法〔「ネーチュアーＪ　（Ｎａｔｕｒｅ）、第２７
５巻、第１０４〜１０９頁（１９７８）　）により形質
転換して、部位特異変異されたアルカリプロテアーゼ遺
伝子をベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを含
みアルカリプロテアーゼ分泌生産能を有するサツカロマ
イセス属に属する微生物を得る。

このようにして得られたサツカロマイセス属に属する微
生物より、本発明の純化された新規な組み換え体ＤＮＡ
を得るには、例えば、「ブロク・ナトル・アカド・サイ
Ｊ　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、
）第６２巻、第１１５９〜１１６６頁（１９６９）記載
の方法等により得ることができる。

次いで、上記微生物を培地に培養し、培養物よりアルカ
リプロテアーゼを採取するのである。

培地としては、例えば、サツカロマイセス属に属する微
生物の培養に用いられるものであれば、如何なるもので
もよく、例えば、グルコース、ポリペプトン、酵母エキ
スからなるＹＰＤ培地が挙げられる。

また、培養温度は、例えば、２５〜３５℃、好ましくは
３０℃程度で、培養時間は、例えば、６〜１２０時間、
好ましくは４８時間程度である。

そして、培養物を、例えば、３．００Ｏｒ、ｐ、ｍ、で
２分間程度の遠心分離処理し、培養液及び菌体を得、得
られた培養液は、粗酵素液として用いることができ、ま
た、得られた菌体を、例えば、ガラスピーズと共に、ポ
ルテックスミキサーにより３分間程度攪拌して破砕し、
粗酵素液を得る。

そして、夫々の粗酵素液は、そのままでも使用可能であ
るが、必要により硫安分画、イオン交換クロマトグラフ
法、例えば、ＤＥＡＲ−バイオゲルＡでの処理等、ゲル
濾過法、例えば、ウルトロゲルＡｃＡ３４での処理等に
より精製して、純化されたアルカリプロテアーゼを得る
。

このようにして得られたアルカリプロテアーゼの理化学
的性質は、従来の野生型アルカリプロテアーゼの活性に
比較して、アミノ酸配列の４０位においてバリンがロイ
シン又はイソロイシンに部位特異変異された場合には、
夫々約１．６又は１．７倍程度酵素活性が増強される以
外は、「アグル・パイオル・ケムＪ　（Ａｇｒ、Ｂｉｏ
ｌ、Ｃｈｅｍ、）、第３７巻、第２６８５〜２６９４頁
（１９７３年）に記載されたものと全く同様である。

また、本発明においては、下記に示されるアミノ酸配列
をコードする野生型アルカリプロテアーゼ遺伝子のプレ
プロ領域のＤＮＡ断片は、野生型アルカリプロテアーゼ
遺伝子に替えて、遺伝子例えば、野生型アルカリプロテ
アーゼのアミノ酸配列の４０位において、バリンがイソ
ロイシンまたはロイシンに変異されているアルカリプロ
テアーゼのアミノ酸配列をコードするアルカリプロテア
ーゼ遺伝子等を発現させることができるので、上記プレ
プロ領域のＤＮＡ断片は、ポリペプチド遺伝子発現用の
ＤＮＡ断片領域として極めて有用なものである。

Ｍｅｔ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　ｌｉｅ　Ｌｙｓ　ＡｒｇＬｅ
ｕ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｐｒ。

Ａｌａ　　Ｐｒｏ　　Ｖａｌ　　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｔｈ
ｒＧｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　ＬｙｓＰ
ｈｅ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　ｌｉｅ　ＡｓｐＧｉｎ
　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　ＴｒｐＨｉｓ　Ｇ
ｌｎ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　ＧｌｕＴｈｒ　Ｇｌｙ
　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｐｒ。

Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　　Ｉｌｅ　Ａｓｎ１
３＋ｒ　　Ｖａｔ　　Ｌｓｌｕ　　ｔｙｌｕ　　Ａｓｐ
　　ｔｗｉｎＴｈｒ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ Ａｌａ　　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ Ｔｙｒ　ｌｉｅ　Ｖａｌ Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｌｙｓ Ａｌａ　　Ｔｈｒ　　Ａｓｎ Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ Ｖａｌ　Ｇｌｙ　　１１ｅ Ｌｙｓ　　Ｐｈｅ　Ａｌａ １１ｅ　　Ｔｙｒ　　Ｔｙｒ　　Ｌｅｕｓｐ 〔発明の効果〕 上述したことから明らかな如く、本発明によれば、上記
したアミノ酸配列をコードするアルカリプロテアーゼ遺
伝子の組み込まれた組み換え体ＤＮＡを含む、サツカロ
マイセス属に属する微生物を培地に培養することにより
、極めて短期間のうちに、高活性のアルカリプロテアー
ゼを効率よく分泌生産させることができるので、本発明
は、産業上極めて有用である。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例を挙げて更に詳細に説明する。

実施例 （１）菌体の取得 黄麹菌アスペルギルス・オリゼー（ＡＴＣＣ２０３８６
）ノ胞子（１，２Ｘ１０”個）を、アルカリプロテアー
ゼ生産培地〔３％（Ｉｎ／％ｌ）加熱、加圧膨化処理し
た脱脂大豆、３％（Ｗ／Ｖ）ＫＨ！ＰＯ４）　５０−に
接種し、恒温振盪機（大洋科学工業社製、Ｍ−１００”
）を用いて１２０ｒ、ｐ、−、、温度３０℃で４５時間
振盪培養を行ない培養物を得、常法によりこの培養物を
濾過して菌体１０ｇを得た。

（２）ｓ−ＲＮＡの取得 項目（１）で得られた菌体１０ｇを、２０−のグアニジ
ンイソチオシアネート溶液（６Ｍグアニジンイソチオシ
アネー）／３７．５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７，
０）　１０．７５％（Ｗ／Ｖ）Ｎ−ラウロイルザルコシ
ンナトリウム１０．１５Ｍβ−メルカプトエタノール）
に添加したものを、カップ型ブレンダー（日本精機製作
所社製）に入れ、更に、１０ｇのガラスピーズ（直径０
．５ｍ）を添加し、１０．００Ｏｒ、ｐ、ｓ、で５分間
処理したのち、また更に、１０−の水飽和フェノールを
添加し、１０．００Ｏｒ、ｐ、ｍ、で１０分間処理して
菌体を破砕処理し、破砕物を得た。

このようにして得られた破砕物を冷却遠心機（日立工機
社製、１８ＰＲ−５２）を用いて５．０００ｒ、ｐ、ｍ
。

で１０分間遠心分離処理して、菌体破砕液２０−を得た
。

次いで、超遠心分離機用チューブ（日立工機社製）４本
に、予め１．２−の５．７Ｍの塩化セシウム溶液を夫々
重層し、その上に、上記菌体破砕液を重層するように夫
々分注し、超遠心分離機（日立工機社製、５ＣＰ５５旧
を用いて温度１５℃、３０、００Ｏｒ、ｐ、ｍ、で１６
時間遠心分離して沈澱物を得た。

得られた沈澱物を、冷７０％（Ｖ／Ｖ）エタノールを用
いて洗浄したものを、１０５Ｍ　）リス緩衝液（１０ｇ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）１５鏑Ｍ　ＥＤＴ
＾／１％ドデシル硫酸ナトリウム〕４−に懸濁したもの
に、同量のｎ−ブタノール及びクロロフォルムを４対ｌ
（容量比）となる如く混合したものを添加して抽出し、
常法により３＋００Ｏｒ、ｐ、ｍ、で１０分間遠心分離
し、水層及び有機溶媒層に分離し、この有Ｉｌ溶媒層に
上記１０ｇ＋Ｍ　）リス緩衝液４−を添加し、上記抽出
及び分離操作を行う操作を２回繰り返して得られた水層
に、１／１０量の３Ｈ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，２）及
び２倍量の冷エタノールを添加したものを温度−２０℃
で２時間放置したのち、常法により８．００Ｏｒ、ｐ、
ｍ、で２０分間遠心分離し、ＲＮＡを沈澱させ、得られ
たＲＮＡを４−の水に溶解し、上記エタノール沈澱操作
を行い、得られたＲＮＡを１−の水に溶解し、１２■の
ＲＮＡを得た。

このＲＮＡ中より−ＲＮＡを選択するために、１２■の
ＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）−セルロースにューイングラ
ンドバイオラボ社製）カラムクロマトグラフィーにかけ
た。

カラムとして２．５−テルモシリンジ（テルモ社製）を
用い、樹脂０．５ｇは、溶出緩衝液（１０−Ｍ　）リス
−塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，６）　／　１ｍＭ　ＥＯＴＡ
　／　０．１％（Ｗ／Ｖ）　　ドデシル硫酸ナトリウム
〕で膨潤させたのち、カラムに充填し、結合緩衝液（１
０ｓＭ　）リス−塩酸（ｐ　Ｈ７，６）　／　１ｍＭ　
ＥＤＴ＾／　０．４　Ｍ　ＮａＣ１／　０．１％ドデシ
ル硫酸ナトリウム〕で平衡化したものである。

１２■のＲＮＡに、同量の緩衝液〔１０■Ｈトリス−塩
酸（ｐＨ７，６）／１ｍＭ　ＥＤＴＡｌｏ、　８　Ｍ　
ＮａＣ１／　ｏ、　１％ドデシル硫酸ナトリウム〕を添
加し、温度６５℃で１０分間加熱処理し、水中で急冷し
、オリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムにかけたのち、結
合緩衝液で樹脂を洗浄し、未結合のｒ−ＲＮＡ及びｔ−
ＲＮＡを完全に洗浄し、更に、溶出緩衝液で−ＲＮＡを
溶出し、９０ｕｇの５−ＲＮＡを得た。

（３）　　アルカリプロテアーゼ−ＲＮＡの濃縮衣に、
シラ線密度勾配遠心分離法によりアルカリプロテアーゼ
ー−ＲＮＡを濃縮した。

１０〜２５％０１／Ｖ）のシ！糖密度勾配は、ベックマ
ン社製のローター５−４１用ポリアロマチエープに４０
％（Ｗ／Ｖ）　、／　！ｌ　Ｉ！液（５０ｓ＋Ｍ　）　
’Ｊ　スー塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）／２０ｍＭ　　Ｎ
ａＣ１／１ｍＭ　　ＥＯＴＡ／４０％（Ｗ／Ｖ）　　シ
ョ糖）０．５−を入れ、その上ニ２．４−ずツ２５％（
Ｗ／Ｖ）、２０％（Ｗ／Ｖ）　、１５％（Ｗ／Ｖ）及び
１０％（Ｗ／Ｖ）の−７１糖液を重層し、温度４℃で２
４時間放置することにより作製した。このシ！ＩＩＩ密
度勾配に、ｓ−ＲＮ　Ａ５０μｇを重層し、ベックマン
社製の５０４１０−ターを用い、常法により３０．００
Ｏｒ、ｐ、ｓ、、温度１８℃で１８時間遠心分離を行っ
た。遠心分離操作ののち、０．５−ずつ分画し、エタノ
ール沈澱法により−ＲＮＡを回収し、ｌＯμｌの水に溶
解した。

次に、−ＲＮＡにコードされている蛋白質を調べること
により、アルカリプロテアーゼ−ＲＮＡが濃縮されてい
る画分の同定を行った０分画したＲＮＡＩ、ｃｚｊ！、
ウサギ網状赤血球ライセード（アマジャム社製）９μｌ
及び（ｓｓ３）メチオニン１μｆ（アマジャム社製）を
混合し、温度３０℃で３０分間反応させたものに、１５
０μｌのＮＥＴ緩衝液（１５０ｍＭ　　ＮａＣ１１５ｍ
Ｍ　　ＥＯＴＡｌｏ、０２％（Ｗ／Ｖ）　　ＮａＮ３／
２０−トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）１０．０５％
（Ｗ／Ｖ）　／ニデットＰ−４０（ベセスダリサーチラ
ボラトリー社製、界面活性剤）〕を添加し、更に、１μ
ｌの抗アルカリプロテアーゼ血清（後述のようにして調
製したもの、）を添加し、温度４℃で１８時間放置した
ものに、１０■のプロティンＡセファロース（ファルマ
シア社製）を添加し、温度２０°Ｃで３０分間放置した
ものを、常法により１２．００Ｏｒ、ｐ、ｍ、で１分間
遠心分離処理し、樹脂、すなわち、上記プロティンＡセ
ファロースを回収した。

回収した樹脂を、２００μｌのＮＥＴ緩衝液で３回洗浄
し、この樹脂に、４０ｕｌの５ＯＳ−ＰＡＧＥ用サンプ
ル緩衝液（６２，５ｇＭ　）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ６
，８）７１０％（Ｖ／Ｖ）グリセロール／２％（Ｗ／Ｖ
）　　ドデシル硫酸ナトリウム１５％（Ｖ／Ｖ）メルカ
プトエタノール７０．０２％（Ｗ／Ｖ）ブロムフェノー
ルブルー〕を添加し、温度１００℃で３分間煮沸し、常
法によりＩＺ、００Ｏｒ、ｐ、ｍ、で１分間遠心分離処
理し、上滑を回収し、全量を１２％（Ｗ／Ｖ）　　ドデ
シル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルに乗せた
。

ゲル電気泳動は、ラエムリ（Ｌａｅｓｓｌｉ）の方法〔
「ネーチュアーＪ　（Ｎａｔｕｒｅ）、第２２７頁、第
６８０頁（１９７０）　）で行い、泳動したのちのゲル
は、１０％（Ｖ／Ｖ）の酢酸に３０分間浸漬し、蛋白質
を固定したのち、水に３０分間浸漬し、更に、１Ｍサリ
チル酸ナトリウム溶液に３０分間浸漬し、乾燥して乾燥
ゲルを得、Ｘ線フィルム（フジ写真フィルム社製、ＲＸ
）を用いてフルオログラフィーを行った。

以上の操作により、アルカリプロテアーゼ■−ＲＮＡの
存在する両分のＲＮＡを用いた場合にのみ、アルカリプ
ロテアーゼ蛋白質のバンドがＸ線フィルム上に認められ
、アルカリプロテアーゼ−ＲＮＡの濃縮されている画分
が同定できた。

（４）抗血清の調製 精製アルカリプロテアーゼに対するウサギの抗アルカリ
プロテアーゼ血清は、以下の方法により調製した。

４０■／−濃度のアルカリプロテアーゼ溶液０．７−を
、等量のフロイント（Ｆｒｅｕｎｄ）完全アジュバント
で懸濁したもの２８■を、抗原として体重２ｋｇの日本
白色種ウサギの視床部に投与し、飼育２週間経過したの
ち、初回と同量の抗原を背部皮肉へ投与し、更に、飼育
１週間経過したのち、同様の操作を行い、また更に、飼
育１週間後全採血を行った。

そして、得られた血液を、温度４℃で１８時間放直重た
ものを、常法により３．００Ｏｒ、ｐ、−、で１５分間
遠心分離し、上清として抗アルカリプロテアーゼ血清を
得た。

（５）ｃ−ＤＮＡの合成 ｃ−ＤＮＡＯ合威は台底マジャム社製キットを用いて行
ったものである。

上述の如くして得られた一ＲＮＡ１．６μｇを用いてア
マジャム社の指示する「モル・セル・パイオルＪ（Ｍｏ
１．Ｃｅ１１　Ｂｉｏｌ、）、第２巻、第１６１頁（１
９８２）及び「ジーンＪ　（Ｇｅｎｅ）、第２５巻、第
２６３頁（１９８３）記載の方法に従い実施した結果、
１６０ｎｇの２本額ｃ−Ｄ　Ｎ　Ａが得られた。

このようにして得たｃ−Ｄ　Ｎ　Ａ　１６０ｎｇに、ア
マジャム社製ｃ−ＤＮＡクローニングキッドを用い、ア
マジャム社の指示する方法により制限酵素ＥｃｏＲ１切
断部位のメチル化を行い、更にｃ−Ｄ　Ｎ　Ａの両端に
ＥｃｏＲＩリンカ−を付着させた。

（５）ｃ−ＤＮＡバンクの作製 プラスミドｐＵｃ１１９　Ｄ　Ｎ　Ａ　（宝酒造社製）
１００ｎｇを、８μｌの水に溶解したものに、１μｌの
Ｍｅｄｉｌ衝液（１００ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（ｐ
　Ｈ７，５）　／　ｌＯｈＭＭｇＣ１ｚ／１０５Ｍジチ
オスレイトール１５００ｍＭ　ＮａＣ１）を添加したの
ち、更に、これに、１０ユニツト　（ｌμｌ）の制限酵
素ＥｃｏＲＩ　（宝酒造社製）を添加し、温度３７℃で
２時間切断処理を行った。

次いで、この切断処理物に、１μｌのＩＭ　トリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ８，０）及び０．３ユニツト（ｌμｌ）
のアルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）を添加し、
温度６５℃で１時間酵素反応処理し、切断処理物の両端
の脱リン酸化を行い、これに、１２μｌの水飽和フェノ
ールを添加して除蛋白を行ったのち、回収した水層に、
ｌｕｉの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，８）及び２６μ
ｌの冷エタノールを夫々添加し、温度−７０℃で１５分
間放置し、微量遠心機［■トミー精工、ＭＲＸ−１５０
］を用い、１２．００Ｏｒ、ｐ、ｍ。

で５分間遠心分離処理を行いＤＮＡを回収した。

このようにして得られた制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、
かつ両端を脱リン酸化したプラスミドベクタｐＵｃ１１
９　Ｄ　Ｎ　Ａ　１１００ｎと、項目（５）で調製した
ｃ−ＤＮＡ　１６０ｎｇを混合したものを、８μｌの水
に懸濁したのち、これに、１μｌのＸ１０ライゲーシヨ
ン緩衝液（２００ｍＭ　ＭｇＣ１ｇ／６６ｍＭ　）リス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）／１０ｍＭ　ＡＴＰ／１５
０■Ｈジチオスレイト−Ｊし〕を添加したものに、１ユ
ニツト（１μ０のＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製））
を添加し、温度１６℃で１６時間放直置、プラスミドベ
クターｐｌＪｃ１１９ＤＮＡ及びｃ−ＤＮＡのライゲー
シッンを行い反応物を得た。

この反応物を用いて、ハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）の方
法〔「ディーエヌエイ・クローニング」　（ＤＮＡＣ１
ｏｎｉＢ）、第１巻、第１０９〜１３５頁（１９８５）
　）により大腸菌０８１株（ＡＴＣＣ３３８４９）を形
質転換し、プラスミドｐＵｃ１１９Ｄ　Ｎ　Ａをベクタ
ーとしたｃ−Ｄ　Ｎ　Ａ　バンクを作製した。

（７）アルカリプロテアーゼｃ−ＤＮＡの断片の検索ハ
イブリダイゼーシゴン・セレクシゴン〔「モレキュラー
・クローニング」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ）、第３２９頁、コールド・スプリング・ハーバ−・
ラボラトリ−（１９８２）　）に従ってアルカリプロテ
アーゼｃ−ＤＮＡの検索を行った。以下に、詳述する。

項目（６）で得られたｃ−ＤＮＡバンクより任意な大腸
菌７０株を選び夫々について以下の操作を行った。

「モレキュラー・クローニングＪ　（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ　Ｃ１゜ｎｉｎｇ）、第８６ｊＬコールド・スプリン
グ・ハーバ−・ラボラトリ−（１９１１１２）記載の方
法により、ｃ−ＤＮＡバンク中の大腸菌から組み換え体
プラスミドＤＮＡ５００μｇを夫々得た。このうち１０
０μｇを、水２００ｕｆに溶解し、温度１００″Ｃで１
０分間放置したのち、水中に移して急冷したものに、２
００μｌの１Ｍ水酸化ナトリウムを添加し、室温にて２
０分間放置し、組み換え体プラスミドＤＮＡの変性液を
得た。

次いで、このようにして得た変性液に、２００μｌの中
和液（１Ｍ塩化ナトリウム１０．３Ｍクエン酸ナトリウ
ム１０．５Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）／ＩＭ
塩酸〕をすばやく添加、混和したのち、氷中へ移して急
冷した。この溶液を、直径５鵬の円形ニトロセルロース
フィルター（ミリボア社製、カタログナンバーＨＩＶＰ
　０２５００）を用いて濾過し、変性した組み換え体プ
ラスもドＤＮＡをニトロセルロースフィルター上に吸着
させたものを、常法により風乾したのち、６　Ｘ５ＳＣ
（０，９？１塩化ナトリウム１０．０９Ｍクエン酸ナト
リウム）を用いて洗浄し、更に常法により風乾したのち
、温度８０℃に保った真空オーブン中で２時間放置し、
組み換え体プラスミドＤＮＡをニトロセルロースフィル
ターへ固定させた。

次いで、１０μ２のハイプリダイゼーシゴン溶液（１０
０μｇｏｄ　ｓ−ＲＮ　Ａ　（項目（２）で調製したも
の〕７６５％（Ｖ／Ｖ）脱イオン化したホルムアミド／
２０１１Ｍ１．４−ビペラジンジエタンスルホン酸（ｐ
Ｈ６，４）１０．２％ドデシル硫酸ナトリウム１０．４
１’ｌ塩化ナトリウム／１００μｇ／＠ｌ酵母ｔ−ＲＮ
Ａ）に、上記の如くして得た組み換え体プラスミドＤＮ
Ａを固定したニトロセルロースフィルターを浸し、温度
５０℃にて３時間放置し、フィルター上の組み換え体プ
ラスミドＤＮＡと−ＲＮＡとのハイフ゛リダイゼーショ
ンを行った０反応終了したフィルターを取り出し１−の
洗浄液１　（１０＋ｗＭｌ−リス−塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ
７，６）　／　０．１５Ｍ塩化ナトリウム／　１　ｍＭ
　ＥＤＴＡｌｏ、５％ドデシル硫酸ナトリウム〕で９回
洗浄したのち、１−の洗浄液ｕ　（ＩＱｍＭ）リス−塩
酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，６）　／　０．１５Ｍ１５Ｍ塩化
ナトリウム／　ＥＤＴＡ）にて２回洗浄を行い、フィル
ター上に固定したプラスミドＤＮＡとハイブリダイズし
ていないｍ−ＲＮＡを除去した。

次いで、このニトロセルロースフィルターを、１００μ
ｌの水中へ移し、１０μｇの酵母ｔ−ＲＮＡを添加して
、１分間１００℃の湯中へ放置し、ドライアイスで冷却
したエタノール中へ移したのち、室温中で放置し溶解し
た。このようにしてハイブリダイズしたｍ−ＲＮＡをニ
トロセルロースフィルターより剥離した。得られた水溶
液に、１０ＩＪｉ！、の３Ｈ酢酸ナトリウム（ｐ）（５
，２）及び３００μｌの冷エタノールを添加し、温度−
７０℃にて１時間放置し、エタノール沈澱を行ったのち
、微量遠心機〔■トミー精工、ＭＲＸ−１５０）を用い
て１２，０ＯＯｒ、ｐ、ｍ、で５分間遠心分離処理して
上記ハイブリダイズした一ＤＮＡを回収した。

次いで、項目（３）に記載したと同様にして、回収した
上記−ＲＮＡにコードされている蛋白質を台底し、項目
（４）で得られた抗アルカリプロテアーゼ血清を用いて
、台底した蛋白質がアルカリプロテアーゼか否かを分析
した。

その結果７０株中１株についてポジティブな結果が得ら
れた。この株の保有する組み換え体プラスミドＤＮＡ（
ρ０ＡＰ３と命名）にはアスペルギルス・オリゼー（Ａ
ＴＣＣ２０３８６）由来のアルカリプロテアーゼｃ−Ｄ
ＮＡの断片が挿入されていると結論できる。

次いで、組み換え体プラスくドρ０＾Ｐ３　ＤＮＡ　１
μｇを項目（６）に記載の方法により制限酵素ＥｃｏＲ
１で処理しアガロースゲル電気泳動法により移動度パタ
ーンを分析し、得られたパターンとプラスミドｐＢＲ３
２２Ｄ　Ｎ　Ａ　（宝酒造社製）を制限酵素Ａｌｕ　Ｉ
により消化して得られたＤＮＡ断片の標準パターンと対
比することにより、組み換え体プラスミドｐＯＡＰ３Ｄ
ＮＡに挿入されているアルカリプロテアーゼｃ−ＤＮＡ
断片の大きさは７５０ｂρであることが判明した。

（８）大きなアルカリプロテアーゼｃ−ＤＮＡの検索項
目（７）で得られたアガロースゲルより７５０ｂρのア
ルカリプロテアーゼｃ−ＤＮＡ断片を含むアガロースゲ
ルを切り出し、透析チューブに入れたものに、５００μ
ｌのＴＥＩｌ衝液（１０＋ｓＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐ
　Ｈ８，０）　／　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ）　）を添加し
たのち、透析チューブをシールし、電気泳動により、ゲ
ル中より緩衝液中にＤＮＡを溶出して得た溶液に、等容
量の水飽和フェノールを添加して撹拌し、水層を回収し
、常法に従ってエタノール沈澱により１１００ｎのＤＮ
Ａを回収した。この１１００ｎのアルカリプロテアーゼ
ｃ−ＤＮＡを、〔α−”　Ｐ　）　ｄＣＴＰ（アマジャ
ム社製）を用いてニックトランスレーション法により標
識した。ニックトランスレーションは、宝酒造社の指示
する「ジエイ・モル・パイオル」（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏ
ｌ、）、第１１３巻、第２３７〜２５１頁（１９７７）
及び「モレキュラー・クローニングＪ　（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）、第１０９〜１１２頁（１９８
２）記載の方法に従った。このようにして調製した！ｔ
ｐで標識したアルカリプロテアーゼｃ−ＤＮＡ断片をプ
ローブとして用い、項目（６）で得たｃ−Ｄ　Ｎ　Ａバ
ンクに対しコロニーハイブリダイゼーション法〔「蛋白
質・核酸・酵素」、第２６巻、第５７５〜５７９頁（１
９８１）　）より検索し、アルカリプロテアーゼｃ−Ｄ
　Ｎ　Ａを有するコロニーを得た。そのうち１個のコロ
ニーの有する組み換え体プラスミドＤＮＡをｐｏａｐ　
５と命名し、項目（７）に従い組み換え体プラスミドＤ
ＮＡを調製した。

該組み換え体プラスミドＤＮＡを含有する大腸菌を大腸
菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　０８１　（ｐＯＡＰ　５　）と命
名した。

なお、該形質転換株は、工業技術院微生物工業技術研究
所に、微工研菌寄第９８７０号（ＦＥＲＭ　Ｐ−９８７
０）として寄託されている。

組み換え体プラスミドｐＯＡＰ５ＤＮＡを項目（６）に
記載の方法と同様にして制限酵素ＥｃｏＲＩで処理し、
アガロースゲル電気泳動を行ったところ、挿入ＤＮＡ断
片の大きさは１．１００ｂｐであることが判明した。そ
して、項目８記載の方法と同様にしてこの１、１ｏｏｂ
ｐのアルカリプロテアーゼｃ−ＤＮＡを含むＤＮＡ断片
０．１μｇを分離、精製した０組み換え体プラスミドｐ
Ｏ＾Ｐ５ＤＮＡを制限酵素Ａｆｌ　Ｉ［、ＥｃｏＲＩ　
、ＫＢＩ　、Ｓａｌ　Ｉ及びＸ＋＋ｎ　［の単一または
二重消化を行い、項目７に記載したと同じ方法にて、現
われた断片の大きさを分析することにより、組み換え体
プラスミドｐＯ＾Ｐ５ＤＮＡの制限酵素地図を作製し、
該地図を第１図に示した。

（９）アルカリプロテアーゼｃ−Ｄ　Ｎ　Ａの塩基配列
の決定 項目（８）で得られた夫々のアルカリプロテアーゼｃ−
ＤＮＡを、画一ののりしろの制限酵素により切断したプ
ラスえドｐＵｃｌＢ及びｐＵｃ１９　Ｄ　Ｎ　Ａ　（宝
酒造社製）にクローニングした。シーフェンシングは、
プラスミドＤＮＡを榊の方法〔「ベクターＤＮＡ」、第
７０頁、講談社（１９８６年）〕に従ってアルカリ変性
させたのち、Ｍ１３シークエンスキット（宝酒造社製）
を用いて常法によりダイデオキシ・チェーン・ターミネ
ーシッン法で行った。

このようにしてアスペルギルス・オリゼー（ＡＴＣＣ２
０３８６）由来のアルカリプロテアーゼｃ−ＤＮＡ断片
の塩基配列を決定し、得られた塩基配列のうち、マチエ
アーなアルカリプロテアーゼに対応する遺伝子の塩基配
列を第２図に、また、前記第２図に示す塩基配列を有す
る遺伝子から翻訳されるポリペブタイドのアミノ酸配列
を第３図に夫々示した。

このＤＮＡ塩基配列より推測されるアミノ酸配列のＮ末
端には精製したアルカリプロテアーゼのＮ末端のアミノ
酸配列１６個（Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌ
ｕＬｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　
Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　５ｅｒ）が確認され
た（第３図下線部）。

以上の知見より第２図に示した塩基配列は、マチエアー
なアルカリプロテアーゼのＮ末端部分よりＣ末端部９迄
をコードしていると結論できる。

００）アルカリプロテアーゼ完全長ｃ−ＤＮＡの検索項
目（９）での塩基配列決定の結果、項目（８）で得られ
た組み換え体プラスミドｐＯＡＰ　５はマチエアーなア
ルカリプロテアーゼのＮ末端部分よりＣ末端部９迄をコ
ードしていたが、それより上流にあると考えられるプレ
プロ領域が欠如していた。そこで、項目（８）と同様に
組み換え体プラスもドｐＯＡＰ　５のアルカリプロテア
ーゼｃ−Ｄ　Ｎ　Ａ断片を単離した後、ニックトランス
レーション法により３ｔｐで標識し、これをプローブと
して項目（６）で得たｃ−Ｄ　Ｎ　Ａバンクに対して再
度コロニーハイブリダイゼーション法により検索し、更
に長いアルカリプロテアーゼｃ−Ｄ　Ｎ　Ａを有するコ
ロニーを得た。そのうち１個のコロニーの有する組み換
え体プラスミドＤＮＡをｐＯＡＰｌｏと命名し、該組み
換え体プラスミドＤＮＡを有する大腸菌を大腸菌（Ｅ、
ｃｏｌｉ）　ＤＨＩ（ｐＯＡＰｌｏ）と命名した０項目
（７）に従い、純化された組み換え体プラスミドｐＯＡ
Ｐ１０．１００μｇを調製した。

組み換え体プラスミドｐＯＡＰ１０　Ｄ　Ｎ　Ａを項目
７に記載の方法と同様にして制限酵素ｔｉｃｏＲＩで処
理し、アガロースゲル電気泳動を行ったところ、挿入Ｄ
ＮＡ断片の大きさは１．５００ｂｐであることが判明し
た。更に組み換え体プラスミドｐＯ＾ＰＩＯＤＮＡを制
限酵素Ａｆｌ　Ｉｆ　、ム冴Ｒ１、幻狙Ｉ、影畦Ｉ　、
Ｘｍｎ　Ｉ、３ｐｎ、Ｂｉｎｄｎｌの単一または二重消
化を行い、項目（７）に記載したと同じ方法にて、現れ
た断片の大きさを分析することにより、組み換え体プラ
ス果ドｐＯＡＰ１０　Ｄ　Ｎ　Ａの制限酵素地図を作製
し、該地図を第４図に示した。

０υ　アルカリプロテアーゼ完全長ｃ−ＤＮＡの塩基配
列の決定 項目ＧＯで得られた組み換え体プラスミドｐｏａｐｉ。

のアルカリプロテアーゼｃ−ＤＮＡ断片を項目（９）と
同様に、同−又は同一ののりしろの制限酵素により切断
したプラスミドｐ［ｆｃｌｇおよびｐＵｃ１９　Ｄ　Ｎ
　Ａにクローニングした。シーフェンシングは項目（９
）と同様にダイデオキシ・チェーンターミネーシゴン法
で行った。

このようにしてアスペルギルス・オリゼー（＾ＴＣＣ２
０３８６）由来のアルカリプロテアーゼｃ−ＤＮＡの塩
基配列を決定し、その全塩基配列を第５図に、また、前
記第５図に示す塩基配列を有する遺伝子から翻訳される
ポリペブタイドのアミノ酸配列を第６図に夫々示した。

第５図は、実施例（ＩＩ）項目に記載の完全長アルカリ
プロテアーゼ（プロプロ型）に対応する遺伝子の塩基配
列を示す０図中、塩基番号５３　（Ａ）〜４１５（Ｔ）
がプレプロ領域を、塩基番号４１６（Ｇ）〜１２６１　
（Ｔ）がマチエアーなアルカリプロテアーゼ遺伝子領域
を示す。

翻訳されるポリペブタイドは４０３アミノ酸からなり、
精製したアルカリプロテアーゼのＮ末端のアミノ酸配列
１６個（Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｌ
ｙｓ　５ｅｒＡｌａ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ
　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　５ｅｒ）は１２２番目から
のアミノ酸配列に一致した（第６図下線部）。

したがって、Ｎ末端から１２１番目までのアミノ酸配列
は、アルカリプロテアーゼの分泌に必要なプレプロ領域
であり、１２２番目から４０３番目までのアミノ酸配列
はマチエアーなアルカリプロテアーゼをコードする領域
である。

以上の知見より第５図に示した塩基配列は、プレプロ領
域までを含んだアルカリプロテアーゼの全ポリペブタイ
ドをコードしていると結論できる。

０２１　−本１１Ｍミｔ１４工体フラスミＦｌ）ＯＡＰ
ＩＯＤＮＡ（７）調製 項目ＯＩで得られたアルカリプロテアーゼｃ−ＤＮＡを
含む組み換え体プラスミドｐＯＡＰ１０　Ｄ　Ｎ　Ａを
含有する大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＤＩ　１　（ｐＯＡ
Ｐｌｏ）より、「メソッズ・イン・エンザイモロジーＪ
　（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第
１５３巻、第３〜１１頁記載の方法を用いて一本鎖組み
換え体プラスミドｐＯＡＰ１０　Ｄ　Ｎ　Ａを調製した
。

０３１　　オリゴヌクレオチドの合成 りＮＡ台底機（ベックマン社製、システムＩＥプラスＤ
ＮＡ合戒ＩＩ）を用い、変異を導入するためにオリゴヌ
クレオチドＡ、Ｂを合成した。オリゴヌクレオチドＡ、
Ｂの構造を第７及び８図に示した。

側　アルカリプロテアーゼｃ−ＤＮＡへの変異の導入 このようにして得られた一本鎖組み換え体プラスミドｐ
ＯＡＰ１０　Ｄ　Ｎ　Ａ及びオリゴヌクレオチドＡＢに
、アマジャム社製オリゴヌクレオチド−ダイレクチイド
・イン・ビトロ・ミュータジェネシス・システム・バー
ジョン・２　（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉ
ｒｅｃｔｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓ
ｉｓ　５ｙｓｔｅｏ＋　ｖｅｒｓｉｏｎ　２）を用い、
アマジャム社の指示する方法により部位特異変異を導入
し変異体アルカリプロテアーゼｃ−ＤＮＡを含む組み換
え体プラスミドＤ　Ｎ　ＡｐＯＡＰ３０及びｐＯ＾Ｐ３
１を取得した。

０５）変異体の塩基配列の決定 プラスミドＤＮＡを榊の方法（「ベクターＤＮＡＪ、第
７０頁、講談社（１９８６年））に従ってアルカリ変性
させたのち、Ｍ１３シークエンスキット　（宝酒造社製
）を用いて常法によりダイデオキシ・チェーン・ターも
ネーション法で行った結果組換え体プラスミドｐＯＡＰ
３０のアルカリプロテアーゼ構造遺伝子中の第１１８〜
１２０番目が野生型ＣＴＣから変異型のＡＴＴに置換さ
れており、また、組換え体プラスミドｐＯＡＰ３１のア
ルカリプロテアーゼ構造遺伝子中の１１８〜１２０番目
が野生型のＧＴＧから変異型のＣＴＧに置換されている
ことが判明した。

０６）分泌発現ベクターの構築 先ず、既にＥｃｏＲＩサイトで基プロモーターとターミ
ネータ−が連結しているＡＡＲ６（ワシントン・・リサ
ーチ・ファウンデーシａンより人手）のＥｃｏＲＩサイ
トにプラスミドｐＯＡＰ１０　Ｄ　Ｎ　Ａ　（特願昭６
３−２８０３７３号特許出願明細書）の１．５　ｋｂの
ＥｃｏＲＩ断片（アルカリプロテアーゼｃ−ＤＮＡ）を
連結し、プラスミドｐＯＡＰ１０３　Ｄ　Ｎ　Ａと命名
した。このプラスミドは、複製起点がＡＲ３Ｉであるた
めに酵母内では不安定であることが予測されたため、複
製起点を２μ■ＤＮＡ由来に変更した。即ち、２μｍＤ
ＮＡ由来の複製起点を有するＡＡＨ５（ワシントン・リ
サーチ・ファウンデーションより入手）とｐＯＡＰ１０
３の影υ旧断片を連結し、プラスミドｐＯＡＰ１０？　
ＤＮＡを得た。このプラスミドは、選択マーカーとして
■幽を用いているためにプラスミドのサイズが１４．２
ｋｂと大きくなっている。そこでプラスミドを小型化す
るために、選択マーカーを４皿から旦■に変更した。即
ち、ｐＯＡＰ１０７のＰｓｔＩ断片（基プロモーター・
アルカリプロテアーゼｃ−ＤＮＡ−■むターミネータ−
を含む）と■皿を選択マーカーとして有するＭＡ５６　
（ワシントン・リサーチ・ファウンデーションより入手
）のＰｓｔＩ断片を連結することにより、プラスミドｐ
ＯＡＰ１０８　Ｄ　Ｎ　Ａを作製した。

まず、ｚ、ルーキシＧＡＰＤＨプロモーターのプラスミ
ドｐＨｃ１９　Ｄ　Ｎ　Ａへのサブクローニングを行っ
た。即ち、ＧＡＰＤＨプロモーターのうち翻訳開始コド
ン（ＡＴＧ）上流を４塩基欠失させたプラスミドｐＴ１
４３（広島大学、東江教授より分譲）のＧＡＰＤＨプロ
モーターを含むＥｃｏＲＩ　−Ｐｓｔ　Ｉ断片をプラス
ミドｐυＣ１９ＤＮＡのＥｃｏＲＩ　−Ｐｓｔ　Ｉサイ
トに挿入することによりプラスミドｐＨＧ４３　Ｄ　Ｎ
　Ａを得た。更に、Ｚ、ルーキシのＧＡＰＤＨターミネ
ータ−を付加するための準備として、プラスミドｐＵＧ
４３　Ｄ　Ｎ　Ａの影注１サイトをＢａｗｌ　Ｉサイト
に変換したプラスミドｐＬＩＢＧ４３　Ｄ　Ｎ　Ａを作
製した０次に、プラスミドｐＵＢＧ４３　Ｄ　Ｎ　Ａへ
のＧＡＰＤＨターミネータ−の付加を行った。１！ＩＩ
ち、ｐＵＢＧ４３をＥｃｏＲＩとＢａｍ＋ＨＩで消化し
、ここにｐＧＡＰ４−Ｚｒ（広島大学、東江教授より分
譲）のＥｃｏＲＩ　−ＢａｍＨＩ断片（ＧＡＰＤＨの終
止コドンの下流約７００ｂｐを含む）を挿入し、ＧＡＰ
ＤＨプロモーターとターミネータ−がＥｃｏＲＩサイト
を介して結合したプラスミドｐＵＧＴ４３４３ＤＮＡを
得た。次に、このプラスミドｐＵＧＴ４３　ＤＮＡの影
遼Ｒ１サイトにプラスミドｐＯＡＰ１０　Ｄ　Ｎ　Ａの
アルカリプロテアーゼｃ−Ｄ　Ｎ　Ａを含む１．５　ｋ
ｂのＥｃ。

Ｒ１断片を挿入し、プラスミドｐＧＡＴ４３　Ｄ　Ｎ　
Ａを得た。

続いて、プラスくドｐＧＡ丁４３ＤＮＡが有するＧＡＰ
ＤＨプロモーター・アルカリプロテアーゼｃ−Ｄ　Ｎ　
Ａ・ＧＡＰＤＨターミネータ−から戒る発現ユニットに
酵母での複製起点と選択マーカーを付加した。即ち、プ
ラスミドｐＯＡＰ１０８　Ｄ　Ｎ　Ａのシ穂ＩＩ−シ虫
■サイト間に、ｐＧＡＴ４３のＢａ５ＨＩ　−力４１断
片を挿入することにとにより、プラスミドｐＯＡＰ１０
６Ｂ　Ｄ　Ｎ　Ａが得られた。プラス〔ドｐＯＡＰ３０
　Ｄ　Ｎ　Ａ及びプラスミドｐＯＡＰ３１ＤＮＡ−ｔ−
シ辻■と」１■　（夫々宝酒造社製）で消化することに
より、変異アルカリプロテアーゼｃ−ＤＮＡのうちの成
熟アルカリプロテアーゼをコードする領域が８６０ｂｐ
のＤＮＡ断片として得られる。

プラスミドｐＯＡＰ１０６Ｂ　Ｄ　Ｎ　Ａを同様にシ江
■とＭユ■で消化した後、常法通り電気泳動によって８
．９ｋｂの断片を得た。次いで、これら二種類のＤＮＡ
断片をライゲーションすることにより、変異アルカリプ
ロテアーゼを酵母で発現させるためのベクターを得た。

プラスミドｐＯＡＰ３０　Ｄ　Ｎ　Ａの断片を組み込ん
だベクターをプラスミドｐＯＡＰ３０１　ＤＮＡプラス
ξドｐＯＡＰ３１　Ｄ　Ｎ　Ａの断片を組み込んだベク
ターをプラスミドｐＯＡＰ３１１　ＤＮＡと命名し、夫
々の制限酵素地図を第９及び１０図に示した。

０′Ｉ）組み換え体プラスミドｐＯＡＰ３０１　Ｄ　Ｎ
　Ａ及びｐＯ＾Ｐ３１１　Ｄ　Ｎ　Ａによる酵母の形質
転換組み換え体プラスミドｐＯ＾Ｐ３０１ＤＮＡ、　Ｐ
ＯＡＰ３１１ＤＮＡを用い、サツカロマイセス・セレビ
シェＮＡ３７−１１Ａ　（大阪大学　大嶋泰治教授より
分譲〉を、ベッグス（Ｂｅｇｇｓ）の方法（「ネイチ’
ｒ　　Ｊ　（Ｎａｔｕｒｅ）、第２７５　！、第１０４
〜１０９頁（１９７８）　）により形質転換し、形質転
換株、サツカロマイセス・セレビシエＮＡ３７−１１＾
（ｐＯＡＰ３０１）及びサツカロマイセス・セレビシェ
ＮＡ３７−１１＾（ｐＯＡＰ３１１）を得た。なお、サ
ツカロマイセス・セレビシェＮＡ３７−１１＾（ｐＯＡ
Ｐ３０１）及びサツカロマイセス・セレビシェＮＡ３７
−１１Ａ（ｐＯＡＰ３１１）は、それぞれ工業技術院微
生物工業技術研究所に微工研菌寄第１１３４５号（ＦＥ
ＲＭ　Ｐ−１１３４５）及び微工研菌寄第１１３４６号
（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１３４６）として寄託されている。

ＯＥＤ　　形質板１１に株、サツカロミセス・セレビシ
ェＮＡ３７−１１＾（ｐＯＡＰ３０１）及びサツカロ累
セス・セレビシェＮＡ−８７−１１＾（ｐＯＡＰ３１１
）によるアルカリプロテアーゼの生産 サツカロミセス・セレビシェＮＮＡ３７−１１Ａ（ｐＯ
ＡＰ３０１）（ＦＥＲＰ−１１３４５）及びサツカロマ
イセス・セレビシェＮＡ３７−１１＾（ｐＯＡＰ３１１
）（ＦＢＲＭ　Ｐ−１１３４６）をＹＰＤ培地（グルコ
ース２０ｇ／　ｌ、ポリペプトン２０ｇ／　Ｉｔ及び酵
母エキス１０ｇ／ｊす　３ｍｌに接種し、温度３０℃で
、１６時間優湯培養し、得られた培養物ＩＭ１を、ＭＸ
Ｒ−１５０型遠心分離機（トミー精工社製）を用いて、
３．００Ｏｒ、ｐ、ｍ、で５分間遠心分離を行った。

得られた培養上澄液についてアンソン−萩原変法（マイ
、ツクシマ（Ｙ、　Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ）　’アグリ・
ンク・パイオル・ケムＪ　（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、
　Ｃｈｅｓｓ、）、第４９巻、第１６４３〜１６４８頁
（１９８５）　）を用いてアルカリプロテアーゼ活性を
測定したところ、夫々のアルカリプロテアーゼ活性は、
１．７　Ｐ、ＩＪ、／＋ｄであった。

なお比較のため、対照としてプラスミドベクターｐＯＡ
Ｐ１０６Ｂ　Ｄ　Ｎ　Ａを有するサツカロマイセス・セ
レビシェＮＡ３７−１１Ａを用い、上記と同様にして培
養及びプロテアーゼ活性の測定を行ったところ、０．Ｉ
Ｐ、Ｕ、／ｙｄであった。

以上より明らかな如く、本発明により得られる培養液は
、対照に比しプロテアーゼ活性が著しく増加しているた
め、本発明に従い上記したサツカロマイセス属に属する
酵母菌体を培養することにより、培地中にアルカリプロ
テアーゼが大量に分泌生産されていることが判明した。

（ＩｔＥｌ　　変異体アルカリプロテアーゼの精製生産
された両度異体アルカリプロテアーゼの精製は、中台ら
の方法（ティ、ナカダイ（Ｔ、Ｎａｋａｄａｉ）「アゲ
リック・バイオ・ケムＪ　（Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃ
ｈｅｍ）第３７巻、第２６８５〜２６９４頁（１９７３
）　）に従い行った。

その結果、野生型アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列
の４０位において、バリンをロイシンまたはイソロイシ
ンに部位特異変異したアルカリプロテアーゼの理化学的
性質は、野生型アルカリプロテアーゼの活性と比較して
夫々的１．６及び１．７倍である以外は、上記文献に記
載されたものと全く同様であり、また、夫々の収量は１
６，０ＯＯＰ、Ｕ、及び２０、０ＯＯＰ、Ｕ、であった
。

【図面の簡単な説明】

第１図は、組み換え体プラスミドｐＯＡＰ５ＤＮＡの制
限酵素地図を示す図であり、第２図は、実施例の（９）
項目に記載のマチエアーなアルカリプロテアーゼに対応
する遺伝子の塩基配列を示す図であり、また、第３図は
、第２図に示す塩基配列を有する遺伝子から翻訳される
ポリペブタイドのアミノ酸配列を示す図である。 第４図は、組み換え体プラスミドｐＯＡＰ１０　Ｄ　Ｎ
　Ａの制限酵素地図である。 第５図は、実施例のＯＤ項目に記載の完全長アルカリプ
ロテアーゼ（プレプロ型）に対応する遺伝子の塩基配列
を示す。図中、塩基番号５３（＾）〜４１５（Ｔ）がプ
レプロ領域を、塩基番号４１６（Ｇ）〜１２６１　（Ｔ
）がマチエアーなアルカリプロテアーゼ遺伝子領域を示
す。 第６図は、第５図に示す塩基配列を有する遺伝子から翻
訳されるポリペブタイドのアミノ酸配列を示す。 第７図は、オリゴヌクレオチドＡの構造を示す。 第８図は、オリゴヌクレオチドＢの構造を示す。 第９図は、組み換え体プラスミドｐＯＡＰ３０１　Ｄ　
ＮＡの制限酵素地図を示す。 第１０図は、組み換え体プラスミドｐＯＡＰ３１１０　
ＮＡの制限酵素地図を示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、野生型アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列の４０
   位において、バリンがロイシンまたはイソロイシンに変
   異されていることを特徴とするアルカリプロテアーゼ。 ２、野生型アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列の４０
   位において、バリンがロイシンまたはイソロイシンに変
   異されているアミノ酸配列をコードするアルカリプロテ
   アーゼ遺伝子。 ３、野生型アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列の４０
   位において、バリンがロイシンまたはイソロイシンに変
   異されているアミノ酸配列をコードするアルカリプロテ
   アーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴と
   する新規な組み換え体ＤＮＡ。 ４、野生型アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列の４０
   位において、バリンがロイシンまたはイソロイシンに変
   異されているアミノ酸配列をコードするアルカリプロテ
   アーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した組み換え体Ｄ
   ＮＡを含み、アルカリプロテアーゼ生産能を有するサッ
   カロマイセス属に属する微生物を、培地に培養し、培養
   物よりアルカリプロテアーゼを採取することを特徴とす
   るアルカリプロテアーゼの製造法。 ５、下記のアミノ酸配列をコードするポリペプチド遺伝
   子発現用ＤＮＡ断片。 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 ６、ポリペプチドがアルカリプロテアーゼである請求項
   ５記載のＤＮＡ断片。