JPH0223871A - プレプロ型アルカリプロテアーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、プレプロ型アルカリプロテアーゼ遺伝子に関
する。

（従来の技術〕 従来、黄麹菌の１種であるアスペルギルス・オリゼー（
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）由来のアルカ
リプロテアーゼ遺伝子の構造については、全く未知であ
り、また、該遺伝子の単離すらされていないのが実情で
ある。

アルカリプロテアーゼは、蛋白質又はその部分加水分解
物に作用して、ペプタイド結合を分解する加水分解酵素
であって、医薬、飲食品、洗剤等広範に用いられている
。

［発明が解決しようとする課題］ そこで、本発明者等は、アルカリプロテアーゼ遺伝子を
提供することを目的としてアスペルギルス・オリゼー由
来のアルカリプロテアーゼ遺伝子について種々検討した
結果、アスペルギルス・オリゼー由来のプレプロ型アル
カリプロテアーゼ遺伝子を初めて単離及び構造決定する
ことに成功し、本発明を完成した。

［課題を解決するための手段〕 本発明は、アスペルギルス属に属する微生物に由来し、
制限酵素開裂地図で規定されるプレプロ型アルカリプロ
テアーゼ遺伝子である。

ＥＨＢＳ　　　　Ｘ　　　　ＫＡＥ （式中、ＥはＥｃｏＲＩ、ＡはＡｆｌｌｌ、　ＫはＫｐ
ｎＩ、ＸはＸｍｎＴ、Ｓは５ａｌｌ、ＢはＢｇｌＩＩ、
　ＨはＨｉｎｄ　ｍを示す） そして、このプロブレ型アルカリプロテアーゼ遺伝子は
下記に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を
有する。

Ｍｅｔ　　Ｇｉｎ　　５ｅｒ Ｌｅｕ　　Ｇｌｙ　　Ａｌａ Ａｌａ　　Ｐｒｏ　　Ｖａｌ Ｇｌｕ　　Ｌｙｓ　　Ｌｅｕ Ｐｈｅ　　Ｌｙｓ　　Ｐｒ。

Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ Ｈｉｓ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ Ｔｈｒ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｙ Ａｒｇ　　Ａｓｎ　Ｔｙｒ Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ　　ｌ１ｅ Ａｓｐ　Ｇｌｙ　　Ｌｅｕ Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　　Ｌｅｕ ｌｉｅ　　Ｌｙｓ　　Ａｒｇ ｌｉｅ　　Ｌｅｕ　　Ｐｒ。

Ｇｉｎ　　Ｇｌｕ　　Ｔｈｒ Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　　Ｌｙｓ Ｇｌｙ　　Ｔｉｅ　　Ａｓｐ Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｐｒ。

Ｌｙｓ　　Ｉｌｅ　Ａｓｎ Ａｒｇ　　Ｌｙｓ　　Ａｓｎ Ｔｈｒ　　Ｔｈｒ　　Ｇｌｎ Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　　１ｉｅ Ｔｈｒ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ Ａｌａ　　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ Ａｒｇ　Ａｒｇ　　Ａｌａ Ｔｙｒ　　Ｉｌｅ　　Ｖａｌ Ｇｌｕ　　Ａｌａ　　Ｌｙｓ Ａｌａ　　Ｔｈｒ　　Ａｓｎ Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ Ｖａｌ　　Ｇｌｙ　　Ｔｉｅ Ｌｙｓ　　Ｐｈｅ　Ａｌａ Ｇｌｕ　　Ａｓｐ　　Ｖａｌ Ｌｙｓ　　Ｓｅｒ　　Ａｌａ Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｌｙｓ １ａ Ｐｒ。

１ｙ Ｇｌｎ　　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　
　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　ＴｈｒＬｅｕ　　Ａｓｐ　
Ｇｌｙ　　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　　Ａｌａ
　　Ａｓｎ　Ａｓｐ八ｌへ　　Ａｌａ　　Ｇｌｙ　　Ａ
ｓｎ　　Ｇｌｕ　　Ａｓｎ　　Ｓｅｒ　　Ａｓｐ　　Ａ
ｌａ　　Ｇｌｙｌｌｅ　　Ｔｈｒ　　Ｖａｌ　　Ａｌａ
　　Ａｌａ　　Ｉｌｅ　　Ｇｌｎ　　Ｌｙｓ　　Ｓｅｒ
　　Ａｓｎ八ｓへ　　Ａｒｇ　　Ａｌａ　　Ｓｅｒ　　
Ｐｈｅ　　Ｓｅｒ　　Ａｓｎ　　Ｐｈｅ　　Ｇｌｙ　　
Ｌｙｓｌｌｅ　　Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ　　Ａｌａ　　Ｔｒ
ｐ　　ｌｉｅ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　　５ｅｒＡｌ
ａ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌ
ｙ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ以下、本発明の詳細な説明
する。

先ず、本発明の遺伝子のドナーとして用いられるアスペ
ルギルス・オリゼーとしては、例えば、アスペルギルス
・オリゼー（ＡＴＣＣ２０３８６）等が挙げられる。

次いで、上記微生物を、特公昭４８−３８８７３号公報
記載の方法と全く同様にして培養し、培養物を得、該培
養物から常法、例えば、濾過、遠心分離処理等によりア
スペルギルス・オリゼーの菌体を得る。

上記アスペルギルス・オリゼーの菌体よりｍ−ＲＮＡを
調製するには、例えば、菌体の破砕の際、ガラスピーズ
及びフェノールを用いる以外は、例えば、「モレキュラ
ー・クローニングＪ　　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ＣＩｏ
ｎｉＢ）、第１９６頁、コールド・スプリング−バー　
バー−ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ
ｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）　（１９８２）及び「分
子遺伝学実験法」、小関冶男、志村令部、第６６〜６７
頁（１９８３）記載の方法等により得ることができる。

得られたｍ−ＲＮＡよりアルカリプロテアーゼをコート
するｚ−ＲＮＡ（以下、アルカリプロテアーゼｍ−ＲＮ
　Ａという）を濃縮するには、例えば、［バイオメディ
カル・リサーチ（Ｂｉｏｍｅｄ　ｉｃａ　ｌＲｅ５ｅａ
ｒｃｈ）　Ｊ第３巻、第５３４〜５４０頁（１９８２）
記載の方法により行うことができる。

なお、この際、アルカリプロテアーゼに対する抗アルカ
リプロテアーゼ血清を使用するのであるが、該血清は、
例えば、「免疫化学」、山村雄−第４３〜５０頁（１９
７３）記載の方法により得ることができる。

アルカリプロテアーゼｍ−ＲＮ　Ａよりｃ−ＤＮＡを合
成するには、例えば、［モル・セル・パイオル」（Ｍｏ
１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）、第２巻、第１６１頁（１
９８２）及び１ジーンＪ　（Ｇｅｎｅ）、第２５巻、第
２６３頁（１９８３）記載の方法により行うことができ
る。

次いで、このようにして得られたｃ−Ｄ　Ｎ　Ａをベク
ターＤＮＡ、例えば、プラスミドｐｌＪｃ１１９Ｄ　Ｎ
　Ａ（宝酒造社製）等に組み込み、種々の組み換え体プ
ラスミドＤＮＡを得、該ＤＮＡを用いて例えば、大腸菌
（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｄ　Ｈ１（ＡＴＣＣ３３８４９）、
大腸菌（Ｅ。

ｃｏｌｉ）　ＨＢ　１０１（ＡＴＣＣ３３６９４）等を
ハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）の方法〔「ディーエヌエイ
・クローニングＪ（Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　、
第１巻、第１０９〜１３５頁（１９８５）　）により形
質転換し、種々の形質転換株を得る。

上記の種々な形質転換株よりアルカリプロテアーゼをコ
ードするｃ−ＤＮＡ（以下、アルカリプロテアーゼｃ−
Ｄ　Ｎ　Ａという）を検出するには、ハイブリダイゼー
ション・セレクション〔「モレキュラー・クローニング
Ｊ　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　、第３
２９〜３３３頁及び第３４４〜３４９頁、コールド・ス
プリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒ
ｉｎｇｌａｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２
年）〕により検出することができる。

次いで、不完全なアルカリプロテアーゼｃ−ＤＮＡをｉ
ｚｐを用いニックトランスレーション法〔「モレキュラ
ー・クローニングＪ　（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉ
ｎｇ）、第１０９〜１１２頁、コールド・スプリング・
ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１
ａｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）　（１９８２年）、及
び「ジヱイ・モル・パイオルＪ　（Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉ
ｏｌ、）、第１１３巻、第２３７〜２５１頁（１９７７
）　）により標識したのち、該ｃ−ＤＮＡをプローブと
してコロニーハイブリダイゼーション法〔「蛋白質・核
酸・酵素」、第２６巻、第５７５〜５７９頁（１９８１
）　）によりプラスミドｐＵｃ１１９　Ｄ　Ｎ　Ａをベ
クターとして作成したｃ−Ｄ　Ｎ　Ａのシーンバンクの
ライブラリーより１．５Ｋｂのアルカリプロテアーゼｃ
−Ｄ　Ｎ　Ａを含有するプラスミドＤＮＡを得ることが
できる。

そして、このようにして得られた組み換え体プラスミド
ＤＮＡよりアスペルギルス・オ゛リゼー由来のアルカリ
プロテアーゼをコードする遺伝子においてプレプロ領域
を有するもの（以下、プレプロ型アルカリプロテアーゼ
遺伝子という）を含有するＤＮＡを得るには、該プラス
ミドＤＮＡに、制限酵素、例えばＥｃｏＲＩを温度３０
〜４０°Ｃ１好ましくは３７°Ｃで１〜２４時間、好ま
しくは２時間作用させ、得られた反応終了液を、アガロ
ースゲル電気泳動法〔「モレキュラー・クローニング」
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　、第１５０
頁、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（
Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ）（１９８２）記載〕によりアスペルギルス・オ
リゼー由来のプレプロ型アルカリプロテアーゼ遺伝子を
含有するＤＮＡを得ることができる。

そして、このプレプロ型アルカリプロテアーゼ遺伝子の
塩基配列の決定を実施例の第１１項目に示すような方法
によって行い（第５図参照）、ついで、前記塩基配列を
有する遺伝子によって翻訳されるポリペブタイドのアミ
ノ酸配列を確定する（第６図参照）。

このようにして確定されたアミノ酸配列をコードする遺
伝子が本発明の遺伝子である。

また、本発明遺伝子の塩基配列としては第５図中塩基番
号５３　（Ａ）〜１２６１（Ｔ）で示されることが好ま
しい。

〔発明の効果］ 上述したことから明らかな如く、本発明によれば、本発
明プレプロ型アルカリプロテアーゼ遺伝子の組み込まれ
た組み換え体ＤＮＡを含む、例えば微生物を培地に培養
することにより、極めて短期間のうちに、アルカリプロ
テアーゼを効率よく得ることができ、また上記遺伝子は
、蛋白質工学用試料と用いることができるので本発明は
産業上極めて有用なものである。

〔実施例］ 以下、本発明を実施例を挙げて更に詳細に説明する。

実施例 黄麹菌アスペルギルス・オリゼー（ＡＴＣＣ２０３８６
）由来のプレプロ型アルカリプロテアーゼｃ−ＤＮＡの
クローニング １、菌体の取得 黄麹菌アスペルギルス・オリゼー（ＡＴＣＣ２０３８６
）の胞子（１，２Ｘ１０”個）を、アルカリプロテアー
ゼ生産培地〔３％（Ｗ／Ｖ）加熱、加圧膨化処理した脱
脂大豆、３％（Ｗ／Ｖ）ＫＨ，Ｐｏ４）　５０ｍ１に接
種し、恒温振盪機（大洋科学工業社製、Ｍ−１００’　
”）を用いて１２Ｏｒ、ｐ、ｍ、　、温度３０°Ｃで４
５時間振盪培養を行ない培養物を得、常法によりこの培
養物を濾過して菌体Ｌｏｇを得た。

２、ｍ−ＲＮＡの取得 項目１で得られた菌体１０ｇを、２０ｍ／のグアニジン
イソチオシアネート溶液（６Ｍグアニジンイソチオシア
ネート／３７．５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７，０
）　１０．７５％（Ｗ／Ｖ）　Ｎ−ラウ０　イＢ／ザル
コシンナトリウム１０．１５Ｍ　β−メルカプトエタノ
ール）に添加したものを、カップ型ブレンダー（日本精
機製作所社製）に入れ、更に、Ｌｏｇのガラスピーズ（
直径０．５ｍｍ）を添加し、１０．０ＯＯｒ、ｐ、ｍ、
で５分間処理したのち、また更に、１０ｒｎｌの水飽和
フェノールを添加し、１０．００Ｏｒ、ｐ、ｍ、で１０
分間処理して菌体を破砕処理し、破砕物を得た。

このようにして得られた破砕物を冷却遠心機（日立１機
社製、１８ＰＲ−５２）を用いて５．００Ｏｒ、ｐ、ｍ
、で１０分間遠心分離処理して、菌体破砕液２０ｒｎｌ
を得た。

次いで、超遠心分離機用チューブ（日立１機社製）４本
に、予め１．２　ｍｌの５．７Ｍの塩化セシウム溶液を
夫々重層し、その上に、上記菌体破砕液を重層するよう
に夫々分注し、超遠心分離機（日立１機社製、５ｃＰ５
５Ｈ）を用いて温度１５°Ｃ１３０，００Ｏｒ、ｐ、ｍ
、で１６時間遠心分離して沈：Ｒ物を得た。

得られた沈澱物を、冷７０％（Ｖ／Ｖ）エタノールを用
いて洗浄したものを、１０ｍＭトリス緩衝液（１０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）１５ｍＭ　ＥＤＴＡ
／　１％ドデシル硫酸ナトリウム）４／に懸濁したもの
に、同量のｎ−ブタノール及びクロロフォルムを４対１
（容量比）となる如く混合したものを添加して抽出し、
常法により３，０ＯＯｒ、ｐ、ｍ、で１０分間遠心分離
し、水層及び有機溶媒層に分離し、この有機溶媒層に上
記１１０１ＩＩトリス緩衝液４−を添加し、上記抽出及
び分離操作を行う操作を２回繰り返して得られた水層に
、１７１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，２）及び
２倍量の冷エタノールを添加したものを温度−２０°Ｃ
で２時間放置したのち、常法により８゜０００ｒ、ｐ、
ｍ、で２０分間遠心分離し、ＲＮＡを沈澱させ、得られ
たＲＮＡを４艷の水に溶解し、上記エタノール沈澱操作
を行ったのち、得られたＲＮＡを１ｍｆの水に溶解し、
１２■のＲＮＡを得た。

このＲＮＡ中よりｍ−ＲＮＡを選択するために、１２　
ｍｇのＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）−セル０−ス　にュー
イングランドハイオラボ社製）カラムクロマトグラフィ
ーにかけた。

カラムとして２．５コテルモシリンジ（テルモ社製）を
用い、樹脂０．５ｇは、溶出緩衝液（１０ｍＭ　）リス
−塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，６）　／　１ｍＭ　ＥＤＴＡ
／　０．１％（讐／Ｖ）　　ドデシル硫酸ナトリウム〕
で膨潤させたのち、カラムに充填し、結合緩衝液（１０
ｍＭ　）リス−塩酸（ｐＨ７，６）／　１ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ／　０．４　Ｍ　ＮａＣ１／　ｏ、　１％ドデシル硫
酸ナトリウム］で平衡化したものである。

１２■のＲＮＡに、同量の緩衝液〔１１０１ＩＩトリス
−塩酸（ｐＨ７，６）／　１ｍＭ　ＥＤＴＡ／　０．８
　Ｍ　ＮａＣ１／　ｏ、　１％ドデシル硫酸ナトリウム
］を添加し、温度６５°Ｃで１０分間加熱処理し、水中
で急冷し、オリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムにかけた
のち、結合緩衝液で樹脂を洗浄し、未結合のｒ−ＲＮＡ
及びｔ−ＲＮＡを完全に洗浄し、更に、溶出緩衝液でｍ
−ＲＮＡを溶出し、９０％ｇのｍ−ＲＮＡを得た。

３、アルカリプロテア・−ゼｍ−ＲＮ　Ａの濃縮衣に、
ショ糖密度勾配遠心分離法によりアルカリプロテアーゼ
ｍ−ＲＮＡを濃縮した。

１０〜２５％（Ｗ／Ｖ）のショ糖密度勾配は、ベックマ
ン社製のローターＳ　Ｗ４１用ポリアロマチューブに４
０％（Ｗ／Ｖ）シーｙ　ｔＦ’液（５０ｍＭ　）リス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）／２０ｍＭ　ＮａＣｌ　７１
ｍＭ　ＥＤＴＡ／４０％（Ｗ／Ｖ）　　ショ糖）０．５
−を入れ、その上ニ２．４　ｍｊずツ２５％（Ｗ／Ｖ）
、２０％（Ｗ／Ｖ）　、１５％（−ハ）及び１０％（Ｗ
／Ｖ）　（Ｄ　’ｉ　ヨ糖液を重層し、温度４°Ｃで２
４時間放置することにより作製した。このショ糖密度勾
配に、ｍ−ＲＮ　Ａ５０μｇを重層し、ベックマン社製
のＳ　Ｗ４１０−ターを用い、常法により３０．００Ｏ
ｒ、ｐ、ｍ、、温度１８”Ｃで１８時間遠心分離を行っ
た。遠心分離操作ののち、０．５ｄずつ分画し、エタノ
ール沈澱法によりｍ−ＲＮＡを回収し、１０μｌの水に
溶解した。

次に、ｍ−ＲＮＡにコードされている蛋白質を調べるこ
とにより、アルカリプロテアーゼｍ−ＲＮ　Ａが濃縮さ
れている両分の同定を行なった。分画したＲＮＡＩμ！
、ウサギ網状赤血球ライセード（アマジャム社製）９μ
！及び（３５３）メチオニン１μ！（アマジャム社製）
を混合し、温度３０°Ｃで３０分間反応させたものに、
１５０μｌのＮＥＴ緩衝液（１５０ｍＭ　ＮａＣ１１５
ｍＭ　ＥＤＴＡｌｏ、０２％（Ｗ／Ｖ）ＮａＮｚ／２０
ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐ）１７．４）１０．０５％
（Ｗ／Ｖ）ノニデットＰ−４０（ベセスダリサーチラボ
ラトリー社製、界面活性剤）〕を添加し、更に、１μｌ
の抗アルカリプロテアーゼ血清（後述のようにして調製
したもの。）を添加し、温度４°Ｃで１８時間放置した
ものに、１０■のプロティンＡセファロース（ファルマ
シア社製）を添加し、温度２０°Ｃで３０分間放置した
ものを、常法により１２，０ＯＯｒ、ｐ、ｍ、で１分間
遠心分離処理し、樹脂、すなわち、上記プロティンＡセ
ファロースを回収した。

回収した樹脂を、２００μ２のＮＥＴ緩衝液で３回洗浄
し、この樹脂に、４０μｌの５ＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプ
ル緩衝液［６２，５ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ
６，８）　／　１０％（Ｖ／Ｖ）グリ−ｆ＝　Ｏ−）Ｌ
／／　２％（Ｗ／Ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム１５％（
Ｖ／Ｖ）メルカプトエタノール１０．０２％（Ｗ／Ｖ）
ブロムフェノールブルー〕を添加し、温度１００°Ｃで
３分間煮沸し、常法により１２．００Ｏｒ、ｐ、ｍ、で
１分間遠心分離処理し、上清を回収し、全量を１２％（
Ｗ／Ｖ）　　ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア
ミドゲルに乗せた。

ゲル電気泳動は、ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）の方法〔
「ネーチュアーＪ　Ｎａｔｕｒｅ）　、第２２７頁、第
６８０頁（１９７０）　）で行ない、泳動したのちのゲ
ルは、１０％（Ｖ／Ｖ）の酢酸に３０分間浸漬し、蛋白
質を固定したのち、水に３０分間浸漬し、更に、１Ｍサ
リチル酸ナトリウム溶液に３０分間浸漬し、乾燥して乾
燥ゲルをｆＬＸ＆！フィルム　（フジ写真フィルム社製
、ＲＸ）を用いてフルオログラフィーを行った。

以上の操作により、アルカリプロテアーゼｍ−ＲＮＡの
存在する両分のＲＮＡを用いた場合にのみ、アルカリプ
ロテアーゼ蛋白質のバンドがＸ線フィルム上に認められ
、アルカリプロテアーゼトＲＮＡの濃縮されている画分
が同定できた。

４、抗血清の調製 精製アルカリプロテアーゼに対するウサギの抗アルカリ
プロテアーゼ血清は、以下の方法により調製した。

４０ｍｇ／ｍ１４度のアルカリプロテアーゼ溶液０．７
−を、等量のフロイント（Ｆｒｅｕｎｄ）完全アジュバ
ントで懸濁したもの２８■を、抗原として体重２　ｋｇ
の日本白色種ウサギの視床部に投与し、飼育２週間経過
したのち、初回と同量の抗原を背部皮内へ投与し、更に
、飼育１週間経過したのち、同様の操作を行い、また更
に、飼育１週間後全採血を行った。

そして、得られた血液を、温度４°Ｃで１８時間放置し
たものを、常法により３．００Ｏｒ、ｐ、ｍ、で１５分
間遠心分離し、上清として抗アルカリプロテアーゼ血清
を得た。

５、ｃ−ＤＮＡの合成 ｃ−Ｄ　Ｎ　Ａの合成は、アマジャム社製キットを用い
て行ったものである。

上述の如くして得られたｍ−ＲＮＡ１．６μｇを用イテ
アマシャム社の指示する［モル・セル・パイオルＪ　（
Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）、第２巻、第１６１頁
（１９８２）及び１ジーン」（Ｇｅｎｅ）、第２５巻、
第２６３頁（１９８３）記載の方法に従い行った結果、
１６０ｎｇの２本鎖ＣＤＮＡが得られた。

このようにして得たｃ−Ｄ　Ｎ　Ａ　１６０ｎｇに、ア
マジャム社製ｃ−Ｄ　Ｎ　Ａクローニングキッドを用い
、アマジャム社の指示する方法により制限酵素ＥｃｏＲ
■切断部位のメチル化を行い、更にｃ−Ｄ　Ｎ　Ａの両
端に１並Ｒ１リンカ−を付着させた。

６、ｃ−ＤＮＡバンクの作製 プラスミドｐＵｃ１１９ＤＮＡ　（宝酒造社製）１００
ｎｇを、８μｌの水に溶解したものに、１μｌのＭｅｄ
　緩衝液［１００ｍＭ　　トリス−塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ
７、５）　／　１００ｍＭＭｇＣｈ／１０ｍＭジチオス
レイトール／　５００ｍＭ　ＮａＣｌ　）を添加したの
ち、更に、これに、１０ユニツト　（１μｍ）の制限酵
素立並Ｒ１（宝酒造社製）を添加し、温度３７°Ｃで２
時間切断処理を行った。

次いで、この切断処理物に、ｌｕｌのＩＭ　トリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ８，０）及び０．３ユニツト　（１μｌ
）のアルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）を添加し
、温度６５°Ｃで１時間酵素反応処理し、切断処理物の
両端の脱リン酸化を行い、これに、１２μｌの水飽和フ
ェノールを添加して除蛋白を行ったのち、回収した水層
に、ｌμでの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，８）及び２
６μ２の冷エタノールを夫々添加し、温度−７０″Ｃで
１５分間放置し、微量遠心機〔■トミー精工、ＭＲＸ−
１５０１を用い、１２．００Ｏｒ、ｐ、ｍ。

で５分間遠心分離処理を行いＤＮＡを回収した。

このようにして得られた制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、
かつ両端を脱リン酸化したプラスミドベクターｐＵｃ１
１９　Ｄ　Ｎ　Ａ　１１００ｎと、項目５で調製したＣ
Ｄ　Ｎ　Ａ　１６０％ｇを混合したものを、８μｌの水
に懸濁したのち、これに、１μｌのライゲーション緩衝
液（２０ｍＭ　ＭｇＣｈ／６６ｍＭ　）リス−塩酸緩衝
液（ｐＨ７，６）　／　１　ｍＭ＾ＴＰ／１５ｍＭジチ
オスレイトール〕を添加したものに、１ユニツト　（１
μｆ！、）の７４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製））を添
加し、温度１６°Ｃで１６時間放置し、プラスミドベク
ターＤＮＡ及びＣＤＮＡのライゲーションを行ない反応
物を得た。

この反応物を用いて、ハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）の方
法〔「ディーエヌエイ・クローニングＪ　　（ＤＮＡＣ
ｌｏｎｉｎｇ）、第１巻、第１０９〜１３５頁（１９８
５）　〕により大腸菌ＤＨＩ株（ＡＴＣＣ３３８４９）
を形質転換し、プラスミドρＵＣ１１９Ｄ　Ｎ　Ａをベ
クターとしたｃ−Ｄ　Ｎ　Ａバンクを作製した。

７、アルカリプロテアーゼｃ−ＤＮＡの断片の検索ハイ
ブリダイゼーション・セレクション〔「モレキュラー・
クローニングＪ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ
）、第３２９頁、コールド・スプリング・バーバー・ラ
ボラトリ−（１９８２）　）に従ってアルカリプロテア
ーゼｃ−ＤＮＡの検索を行った。以下に、詳述する。

項目６で得られたｃ−Ｄ　Ｎ　Ａバンクより任意な大腸
菌７０株を選び夫々について以下の操作を行った。

「モレキュラー・クローニング」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
　Ｃ１゜ｎｉｎｇ）　、第８６頁、コールド・スプリン
グ・バーバー・ラボラトリ−（１９８２）記載の方法に
より、ｃ−ＤＮＡバンク中の大腸菌から組み換え体プラ
スミドＤＮＡ５００μｇを夫々得た。このうち１００μ
ｇを、水２００μｌに溶解し、温度１００°Ｃで１０分
間放置したのち、水中に移して急冷したものに、２００
μｌの１Ｍ水酸化ナトリウムを添加し、室温にて２０分
間放置し、組み換え体プラスミドＤＮＡの変性液を得た
。

次いで、このようにして得た変性液に、２００μ！の中
和液［１Ｍ塩化ナトリウム１０．３Ｍクエン酸ナトリウ
ム１０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）／ＩＭ
塩酸〕をすばやく添加、混和したのち、氷中へ移して急
冷した。この溶液を、直径５ｍｍの円形ニトロセルロー
スフィルター（ミリポア社製、カタログナンバーＨＡＷ
Ｐ　０２５００）を用いて濾過し、変性した組み換え体
プラスミドＤＮＡをニトロセルロースフィルター上に吸
着させたものを、常法により風乾したのち、６　Ｘ５Ｓ
Ｃ（０，９Ｍ塩化ナトリウム１０．０９Ｍクエン酸ナト
リウム）を用いて洗浄し、更に常法により風乾したのち
、温度８０°Ｃに保った真空オーブン中で２時間放置し
、組み換え体プラスミドＤＮＡをニトロセルロースフィ
ルターへ固定させた。

次いで、１０μｌのハイブリダイゼーション溶液（１０
００μｌｍｌ　ｍ−ＲＮＡ　（項目２で調製したもの）
７６５％（Ｖ／Ｖ）脱イオン化したホルムアミド７２０
ｍＭ１．４−ピベラジンジエタンスルホン酸（ｐＨ６，
４）１０．２％ドデシル硫酸ナトリウム１０．４Ｍ塩化
ナトリウム／１００　ｕ　ｇ／ｗＩ酵母ｔ−ＲＮＡ：ｌ
に、上記の如くして得た組み換え体プラスミドＤＮＡを
固定したニトロセルロースフィルターを浸し、温度５０
°Ｃにて３時間放置し、フィルター上の組み換え体プラ
スミドＤＮＡとｍ−ＲＮＡとのハイブリダイゼーション
を行った。反応終了したフィルターを取り出し１成の洗
浄液１［１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）１
０．１５Ｍ塩化ナトリウム／１ｍＭ　ＥＤＴＡｌｏ、　
５％ドデシル硫酸ナトリウム］で９回洗浄したのち、１
ｍ！の洗浄液Ｕ　（１０ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，６）１０．１５　Ｍ塩化ナトリウム／１ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡ　）にて２回洗浄を行い、フィルター上に固定し
たぶらすみどＤＮＡとハイブリダイズしていないｍ−Ｒ
Ｎ化を除去した。

次いで、このニトロセルロースフィルターを、１００μ
ｌの水中へ移し、１０μｇの酵母ｔ−ＲＮＡを添加して
、１分間１００°Ｃの湯中へ放置し、ドライアイスで冷
却したエタノール中へ移したのち、室温中で放置し溶解
した。このようにしてハイブリダイズしたｍ−ＲＮＡを
ニトロセルロースフィルターより剥離した。得られた水
溶液に、１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，２）
及び３００　μ！の冷エタノールを添加し、温度−７０
°Ｃにて１時間放置し、エタノール沈澱を行ったのち、
微量遠心［■トミー精工、ＭＲＸ−１５０）を用いて１
２．０ＯＯｒ、ｐｏｍ、で５分間遠心分離処理して上記
ハイブリダイズしたｍ−ＲＮＡを回収した。

次いで、項目３に記載したと同様にして、回収した上記
ｍ−ＲＮ　Ａにコードされている蛋白質を合成し、項目
４で得られた抗アルカリプロテアーゼ血清を用いて、合
成した蛋白質がアルカリプロテアーゼか否かを分析した
。

その結果７０株中１株についてポジティブな結果が得ら
れた。この株の保有する組み換え体プラスミドＤＮＡ（
ｐＯＡＰ３と命名）にはアスペルギルス。

オリゼー（ＡＴＣＣ２０３８６）由来のアルカリプロテ
アーゼｃ−Ｄ　Ｎ　Ａの断片が挿入されていると結論で
きる。

次いで、組み換え体プラスミドｐＯＡＰ３　Ｄ　ＮＡ　
１μｇを項目６に記載の方法により制限酵素ＥｃｏＲＩ
で処理しアガロースゲル電気泳動法により移動度パター
ンを分析し、得られたパターンとプラスミドｐＢＲ３２
２Ｄ　Ｎ　Ａ　（宝酒造社製）を制限酵素ＡｌｕＩによ
り消化して得られたＤＮＡ断片の標準パターンと対比す
ることにより、組み換え体プラスミドｐＯＡＰ３ＤＮＡ
に挿入されているアルカリプロテアーゼｃ−Ｄ　Ｎ　Ａ
断片の大きさは７５０ｂｐであることが判明した。

８、大きなアルカリプロテアーゼｃ−Ｄ　Ｎ　Ａの検索
項目７で得られたアガロースゲルより７５０ｂｐのアル
カリプロテアーゼｃ−ＤＮＡ断片を含むアガロースゲル
を切り出し、透析チューブに入れたものに、５００μｌ
のＴＥ緩衝液［：１０ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（ｐ　
Ｈ８，０）　／　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ）　）を添加した
のち、透析チューブをシールし、電気泳動により、ゲル
中より緩衝液中にＤＮＡを溶出して得た溶液に、等容量
の水飽和フェノールを添加して撹拌し、水層を回収し、
常法に従ってエタノール沈澱により１１００ｎのＤＮＡ
を回収した。この１１００ｎのアルカリプロテアーゼｃ
−ＤＮＡを、〔ａ−”Ｐ）　ｄＣＴＰ　（７マシヤムｌ
）を用いてニックトランスレーション法により標識した
。ニックトランスレーションは、宝酒造社の指示する「
ジェイ９モル・パイオル」（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）
、第１１３巻、第２３７〜２５１頁（１９７７）及び［
モレキュラー・クローニングＪ　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第１０９〜１１２頁（１９８２）記
載の方法に従った。このようにして調製した３Ｚｐで標
識したアルカリプロテアーゼｃ−Ｄ　Ｎ　Ａ断片をプロ
ーブとして用い、項目６で得たｃ−Ｄ　Ｎ　Ａパンクに
対しコロニーハイブリダイゼーション法〔［蛋白質・核
酸・酵素」、第２６巻、第５７５〜５７９頁（１９８１
）　）より検索し、アルカリプロテアーゼｃ−Ｄ　Ｎ　
Ａを有するコロニーを得た。そのうち１個のコロニーの
有する組み換え体プラスミドＤＮＡをｐＯＡＰ　５と命
名し、項目７に従い組み換え体プラスミドＤＮＡを調製
した。

該組み換え体プラスミドＤＮＡを含有する大腸菌を大腸
菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｄ　Ｈ１（ｐＯＡＰ　５）と命名
した。

なお、該形質転換株は、工業技術院微生物工業技術研究
所に、微工研菌寄第９８７０号（ＦＥＲＭ　Ｐ−９８７
０）として寄託されている。

組み換え体プラスミドｐＯＡＰ５ＤＮＡを項目６に記載
の方法と同様にして制限酵素ＥｃｏＲＩで処理し、アガ
ロースゲル電気泳動を行ったところ、挿入ＤＮＡ断片の
大きさは１，１００ｂｐであることが判明した。そして
、項目８記載の方法と同様にしてこの１，１００ｂｐの
アルカリプロテアーゼｃ−ＤＮＡを含むＤＮＡ断片０．
１μｇを分離、精製した。組み換え体プラスミドｐＯＡ
Ｐ５ＤＮＡを制限酵素ＡｆｌＩＩ、足並Ｒ１，に凹１，
５ａｌｌ及び又訓Ｉの単一または二重消化を行い、項目
７に記載したと同じ方法にて、現われた断片の大きさを
分析することにより、組み換え体プラスミドｐＯＡＰ５
ＤＮＡの制限酵素地図を作製し、該地図を第１図に示し
た。

９、アルカリプロテアーゼｃ−ＤＮＡの塩基配列の決定 項目８で得られた夫々のアルカリプロテアーゼｃ−ＤＮ
Ａ断片を、同−又は同一ののりしろの制限酵素により切
断したプラスミドｐＵｃ１８及びｐＵｃ１９ＤＮＡ　（
宝酒造社製）にクローニングした。シーフェンシングは
、プラスミドＤＮＡを榊の方法（［ベクターＤＮＡ、、
第７０頁、講談社（１９８６年）〕に従ってアルカリ変
性させたのち、Ｍ１３シークエンスキット（宝酒造社製
）を用いて常法によりダイデオキシ・チェーン・ターミ
ネーション法で行った。

このようにしてアスペルギルス・オリゼー（ＡＴＣＣ２
０３８６）由来のアルカリプロテアーゼｃ−Ｄ　Ｎ　Ａ
断片の塩基配列を決定し、得られた塩基配列のうち、マ
チュアーなアルカリプロテアーゼに対応する塩基配列を
第２図に、また、前記第２図に示す塩基配列を有する遺
伝子から翻訳されるポリペブタイドのアミノ酸配列を第
３図に夫々示した。

このアミノ酸配列をコードする遺伝子が本発明の遺伝子
である。

このＤＮＡ塩基配列より推測されるアミノ酸配列のＮ末
端には精製したアルカリプロテアーゼのＮ末端のアミノ
酸配列１６個（Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌ
ｕＬｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　
Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　５ｅｒ）が確認され
た（第３図下線部）。

以上の知見より第２図に示した塩基配列は、マチュアー
なアルカリプロテアーゼのＮ末端部分よりＣ末端部分宿
をコードしていると結論できる。

ｌＯ，アルカリプロテアーゼ完全長ｃ−Ｄ　Ｎ　Ａの検
索項目９での塩基配列決定の結果、項目８で得られた組
み換え体プラスミドｐＯＡＰ　５はマチュアーなアルカ
リプロテアーゼのＮ末端部分よりＣ末端部分宿をコード
していたが、それより上流にあると考えられるプレプロ
領域が欠如していた。そこで、項目８と同様に組み換え
体プラスミドｐＯＡＰ　５のアルカリプロテアーゼｃ−
Ｄ　Ｎ　Ａ断片を単離した後、ニックトランスレーショ
ン法により３２ｐで標識し、これをプローブとして項目
６で得たｃ−Ｄ　Ｎ　Ａバンクに対して再度コロニーハ
イブリダイゼーション法により検索し、更に長いアルカ
リプロテアーゼｃ−ＤＮＡを有するコロニーを得た。そ
のうち１個のコロニーの有する組み換え体プラスミドを
ｐＯＡＰｌｏと命名し、該組み換え体プラスミドを有す
ル大腸菌を大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｄ　Ｈ１（ｐＯＡ
Ｐｌｏ）と命名した。

項目７に従い、組み換え体プラスミドｐＯＡＰ１０を調
製した。

組み換え体プラスミドｐＯＡＰ１０　Ｄ　Ｎ　Ａを項目
７に記載の方法と同様にして制限酵素ＥｃｏＲＩで処理
し、アガロースゲル電気泳動を行ったところ、挿入ＤＮ
Ａ断片の大きさは１，５００ｂｐであることが判明した
。更に組み換え体プラスミドｐＯＡＰ１０　Ｄ　Ｎ　Ａ
を制限酵素地図■、足並ＲＩ、Ｋ匣１、Ｓ刀」、Ｘｍｎ
１．　几Ｉ［、ＨｉｎｄＩ［Ｉの単一または二重消化を
行い、項目７に記載したと同じ方法にて、現れた断片の
大きさを分析することにより、組み換え体プラスミドｐ
Ｏ＾ＰＩＯＤＮＡの制限酵素地図を作製し、該地図を第
４図に示した。

１１、アルカリプロテアーゼ完全長ｃ−ＤＮＡの塩基配
列の決定 項目１０で得られた組み換え体プラスミドｐＯＡＰ１０
のアルカリプロテアーゼｃ−ＤＮＡ断片を項目９と同様
に、同−又は同一ののりしろの制限酵素により切断した
プラスミドｐＵｃ１８およ゛びｐＵｃ１９　ＤＮＡにク
ローニングした。シーフェンシングは項目９と同様にダ
イデオキシ・チェーンターミネーション法で行った。

このようにしてアスペルギルス・オリゼー（ＡＴＣＣ２
０３８６）由来のアルカリプロテアーゼｃ−ＤＮＡの塩
基配列を決定し、その全塩基配列を第５図に、また、前
記第５図に示す塩基配列を有する遺伝子から翻訳される
ポリペブタイドのアミノ酸配列を第６図に夫々示した。

翻訳されるポリペブタイドは４０３アミノ酸からなり、
精製したアルカリプロテアーゼのＮ末端のアミノ酸配列
１６個（Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　ＴｈｒＴｈｒ　Ｇｌｕ　Ｌｙ
ｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ
　Ｇｌｙ　５ｅｒ１１ｅ　５ｅｒ）は１２２番目からの
アミノ酸配列に一敗した（第６図下線部）。したがって
、Ｎ末端から１２１番目までのアミノ酸配列は、アルカ
リプロテアーゼの分泌に必要なプレプロ領域であり、１
２２番目から４０３番目までのアミノ酸配列はマチュア
ーなアルカＪＪプロテアーゼをコードする領域である。

以上の知見より第５図に示した塩基配列は、プレプロ領
域までを含んだアルカリプロテアーゼの全ポリペブタイ
ドをコードしていると結論できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、組み換え体プラスミドｐＯＡＰ５ＤＮＡの制
限酵素地図を示す図であり、第２図は、実施例の９項目
に記載のマチュアーなアルカリプロテアーゼに対応する
遺伝子の塩基配列を示す図であり、また、第３図は、第
２図に示す塩基配列を有する遺伝子から翻訳されるポリ
ペブタイドのアミノ酸配列を示す図である。 第４図は、組み換え体プラスミドｐＯＡＰ１０　Ｄ　Ｎ
　Ａの制限酵素地回である。 第５図は、実施例１１１項目記載の完全長アルカリプロ
テアーゼ（プレプロ型）に対応する遺伝子の塩基配列を
示す。図中、塩基番号５３（Ａ）〜４１５（Ｔ）がプレ
プロ領域を、塩基番号４１６（Ｇ）〜１２６１　（Ｔ）
がマチュアーなアルカリプロテアーゼ遺伝子領域を示す
。 第６図は、第５図に示す塩基配列を有する遺伝子から翻
訳されるポリペブタイドのアミノ酸配列を示す。 出願人　食品産業酵素機能変換技術研究組合代理人　弁
理士　平　木　祐　輔 同　　弁理士　石　井　貞　次 第１図 ｐＬＪ（＋１９ 二：ｌ　ｃ−ＤＮＡ ξ に −ｐｕｃ　＋１９ 二二二二　〇　ＤＮＡ 第２図 ＧＧＣＣＴＧ ＣＡＧ　　ＡＧＣ ＧＡＴ　　ＡＧＣ ＧＣＴ　　ＧＣＣ ＧＣＴ　　ＧＧＣ ＧＧＴ　　ＧＡＡ ＧＴＴ　　ＡＧＣ ＡＡＧ　　ＧＣＴ ＧＣＣＧＧＴ ＡＣＴ　　ＧＴＴ ＧＴＴ　　ＧＡＣ ＡＣＣＡＡＣ ＣＴＣＧＣＴ ＧＣＣＡＣＣ ＡＡＣＧＣＴ ＡＣＴ ＡＣＣ ＣＣＴ ＣＣＴ ＡＡＣ ＴＣＣ ＡＡＣ ＡＴＣ ＡＡＣ ＡＣＣ ＡＴＣ ＡＣＣ ＡＣＣ ＡＡＣ ＡＣＣＣＡＧ ＩＥＡｃ　　ＴＡＣ ＧＴＣＡＡＴ ＧＧＴ　　ＣＡＧ ＡＣＴ　　ＴＡＴ ＡＧＣＡＧＣ ＡＡＧ　　ＣＧＴ ＡＡＣＧＡＴ ＧＡＧ　　ＡＡＣ ＧＣＴ　　ＡＴＣ ＴＴＣＧＣＴ ＡＴＩ：　　ＴＣＴ ＣＴＴ　　ＧＡＧ ＧＡＣＧＴＣ ＡＡＧ　　ＡＧＴ　　ＧＣＣ ＡＴＣＴＡＣＧＡＣ ＧＴＣＧＡＣＣＡＴ ＣＡＴ　　ＧＴＧ　　ＧＡＣ ＧＧＴ　　ＡＴＣＧＣＣ ＡＣＴ　　ＴＣＧ　　ＣＴＣ ＡＣＣＡＧＣＡＡＧ ＧＣＧ　　ＧＴＣＧＡＧ ＴＣＴ　　ＧＡＴ　　ＧＣＣ ＣＡＧ　　ＡＡＧ　　ＡＧＣ ＣＣＣＧＧＴ　　ＣＡＡ ＧＧＴ　　ＡＣＣＴＣＣ ＡＡＣＣＴＣＧＡＴ ＧＴＣＡＡＧ　　ＧＡＴ ＣＣＣＴＧＧ　　ＧＧＴ　　ＣＴＧ　　ＧＧＣＡＧＣＣ ＡＣＴ　　ＡＧＴ　　ＧＣＣＧＧＣＧＡＧ　　ＧＧＣＧ
ＡＧ　　ＧＡＧ　　ＴＴＣＧＡＧ　　ＧＧＣＣＧＣＡＧ
ＣＡ丁−Ｔ　ＧＧＣＣＡＴ　　ＧＧＣＡＣＣＡＡＧ　　
ＡＡＧ　　ＧＣＣＡＧＣＡＴＣＣＴＴＡＴＴ　　ＣＴＴ
　　ＧＡＣＧＧＣＴＴＣＡＡＣＧＣＴ　　ＧＣＡ　　Ａ
ＴＣ−ＡＡＣＡＴＧ　　ＡＧＣＡＡＣＧＣＡ　　ＴＴＣ
ＧＡＧ　　ＣＡＧ　　ＧＧＴＧＧＣＣＡＡ　　ＡＣＣＡ
ＧＣ：　　ＣＣＴ　　ＧＣＣＡＡＣＡＡＣＣＧＣＧＣＣ
ＡＧＴ　　ＴＴＣＡＴ ＡＴＣ ＧＧＣＣＣＣＧＣＴ　　ＧＣＣＧＴＧ　　ＡＣＣＧＴＴ
　　ＡＡＧ　　ＧＧＣＡＧＣＣＣＴ　　ＡＡＣＴＴ ＡＣＣ ＡＣＣ ＡＡＣ ＴＣＣ ＴＣＧ ＡＴＣ ＡＴＴ ＡＣＴ ＡＣＣ ＡＡＣ ＡＴＣ ＡＣＣ ＣＡＴ ＡＣＣ ＡＴＴ ＡＴＣ ＡＣＴ ＡＣＣ ＡＴＣ ＡＣＣ ＡＡＣ ＡＣＣ ＡＴＴ ＡＡＣ ＡＣＣ ＡＡＣ ＡＣＣ ＡＡ ＡＣＣ ＣＣＴ ＴＣＣ ＡＣＴ ＡＴＴ ＡＴＣ ＡＣＣ ＡＡＣ ＡＡＣ ＡＣＣ ＡＣＣ ＡＴＴ ＡＡＣ ＡＣＣ ＡＴＴ ＣＡＴ ＡＣＣ ＡＡＣ ＡＡＣ ＡＣＣ ＡＴＣ ＡＡＣ ＡＣＣ ＡＴＣ ＡＡＣ ＡＡＣ ＧＴＣ ＡＣＣ ＡＡＣ ＡＡＣ ＡＡＣ ＡＡＣ ＡＴＣ ＡＡＣ ＡＴＴ ＡＡＣ ＡＴＴ ＡＣＴ ＡＣＴ ＡＴＣ ＡＴＣ ＡＴＣ ＧＴ 第５ １４６０　　　１４７０　　　１．！、８０ＡＴＡＡＡ
ＡＴＣＴＴ　ＧＧＣｍＣＴＡＡ　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
　ＡＡＡＡＡＡＡ　３’第６図（その１） 第６図（その２）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）アスペルギルス属に属する微生物に由来し、制限
   酵素開裂地図で規定されるプレプロ型アルカリプロテア
   ーゼ遺伝子。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＥはＥｃｏＲ I 、ＡはＡｆｌII、ＫはＫｐｎ
   I 、ＸはＸｍｎ I 、ＳはＳａｌ I 、ＢはＢｇｌII、
   ＨはＨｉｎｄIIIを示す）