JPH0223889A - 新規な酵素活性測定用基質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、トリプシン、α２−マクログロブリン−トリ
プシン複合体く以下α２Ｍ−Ｔｒｙと略す）などの酵素
活性を測定するのに有用な新規酵素活性測定用基質−に
関する。本発明の基質は、従来、報告されている基質に
比して、極めて選択性、反応性に優れ、例えば、トリプ
シンが形成、８１害又は消費される反応の研究、又はそ
れ等に関与する因子の測定に利用できるとともに医療分
野においては、膵炎の診所に有用である。

従来の技術 トリプシンなどの酵素活性を測定する方法として、酵素
と反応する基質を利用して酵素を測定する方法がある。

このような方法に用いる酵素活性測定用基質として、こ
れまで多くの基質が開発されている。例えばトリプシン
活性測定用基質としては、古くはゼラチン、ヘモグロビ
ン等の蛋白質が用いられていたが、膵液や一二脂腸液で
は他の蛋白質分ｗｌ酵素、例えばキモトリプシン、エラ
スターゼ等が共存するため、この基質を用いて膵液や一
二脂腸液中のトリプシン活性を測定する方法は適当でな
い。

トリプシンが蛋白質分解作用の他にアミダーゼ、■ステ
ラーゼ作用を有していることが、Ｂｅｒｏｍａｎ′８［
Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　　１３０．８１〜８６（
１９３９）］によって報告されて以来、多くの合成基質
（例えばＢ　Ｚ　　Ａ　ｒ　ＯＮ　Ｈ２、Ｔ　ｏ　ｓ−
△ｒｇＯＭｅ、Ｂｚ−Ｄ、Ｌ−Ａｒｑ−ｐＮＡ。

Ｔｏｓ−Ａｒａ−ＰＮＡ等）が開発されてきたが、これ
らの多くの合成基質は、血清や腹水などの検体中のヒリ
ンブロテイアーゼ、例えば、トロンビン、Ｆａｃｔｏｒ
Ｘａ、補体、カリクレインなどの類似酵素活性を早する
物質との交叉反応をおこし、また目的とするトリプシン
自体との反応性も充分でなく測定に時間を要し、再現性
などにも問題があり、実用には耐えかねるものであった
。

近年、トリプシン用基質としてＺ−ＶａＧ　Ｉ　Ｖ−Ａ
ｒ（］−ＤＮＡ　（ＣＨＲ−ＴＲＹ。

Ｐｅｎｔａｐｈａｒｆｆｉ社、Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔ
ｅｓ　Ｐａｔｅｎｔ　　Ｎｎ４２７８７６２、ｐａｔｅ
ｎｔｄ　　ｏｎ　　Ｊｕｌ、　　１　４、１９８１）　
　、３Ｚ−１１ｅ−Ｇ　　Ｉ　　Ｕ　　（７−ＯＲ）−
Ｇ　Ｉ　　Ｖ−Ａｒ　　ｇ−ＤＮＡ　　−トｆ　　ＣＩ
　　（Ｓ−２２２２、Ｋｏｂｉ社　、Ｊ、Ｇａ５ｔｒＯ
ｅｎｔ、、互、５３３　（１９７０）Ｂｅｒｇｓｔｒｏ
ｍ、に）などのペプチド型のアルギニルアニリド誘導体
が開発されたが、選択性、反応性、溶解性等に問題があ
り、また高価格であるなどまだ充分とは言えない。

酵素活性測定用基質は、酵素に対する高感度及び特異性
、水あるいは緩衝液に対する良好な溶解性、及び分解物
の易検出性の４点を満足することが肝要であるが、以上
述べてきたようにこれらを満たすような例えばトリプシ
ンなどの酵素活性測定用基質の開発は、まだ十分な状態
とは言えない。

発明が解決しようとする課題 前記の点から既に明らかなとおり、トリプシン、α２Ｍ
−Ｔｒ″ｙなどの酵素活性測定に使用することのできる
基質は膵炎などの診断に極めて有用であり、その必要性
は依然として存在する。その基質は前記の問題点を解決
するものであるべきである。使用するトリプシン、α２
ＭＴｒｙなとの酵素活性測定用基質は、溶解度が高く、
基質阻害もなく、測定用の反応は基質限定的でなく、か
つ目的とする酵素に対して選択性、反応性に優れ、合成
法も容易なものであるべきである。

しかして、本発明の目的は、これらの要求を具備する優
れた酵素活性測定用基質を提供することにある。

課題を解決するための手段 本発明者は、成る種のアルギニルアニリドが例えばトリ
プシン、α２Ｍ−Ｔｒｙなとの酵素活性測定用の優れた
基質であることを見出した。

叩ら、本発明は下記式 ％式％ ［式中、ＡはｐｙｒｏＧ　ｌ　ｕＷ又はＤ−Ｇｌｕ（Ｏ
Ｒ又はＮＲ’　Ｒ″）基（ＯＲ及びＮＲ′Ｒ″はグルタ
ミン酸のｒ−カルボキシル基に結合する基であり、Ｒは
水素原子、置換もしくは非置換の炭素数１〜８のアルキ
ル基又は置換もしくは非置換の炭素数３〜８のシクロア
ルキル基、Ｒ′及びＲｈは同じでも異なっていてもよく
、水素原子、炭素数１〜７のアルキル基、炭素数３〜７
のシクロアルキル基、又はＲ′とＲ″とが一緒になって
窒素原子を含む炭素数２〜７のシクロアルキル基を示す
。）であり；ＢはＧＩＶＭ、Ｐｒｏ基、Ｐｉｐ基、５ａ
ｒＪ１又は△１ａ基テアリ；Ｘハｐニトロアニリン残基
又はその誘導体残塁である１で表わされる酵素活性測定
用基質及びその塩である。

本明細書において使用する略号の意味は以下の通りであ
る。

Ａｒｇ＝フルギニン Ｇｌｙ−グリシン Ｇｌｕ−グルタミン酸 ｐｙｒｏＧ　Ｉ　ｕ＝ピログルタミン酸Ｐｒｏ＝プロリ
ン Ｐｉｐ＝ピペコリン酸 Ａｊ！ａ−アラニン ５ａｒ−サルコシン Ｖａｌ−バリン １１８−イソロイシン ｐｈｅ＝フェニルアラニン １）ＮＡ＝Ｉ）−ニトロアニリド ＢＯＣ＝第３ブチルオキシカルボニル ＢＺｊ２−ベンジル ’Ｂｕ−第３ブヂル ７＝ベンジルオキシカルボニル ＷＳＣ＝ＳＣ性カルボジイミド ＤＣＣ−ジシクロへキシルカルボジイミドＴｏｓｏＨ＝
ｐ−ｔ−ルエン　スルフォン酸ＴＯ８＝０−トルエンス
ルフォニル ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド 本発明の酵素活性測定用基質を表わす上記式におイテ、
ＡはｐｒｏＧ　ｌ　ｕｆ３又はＤ−Ｇｌｕ（０［（又は
ＮＲ’Ｒ″）基であり、好ましくはＤＧｊ！ＩＪ（ＯＲ
又はＮＲ’Ｒ”）基である。ここでＲは水素原子又は置
換もしくは非置換の炭素数１〜８のアルキル基又は置換
もしくは非置換の炭素数３〜８のシクロアルキル基〈Ｒ
が水素原子以外の場合ＯＲはエステル基を形成する）で
ある。かかるアルキル基としては例えばメチル、ｎ−プ
ロピル（０Ｐｒ）、ｉ−プロピル（Ｐｒ）、ｔ−ブチル
（’Ｂｕ）、ペンチルー３−イル、ｎ−ヘキシル（０Ｈ
ｅｘ）、ヘプチル、オクチル（ＯＣｔ）、オクチル−３
−イル（３０Ｃｔ）などの非置換の炭素数１〜８のアル
キル基；シクロヘキシルメチルなどの炭素数３〜６のシ
クロアルキル基で置換された炭素数１〜８のアルキル基
：ベンジル（ＢＺｉりなどの、゛）工二ル基で置換され
た炭素数１〜８のアルキル基等が挙げられる。シクロア
ルキル基としては、シクロペンチル、シクロヘキシル、
シクロへブチル、シクロオクチルなどの非置換の炭素数
３〜８のシクロアルキル基；２−メチルシクロヘキシル
、３メチルシクロヘキシル、４−メチルシクロヘキシル
などの炭素数１〜４のアルキル基で置換されたシクロヘ
キシル等が挙げられる。

Ｒ′及びＲｎは同じでも異なっていてもよく、水素原子
、炭素数１〜７のアルキル基、炭素数３〜７のシクロア
ルキル基、又はＲ′とＲ″とが一緒になって窒素原子を
含む炭素数２〜７のシクロアルキル基（これらの場合Ｎ
Ｒ’Ｒ″はアミド基を形成する）である。かかるアルキ
ル基としては例えばメチル、エチル、ｉ−プロピル（Ｐ
ｒ）、ｎ−プロピル（０Ｐｒ）、ｎ−ヘキシルなどが挙
げられ、シクロアルキル基としては例えばシクロへブチ
ル、シクロヘキシルなどが挙げられる。

Ｒ′　とＲｒｒとが一緒になって窒素原子を含む炭素数
２〜７のシクロアルキル基としては例えばピペリジノ、
ピロリジノなどが挙げられる。

上記式においてＢはＧｌｙ基、ｐｒｏ基、Ｐｉｐ基、３
ａｒ基、又はＡｌ基であり、好ましくはＧｌｙ基である
。

Ｘは発色基に相当１６基であり、ρ−ニトロアニリン残
基又はその誘導体残基を示す。かかる誘導体残基として
は、例えば３−カルボキシ−４−二トロアニリン残基；
３−メトキシカルボニル４−ニトロアニリン、３−エト
キシカルボニル４−ニトロアニリンなどの３−Ｃアルコ
キシカルボニルー４−ニトロアニリン残基：３−ベンジ
ルオキシカルボニル−４−ニトロアニリン残基；３−Ｎ
−メチルカルバモイル−４−ニトロアニリン、３−Ｎ−
エチルカルバモイル− ニリン、３−Ｎ−ブチルカルバモイル−４−ニトロアニ
リンなどの３−Ｎ−Ｃ１−６アルキルカルバモイルー 上記式におけるアミノ酸残基は、ことわりのない限りＬ
体である。

本発明の基質は酸付加塩であってもよく、かかる酸付加
塩としては、−例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リンＩ！
Ｉ塩、硫酸塩、硝酸塩などの無殿酸塩；コハク酸塩、リ
ンゴ酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、ベンゼンスルホン酸塩
などの有機酸塩等が挙げられる。

本発明による好ましい基質の１例は である。

他の好ましい基質としては、例えば以後に示す実施例に
おいて記載された基質などが挙げられる。

上記式で表わされる本発明の基質は、ペプチド化学にお
いてよく知られる方法により合成される。

即ち、基質合成は、最初ｐ−ニトロアニリン又はその誘
導体などの発色基となる化合物をアルギニンに結合させ
、次いで逐次的にアミノ酸をカップリングしていく方法
により行なうことができる。

或いはＮ−末端ジペプチドフラグメント自体を最初に合
成し、それに発色基を有するアルギニンを結合させて合
成することも可能である。

上記の反応を行なうに際しては、反応を行なうアミノ酸
、ジペプチドフラグメントなどの分子中に存在する反応
に直接関与しないアミン基、カルボキシ基は、ペプチド
合成で通常使用される保護すで保護する。アミン保護基
としては、カルボベンゾキシ、第３ブチルオキシカルボ
ニル；それに関連する基、例えば、ｐ−メトキシ、ｐ−
ニトロ又はｐ−メトキシフェニルアゾールカルボベンゾ
キシ基；及びフタロイル基等を用いるのが、有利である
。カルボキシ保護基としては、ベンジル、ｔ−ブチルな
どによるエステル基が有利である。

アルギニンを反応に用いるに際しては、通常アルギニン
のδ−グアニジノ基を保護する。かかる保護にはニドＯ
基やプロトン化を用いるのが有利である。

以上に述べた保護基は、反応後、それ自体公知の方法に
よって脱離することができる。

２個のアミノ酸のカップリング、ジペプチドとアミノ酸
のカップリング、発色基となる化合物とアルギニンのカ
ップリング等は、ペプチド合成に通常使用される活性エ
ステル化法、混合酸無水物法あるいはカルボジイミド法
により行われる。活性エステル化法はα−カルボキシ基
の活性化により行なわれ、例えばＮ−ヒドロキシサクシ
ニックイミド、ｐ−ニトロフェノール、トリクロ［１フ
エノール、４．６−シメチルピリミジルー２−チオール
等を用いた活性エステル化法が右利である。

混合酸無水物法では、炭酸モノアルキルエステル塩化物
、例えば、イソブチルクロロフォルメートを用いるのが
有用である。

カルボジイミド法では、カルボジイミド、例えばＮ、Ｎ
’　−ジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）の存
在下で行なうのが有利である。

上記式のＤ−Ｇｆｕ　（ＯＲ又はＮＲ’Ｒ″）基におけ
るグルタミン酸のγ位のカルボキシ基のニスデル化は、
対応するアルコールとの縮合、例えば酸触媒下の３−ペ
ンタノール、ベンジルアルコールなどとの脱水綜合、あ
るいはイソブテンとの反応などによって行うのが有利で
ある。グルタミン酸のγ位のアミド化は、対応するアミ
ンとの縮合、例えばジシクロへキシルカルボジイミド（
ＤＣＣ）存在下での例えばジイソプロピルアミンどの縮
合によるのが有利である。

発明の効果 本発明の基質の特徴は、トリプシン、α２ＭＴｒｙなと
の酵素に対して優れた基質特異性及び反応性を有し、水
あるいは緩衝液に対する溶解性に優れでいることにある
。例えば、新規基質：ＣＨＲ−Ｔ　　ＲＹ　　（Ｐｅｎ
ｔａｐｈａｒｍ　社　、　ｚ−ｖａｚ−Ｇｌｙ−Ａｒａ
−ｐＮＡ−ＨＣｊり及びＳ−２２２２（Ｋａｂｉ社、Ｂ
Ｚ−１１８−Ｇ　Ｉ　Ｕ　（ＯＲ）Ｇ　ｌ　ｙ−Ａｒｇ
−ｐＮＡ−Ｈ（１！　：Ｒ＝ＨとＣＨ３）と、トリプシ
ン、ａ　２　Ｍ　　Ｔ　ｒ　ｙ及び正常血清との相対反
応性を、Ｓ−２２２２を１．０として示すと一番１の如
くなり、トリプシン及びα２Ｍ−Ｔｒｙに対する反応性
はほぼＳ−２２２２と同程度であるが、正常血清に対す
る反応性が著しく低下しており、選択性の向上という点
では著しい進歩であり無希釈検体（例えば血清や腹水）
を用いて検体中の微量のトリプシン又はα２ＭＴｒｙ活
性を他醇索の妨害を受けずに測定することが可能となる
。またＣＨＲ−ＴＲＹ、Ｓ−２２２２と比べて水、及び
緩衝液に対する溶解性に優れており、従来よりも高濃度
の基質液の調整が可能となった。

以上の通り本発明の基質は、トリプシン、α２Ｍ−Ｔｒ
ｙ等の酵素活性測定用基質として、従来のものに比べ非
常に優れていることが明らかであり、膵炎などの診断薬
として極めて有用である。

実施例 本発明を以下実施例により詳細に説明するが、本発明は
これら実施例に限定されるものではない。

本実廠例の１ｍクロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析は、
シリカゲルＦ　　（メルク類）プレートを使用した。ア
ミノ酸は特にことわらなければし一体を示す。

実施例１ （２０ｍｍｏｌ）を無水塩化メチレン２０ｄに溶解し、
水冷下、４−ジメチル−アミノピリジン２４４ｍ！Ｎ２
ｍｍｏｌ　＞、ＷＳＣ−ＨＣＪ！３．８３９（２（Ｍ　
ｍｏｌ　）　、３−ペンタノール５．２８９（６０ｍｍ
ｏｌ）を加え、５分間、攪拌不反応を行う。次いで、反
応温度を室温まで上昇させ引き続き攪拌不反応を３時間
行ない、冷５％塩酸３０ｄ×２、飽和食塩水３０ｄＸ２
．１０％炭酸水索ナトリウム水溶液３０ｄ×２、飽和食
塩水３０ｄ×２にて洗浄後、無水１ａｖｉマグネシウム
にて乾燥する。乾燥侵、ｌ１ａｌｌ？マグネシウムを濾
別し、減圧下溶媒を留去する。残基をシリカゲルクロマ
トにより精製を行ない、酢酸エチル−〇−ヘキサンより
再結晶を行ない Ｂｏｃ−Ｄ−Ｇｌｕ（ＯＣｌｌ−（Ｃ、）　２）　−０
ＢＺｊ！６．５１ｇ＜８０％）を拠る。

Ｒｆ＝０．６８　（酢酸エチル−〇−ヘキサンー１：３
） Ｂｏｃ−Ｄ−Ｇｌｕ−ＯＢＺＩ　　　６．７４１元素分
析 ＣＨＳ 測定値　　６４．６４％　　８．５３χ　３．３８％理
論値　　６４．８４％　８．１６％　３．４４％次いで
Ｂｏｃ−Ｄ−Ｇｌｕ（ＯＣＩＩ・（Ｃ，、ｌｌ５）　２
　）　−０ＢｚＪ！６、５１　ｇ（１６ｍｍｏｌ）をエ
タノール２００彪に溶解後、パラジウム黒１ｇを加え、
室温下、水素気流中、１時間還元を行う。触媒を濾別後
、減圧下、溶媒を留去し残漬を酢酸エチル−ｎ−へキサ
ンより再結晶を行ない４．３９ｇ（８７％）のＢｏｃ−
Ｄ−Ｇｌｕ（ＯＣＩＩ−（Ｃ２Ｉｆ５）　２）−０１１
を１ｑる。

Ｒｆ＝０．　　５５　　　（ＣＦＩ　Ｃ１：　△　Ｃ０
Ｈ＝９．　　５：０．５） 元素分析 （ＢＯＣ−Ｄ−Ｇｌｕ（ＯＣｌｌ−（Ｃ２ＩＩ５）　２
　）−０１１−１／４＋１２０）測定ｒＩｔｉＣ：　５
６．０７％　　Ｈ：　　８．９６％　Ｎ：４．３８％理
論値　Ｃ：　５５．９７％　　１」；　　８６１Ｘ　　
Ｎ　：　　４．３５％盛 Ｂｏｃ−Ｄ−Ｇｌｕ（ＯＣＩＩ−（Ｃ，、１１５）　２
　）−０１１２４、５（７，７３ｍｍｏｌ　）を酢酸エ
チル３０ｄに溶解後、４．６−ジメチル−ピリミジルー
２−チオール１　、１９９　（８，５０＋ｎ　ｍｏｌ　
）を加え、　ＤＣＣｌ、５９ｇ（７，７３ｍ　ｍｏｌ　
）を溶解した酢酸エチル溶液を水冷下に滴下し、次いで
、室温下にで一晩攪拌下反応を行なう。

析出物を濾別後、濾液を１０％炭酸水素ナトリウム水溶
液５０ＩｎＩ！Ｘ２、飽和度ｊｇ水５０ｍｌ１Ｘ　２に
て洗浄後、無水１ｉｉｌＩＦｉ！ｆマグネシウムにて乾
燥を行なう。乾燥剤を濾別後、減圧下溶媒を留去するど
３．１６ｇ（９３％）の活性エステルが得られる。

次に、Ｈ−Ｇ　ｌ　ｙ−ＯＢｚ　１・Ｔ　ｏ　ｓ　ＯＨ
２、６６９（１１，６ｍ　ｍｏｌ　）を酢酸エチル１０
０ｄにけん濁させ、水冷下Ｎ−エチル−［ルフＡリン１
．５１ｍ（１１，６ｍｍｏｌ　）を滴下し、５分間攪拌
反応を行ない、次いで先に調整した活性エステル３．１
６ｇ（７，２０ｍ　ｍｏｌ　）を溶解した酢酸エチル１
０〇−溶液を氷冷下に加え、−晩ｌｌｌ￥−反応を行な
う。

反応液を冷５％塩酸、１５０ｄｘ２．飽和食塩水１５０
戒Ｘ２．１０％炭酸水素ナトリウム水溶１１５０ｄｘ２
、飽和食塩水１５０Ｍ１Ｘ２にて洗浄後、無水硫酸マグ
ネシウム及び活性炭にて脱色乾燥を行なう。

乾燥剤、活性炭を濾別し、減圧下溶媒を留去し、残漬を
シリカゲルクロマトにより精製を行すい、無色透明油状
の Ｂｏｃ−Ｄ−Ｇｌｕ（ＯＣｔｌ−（ｃ２＋ｆ５）　２　
）　−ＧＩＶ−ＯＢ２１２．８４ｇ（８５％）を得る。

Ｒｆ＝０．６５　（酢酸１チル：ｎ−ヘキサン＝１：１
） 元素分析 測定値　Ｃ；　６１．６４％　　ｌ−１；　　８．１５
％　　Ｎ　：　　５．９６％理論値　Ｃ：６２．０５％
　　ｔ」：　　７．８１％　　Ｎ　：　　６．０３％次
いでＢｏｃ−Ｄ−ＧＩＩＪ（ＯＣｔｌ−（Ｃ２Ｎ５　）
　２　）　−０ＢＺＩ２、８４９　（６，１２ｍ　ｍｏ
ｌ　）をエタノール２００ｄに溶解後、パラジウム黒１
ｇを加え、室温下、水素気流中、１時間還元を行う。

触媒を濾別後、減圧下、溶媒を留去し、２．０９ｇ（９
１％）の油状の Ｂｏｃ−０−Ｇｌｕ（ＯＣＨ−（Ｃ，、Ｈ５）　２）−
ＧＩＶ−ＯＲをする。

Ｒｆ＝０．１　（クロロホルム：酢酸＝９．５：０、５
） 元素分析 測定値　Ｃ：５４．３３％　　ｌ−（；　　８．２９Ｘ
　　Ｎ：　　７．４９％理論１ｉＩＱ：５４．５３％　
　）ｌ；　　８．０８％　　Ｎ：　　７．４８Ｘ■。

の合成 り０Ｃ−Ａｒ（７−ＯＨ−ＨＣｊ！−＋２０１３、１５
ｇ（４０ｍ　ｍｏｌ　）を無水ピリジン８０９、５３９
　（４０ｍ　ｍｏｌ　）を加工、次イテ氷冷下ＤＣＣ１
８，１６９（８８１ｍｏｌ　）を溶解したピリジン溶液
を攪拌下漬下し、次いで室温下にて一晩攪拌反応を行な
う。

反応液に酢酸エチル１６０ｄを加え、不溶物を濾別後、
減圧下、溶媒を留去し、残漬に酢酸エチル３６０−を加
えると、結晶が析出するので、これを濾別し、減圧上五
酸化ニリン上にて乾燥を行ない、１８．４７ｇ（８７％
）の ５℃にて３０分間攪拌下反応を行なう。

反応終了書、反応液に酢酸エチル３６ｇｄｌを加え、攪
拌下エーテル３１中にこれを加え、析出物を濾別し、減
圧上五酸化二りん一水酸化カリウム上で乾燥すると、６
．５４ｇ（９３％）の を得る。

Ｒ１’＝０．２５（クロロホルム：メタノール：酢酸：
水−２０：５：０．５：０．５＞ ｍｐ、２１２−２１９℃（分解） 元素分析 測定［Ｃ：　４９．２６％　Ｈ：６．８７％　Ｎ　；　
１５．８９％理論値　Ｃ：　４９．７６Ｘ　　Ｈ；　　
６．６４％　　Ｎ　：　１５．８３％次いで ７、９７ＬＪ（１５ｍ　ｍｏｆ　）をＤＭＦ９ｍに溶解
後、更に酢Ｍ３ｄを加え、水冷攪拌下に２Ｎｍ１ｇ！／
酢酸溶液６０ｍ１（３０ｍ　ｍｏｌ　）を）＾下し、次
いで１が得られる。

Ｒｆ＝０．４８　（ｎ−ブチルアルコール：酢酸：水＝
４：１：２＞ ＋１９．６５°−９５℃（分解） 元素分析（ＣＨＮ　　ＯＣｊ！　　・１／２Ｆ（２０）
測定値　Ｃ：４２．７７％　　Ｈ：　　６．２０％　Ｎ
　：　１７．６０％理論値　Ｃ：　４２．８６％　）ｌ
：６．１４％　Ｎ　：　１７．６４％ＢＯＣ−Ｄ−Ｇｌ
ｕ（ＯＣＨ−（Ｃ２Ｈ５）　２）　−ＧＩＶ−ＯＨ２，
０９ｇ（５，５９ｎ＋　ｍｏｌ　）を酢酸エチル５０ｄ
に溶解後、４．６−シメチルービリミジルー２チオール
８６１＋１１９　（６，１５ｍ　ｌｌ１ｏｔ　）を加え
、ＤＣＣｌ、１５ｇ（５，５９ｍｍｏｌ　＞を溶解した
酢酸エチル溶液を水冷下に滴下し、次いで室温下にて−
晩攪拌下反応を行なう。

析出物を濾別後、濾液を１０％炭酸水素ナトリウム水溶
液５０ｄＸ２、飽和食塩水５０ｄＸ２にて洗浄後、無水
硫酸マグネシウムにて乾燥を行なう。

乾燥剤を濾別後、減圧下、溶媒を留去すると２．５０ｇ
（９０％）の活性エステルが得られる次に ０ｄＸ２にて洗浄を行ない、無水ｒＩｌ！ｉ酸マグネシ
ウムにて乾燥を行なう。

乾燥剤を濾別後、減圧下、溶媒を留去し残漬を５ｅｐｈ
ａｄｅｘ　　Ｌ　Ｈ−２０クロマトにて精製を行ない、
淡黄色フオーム状の ２．２２ｇ（４，７５ｎ＋　０１０１　）をＤＦＭ２０
−に溶解後、氷冷下Ｎ−エチルーモルフォリン０．６２
ａｉ）（４，７５ｍｎｏｌ　）を滴下し、５分間攪拌反
応を行ない、次いで先に調整した活性エステル２．１４
ｇ（４，３２ｍｍｏｆ　）を溶解したＤＭＦ２０ｄ溶液
を氷冷下に加え、−晩攪拌反応を行なう。反応終了後、
減圧下、溶媒を留去し、残漬に酢酸エチル１００ＩｕＩ
ｌを加え、冷５％ＨＣＪ５０＃ｌｉ！×２、飽和食塩水
５０ｄｘ２．１０％炭酸水素ナトリウム水溶液５０ｙｄ
×２、飽和食塩水５Ｒｆ−０，７８（クロロホルム：メ
タノール：水：酢酸−２０：５：０．５：０．５） 元素分析 Ｈ３ 測定ｍ　　　５１．１９％　　７．４１％　　１３８７
％理論値　　５０．９４％　　７．１２％　　１３．９
８％■。

の合成 ８２０■（９０％）を（りる。

Ｒｆ’＝０．４２　（ｎ−ブタノール：酢’ｔｉ：水＝
４：１　：　２） １１１０．１０８−１４７℃（分解） 元素分析 １．０７ｇ（１，３６ｍ　ｍｏｌ　）を酢Ｍ５ｍｅに溶
解後、水冷下２Ｎ塩酸／酢酸溶液６．８−（１３，６ｍ
ｍｏｌ　）を滴下し、３０分間攪拌反応を行ない、次い
で、反応液をエーテル５０（７中に攪拌下に加え析出物
を濾別する。

次いでこれを５ｅｐｈａｃｌｅｘＬ　Ｈ−２０クロマト
ニより精製を行ない、 測定（１１Ｃ：　４３．４４％　Ｈ：６．１７％　Ｎ　
：　１６．１３％理論値　Ｃ：　４３．３４Ｘ　　Ｈ：
　　６．２３％　　Ｎ　：　１６．１７％実施例２ 実施例１と同様な方法にて下記の表に示す新規基質の合
成を行った。合成した新Ｍｌ質の物性値を下記の表に示
した。

実施例３ （Ａ）　’ｉＲ現に合成した基質の特異性を各酵素と反
応させることにより試験した。

（１）基質液：１０ｍＭ／１ （２）緩衝液：緩酌種、ＮａＣ！およびそれらの濃度、
ρＩ＋　＜　２５℃）は酵素により次の通りとした。

（３）使用酵Ｍ：使用したＭ索及それらの起源等は次の
通りである。

（４）反応停止液：１０％酢酸水溶液 測定法： （ａ）トリプシン 緩衝液０．５戒と基質液０．１＃Ｉｉ！をシリコン処理
硬質ガラス製試験管又はプラスチック製試験管に採取し
、３７℃恒温槽中にて１０分間予加温する。次いで酵素
試薬０．０５ａｅを加えて酵素反応を３７℃１０分間実
施する。

正確に１０分後、反応停止液２．５ａｅを加えて酵素反
応を停止後、３７℃で１０分間放置し、次いで４０５　
ｒｖの吸光度を測定する。

（ｂ）α２Ｍ−Ｔｒｙ 緩衝液０．！Ｍと基質液０．１ｄをシリコン処理硬質ガ
ラス製試験管又はプラスチック製試験管に採取し、３７
℃恒温槽中にて５分間予加温する。

次いで酵素試薬０．０５ｍを加えて酵素反応を３７℃、
１０分間実施する。

正確に１０分後、反応停止液１．Ｏａｅを加えて酵素反
応を停止後、３７℃で１０分間放置し、次いで４０５　
ｎｍの吸光度を測定する。

（Ｃ）正常血清 緩衝液０．５ｍと基質液０．１ｔｌ！をシリコン処理硬
質ガラス製試験管又はプラスチック製試験管に採取し、
３７℃恒温槽中にて５分間予加温する。

次いで酵素試薬０．　１ｍｆ！を加えて酵素反応を３７
℃５分間実施する。

正確に５分掛、反応停止液２．０ｄを加えて酵素反応を
停止後、３７℃で・１０分間放置し、次いで４０５　ｎ
ｍの吸光度を測定する。

上記した測定法に従って測定した結果は、下記の表に示
した通りである。下記の表中の値は、基質Ｓ−２２２２
，１０ＩＩＩＨの吸光度の測定値を１．０とした時の相
対値を示している。

（Ｂ） 本発明の基質と従来の基質との水に対する溶解性を調べ
た。

結果は以下の通りである。

基 質 溶 解 性 Ｓ−２２２２： ５　ｍＭ／　１ ＣＨＲ−ＴＲＹ　： 不溶 （基質Ｎα８） ３００　ｍＭ／　１以上 （基質Ｎα１８） ３００　ｍＭ／　１以上

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記式 Ａ−Ｂ−Ａｒｇ−Ｘ ［式中、ＡはｐｙｒｏＧｌｕ基又はＤ−Ｇｌｕ（ＯＲ又
   はＮＲ′Ｒ″）基（ＯＲ及びＮＲ′Ｒ″はグルタミン酸
   のｒ−カルボキシ基に結合する基であり、Ｒは水素原子
   、置換もしくは非置換の炭素数１〜８のアルキル基又は
   置換もしくは非置換の炭素数３〜８のシクロアルキル基
   、Ｒ′及びＲ″は同じでも異なつていてもよく、水素原
   子、炭素数１〜７のアルキル基、炭素数３〜７のシクロ
   アルキル基、又はＲ′とＲ″とが一緒になつて窒素原子
   を含む炭素数２〜７のシクロアルキル基を示す。）であ
   り；ＢはＧｌｙ基、Ｐｒｏ基、Ｐｉｐ基、Ｓａｒ基又は
   Ａｌａ基であり；Ｘはｐ−ニトロアニリン残基又はその
   誘導体残基である］で表わされる酵素活性測定用基質及
   びその塩。