JPS63502897A

JPS63502897A - 新規なペプチド誘導体

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Publication number: JPS63502897A
Application number: JP62502039A
Authority: JP
Inventors: アリエツリ，サロ; グスタフソン，ステイグ・オーケ・インゲマル
Original assignee: クロモイエニツクス・アクチエボラーグ
Priority date: 1986-03-21
Filing date: 1987-03-19
Publication date: 1988-10-27
Anticipated expiration: 2011-12-04
Also published as: JP2560058B2; SE8601327D0; AU590836B2; ATE70068T1; EP0262191B1; EP0262191A1; AU7169787A; FI875151A0; FI875151A7; WO1987005608A1; FI875151L

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】新規なはプチド誘導体技術分野本発明はセリンプロテアーゼの測定に有用な新規トリペプチド誘導体に関する。

この新規な誘導体は第Ｘ、ａ因子（Ｅ、Ｃ，３，４，２１，６）の測定に特に適するしあるいは反応中に存在する他の酵素および／または阻害剤の定量を可能にするＦＸａが形成、阻害または消費される反応の分析に、特に適している。

発明の背景第）（ａ因子は血液凝固に至る反応カスケードにおける重要な物質である。色原体基質を用いるＦＸ、ａの測定に基づくいくつかの方法は血液凝固系における障害を説明する上で臨床診断上かなり価値があることが示されている（Ｈｅｍｋｅｒ　Ｈ，Ｃ，著ｒＨａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　５ｕｂｓｔｒａｔｅｓＪ（１９８３年）　Ｍａｒｔｉｎｕｓ　Ｎ１ｊｈｏｆｆ社発行参照〕。

従来技術色原体テトラペプチド誘導体は、Ａｕｒｅｌｌ、　Ｌ、民地の（Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ　７．　（１９７８）　９２〜９４）により報告されており、またその場合（＝かなり価値があることが分っている。。これらの基質は、天然の基質であるプロトロンビン中）開裂部位に先行するアミノ酸配列（−１１ｅ−Ｇｌｕ− Ｇｌｙ−Ａｒｇ）を基礎としている。それらテトラペプチド基質は高い選択性を特徴としている、すなわち、その他の酵素、特にトロンビン、が第Ｘａ因子の測定を乱すことはない。しかしながら、溶解度に限りがあり、そして合成が数工程にわたるという欠点がある。ＥＰ５４１２２は、トリペプチド誘導体がＦＸａ基質として有用でありうることを示している。しかしながらこれらのトリペプチドもトロンビンに対して敏感である。前記テトラはプチドの高い選択性はこれらのトリペプチドによっては得られない。

発明の記述本発明のトリペプチドは、高い感度及び溶解度を示すと同時に、従来技術のテトラにプチドと同等の選択性を示す。これら、新規基質は、次式％式％〔式中、Ｒ１は水素、α−もしくはβ−ナフチル基、低級アルキル基（該基はカルボキシル基で置換されていてもよい）、未置換もしくは置換フェニル−もしくはフェニルアルキル基（そのアルキル基は１〜４個の炭素原子を有し、また好ましくは、置換基は、フェニル環のパラ位にあり、そして置換基は、低級アルキル、低級アルコキ７、ハロゲンまたはニトロ基である）であり；低級アルキルは、１〜４個の炭素原子を有する直鎖状または分枝鎖状アルキル基、好ましくはメチル、エチル、またはｔｅｒｔ−ブチルであり；低級アルコキシ基は、１〜４個の炭素原子を有するアルコキシ基、好ましくはメトキシであり；ハロゲンは塩素、臭素、弗素または沃素、好ましくは塩素であり；Ｒ１が水素である場合にのみ又は単結合であり；ＡはＧｌｙまたはＳａｒであり；Ｒ２は酵素による加水分解によりＲ２−ＮＨ２化合物を生ずる芳香族または複素環残基である〕またはそれらの無機または有機酸とのジーおよびトリー塩によって特徴付けられる。

これらＲ２−ＮＨ２化合物は、開裂されたマーカーを直接または誘導体形成後Ｃ二測定することによりセリンプロテアーゼの定量を可能にする色原体性が、螢光原性かまたは電気化学的特性を有する従来から知られている化合物である（Ｈｅｍｋｅｒ　Ｈ，Ｃ，！前掲書およびそこに引用されている文献）。

Ｒ２−ＮＨ２化合物の例としては次のものが挙げられる：ｐ−ニトロアニリン、３−カルボキシ−４−ヒドロキシアニリン、３−スルホ−４−ニトロアニリン、３−フルフキシー４−ニトロアニリン、３−カルボキシ−４−二トロアニリン、４−メトキシ−β−ナフチルアミン、４−（Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキクエチル）アミノアニリン、５−アミノ−イソフタル酸ジメチルエステル、５−アミノ− ８−ニトロキノリン、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン、４−アミノジフェニルアミン。

強塩基性側鎖を有する２個のアミノ酸を含有する新規誘導体は、無機または有機酸とジ塩、あるいはＲ１が水素である場合にはトリ塩を形成することができる。

高い水溶解性をもつことから無機または有機酸のジ塩が塩としては好ましい。特に好適なのは塩酸塩である。

測定に適した酵素による基質の開裂は、Ｌ型アルギニンのカルボン酸側で起こり、従ってＮ末端アルギニンはＤ−異性体として存在しなければならない。驚くべきことに、生物学的−において、テトラはプチド基質の負に荷電した部分または中性の親脂質部分を、高い選択性とより強い感受性を保持した正荷電強塩基性アミノ酸に変化させることができた。

セリンプロテアーゼの定量および／または定性的測定、またはセリンプロテアーゼまたはその酵素前駆体形、例えば第Ｘａ因子に活性化される第Ｘ因子、と相互作用し得る成分の定量および／または定性的測定への本発明のペプチド誘導体の使用は重要な適用である。

この新規第Ｘａ基質は、それらの感度、高い溶解度および良好な選択性の故に、第）（ａ因子の測定に基づく診断上の分析を確立するにあたっての価値ある付加物である。

選択性が高いかどうかは血漿中のＦＸａの測定における重要な基準である。何故ならば、選択性が良くないと、最初から存在するかあるいはアッセイ中に形成される可能性のあるトロンビンから影響を受ける危険があるからである。重要な適用例は、ラッセルマムシ（ＲＹＶ−Ｘ’）からのプロテアーゼで活性化した後のヒト血漿中ＦＸａの測定、抗第り因子の測定、ヘパリンの測定および血友病におけるＦ■：Ｃの測定である（Ｈｅｍｋｅｒ　Ｈ，Ｃ，、前掲、Ｓ、　Ｒｏｓｉｎ。

５ｃａｎｄ、　Ｊ、　Ｈａｅｍａｔｏｌ、補遺４０．５３．　（１９８４）（３９−１４５）。

特に重要な適用例は、伝統的な血餅な基礎とする方法を使用できない、°低分子量ヘパリン画分を用いた抗凝血処理に関連した分析である（Ｗａｌｅｎｇａ　Ｊ、Ｍ、民地、Ｓｅｍ１ｎａｒｓｉｎ　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈｅｍｏｓｔａｔｉｓ、　１１．　（ｎｏ、２）、１９８５゜１００−１０７）。詳細にはＦＸａ活性の測定に依拠し、そしてＦＸおよびＦＸ’ａの直接測定にまたはＦ ■、Ｆ■ａ、　Ｆ■：Ｃ，ＦＶＩ：Ｃａ、　ＦＩＸ、ＦＸａ、アンチトロンビン ■、血小板第４因子、ヘパリン、低分子量ヘパリンおよびヘパリノイドの間接測定に用いられる方法が包含される。新規基質のこれら性質ゆえにこれらの基質は自動分析器における使用に対し特に適する。

新規ＦＸａ基質の合成にあたっては、はプチド化学において通常用いられる保護基およびカップリング方法（Ｍ。

Ｂｏｄａｎｓｋｙ　：　”Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ”、　ＳｐｒｉｎｇｓｒＶｅｒｌａｇ１９８４）、例えばマーカーを付与したＣ末端アミノ酸にアミノ酸を段階的に付加する方法、あるいはＮ末端ペプチド断片を合成し次いでそれをマーカーを付与したＣ末端アミノ酸にカップリングさせる方法などが用いられる。

有用なアミノ保護基は、ベンジルオキシカルボニル−１９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−またはｔ−プチルオキシーカルボニル基である。アルギニンのグアニジノ基の保護には、プロトン化、ニトロ保護基またはｐ−）ルエンスルホニル保獲基が用いられる。アミノ散開のカップリングは、α−カルボン酸基の活性化（例えば活性エステル、対称または非対称無水物、アジド、ＤＣＣＩまたは関連試薬）により行われる。

本発明を以下、本発明の様々な基質の製造を示す実施例で説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。

中間体および最終生成物の精製は、沈殿、結晶化、またはゲル濾過クロマトグラフィーにより行われる。精製された最終生成物は、凍結乾燥される。ＴＬＣ分析では予め製作されたシリカゲルＦ２５４のガラスプレートが用いられる。クロマトグラフィー終了後プレートをＵＶ光（２５４ｎｍ）で検査し、次いでニンヒドリンおよび塩素／ジカルボキシジン試薬で発色させる。示されるＲｆ値は単一クロマトグラフィーの結果である。

ＴＬＣに用いられる溶媒系を次表に示す表示　溶　媒　系　容量比Ａ＝ｎ−ブタノ−ｔｂ　：　ＡｃＯＨ：水　（５：２：１）Ｐａ６＝　りｏｏホルム：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ：水　（３４：４：９：２）Ｍ＝ｎ−ブタノール：ＡｃＯＨ：水：ピリジン　（１５：３：１２：１０）”３”＝　ＥｔＯＡｃ：ＡｃＯＨ：水：ピリジン　（３０：６：１１　：２０）ＨＰＬＣ分析はＭｅｒｃｋ　ＲＰカラム（Ｈｉｂａｒ　ＬｉＣｈｒａＣａｒｔ）にてα５チドリエチルアミノホスフエート（ｐＨ＝２．３５　）　中の４０％ＭｅＯＨを溶離剤（１−７分）として用いて行った。最。

終生放物の光学活性はｓｏ＊！１″駿中α４〜ｔＯＰ／１００ｄ濃度および＋２５℃で５８９　ｎｍで測定した。

以下において記載される略記は次の意味を有する＝ＣＩＵＰＡＣ表示が存在する場合にはそれを用いである）アミノ酸：Ａｒｇ＝アルギニンＤ−Ａｒｇ　＝　Ｄ−アルギニンＧｌｙ　＝　グリシンＳａｒ　＝　サルコシン（Ｎ−メチルグリシン）基質中のすべてのアミノ酸は、他に何の表示もなければＬ−配置を有する。

遊離アミノ酸またはペプチドは、Ｎ末端アミノ基のＨ−およびカルホキフル末端基の一〇Ｈにより示される。アミノ基は常に左方に与えられ、そしてカルボキシル基は右方に示される。

省略形Ａｃ　＝　アセチルＡｃＯＨ＝酢　酸ＡＭＣ：　７−アミノ−４−メチルクマリンＢｏｃ　＝　ｔ−ブチルオキシカルボニルＢｓ　＝　ベンゼンスルホニルＢｚ　＝　ベンゾイルＢｚｌＳ　＝　ベンジルスルホニルＣＨＡ　＝　５−カルボキシ−４−ヒドロキシアニリド４−ＣＩＢｓ＝　４−／ロロベンゼンスルホニルＤＣＣＩ　＝　シフクロへキシルカルボジイミドＤＣＵ　＝　ジンクロヘキフル尿素ＤＭＦ　＝　ジメチルホルムアミドＥｏｃ　＝　エチルオキシカルボニルＥｔＯＡｃ　＝酢酸エチルＥｔＯＨ：エタノールＥｔｓＮ　＝　）リエチルアミンＥｔｓ　＝　エタンスルホニルＨＯＢＴ　＝　１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエ　＝イオン強度Ｍｂｓ＝４−メトキシベンゼンスルホニルＭｅＯＨ＝　メタノールＭｅｓ　＝　メタンスルホニルＭｏｚ＝４−メトキシベンジルオキ７カルボニル４−Ｎｂ５＝４−二トロベンゼンスルホニルＮＥＭ＝４−二チルモルホリン４−Ｎｚ　＝　４−ニトロベンジルオキシカルボニルＮｓ　＝　β−ナフタレンスルホニル０Ｎｐ＝ｐ−二トロフェニルエステルｐＮＡ　＝　ｐ−ニトロアニリンＳｕｅ　＝　スクシニルＴＦＡ　＝　トリフルオロ酢酸ＴＬＣ＝　薄層クロマトグラフィーＴｏｓ　＝　ｐ−）ルエンスルホニルＴｒｉｓ　＝　）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタンＺ　＝　ベンジルオキシカルボニル実施例　１Ｎａ−Ｚ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・２ＨＣ１分子量＝７１４．６２１ａ）　Ｂｏａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ−ＨＢｒ　分子量＝　５３２．４０１２０ゴのＤＭＦに溶解した４３ミリモルのＨ−Ａｒｇ−ｐＮＡ−２ＨＢｒをＥｔｘＮを用いて冷却（−１０℃）下に中和する。形成されたＥｔｘＮ−ＨＢｒをＰ去後、４３ミリモルのＢｏｃ−Ｇｌｙ−○Ｈ１４５ミリモルのＨＯＢＴおよび５０ミリモルのＤＣＣＩを添加する。冷却下に１時間次に室温で一夜攪拌した反応を進行させる。形成されたＤＣＵを戸去しそしてその溶液を真空下に蒸発させて得られる油状物を１６０−のＥｔＯＡｃ　ｌ−溶解し、２％ＮａＨＣＯ３，Ｈ２Ｏ，２％　ＫＨＳＯ３およびＨ２Ｏで洗浄する。Ｎａ２Ｓ○４で乾燥後、ＥｔＯＡｃ相を蒸発させそしてジエチルエーテルで沈殿させる。

収率ニア１％ＴＬＣ：　Ｒｆ＝ｏ、２５　（ｐａ６）１ｂ）　Ｈ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ− ＴＦＡ−ＨＢｒ　分子量＝５４６．３Ｓ５５１！ＬｔのＴＦＡを５５１Ｒ１のメチレンクロライドに溶解した３０ミリモルのＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ− ＨＢｒ　（実施例１ａに従って製造）に添加する。その混合物を室温で５０分間攪拌した後ジエチルエーテルで沈殿させる。

収率：〜１００％ＴＬＣ：　Ｒｆ＝０．２８　（Ａ）ＩＮα−Ｚ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ−２ＨＣｔ　分子量＝７１４．６２２５−のＤＭＦに溶解しそして冷却下（−１０℃）でＥｔ３Ｎを用いて中和した２、５ミリモルのＨ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ−ＴＦＡ−ＨＢｒ（実施例１ｂに従って製造）中に２．５ミリモルのＺ−Ｄ−Ａｒｇ−ＯＨ−ＨＣＬ、　３ミリモルのＨＯＢ’ｌ’および５ミリモルのＤＣＣＩを添加する。その混合物を冷却下に１時間次に室温で４８時間攪拌する。形成されたＤＣＵを戸去し、そしてその溶液を真空下に蒸発させて油状物とし、３０−の水を添加し、そしてその溶液を２Ｘ２０ｄのＥ　ｔＯＡｃを用いて洗浄する。水相を真空蒸発させ、そして生成物を５０　％　ＥｔＯＨを溶離剤として用いるクロライド型の５ｅｐｈａｄｅｘ　（商標名）ＱＡＥ　−２５カラムにてイオン交換し、そして最後にＭｅｒｃｋＬｏｂａｒ　（商標名）を予め充填したカラム（Ｌｉｃｈｒｏｐｒｅｐ（商標名）・ＲＰ−８−Ｂ）にて３０％ＭｅＯＨを溶離剤（２ｔｎｔ／分）として用いて精製する。精製された生成物を凍結乾燥する。

収率：３７％ＴＬＣ：　Ｒｆ＝０．１１　（Ｆａ６）ＨＰＬＣ：　９８．５％純度〔α）＝−１８，１°（ｃ＝０．５％）実施例　２Ｎａ−Ｂｏｃ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ−２ＨＣＬ　分子量＝６８０．５９２．５ミリモルのＨ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ−ＴＦＡ−ＨＢｒおよび２．５ミリモルのＢｏｃ−Ｄ−Ａｒｇ−ＯＨＨＣＬを実施例１と同じカップリング方法および反応条件を用いて処理する。

収率：３５％ＴＬＣ：　Ｒｆ＝０．５５　（Ｍ）ＨＰＬＣ：　９６％純度（α）＝−２５，５°（ｃ＝０．４％）実施例　３Ｈ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ−５ＨＣＬ　分子量＝６１６．９６２２１ｎｔのメチレンクロライドに溶解した１２ミリモルのＮａ−Ｂｏａ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・２ＨＣＬ（実施例２（二従って製造）に２２− のＴＦＡを添加する。その混合物を３０分間室温で攪拌し、次いでジエチルエーテルで沈殿させる。

その生成物を実施例１と同様にしてイオン交換し精製する。

収率：３８％ＴＬＣ：　Ｒｆ＝０．３０　ＣＭ）ＨＰＬＣ：　９　Ｂ％線純度α）＝−６２，４°（ｃ＝０．５％）実施例　４Ｎａ−Ｅｔｓ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・２ＨＣｔ　分子量＝６７２．６２１０−のＤＭＦに溶解しそして（−１０”Ｃ）で８ｏμｔのＥｔｓＮを用いて中和した０、５ミリモルのＨ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・３ＨＣｔ（実施例３に従って製造）に０．５　ミ！Ｊモルのエタンスルホニルクロライドおよび８ｏμｔのＥｔ３Ｎを添加する。冷却下に１時間、そして室温で２時間攪拌する間に反応が進行する。その混合物を真空蒸発させる。生成物を実施例１と同じ方法でイオン交換しそして精製する。

収率：４４％ＴＬＣ：　Ｒｆ＝（１，５（Ｍ）ＨＰＬＣ：　９７％純度〔α）＝−１５，６’（ｃ＝０．６５％）実施例　５Ｎα−Ｂｓ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・２Ｈｃｔ　分子量＝７２０．６６０．５ミリモルのＨ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ−５１（ＣＬ（実施例３ニ従って製造）および０．５ミリモルのベンゼンスルホニルクロライドを実施例４と同じ方法および同じ反応条件下に処理する。

収率：３７％ＴＬＣ：　Ｒｆ＝０．５３　（Ｍ）ＨＰＬＣ：　９８％純度〔α）＝＋１１６°（ｃ＝０．４５％）実施例　６Ｎα−４−Ｎｚ−Ｄ−Ａｒｇ−（）ｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・２ＨＣｔ　分子量＝７５９．６４０．５ミリモルの）Ｉ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ−３ＨｃＬ　（実施例３に従って製造）および０．５ミリモルの４−ニトロベンジルオキシカルボニルクロライドを実施例４と同じ方法および同じ反応条件下で処理する。

収率：５７％ＴＬＣ：　Ｒｆ＝０．３　（Ａ）ＨＰＬＣ：　９９％純度［α］＝−２０，２℃（ｃ＝（Ｌ４５％）実施例　７Ｎα−４−Ｎｂｓ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・２ＨＣ２分子量＝７６５．６６０．５ミリモルのＨ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・５ＨＣＬ　（実施例３１：、　従−１）　−’Ｃｉ造）および０．５ミリモルの４−二トロベンゼンスルホニルクロライドを実施例４と同じ方法および同じ反応条件下で処理する。

収率：２５チＴＬＣ：　Ｒｆ＝０．２８　（Ａ）ＨＰＬＣ：　９７％純度〔α）＝−０，８９（ｃ＝０．６％）実施例　８Ｎα−Ｔｏｓ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・２ＨＣｔ　分子量＝７５４．６９０．５ミリモルのＨ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ−５ＨＣｔ（実施例３に従って製造）および０．５ミリモルのｐ−）ルエンスルホニルクロライドを実施例４と同じ方法および同じ反応条件下で処理する。

収率：４５％ＴＬＣ：　Ｒｆ＝０．２５　（Ａ）ＨＰＬＣ：　９８チ純度〔α）＝＋２３．１６（ｃ＝０．４５％）実施例　９Ｎ”−Ｍｏｚ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・２　ＨＣＬ　分子量＝７４４．６６０．５ミリモルのＨ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ−５ＨＣＬ　（実施例３に従って製造）および０．５ミリモルの４−メチルオキシベンジルオキシカルボニルアジドを実施例４と同じ方法および同じ反応条件下で処理する。

収率：３１％ＴＬＣ：　Ｒｆ＝０．２２　（Ａ）ＨＰＬＣ：　９７％純度〔α〕Ｌ−−１５．９°（ｃ＝０．４％）実施例　１ＯＮα−Ｍｂｓ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・２ＨＣＬ　分子量＝７５０．６９α５ミリモルのＨ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・３ＨＣｔ（実施例３に従って製造）および０．５ミリそルの４−メトキシベンゼンスルホニルクロライドを実施例４と同じ方法および同じ反応条件下で処理する。

収率：４５％ＴＬＣ：　Ｒｆ＝０．３１　（Ａ）ＨＰＬＣ：　９９％純度〔α）＝＋２２．８°（ｃ＝０．４％）実施例　１１Ｎα−４−Ｃ！Ｂｓ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ−２ＨＣＬ　分子量＝７５５．１２０．５ミリモルのＨ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・５ＨＣＬ　（実施例３に従って製造）および０．５ミリモルの４−クロロベンゼンスルホニルクロライドを実施例４と同じ方法および同じ反応条件下で処理する。

収率：３１％ＴＬＣ：　Ｒｆ＝０．３８　（Ａ）ＨＰＬＣ：　９９％純度〔α）＝千１０．９°（ｃ＝α４％）実施例　１２Ｎα−Ｎｓ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・２ＨＣ２分子量＝７７０．７３α５ミリモルのＨ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ−５ＨＣＬ　（実施例３に従って製造）および０．５ミリモルのβ−ナフタレンスルホニルクロライドを実施例４と同じ方法および同じ反応条件下で処理する。

収率：２５％ＴＬＣ：　Ｒｆ＝０．２９　（Ａ）ＨＰＬＣ：　９９％純度〔α）＝−２１５°（ｃ＝０．４％）実施例　１６Ｎα−Ｚ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ−２ＨＣＬ　分子量＝　７５１．７０３０−のＤＭＦに溶解しそして冷却下（−１０℃）でＥｔ３Ｎを用いて中和した２ミリモルのＨ−Ａｒｇ−ＡＭＣ・２ＨＣｔに２ミリモルのＺ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ＯＨ−ＨＣＬ、　２．５ミリモルのＨＯＢＴおよび２．５％９モルのＤＣＣＩを添加する。冷却下に１時間、次に室温で２４時間攪拌しながら反応を行う。形成されたＤＣＵを戸去しそしてその溶液を真空蒸発させて得られる油状物を実施例１と同じ方法でイオン交換しそして精製する。

収率：３９％ＴＬＣ：　Ｒｆ＝０．７　（”３”）ＨＰＬＣ：　９９％純度〔α）＝−２８，６°（ｃ＝０．５％）実施例　１４Ｎ“−Ａｃ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・２ＨＣＡ　分子量＝６２２．５４０．５ミリモルのＨ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・３ＨＣｔ（実施例６に従って製造）および０．５ミリモルの無水酢酸を実施例４と同じ方法および同じ反応条件下で処理する。

収率：４３チＴＬＣ：　Ｒｆ＝０．４５　（Ｍ）ＨＰＬＣ：　９７チ純度〔α）＝−２７，９６（ｃ＝（］、４％）実施例　１５Ｎα−３ｕｃ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・２　ＨＣｌ　分子量＝６８０．５７０．５ミリモルのＨ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ−３ＨＣ２（実施例乙に従って製造）および０．５ミリモルの無水コノ・り酸を実施例４と同じ方法および同じ反応条件下に処理する。

収率：４０チＴＬＣ：　Ｒｆ＝０．２５　（Ａ）ＨＰＬＣ：　９８チ純度〔α：］＝−２１．４°（ｃ＝０．５％）０．５ミリモルのＨ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ−３ＨＣｔ（実施例３に従って製造）および０．５ミリモルのベンジルスルホニルクロライドを実施例４と同じ方法および同じ反応条件下に処理する。

収率：３８％ＴＬＣ：　Ｒｆ＝０．２６　（Ａ）ＨＰＬＣ：　９８チ純度〔α：）＝−７，８（ｃ二０．４％）実施例　１７Ｎα−Ｂｚ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・２ＨＣＬ　分子量＝６８４．６１１７ａ）　Ｚ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−ｐＮＡ　分子量＝５３０．５１７５０−のＤＭＦに溶解した０、３５モルのＨ−Ａｒｇ−（ＮＯ２）ｐＮＡ・ＨＢｒを冷却下（−１０℃）にＥｔ５Ｎを用いて中和する。形成されたＥｔｓＮ −ＨＢｒを許去した後、０，３５モルのＺ−Ｇｌｙ−ＯＨ。

０．３５そルの）（ＯＢＴおよび０．３８モルのＤＣＣＩを添加する。

冷却下に１時間そして室温で一夜攪拌しながら反応を行う。形成されたＤＣＵを戸去し、そしてその溶液を真空蒸発させて得られる油状物を３ｘ４００ｔｎｔの２％ＮａＨＣＯｓおよび５００ゴの水で摩砕する。生成物を３，５ｔのＭｅＯＨから再結晶する。

収率：８０チＴＬＣ：　Ｒｆ＝０．６　（Ｐａ６）１７ｂ）　Ｈ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−ｐＮＡ−ＨＣｔ　分子量＝４３２．７２０．３モルのＺ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−１）ＮＡ　（実施例１７ａに従って製造）を６′５０−のＡｃ　ＯＨ中に懸濁する。Ａｃ　ＯＨ中の５．６Ｍ　ＨＢｒ　４１５＊を攪拌しながら添加する。その混合物を室温で４５分間攪拌し、そして７．５１の乾燥ジエチルエーテル中に攪拌しながら注入する。沈殿を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄しそして真空乾燥する。

収率：９０％生成物３２を実施例１と同じ方法でイオン交換する。

収率ニア３チＴＬＣ：　Ｒｆ＝０．１５　（Ｐａ６）１７ｃ）　Ｎ”−Ｂｏｃ〒Ｄ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−ｆｌｙ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−ｐＮＡ分子量＝６９７．６９２５ｔＩＬｔのＤＭＦに溶解した４ミリモルのＨ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＮＯ２）− ｐＮＡ−ＨＣＬ（実施例１７ｂに従って製造）を冷却下（−１０℃）にＥｔｓＮを用いて中和する。形成されたＥｔｓＮ−ＨＣｔを戸去後、４ミリモ／）のα− Ｂｏｃ−Ｄ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−ＯＨ、４ミリモルのＨＯＢＴおよび４．２　ミ！ＩモルのＤＣＣＩを添加する。冷却下に１時間次に室温で一夜攪拌しながら反応させる。形成されたＣＣＵを渥去しそして溶液を真空蒸発させて得られる油状物を２％ＮａＨＣＯ３、水、２％ＫＨ８Ｏ４、水およびジエチルエーテルで懸濁させる。

収率ニア３％ＴＬＣ：　Ｒｆ＝０．３２　（Ｐａ６）１７ｄ）　Ｈ−Ｄ−Ａｒｇ（ＮＯ２）− Ｃ）ｌｙ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−ｐＮＡ−ＨＣＬ　分子量＝６３４．０４３ミリモルのＮα−Ｂｏｃ−Ｄ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＮＯ２） −ｐＮａ（実施例１７ｃ　ｌ＝従って製造）を１１ｒｎｔのＡｃＯＨに懸濁し、１１−のＴＦＡを添加し、そしてその混合物を室温で４時間攪拌する。生成物をジエチルエーテルで沈殿させ、そして実施例１と同じ方法でイオン交換する。

収率ニア２％ＴＬＣ：　Ｒｆ＝０．６１　（Ｍ）１７ｅ）　Ｎ”−Ｂｚ−Ｄ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−ｐＮａ　分子量＝７０１．６８２０−のＤＭＦに溶解しそして冷却下（−１０℃）に７０ｔｔＬのＥｔｓＮを用いて中和した０、　５ミリモルのＨ−Ｄ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−ｐＮＡ・ＨＣＬ（実施例１７ｄ（二従って製造）に０．６ミリモルの安息香酸無水物および７０μｔのＥｔｓＮを添加する。冷却下に１時間そして室温で２時間攪拌しながら反応させる。その混合物を真空蒸発させ、そして水で沈殿させる。生成物を３０艷の温Ｍｅ　ＯＨを用いて懸濁させ、濾過しそして乾燥する。

収率：６８％ＴＬＣ：　Ｒｆ＝０．５１　（Ｐａ６）１７、Ｎα−Ｂｚ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ −Ａｒｇ−ｐＮＡ−２ＨＣ６分子量＝６Ｂ４．６１０．３５ミリモルのＮα−Ｂｚ−Ｄ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−ｐＮＡ　（実施例１７ｅ（−従って製造）を、８ａｋａｋｉｂａｒａの報告（Ｓ、　５ａｋａｋｉｂａｒａ氏他、Ｂｕ１１．　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、、　Ｊａｐａｎ　２４０゜７１６４−６７　（１９６７））に従い適切な装置で０．５　ｍＡのアニソールの存在下に１５−の乾燥ＨＦと６０分間０℃で反応させることにより脱保護する。反応終了後、すべてのＨＦを留去し、粗生成物を実施例１と同じ方法でイオン交換しそして精製する。

収率：３６チＴＬＣ：　Ｒｆ＝０．５５　ＣＭ）ＨＰＬＣ：　９８チ純度（α）　＝−２４，４°（ｃ５Ｄ、６％）実施例　１８Ｎａ−Ｅｏｃ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇ１７−Ａｒｇ−ｐＮＡ−２ＨＣＡ　分子量＝６５２．５７１８ａ）　Ｎａ−Ｅｏｃ−Ｄ−Ａｒｇ（ＮＯｚ　）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−ｐＮａ分子量＝６＜５９．６３２０−のＤＭＦに溶解しそして冷却下（−１０℃）に７０μＬのＥｔ３Ｎを用いて中和したＯ、ＳミリモルのＨ−Ｄ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−ｐＮＡ−ＨＣＡ　（実施例１７ｄに従って製造）に０．６ミリモルのエチルクロロホルメートおよび７０μＬのＥｔｓＮを添加する。冷却下に１時間そして室温で２時間攪拌する間に反応を進行させる。その混合物を真空蒸発させ、そして水で沈殿させ、濾過し、そして水およびジエチルエーテルで洗浄する。

収率：８９％ＴＬＣ：　Ｒｆ＝０．２６　（Ｐａ６）１８、Ｎａ−Ｅｏｃ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・２ＨＣ２分子量＝６５２．５７０．４５ミリモルのＮａ− Ｅｏｃ−Ｄ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−ｐＮＡ　（実施例１８に従って製造）を実施例１７と同じ方法で０．５艷のアニソールの存在下に２０−の乾燥ＨＦと反応させることにより脱保護する。

収軍二４１％ＴＬＣ：　Ｒｆ＝１１５５（Ｍ）ＨＰＬＣ：　９８％純度〔α）＝−２５，２°（ｃ＝０．３５％）実施例　１９Ｎａ−Ｍｅｓ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・２　ＨＣｔ　分子量＝６５８．６０１９ａ）　Ｎａ−Ｍｅｓ−Ｄ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−ｐＮＡ分子量＝６７５．６６２０−のＤＭＦ　（二溶解した０、５ミリモルのＨ−Ｄ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−（）ｌｙ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−ｐＮＡ−ＨＣｔ（実施例１７ｄに従りて製造）と０６ミリモルのメタンスルホニルクロライドとを実施例１７ｅと同じ方法および同じ反応条件下に処理する・収率ニア０％ＴＬＣ：　Ｒｆ＝０．４７　（Ａ）１９、Ｎａ−Ｍｅｓ％−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・２ＨＣＬ　分子量＝６５８．６００．３５ミリモルのＮａ−％ｅｓ、−Ｄ−Ａｒｇ　（ＮＯ２） −Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＮＯ２）　−ｐＮＡ　（実施例１９ａに従って製造）を実施例１７と同じ方法で脱保護しそして精製する。

収率：４５．５％ＴＬＣ：　Ｒｆ＝０．４８（Ｍ）ＨＰＬＣ：　９７％純度〔α）＝−１７，６９（ｃ＝０．５％）実施例　２ＯＮａ−Ｚ−Ｄ−Ａｒｇ−８ａｒ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・２ＨＣＬ　分子量＝７２８．６６２０ａ）　Ｈ−８ａｒ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・２ＨＣｊ　分子量＝４５８．５３２５ゴのＤＭＦ冒二溶解しそして冷却下（−１０℃）（二Ｅｔ５Ｎを用いて中和した５ミリモルのＨ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・２ＨＣｌに５ミリモルのＢｏｃ−８ａｒＯＨ、５ミリモルのＨＯＢＴおよび６ミリモルのＤＣＣＩを添加する。その混合物を冷却下に１時間そして室温で一夜攪拌する。形成されたＤＣＵを戸去し、そして溶液を真空蒸発させて得られた油状物を１００ｄのｎ−ブタノールに溶解し、２％ＮａＨＣＯｓ　、Ｈ２Ｏ，２％　ＫＨＳＯ３およびＨ２Ｏで洗浄する。Ｎａ２５Ｏａで乾燥後、ｎ−ブタノール相を蒸発させ、そしてジエチルエーテルで沈殿させる。沈殿を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄し、そして乾燥する。

その物質なＨＣ／、溶液（ＡｃＯＨ９１５Ｍ）２５−中（二懸濁し、室温で２時間攪拌し、ジエチルエーテルで沈殿させ、そして実施例１と同じ方法でイオン交換する。

収率：６３．５係ＴＬＣ：　Ｒｆ＝０．１５　（Ａ）２０、Ｎａ−Ｚ−Ｄ−Ａｒｇ−８ａｒ−Ａｒｇ−ｐＮＡ−２ＨＣＬ　分子量＝７２８．６６′５０−のＤＭＦに溶解しそして冷却下（−１０℃）にＥｔｓＮを用いて中和した３ミリモルのＳａｒ−Ａｒｇ−ｐＮＡ−２ＨＣｔ（実施例２０ａに従って製造）に６ミリモルのＺ−Ｄ−ＡｒｇＯＨ−Ｈ（’ｔ。

６ミリモルのＨＯＢＴおよび五５ミリモルのＤＣＣＩを添加す。

る。その混合物を冷却下に１時間および室温で７２時間攪拌する。形成されたＤＣＵを戸去しそしてその溶液を真空蒸発させる。生成物を実施例１と同じ方法でイオン交換しそして精製する。

収率；４５％ＴＬＣ：　Ｒｆ＝０．２　（Ａ）ＨＰＬＣ：　９９％純度１：ｔｔ：］＝　−２４，７’　（ｃ＝０．５５％）実施例　２１Ｎａ−Ｚ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＣＨＡ・２ＨＣｔ　分子量＝７２９．６５２１ａ）　Ｂｏｃ−Ａｒｇ−ＣＨＡ−ＨＣＬｌｏｓｄのＤＭＦ　に溶解しそして冷却下（−１０℃）に中和した５、０ミリモルのＢｏｃ−Ａｒｇ−ＣＨＡ− ＨＣｌにＳ２ミリモルのインブチルクロロホルメートを添加する。その反応混合物を冷却下に１５分間攪拌し、そして６ミリ七ルの６−カルボキシ−４−ヒドロキシアニリン、３ミリモルのＮＢＩＩＭおよび１［１ｍｇのＤＭＦからなる混合物を添加する。冷却下に２時間そして室温で一夜攪拌する間に反応が進行する。

溶液を真空蒸発させて油状物とし、５０−のｎ″″″ブタノール加し、そしてその混合物を室温で５時間攪拌する。形成されたＢｏｃ−Ａｒｇ−ＣＨＡ−ＨＣｔを戸取する。

収率：５０チＴＬＣ：　Ｒｆ＝α５（Ａ）・２１ｂ）　Ｈ−Ａｒｇ−ＣＨＡ−ＨＣｌ　分子量＝５８２．２５ＡｃＯＨ中の２Ｎ　ＨＣｌ　８　ａｄを２ミリモルのＢＯＣ−Ｇ１７−Ａｒｇ−ＣＨＡ−ＨＣｌ（：添加する。室温で４５分間反応を進行させる。

反応混合物を真空蒸発させて得られる油状物をイソプロ・ぞノール（＝溶解し、そしてＥｔＯＡｃで沈殿させる。

収率：９７チＴＬＣ：　Ｒｆ＝α１５　（Ａ）２１ｃ）　Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＣＨＡ−ＨＣｔ　分子量＝５０２．９５１２　ｄ　ＤＭＦに溶解した２ミリモルのＨ−Ａｒｇ−ＣＨＡ・２ＨＣＡを冷却下（−１０℃）にＮＥＭを用いて中和後、２１ミリモルのＢＯＣ−Ｇｌｙ−ＯＮｐを添加する。冷却下に１時間そして室温で一夜攪拌しながら反応を進行させる。

その溶液を真空蒸発させて得られる油状物を１０ｄのＭｅＯＨに溶解しそしてＥｔｏＡｃで沈殿させる。

収率：８８％ＴＬＣ：　Ｒｆ＝０．４　（Ａ）２１ｄ）　Ｈ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＣＨＡ−２ＨＣｔ　分子量＝４！１９．３０Ａｃ　ＯＨ中の２Ｎ　ＨＣｌ　１０−を２ミリモルのＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＣＨＡ−ＨＣ２ｌ二添加する。その反応混合物を室温で４５分間攪拌し次いでＥｔＯＡｃ中で沈殿させる。

収率：９８％ＴＬＣ：　Ｒｆ：　０．１５　（Ａ）２１、Ｎ”−Ｚ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＣＨＡ−２ＨＣＡ　分子量＝７２９．６５１０ゴのＤＭＦに溶解した１ミリモルのＨ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＣＨＡ・２ＨＣＬを冷却下（−１０℃）にＮＥＭを用いて中和後、１１ミリモルのＺ− Ｄ−Ａｒｇ−ＯＮｐ−ＨＮＯ３を添加する。冷却下に１時間そして室温で２時間反応を進行させる。その溶液を真空蒸発させて得られる油状物をＥｔＯＡｃを用いて沈殿させる。生成物を５ｅｐｈａｄｅｘ　（商標名）カラムにて１０％ＡｃＯＨを溶離剤として用いて精製し、そしてクロライド型の５ｅｐｈａｄｅｘ　（商標名）ＱＡＥ−２５カラムにて５０％ＥｔＯＨを溶離剤として用いてイオン交換する。

収４．５７％ＴＬＣ：　Ｒｆ＝０．２１　（Ａ）ＨＰＬＣ：　９９％純度〔α：）＝−１８，６°（ｃ＝［１，３％）実験酵素反応速度特性の測定様々な基質濃度（Ｓｌ）および一定の酵素濃度（ＥＯ）で加水分解初速度（Ｖｉ）を測定することにより基質に対する反応速度データーをしらべる。結合定数（Ｋｍ）および最大速度（Ｖｍａｘ）をＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ　−Ｂｕｒｋ−プロットから既知の方法で得た後、Ｋｃａｔを算出する（Ｈｅｍｋｅｒ　Ｈ，Ｃ，前掲書）０方法酵素と基質を＋３７℃で緩衝溶液中で混合する。１分間あたりの吸光度変化を、４０５ｎｍで分光光度計を用いて（ｐＮＡ基質の場合）、あるいは３８０　ｎｍの励起波長および４４　Ｄ　ｎｍの発光波長で分光螢光計を用いて（ＡＭＣ基質の場合）測定する。

次の商業的に入手し得る標準基質を試験に用いる。

標準基質Ｓ−２２２２：　Ｂｚ−１１ｅ−Ｇｌｕ−（γ−○Ｒ）　−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ−ＨＣ２Ｒ：Ｈ＝５０％１ｃＨ３＝５０％ＫａｂｉＶｉｔｒｕｍ　ＡＢ社、ストックホルム、スエーデンＣＢＳ　３１．３９　：　ＣＨｘＳＯ２−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ−ＡｃＯＨＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ　Ｓｔａｇｏ社、Ａｓｎ１ｅｒｅｓ　ｓ／５ｅｉｎｅ、フランス試験１．　ウ７ＦＸａに対する反応速度定数の測定一定の酵素濃度、すなわちＦ、ｏ　＝　４ナノモル／　Ｌ　（ｐＮＡ−基質）Ｅｏ　＝　２ナノモル／ｌ（ＡＭＣ−基質）を有するウシＦＸａ　ＣＫａｂｉＶｉｔｒｕｍ社）と、０．０１〜０．４ミリモル／を濃度（Ｓｌ）の基質を６７℃でトリス緩衝溶液（０，０５モル／Ｌ、ｐ）（Ｂ、３、Ｉ　＝　０．２５　（ＮａＣ６））中で混合する。１分間あたりの吸光度変化をｐＮＡ−基質の場合には４０５ｎｍで分光光度計を用いて、あるいはＡＭＣ−基質の場合は４４０ｎｍの発光波長で螢光光度計を用いてそれぞれ測定する。次いでこれらの値から、ＫｍおよびＫｃａｔを算出し、それらを第１表に示す。

第１表は、本発明のトリはプチド基質がウシ酵素ＦＸａに対して高い親和性を有すると同時にその大部分が高い速度を有することを示している。選択性定数Ｋ（ａｔ、／Ｋｍからは、新規基質がＳ−２２２２よりも優れた対ウシＦＸａ選択性を示すこと、そして大部分の新規基質にあってはＣＢ５３１．３９を凌いでさえいることがわかる。

試験２．　ヒ）　ＦＸａに対する反応速度定数の測定０．１〜０．７ミリモル／を濃度（Ｓｌ）の基質をヒト血漿ＦＸａと混合し、そしてＡｕｒｅｌｌ；　Ｌ０氏民地Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ　ｉｎＨｏｍｏｓｔａｓｉｓ、　Ｅｄ、　Ｆａｒｅｅｄ　Ｊ　ｅｔ　ａｌ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ＰｅｒｇａｍｏｎＰｒｅｓｓ　１９８１．　Ｐ、　３８２〜３８８）により報告された方法に従って処理する。

供試血漿、対照または標準物の１０μｔを２００μｔのトリス緩衝溶液（トリス０．０５モル／Ｌ、ｐ！（７，０、Ｉ　＝　０．２５（ＮａＣ４）　）、ポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）　（０，１ｆ／Ｌ）を混合し、そして３７℃で２〜４分間インキュベートする。前述のようにして調製されたトリス緩衝溶液中に溶解された０、１〜０７ミリモル／を濃度の基質（３７℃）２００μＬを添加する。この混合物を十分攪拌し、そして５０秒内にＲＶＶ　＋物を攪拌する。直ちに、４０５　ｎｍおよび３７℃で分光光度計な用いて吸光度変化を測定する。

結果を第１表（二示す。

第■表は、新規トリペプチド基質が標準基質（二比較してヒ）　ＦＸａ酵素（二対して優れた親和性を有すると同時に高い速度を有することを示しており、それゆえこれら新規ペプチドは商業的に入手し得る基質よりも優れている。

試験６．トロンビン感受性の測定血漿中のＦＸを測定する場合、そのｒＸａ測定を妨害する活性トロンビンが形成される危険が常に存在する。

一定濃度（Ｅｏ＝１３ナノモル／Ｌ）のつ／トロンビン（Ｋａｂｊ、Ｖｉ　ｔｒｕｍ社）と０．１〜０．４ミリモル／を濃度（Ｓｉ）の基質を５７℃で、トリス緩衝溶液（０，０５モル／ｌ、ｒｉ４＝８．３、Ｉ　＝　０．２５　（ＮａＣ２）　）中で混合する。この試験は試験１と同様にして行う。

１分間あたりの吸光度変化を４０５　ｎｍで分光光度計を用いて測定し、セしてＫｍおよびＫｃａｔ値を第ｍ表に示されるとおり算出する。

第■表は、新規トリペプチド基質が対ウシＦＸａ選択性定数のトロンビンに対する比においてテトラペプチドに匹敵し、またつ７ＦＸａの感受性をトロンビンと比較した場合に既矧のトリペプチドよりも優れていることを示している。

試験４．　溶解度いくつかの新規基質についてそれぞれ２５℃（二おける水およびトリス緩衝溶液（０，０５モル／ｚ、ｐＨ冨８．３、Ｉ＝０．２５（ＮａＣ６））への溶解度をテトラペプチド基質Ｓ−２２２２色比較したものを第■表に示す。

この表は新規トリはプチド基質が水および緩衝溶液のいずれにおいてもテトラはプチドＳ−２２２２よりも明らかに高い溶解度を有していることを示している。

第　１　表Ｓ−２２２２０，５１１８００，３５１０，１１２５０２，２７２０，２２１８００，８２４０，１９２７０１４２５０，２６２８０１０７６０，２１３５０１６６７０，４５２４５０，５５８０，２２２５０１，０４９０，１５３１０，２，０６１００，２０２１０ｔｏ５１１　０．２７　２６０　０．９６１２　０．１２　１４０　１１４１３　、　０．１９　１７０　０．８９１６　０．０４　１１０　２．７５１８　０．１６　２２５　１４１１９　０．１７　２００　１．１７２０　０．１６　２２０　１３７ＣＢＳ５ｔ３９　０．２９　２９０　ｔｏ。

第　■　表５−２２２２　１９７０　４６　０．ｏ２５１　５８０　７５　Ｑ、１９２４　３４０　４６　０．１５５９　２１０　５１　０．２４２１６　５０　１５　０．３００ＣＢＳ　５ｔ５９　１０６０　６１　０．０５７第ｍ表５−２２２２　０．７１　１ｓ　ｏ、ｏｌｅ　１９．４１　０．１３　１３０．１００　２２．７４　０．４１　２３　０．０５６　２５．４９　０．０７５　１１　０．１５１　１３．６１６　０．１６　１７０．１０６　２５．９ＣＢＳ　５１３９　０．２３　７２　０３１３　＆２第　■　表１６　＞５　＞１０国際調査報告 □＾―−−１観ＰＣＴ／Ｓε８７１００１４１

Claims

【特許請求の範囲】

１．一般式Ｒ１−Ｘ−Ｄ−Ａｒｇ−Ａ−Ａｒｇ−ＮＨ−Ｒ２〔式中、Ｒ１は水素、α−もしくはβ−ナフチル基、低級アルキル基（該基はカルボキシル基で置換されていてもすい）、未置換もしくは置換フエニル−もしくはフエニルアルキル基（そのアルキル基は１〜４個の炭素原子を有し、また好ましくは置換基はフェニル環のパラ位にありそして置換基は低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲンまたはニトロ基である）であり、Ｘは▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等があります▼ または単結合であるがただしＲ１が水素である場合にのみＸは単結合であり、ＡはＱｌｙまたはＳａｒ，であり、Ｒ２は定量的に測定されうる酵素的加水分解にすりＲ２−ＮＨ２化合物を生ずる芳香族または複素環残基である〕を特徴とするトリペプチド誘導体またはその無機または有機酸とのジ塩およりトリ塩。
２．ＡがＱｌｙである請求の範囲第１項記載のトリペプチド誘導体。
３．Ｘがオキシカルボニル−またはスルホニル基である請求の範囲第１項または第２項記載のトリペプチド誘導体。
４．ＮＨ２−Ｒ２が色原体性または螢光原性の基である請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載のトリペプチド誘導体。
５．ＮＨ２−Ｒ２がｐＮＡ、ＡＭＣまたはＣＨＡである請求の範囲第４項記載のトリペプチド誘導体。
６．Ｒ１がエチル、ベンジルまたはｔｅｒｔ−ブチルである請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載のトリペプチド誘導体。
７．ジ塩の形態の請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載のトリペプチド誘導体。
８．Ｎα−Ｂｚｌｓ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・２ＨＣｌである請求の範囲第１項記載のトリペプチド誘導体。
９．Ｎα−Ｍｏｓ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・２ＨＣｌである請求の範囲第１項記載のトリペプチド誘導体。
１０．Ｎα−Ｅｔｓ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・２ＨＣｌである請求の範囲第１項記載のトリペプチド誘導体。
１１．Ｎα−Ｚ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・２ＨＣｌである請求の範囲第１項記載のトリペプチド誘導体。
１２．Ｎα−Ｂｏｃ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・２ＨＣｌである請求の範囲第１項記載のトリペプチド誘導体。
１３．−ＮＨ−Ｒ２を有するかまたは後に−ＮＨ−Ｒ２により交換される脱保護可能なカルボキシル保護基を有するＡｒｇに対するカップリングにより段階的に、あるいはＲ１−Ｘ−Ｄ−Ａｒｇ−ＡをＡｒｇ−ＮＨ−Ｒ２にカップリングさせることにより、合成を行うことを特徴とする請求の範囲第１〜１２項のいずれかに記載のトリペプチド誘導体の製造方法。
１４．請求の範囲第１〜１２項のいずれかに記載のペプチド誘導体を使用することを特徴とするセリンプロテアーゼ、特にＦＸａの測定方法。
１５．請求の範囲第１〜１２項のいずれかに記載のペプチド誘導体を使用することを特徴とするセリンプロテアーゼまたはその酵素前駆体形態のものと相互作用し得る成分の測定方法。
１６．ＦＸ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩａ、ＦＶＩＩＩ：Ｃ、ＦＶＩＩＩ：Ｃａ、ＦＩＸ、ＦＩＸａ、抗トロンビンＩＩＩ、血小板第４因子、ヘパリン、低分子量ヘパリン類およびへパリノイドを測定するための請求の範囲第１４項または第１５項記載の方法。