JPH02253149A - 酵素センサの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、酸素電極を用いた酵素センサ及びその製造方
法に係り、特に酵素反応により消費される酸素（０□）
量に比例した酸化還元応答電流値の変化を検出して被検
物質の濃度を測定する酵素センサ及びその製造方法に関
する。

［従来の技術］ 従来、バイオセンサとしてよく知られているものに、酵
素反応で生成する酸素の消費量を測定して血液中のグル
コース濃度を測定する酵素センサが知られている。

従来、この酵素センサの検知部分には、カットに白金、
アノードに銀または銀／塩化銀を用い、内部液に塩化物
を添加した標準緩衝溶液を封入し、その外側を酸素ガス
選択透過膜を被覆した所謂クラーク型酸素電極がもっば
ら使用されてきた。

［発明が解決しようとする課題］ しかしながら、上述のクラーク型酸素電極では、その微
小化が困難であり、また内部液室を保有しているために
漏れや汚染問題が生し易く、応答速度が遅かった。さら
に、分離型酸素電極では応答が迅速となるが、カソード
の白金電極はＨ′″イオン濃度の影響を受は易く、この
ためｐＨ濃度が大きく変化する流動系では、真の酸素分
圧（ＰＯ２）濃度との区別が困難であった。

本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、
微小化が容易であるとともに、汚染問題が生ずることが
なく、しかもＨ゛イオン濃度酸素分圧の影響を受けるこ
とがなく、応答速度が向上し、流動系における連続モニ
タリング測定に好適な酵素センサ及びその製造方法を提
供することを目的とする。

［課題を解決するための手段］ 上記課題を解決するために、本発明による酵素センサに
おいては、導電性基体と、該導電性基体を被覆するとと
もに酸素還元触媒機能を有する配位子化合物を含む酸素
電極膜と、該酸素電極膜を被覆する酵素固定化膜とを備
えたことを特徴とする。

このような構成によれば、固体型であるため、従来セン
サのような液漏れや汚染等の問題は生しない。また、微
小化（たとえば０．０１ｃｍ２以下）が容易であり、Ｈ
゛イオン濃度影響を受けにくく、したがってｐＨ濃度が
大きく変化する流動系において使用しても精度よく測定
を行うことができる。

前記酸素還元触媒機能を有する配位子化合物としては、
環状の窒素含有化合物からなるものが好ましく、特に、
ポルフィリン誘導体、フタロシアニン誘導体、シフラム
誘導体またはフェナントロリン誘導体であることが好ま
しい。

ポルフィリン誘導体としては、たとえばメソテトラ（０
−アミノフェニル）コバルトポルフィンがある。また、
フタロシアニン誘導体としては、たとえばテトラアミノ
フタロシアニン、またフェナントロリン誘導体としては
ジアミノフェナントレンがある。

なお、上記配位子化合物に取り込まれる遷移金属は、酸
素還元触媒機能を有するものであればよく、たとえばコ
バルト、鉄、ニッケル、クロム、モリブデン、ルテニウ
ム等が用いられる。

また、導電性基体は、酸素濃度やＨ゛イオン濃度影響を
受けない材料、たとえば導電性炭素材料により形成する
ことが好ましい。

上記酵素センサは、導電性基体の表面に、酸素還元触媒
機能を有する配位子化合物を含む溶液を塗布することに
より酸素電極膜を被覆形成させた後、この酸素電極膜の
表面に酵素を含む固定化試薬を塗布して酵素固定化膜を
被覆形成させることにより製造することができる。

酸素電極膜の製造は、上記塗布性以外に、適下法やレジ
スト法によってもよく、さらに電解重合法、蒸着法等に
より配位子化合物の外植に結合したＮＨ２基、ＯＨ基、
Ｃ０ＯＨ基、ビニル基等をポリマー化（ペンダント型ポ
リマー、ラダー型ボッマーおよびビニル型ポリマー等）
することによってもよい。

また、上記酸素還元触媒機能を有する配位子化合物を、
酵素とともに同一の膜内に含有させ、特に酵素とともに
不溶化し固定化するようにしてもよく、この場合にも上
記センサと同様の効果を得ることができる。

この酵素センサば、導電性基体の表面に、酸素還元触媒
機能を有する配位子化合物を含む溶液、酵素を含む溶液
および固定化試薬を順次塗布または滴下し、これらを混
合して反応させ、配位子化合物を酵素とともに不溶化し
固定化することにより製造することができる。

［実施例］ 以下、本発明の実施例を図面を参照して具体的に説明す
る。

（実施例１） 導電性炭素材料（Ｂ　Ｐ　Ｇ　：　Ｂａ５ａｌ　ｐｌａ
ｎｅｐｙｒｏＬｙｔｉｃ　ｃａｒｂｏｎ、　Ｕ　ＣＣ社
製）からなる円柱状（または円板状）の基体（直径０．
５２５ｍｍ）を用意し、その一端に導電性接着剤を用い
てリード線を接続し、その回りを絶縁テフロンチューブ
で覆い、その隙間に絶縁性接着剤（スリーポンド社製、
ＴＢ２０６７）を充填して電気的に絶縁させて、キャピ
ラリ電極を作製した。次に、このキャピラリー電極の先
端の一部を切断して研磨し、第１図（ａ）に示すような
微小炭素ディスク型の電極基体ｌを作製した。この電極
１を２個用意し、それぞれその上に、次の（Ａ）、（Ｂ
）の溶液をマイクロシリンジ２で滴下し、針先で混ぜた
。

（Ａ）　　５ｍＭ　　　メソテトラ　（０−アミノフェ
ニ１し）コバルトポルフィリン（Ｃｏ−ＴＡＰＰ）　　
２．　４ｕ１２（ＣＨ，ＣＮ（溶媒）中） ＋ １５％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を 含む５０ｍＭリン酸緩衝液　２．０μ℃（Ｂ）　　５ｍ
Ｍ　　　メソテトラ　（０−アミノフェニル）コバルト
ポルフィリン（Ｃｏ−ＴＡＰＰ）　　２．　４ｕ、ｅ（
ＣＨ３ＣＮ（溶媒）中） ＋ ０　　、　　２　　ｍｇ／ｍＩ２　　グルコースオキシ
ターｆｆＧｏ　　Ｘ　）および１５％牛血清アルブミン
（ＢＳＡ）を含む５０ｍＭリン酸緩衝液　２０μ℃次に
、同図（ｂ）に示すようにマイクロシリンジ３にて２５
重量％グルタルアルデヒド１．２μ℃をその上に滴下し
、これらの溶液を再度同図（Ｃ）に示すように針先４に
より均一に混ぜ合せで、大気中で１５分間反応させた。

次いで、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）中で１
２時間反応させ、さらに１０重量％グリシン水溶液中に
１５分間浸漬し、未反応グルタルアルデヒドを除去した
。

夫隨桝ユ 実施例１で製作した酵素電極を用いて、１０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ＝７．０）中の酸素濃度に対するサイクリ
ックポルタモグラムを求めた。

第２図（ａ）がグルコースオキシダーゼ（ＧｏＸ）を含
まない電極Ａ、同図（ｂ）がグルコースオキシダーゼを
含む電極Ｂの結果をそれぞれ示すものである。その結果
、一定電位（０，８Ｖ対飽和塩化ナトリウム力ロメロ電
極（ＳＳＣＥ））において、グルコースオキシダーゼを
含む電極Ｂの方が、電極Ａの場合に比べて電流変化が大
きいことが明らかとなった。

また、電流密度（Ａ／ｃｍ”）は、電極Ｂが２、　　ｌ
　２　Ｘ　］　０−３Ａ／ｃｍ２．電極Ａが１．３４Ｘ
１０−”Ａ／ｃｍ２であり、電極Ｂの方が１．５８倍大
きかった。

支脹輿ス 実験例１のグルコースオキシダーゼを含む電極Ｂとグル
コースオキシダーゼを含まない電極Ａを用いてグルコー
ス濃度に対する電流値変化を検討した。

実験は、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７，００）にｌ　ｇ／ｉのグルコース溶液を加え、空気
バブリング（速度０．２１！／分）を行い、スターク（
撹拌器）で撹拌し、一定電位（−０，６Ｖ対５ＳＣＥ）
の時の電流値変化を調べた。その結果を第３図（ａ）、
（ｂ）に示す。同図（ａ）は作製後４日目、また同図（
ｂ）は作製後２００日目結果をそれぞれ示すものである
。

この結果、作製後４日目の電極では、グルココース濃度
５〜１００ｍｇ／ｄβ迄の電流値は約１００〜３９．２
９ｎＡ、さらに作製後２０日では、約１１０〜３３．３
ｎＡに直線的に変化する良好な酵素センサが得られるこ
とがわかった。

（実施例２） 実施例１の電極Ｂのメソテトラ（０−アミノフェニル）
コバルトポルフィリンの濃度をｌｏｍＭに変えた以外は
実施例１と同様にグルコースオキシダーゼを含む酵素電
極を作製した。

実験例３ 実施例２で作製した電極を、実験例２と同様に２０日後
にグルコース濃度（５−１００ｍｇ／ｄｊ２）に対する
電流値変化を調べた。その結果、電流値は１１０〜１０
ｎＡの範囲で直線的に変化し、良好な酵素、センサを作
製できることが明らかとなった。なお、電流密度は一定
電位（−０，８Ｖ対５ＳＣＥ）において１　、６２　Ｘ
　１０−３Ａ／ｃｍ２てあった。

（実施例３） カーボンファイバー（断面積７．８５Ｘ１００ｍ２）の
一端を導電性接着剤を用いてリード線に接続し、先端部
を細く引き伸したガラスキャピラリーに挿入した後、そ
の隙間に絶縁性接着剤を充填して電気的絶縁を行いキャ
ピラリー電極とした。このキャピラリー電極の先端の一
部を切断し研磨して超微小円板（ディスク）型のカーボ
ンファイバー電極を作製した。

次に、飽和塩化ナトリウム力ロメロ電極（ＳＳＣＥ）を
基準極、また白金線を対向電極、カーボンファイバー電
極を作用極として３電極式の電解重合を行った。実験に
は、電解液として。

１ｍＭ　　　　メソテトラ　（０−アミノフェニル）コ
バルトポルフィリン（Ｃｏ　　　　ＴＡＰＰ）　　　　
２．　４ｕＱ（ＣＨ３ＣＮ（溶媒）中） ０．１Ｍ　　ＮａＣｌ２０４（ＣＨ３ＣＮ中）を使用し
、０〜１．８Ｖ（対５ＳＣＥ）（７）電位範囲で３回、
電位掃引速度５０ｍＶ／秒で電位掃引させた後、１，８
ｖで１０分間定電位電解を行い、カーボンファイバー電
極上に膜厚的０．５ｕｍの電解重合膜を被覆形成した。

次に、１００　ｍｇ／ｍＩ２．グルコースオキシダーゼ
および１５重量％牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝液
（ｐＨ＝８．００）中に、上記膜電極を浸漬し、乾燥さ
せた。この浸漬、乾燥を５回程度繰り返した後、５０％
グルタルアルデヒド（ＧＡ）溶液の蒸気中に１２時間お
き、架橋反応を行わせてグルコースオキシダーゼを固定
化した。

その後、未反応のグルタルアルデヒドを２０％グツシン
溶液で洗浄除去して酵素電極を作製した。

続いて、０５％ポリ−ヘキサエチルメタアクリレート　
（Ｐ−ＨＥＭＡ）のメタノール−ＤＭＦ　（ジメヂルホ
ルムアミド）溶液に浸し、膜厚的３０μｍ程度の保護膜
を被覆させた。

実験例４ 実施例３の酵素センサに、１８ｇ／ｄ、ｆ２グルコス溶
液を含む５０ｍＭリン酸緩衝液を滴下し、そのときの応
答速度を窒素、空気および酸素雰囲気中においてそれぞ
れ調べた。

第４図はその結果を示すもので、応答速度は数秒であっ
た。電位は飽和塩化ナトリウムカロメル電極（ＳＳＣＥ
）に対し−０，６ｖの定電位電流変化であり、またグル
コース濃度に対する電流値は、第５図に示すようにグル
コース濃度が２〜２２ｍＭ　（３６−３９６ｇ／ｃＨ２
）の範囲に対し、電流は約−２００〜約−１０ｐＡの範
囲で直線的に変化した。

（実施例４） 被検体中の活物質（本発明では０□）を薄層セル内のデ
ュアル作用電極表面で反応させて生ずる電流をモニタリ
ングするための、所謂フローインジェクション分析への
適用を図るため、第６図および第７図に示すバイオアナ
リティカル社（日本販売店、　　Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉ
ｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｉｎｃ　、ビー・ニー・ニス（
株））製のＥＣ−ディテクタ（ＭｏｄｅｌＬＣ−４８）
　　ｌ　Ｏの作用極（大きさ３０ｍｍＸ　３０ｍｍＸ５
ｍｍ、この中に直径３ｍｍのグラッシーカーボン電極１
２が埋設されている。）１１上に、次の条件でコバルト
ポルフィリン電解重合薄膜を二層被覆させた。なお、第
７図は第６図のＡ部の拡大図である。

上記グラッシーカーボン電極１２を作用極、市販の銀／
塩化銀電極を参照極、白金巻線を対極とした３電極セル
を用い、次の組成の電解液中で０．０−＋１．８Ｖ　（
対５ＳＣＥ）、掃引速度５０ｍＶ／秒で２回掃引して膜
被着を完成した。

１　　ｍ　Ｍ　　　　メソテトラ　（０−アミノフェニ
ル）コバルトポルフィリン（Ｃｏ−ＴＡＰＰ）　　　　
２．　４ｕ、ｌ２（ＣＨ３ＣＮ（溶媒）中） ０．１Ｍ　　ＮａＣ，９０４（ＣＨｊ　ＣＮ中）このよ
うにして膜厚的Ｏ１μｍのポリメソテトラ（０−アミノ
フェニル）コバルトポルフィン膜を得た。

（実施例５） 実施例４で作製したカーボン電極／ポリメソテトラ（０
−アミノフェニル）コバルトポルフィン膜電極表面に、
次の方法で酵素固定化膜を被覆した。すなわち、リン酸
塩緩衝液（ｐＨ＝８．０）中に、グルコースオキシダー
ゼを１００　ｍｇ／ｎ＋ｊ２、牛血清アルブミンを１５
重量％の割合で溶解させた溶液中に、実施例４の膜電極
を浸漬し乾燥させて、これを５回程度繰り返した。その
後、５０％クルクルアルデヒド溶液で架橋反応を行わせ
てグルコースオキシダーゼを固定し、続いて未反応物質
を２０％グリシン溶液で洗浄して除去した。

このようにして約数＋μｍ膜厚の酵素固定化を行い、カ
ーボン電極／ポリメソテトラ（０−アミノフェニル）コ
バルトポルフィン薄膜／酵素固定化膜電極を得た。

１隨桝二二ｌ フローインジェクション分析装置中の作用極（グラッシ
ーカーボン電極：直径３ｍｍφ電極面積７、０６５’Ｘ
　１０−２ｃｍ２）上に実施例５のポリメソテトラ（０
−アミノフェニル）コバルトポルフィン薄膜／酵素固定
化膜電極の二層膜被覆電極、基準極に銀／塩化銀電極を
用いて電流特性を検討した。実験条件は、 １１−０．４Ｖ　（対眼／塩化銀）の定電位時の電流値
変化 ２）キャリヤ溶液　５０ｍＭ　　リン酸緩衝液（ｐＨ＝
７．０） ３）注入溶液　１００　ｍｇ／ｄｆ２　　グ　ル　コー
スで注入量２０μ℃を一定とし、流量変化の再現性を流
量１．１．５．０．５ｍｇ／ｍｉｎの３通りにつき検討
した。この結果、一定流量間の再現性が優れており、精
度良くフローインジェクション分析を行うことができる
ことがわかった。

尚、上記実施例においては、導電性基体部を円板（ディ
スク）電極としたが、本発明はこれに限定されるもので
はなく、微小なバンド型電極やアレー型電極、あるいは
柱状または溝型電極を用いてもよいことは勿論である。

なお、本実施例では、酵素としてグルコースオキシダー
ゼについて説明したが、酸素を受容体とし、過酸化水素
を反応生成物として生ずる酵素、グルコ−スオキシダー
ゼ、マレートオキシダーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、
コレステロールオキシダーゼ、アリル−アルコールオキ
シダーゼ、Ｌ−グルコノラクトンオキシダーゼ、ガラク
トスオキシダーゼ、ビラノースオキシグーゼ、Ｌソルボ
ースオキシダーゼ、ピリドキシン４−オキシダーゼ、ア
ルコールオキシダーゼ、ピルベートオキシダーゼ、オキ
サレートオキシダーゼ、グリオキシレートオキシダーゼ
、ジヒドロオロテートオキシダーゼ、ラドステロールオ
キシダーゼ、Ｄ−アルコ−ルオキシダーゼ、Ｄ−アミノ
酸オキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、アミンオ
キシダーゼ、Ｄ−グルタミン酸オキシダーゼ、Ｌ−グル
タミン酸オキシダーゼ、エタノルアミンオキシダーゼ、
チラミンオキシグーゼ、プトレッシンオキシダーゼ、シ
クロヘキシルアミンオキシダーゼ、Ｌ−リシンα−オキ
シダーゼ、Ｎ−メチルアミノ酸オキシダーゼ、Ｎ６−メ
チルノシンオキシダーゼ、６−ヒドロキシ−Ｄ−ニコチ
ンオキシダーゼ、ジメチルグリシンオキシダゼ、ニトロ
エタンオキシダーゼ、サルファイドオキシダーゼについ
ても摘要できることは明らかである。

［発明の効果］ 以上説明したように、本発明に係る酵素センサは、導電
性炭素等の導電性基体上に酸素還元触媒機能膜と酵素膜
とを被覆させるようにしたので、従来のセンサに比べて
、汚染等の問題が生ずることがなく、しかも作製が容易
であるとともに微小化が容易である。したがって、応答
速度が非常に速くなるとともにＨ＋イオン濃度等の影響
を受けることがなく、流動系においても精度良く測定す
ることができる。

また、導電性基体上に、酸素還元触媒物質と酵素とが混
在した膜を被覆した場合には、作製がさらに容易で超微
小化も簡単である上に、触媒物質と酵素との混合割合を
変化させることにより、基質の透過制御や応答速度等の
制御が容易になる。

さらに、本発明に係る酵素センサの製造方法によれば、
上記酵素センサを容易に製造することができるものであ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図（ａ）〜（Ｃ）はそれぞれ本発明の実施例１に係
る酵素センサの製造方法を示す斜視図、第２図（ａ）、
、（ｂ）は第１図の方法で製造したセンサのサイクリッ
クポルタモグラムを示す図で、同図（ａ）はグルコース
オキシダーゼを含まない電極への特性図、同図（ｂ）は
グルコースオキシダーゼを含む電極Ｂの特性図、第３図
（ａ）、（ｂ）はそれぞれ電極Ｂのグルコース濃度に対
する電流値の変化を示すもので、同図（ａ）は作製後４
日月の特性図、同図（ｂ）は作製後２０日口の特性図、
第４図は実施例３の酵素センンサのグルコースに対する
応答特性を示す図、第５図は第４図の特性値に基づいて
グルコース濃度と電流値との関係を示す図、第６図は実
施例４において用いた装置の概略構成を示す断面図、第
７図は第６図の要部を拡大して示す断面図である。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）導電性基体と、該導電性基体を被覆するとともに
   酸素還元触媒機能を有する配位子化合物を含む酸素電極
   膜と、該酸素電極膜を被覆する酵素固定化膜とを備えた
   ことを特徴とする酵素センサ。
2. （２）導電性基体と、該導電性基体を被覆するとともに
   酸素還元触媒機能を有する配位子化合物、および酵素を
   それぞれ含む固体被覆膜とを備えたことを特徴とする酵
   素センサ。
3. （３）前記配位子化合物は、環状の窒素含有化合物から
   なる請求項１または２記載の酵素センサ。
4. （４）前記配位子化合物は、ポルフィリン誘導体、フタ
   ロシアニン誘導体、またはフェナントロリン誘導体であ
   る請求項３記載の酵素センサ。
5. （５）前記酸素還元触媒機能を有する配位子化合物が、
   酵素とともに不溶化し固定化されてなる請求項２記載の
   酵素センサ。
6. （６）導電性基体の表面に、酸素還元触媒機能を有する
   配位子化合物を含む溶液を塗布することにより酸素電極
   膜を被覆させる工程と、前記酸素電極膜の表面に酵素を
   含む固定化試薬を塗布することにより酵素固定化膜を被
   覆させる工程とを含むことを特徴とする酵素センサの製
   造方法。
7. （７）導電性基体の表面に、酸素還元触媒機能を有する
   配位子化合物を酵素とともに固定化試薬により不溶化し
   固定化することにより固体被覆膜を形成させる工程を含
   むことを特徴とする酵素センサの製造方法。
8. （８）導電性基体の表面に、酸素還元触媒機能を有する
   配位子化合物をポリマー化することにより酸素電極膜を
   被覆させる工程と、前記酸素電極膜の表面に酵素固定化
   膜を被覆させる工程とを含むことを特徴とする酵素セン
   サの製造方法。