JPH0417921B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は低温生物学に関し、哺乳動物の胚の低
温保存方法に関する。 適用される産業分野 本発明は、絶滅しつつあるかつ希少な動物種の
胚の低温バンクを確立する目的で、胚の深冷凍結
に関して最も有利に適用することができるが、か
かるバンクは生殖学、家畜繁殖学
（theriogenology）、薬理学、免疫学、ウイルス学
及び実験−臨床医学の更なる進歩のために使用す
ることが有利である遺伝的に貴重な品種のマウス
を維持するうえで極めて必要である。 本発明は、他のいくつかの低温生物学、例えば
公衆の健康サービスにおいても用途を見出すこと
ができ、その場合に女性患者への結果的に成功す
る胚移入は最も基本的な抗不妊手段となるが、一
方卵巣組織の移植は様々な病因のいくつかの疾患
に関して患者の総合的ホルモン状態の改善のため
に有効な方法である。しかも、免疫原性が低下し
た胚骨髄の潅流は、女性患者における造血抑制の
治療に際して有望な手段である。前記の治療手段
においては、深冷凍結状態での長期貯蔵が行われ
た場合にのみ入手可能な十分量の適切な生物学的
物質を必要とする。 本発明は、凍結保存された胚が新品種の飼育動
物を繁殖させるうえで広い用途を有している畜産
業、商業的畜産業、並びに特にチヨウザメ及びコ
イの魚胚の凍結保存に関する養魚業においても応
用することができる。 生体からの単離後における胚貯蔵のためのこの
ような低温及び特に深冷冷凍の応用例は、人間の
経済活動及び公衆の健康維持を含めた更に一層広
い分野にわたつている。 現在、遺伝子資源貯蔵のための低温バンクを確
立しようとする時代の趨勢は、特に畜産を振興す
るために行われる商業的に有用な飼育動物の胚貯
蔵のための低温バンクに関して、最も広範な発展
を遂げさせてきた。 医療及び畜産業における哺乳動物胚の大規模な
利用は、移植物質に関する必要性を更に切迫化さ
せるようになつてきたが、その品質は、不妊症に
対抗しかつ高生産性飼育動物の育成を促進させる
うえで必要な移植操作の最終的結果のためには重
要である。 しかしながら、胚の凍結保存のためにこれまで
開発された方法によれば、凍結された細胞を高レ
ベルで保存することができず、貴重な生物学的物
質を大量に損失してしまう。胚の凍結保存に関す
る実験では、それらの最適化は一段階の超高速冷
却で凍結された生物学的試料におけるガラス質
（vitrification）生成の可能性と関係しているこ
とを明らかにしている。 従来技術 現在の当業界において公知なものに、−3.5℃で
結晶化を開始し、0.2〜2.0℃／分の速度で−40℃
まで冷却し、しかる後冷媒、即ち液体窒素中に浸
漬することを特徴とする1.0Mジメチルスルホキ
シド（DMSO）媒体中でマウス胚を凍結させる
方法がある。それらの解凍後における胚の生存率
は65％である〔エクスペリメンタル・セル・リサ
ーチ、第89巻、第１号、1974年、エス・ピー・レ
イボ，ピー・エム・マズール，エス・シー・ジヤ
コウスキー（Experimental Cell Research，ｖ，
No.1，1974，S.P.Leibo，P.M.Mazur，S.C.
Jackowsky）、“凍結及び解凍中にマウス胚の生
存に影響を及ぼす因子”、第79−89頁参照〕。 この方法の欠点は、凍結保存された胚の生存率
の低さであり、凍結−解凍プロセスパラメーター
に関して最適値からの差が最も取るに足らないも
のであつてもその差に応じて凍結結果に悪影響を
うけていた。 DMSO1.45M含有のリン酸塩緩衝液（PBS）中
におけるマウス胚の凍結保存のための更にもう一
つの従来技術方法が、現在までに使用しうること
が知られている。その方法によれば、凍結防止剤
は胚中に滴下して導入されかつそこから取出され
るが、冷却速度は0.3℃／分で、生存率は67〜68
％である。 前記方法は、関与する胚の低生存率、その方法
の再現性の悪さ、冷却操作のマニユアルコントロ
ール、結晶化プロセスコントロールの同期化を複
雑化しかつ結果の再現性に悪影響を与える装置に
おける可動的成分の多さという問題を有する。そ
の方法の他の欠点としては、凍結保存サイクルの
長時間性、並びに行われる作業の複雑性及び高労
働消費性がある〔クリオバイオロジー、第16巻、
1979年、ジー・エツチ・レイルメーカー、シー・
エム・ピー・エム・ベルハーム（Cryobiology，
v.16，1979，G.H.Reilmaker，C.M.P.M.
Verhamme），“マウス胚を凍結させるための簡
略化された方法”、第６−10頁参照〕。 2.0Mグリセロール＋0.5Mサツカロースの媒体
中におけるマウス胚のもう一つの凍結保存方法
が、現在の当業界において公知である。15分間の
インキユベート後、胚は内径４mmのポリスチレン
チユーブ中に入れられ、密閉シールされた後、液
体窒素中に浸漬された。このように処理された胚
の生存率は84％であつた。 この方法の欠点は、結晶の生成と、不都合なこ
とに解凍後の培地中において進行してしまう細胞
の潜在的ダメージの原因をなす高浸透活性とであ
る。チユーブ周囲における断熱シエルの形成に関
係する冷却速度が低すぎると（約20℃／分）、結
晶化プロセスを進行させてしまい、低温生物系の
液体部分におけるガラス質化の可能性に影響を与
える〔テリオゲノロジー、第23巻、第１号、1985
年、テー・ジエイ・ウイリアムス、エス・イー・
トーンソン（Theriogenology，ｖ，23，No.1、
1985、T.J.Williams，S.E.Tohnson），“４日令マ
ウス胚の急速凍結”、第235頁参照〕。 0.5Mサツカロースと混合された3.5Mグリセロ
ールの媒体中におけるマウス胚の更にもう一つの
凍結保存方法が、現在の当業界において公知であ
る。細胞中に凍結保存剤を分別的に添加する場
合、後者はポリスチレンチユーブ中に入れられ、
密閉シールされた後、液体窒素中に浸漬された
が、このように処理された胚の生存率は85％であ
る。 上記方法の欠点は、凍結保存剤中における浸透
性物質の濃度が高すぎること、胚の冷却速度が低
いことであつて、後者は細胞膜の潜在的障害の原
因をなしており、解凍後の培地中において胚のそ
の後の成長に悪影響を与える〔テリオゲノロジ
ー、第25巻、第１号、1986年、ケー・エー・バー
リー，ジー・イー・セデル・ジユニア，アール・
ピー・エルスデン（Theriogenology，v.25，
No.1，1986，K.A.Biery，G.E.Seddel Jr，R.P.
Elsden），“液体窒素中に直接浸漬することによ
るマウス胚の凍結保存”、第140頁参照〕。 もう一つの胚凍結保存方法が公知であり、その
場合にマウスの生体から単離された胚は1.4Mグ
リセロール及び1.1Mサツカロースの媒体が入つ
たポリスチレンチユーブ中に入れられ、チユーブ
は両端で密閉シールされて、細胞がチユーブ中で
25〜30分間放置される〔テリオゲノロジー、第23
巻、第１号、1985年、ケー・テー・クラブ，ア
イ・エイ・コーラー，アール・ダブル・ライト
（Theriogenology，v.23，No.1，1985，K.T.
Krag，I.M.Koehler，R.W.Wright），“液体窒素
中に直接浸漬することによる初期マウス胚の凍結
方法”、第199頁参照〕。 次いで、チユーブを液体窒素中に浸漬した。解
凍は37℃で行われた。チユーブ内容物をペトリ皿
に注ぎ、いくつかに分けた0.5Mサツカロースで
３回洗浄し、しかる後それらを栄養培地中で培養
した。解凍された胚の40〜67％が胚盤胞段階にま
で成長した。胚中にほとんど浸透しないグリセロ
ール及びその中に全く浸透しないサツカロースの
ような高濃度の凍結防止剤は、急速冷却（約20
℃／分の速度）後におけるそれらのガラス質化の
ためのバツクグラウンドを確立するために、細胞
の脱水が目的とされている。 問題の方法は、凍結防止媒体中における余りに
高い凍結保存剤濃度のせいで低結果を生じてお
り、３段階に分けて胚に加えられた場合であつて
も凍結防止剤は浸透要因によつてそれらのダメー
ジの原因を作用している。用いられる凍結保存剤
の総濃度が48.6％である場合は、胚に対する凍結
防止剤化合物の毒性作用も問題となる。上記すべ
てに加えて、液体窒素中へのそれらの直接浸漬に
より得られる胚の冷却速度は高濃度の凍結保存剤
の場合であつてもガラス質化が進行するうえで十
分に高いものではないが、その理由はチユーブ及
び液体窒素間で形成されかつ窒素蒸気からなる耐
熱シエルが、処理される胚からの高速的熱放出を
妨げてしまうからである。 解決すべき問題 本発明は胚の冷却方法を提供することをその目
的としており、その場合において冷却プロセスは
細胞外及び細胞内双方の大部分の水のガラス質化
の進行のために十分に高い速度で生じ、しかも解
凍中の再結晶化により胚の生物学的構造上で生じ
る有害作用はより低い程度でしか発生しないよう
になるであろう。 問題点を解決するための手段 前記目的は、凍結防止剤としてグリセロールを
含有した緩衝塩液中における冷媒温度への冷却を
含む胚の低温保存方法において、本発明によれ
ば、冷却が、冷媒温度まで予め冷却された高熱拡
散性粉末物質である亜鉛中で行われ、しかも緩衝
塩液が凍結防止剤としてジメチルスルホキシド
（DMSO）及び二価アルコール誘導体の一つを更
に含有している、という事実に基づき達成され
る。 ここに提案された胚の低温保存方法は高熱拡散
性粉末物質の補助をうけたそれらの冷却のせいで
関与する胚の更に高い生存率に寄与しており、そ
の物質が数千度／分もの高い冷却速度の達成を可
能にして、その結果ガラス質化プロセスが処理さ
れる胚において進行するようになる。 しかも、本明細書で提案された方法によれば、
解凍中における胚の生物学的構造上の再結晶化に
より生じる有害作用の悪影響の程度を減少させる
ことができ、これは凍結保存処理剤中への凍結防
止剤としてのDMSO及び二価アルコール誘導体
の導入に基づき達成されるが、双方とも結晶移動
を防止しかつ生体高分子及びタンパク質触媒中心
の周囲の水和シエルの一助となる結晶の大きさ増
加を妨げる抗塩緩衝剤として機能する。 異なる細胞膜浸透度をもつ３種類の使用される
凍結防止剤（グリセロール中、DMSO又は二価
アルコール誘導体の一つ）は、低い総濃度
（14.75〜15.25％）で用いられた場合に、浸透障
害又は毒性進行を生せず、同時にガラス質化を促
進しかつ凍結防止及び解凍中において胚を包括的
に保護する。しかも、使用される凍結保存剤混合
物は細胞にダメージを与えることなく回収され
る。 提案された方法によれば、それは操作者側に特
別の専門的技術を要求しない最も簡単な操作の最
少の組合せからなるだけであるため、胚の低温保
存プロセスを実質上簡略化することができる。 更に、この方法によれば、操作数の減少に基づ
いて低温保存の全サイクルを行うために要する時
間とこれらの操作の各々に費やされる時間とを著
しく削減することができ、その結果本方法は更に
一層効率的かつ安価になる。 本発明においては、亜鉛が高熱拡散性粉末物質
として用いられる。 かかる粉末物質の選択は、いくつかの定価格粉
末物質を比較した中から高い熱伝導率をもつもの
に関してなされるが、このような物質であれば胚
に高い冷却速度を与えることができる。 １，２−プロパンジオールが二価アルコール誘
導体の一つとして用いられ、しかもDMSOは最
も容易に胚細胞中に浸透しかつ凍結及び解凍時に
細胞内生物構造を保護しうる実質的な凍結防止剤
であるという事実から、DMSOとのその混合物
が選択されることが好都合である。１，２−プロ
パンジオールを使用すれば、胚の細胞内構造のみ
ならずその膜器官をも好結果に保護することがで
きるが、これは本方法で使用される他の凍結防止
剤と比較した場合のかかるアルコール平均浸透率
に起因している。 液体窒素が冷媒として用いられる場合の本発明
の一態様によれば、３種の凍結防止剤の各々は
4.75〜5.25％の範囲内の濃度で使用される。上記
濃度で用いられる場合、凍結防止剤はそれらの凍
結防止作用を最も効果的に発現し、しかも事実上
無毒性でかつわずかな浸透性という特徴を示す。 本発明の別の態様によれば、各々の凍結防止剤
は１：１の比率で用いられる。このような比率の
場合、胚の細胞内構造及び膜器官に対して、かか
る低温生物系領域における凍結防止剤の均一な分
布に基づき、同等の凍結防止効果を与えうるとい
う期待をもつことができるが、これは凍結防止剤
の異なる細胞内浸透能力に起因している。 本発明の好ましい態様において、緩衝塩液は生
物学的有効物質を含んでいる。かかる物質の利用
は、氷への相変換中における温度シヨツク及び
“溶解効果”から細胞質膜を保護することによつ
て細胞の生存率に大いに寄与する。生物学的有効
物質は細胞膜の天然構造を安定させ、ひいては最
結晶化過程においてそのダメージを防止すること
ができる。 塩化コリン溶液が生物学的有効物質として用い
られることが非常に望ましいが、これは生物学的
構造の天然メチル化プロセスに関与しており、メ
チル基の存在によつて天然膜構造を安定化させて
いる。 本発明のもう一つの態様によれば、塩化コリン
溶液は0.4％の濃度で用いられるが、これは高濃
度になると前記物質の界面活性作用に基づき膜構
造組織が乱れてしまい、一方この物質が低濃度に
なると上記安定化効果を示さなくなるからであ
る。 本発明の他の目的及び利点は、下記のいくつか
の具体的態様に関する詳細の説明から一層明らか
になるであろう。 態 様 胚の低温保存方法は、緩衝塩液中における冷媒
の介助による後者の温度までのそれらの冷却を特
徴とする。冷却プロセスは、予め冷媒温度まで冷
却された高熱拡散性粉末物質中で行われる。緩衝
塩液は次の凍結防止剤の混合物：グリセロール、
ジメチルスルホキシド（DMSO）及び二価アル
コール誘導体の一つ、並びに生物学的有効物質、
例えば濃度0.4％の塩化コリン溶液を含有してい
る。 亜鉛が高熱拡散性粉末物質として使用可能であ
る。 １，２−プロパンジオールが二価アルコール誘
導体の一つとして使用可能である。 液体窒素が冷媒として使用される場合、３種
各々の凍結防止剤は4.75〜5.25％の濃度でかつ
１：１の比率で用いられる。 本発明は、割球の32期に達したネズミ胚の凍結
保存に関して実施された。 例 １ 総数60個の胚を各々10個の胚からなる（各群５
滴中の）６群に分けた。各群に、グリセロール
10.5％、プロピレングリコール10.6％、
DMSO10.5％及び塩化コリン0.8％（各々の凍結
防止剤の濃度は5.25％で、塩化コリンの濃度は
0.4％である）含有のダルベツコ（Dulbecco）の
リン酸塩液媒体を５滴加えた。すべての操作を４
℃で行つた。次いで、凍結防止剤含有液中の胚
を、１×1.5cm、収容量0.1ml及び壁厚0.03mmの食
品用ホイル製容器に移した。容器の自由端をフレ
ア状に広げ、液体窒素の温度まで冷却された粉末
亜鉛で満たされている金属製容器中に10秒間浸漬
した。次いで、容器を液体窒素中に３週間そこで
保存すべく放置し、しかる後それらを水浴中40℃
で解凍した。解凍された胚の生存率は、培地中に
おけるそれらの成長性から評価したところ、94.2
％であつた。 凍結防止剤の濃度を実証するために、凍結防止
剤の濃度を変えて例１と同様に実験を行つた。 胚の生存率も、胚盤胞の段階までの培地中にお
けるそれらの成長性に基づくデータから調べた。
実験結果は第１表に示されている。 低温保存後の培養中における胚の生長は、第１
〜５表において、同数の天然胚の生長と比較して
計算されている。

【表】 最高の胚生存率は凍結防止剤が4.75〜5.25％の
濃度（総濃度は14.25〜15.75％の範囲である）で
用いられた場合に得られることが、第１表から判
明する。 例１と同様の実験を、凍結防止媒体中における
凍結防止剤の濃度間の比率を実証するために行つ
たが、凍結防止剤の凍結保存剤中におけるそれら
の総濃度が14.25〜15.75％の範囲内であるように
様々な比率で用いた。結果は第２〜４表に示され
ている。

【表】

【表】 グリセ プロピレン 胚の生存率
ロール グリコール DMSO ％

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 凍結防止剤としてグリセロールを含有した緩
   衝塩液中における冷媒温度への冷却を含む胚の低
   温保存方法であつて、 冷却が、冷媒温度まで予め冷却された高熱拡散
   性粉末物質である亜鉛中で行われ、しかも緩衝塩
   液が凍結防止剤としてジメチルスルホキシド及び
   二価アルコール誘導体の一つを更に含有している
   ことを特徴とする方法。 ２ 二価アルコール誘導体の一つとして１，２−
   プロパンジオールが用いられる、請求項１に記載
   の方法。 ３ 冷媒として液体窒素が用いられる場合に、３
   種の凍結防止剤の各々が4.75〜5.25％の濃度を有
   する、請求項１に記載の方法。 ４ ３種の凍結防止剤の各々が１：１の比率で用
   いられる、請求項１に記載の方法。 ５ 緩衝塩液が生物学的有効物質を含有してい
   る、請求項１に記載の方法。 ６ 生物学的有効物質として塩化コリン溶液が用
   いられる、請求項５に記載の方法。 ７ 塩化コリン溶液が0.4％の濃度を有する、請
   求項６に記載の方法。