JPH02258799A - 新規ジヒドロ葉酸還元酵素一成長ホルモン放出因子誘導体融合タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、成長ホルモン分泌調節活性を有することが知
られている中成長ホルモン放出因子（以下、ＧＲＦと略
す）の２７番目のアミノ酸であるメチオニンがイソロイ
シンに変換し、かつ４４番目のアミノ酸であるロイシン
のカルボキシルアミド化されていない誘導体（以下，Ｇ
ＲＦＭと略す）及びその１番目から２９番目までの配列
を有する誘導体く以下，ＧＲＦＭ２９と略す）さらに、
ＧＲＦの１番目から２９番目までの配列を有する誘導体
（以下，ＧＲＦ２９と略す）を、それぞれ酵素タンパク
質のカルボキシ末端側に有するジヒドロ葉酸還元酵素（
以下，それぞれＤＨＦＲ−ＧＲＦＭ，ＤＨＰＲ−ＧＲＦ
Ｍ２９，及びＤＨＰＲ−ＧＲＦ２９と略す）、ＤＨＦＲ
−ＧＲＦＭ。

ＤＨＦＲ−ＧＲＦＭ２９，およびＤＨＰＲ−ＧＲＦ２９
の分離精製方法，及びＧＲＦＭ及びＧＲＦＭ２９の製造
方法に関するものである。本発明の利用分野としては，
発酵工業，医薬品工業，畜産等に好適である。

［従来の技術および問題点コ ＧＲＦは成長ホルモンの分泌を促すペプチドである。牛
のＧＲＦは４４個のアミノ酸からなり。

その配列はアミノ末端側からチロシン−アラニン−アス
パラギン酸−アラニンーイソロイシンーフェニルアラニ
ンートレオニンーアスバラギンーセリンーチロシンーア
ルギニンーリジンーバリンーロイシンーグリシンーグル
タミンーロイシンーセリンーアラニンーアルギニンーリ
ジンーロイシンーロイシンーグルタミンーアスパラギン
酸−イソロイシン−メチオニン−アスパラギン酸−アル
ギニン−グルタミン−グルタミン−グリシン−グルタミ
ン酸−アルギニン−アスパラギン−グルタミン−グルタ
ミン酸−グルタミン−グリシン−アラニン−リジン−バ
リン−アルギニン−ロイシンであり，カルボキシ末端が
アミド化されている。

ＧＲＦは，視床下部に存在するが，その含量は少なく，
牛５００頭からせいぜい数ミリグラム程度分離精製でき
ればよい方であり，効率のよい生産方法の開発が期待さ
れている。

ＧＲＦのアミノ酸配列とその生理活性との関係に関して
は種々の研究成果が報告されている（Ｎ．Ｌｉｎｇ，　
ｅｔ　ａｔ．　Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、
ｖｏｌ．５４，ｐ．４０３（１９８５））。ＧＲＦの２
７番目のアミノ酸であるメチすニンは生理活性発現には
重要な役割を果しておらず、このアミノ酸をイソロイシ
ンとかロイシンに変換しても問題がないことが明らかに
されている（Ｇ、Ｍ、ＣＩｏｒｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　
Ｊ、Ｍｏ１．８ｉｏ１．、ｖｏ！、１９１．ｐ、５５３
（１９８６））。従って５本発明で取り扱う、ＧＲＦＭ
及びＧＲＦＭ２９は、成長ホルモン分泌活性を有するこ
とが十分予想されるポリペプチドである。

本発明の技術的背景としては、いわ（φる遺伝子操作技
術がある。最近、遺伝子操作技術の進歩に伴って興味深
いポリペプチドを微生物をもちいて生産することが可能
になった。ポリペプチドに対応する遺伝子であるＤＮＡ
を９例えば生体よりクローニングと呼ばれる方法で分離
するなどし、その後、これを発現ベクターと呼ばれる適
当なプラスミドなどに組み込み、その結果得られる組換
えプラスミドを大腸菌などの微生物細胞中とこ導入し。

目的遺伝子を微生物中で発現させ、微生物から目的ポリ
ペプチドを分離精製することが行われている。

一般に２分子量１万以下のポリペプチドは、大腸菌など
の宿主中で生産させても菌体中のプロテアーゼなどによ
って分解されるため安定に細胞内に蓄積されない。これ
は２分子として小さいため安定なコンホメーションをと
れないためであると考えられている。従って、遺伝子操
作を利用してＧＲＦなどの短いポリペプチドを生産しよ
うとした場合、融合遺伝子を作成し、融合タンパク質と
して発現させることが必要であると考えられる。

既に２本発明者らは、ＧＲＦ誘導体を安定に発現生産す
ることを目的に、ＤＨＦＲとの融合タンパク質として発
現・生産することを試み、ＤＨＰＲのカルボキシ末端側
に種々のＧＲＦ誘導体を結合させた融合タンパク質を暗
号化する遺伝子を発現する組換えプラスミドを構築して
いる。そのような組換えプラスミドとして、ＧＲＦの１
番目から２９番目までのアミノ酸配列を有するＧＲＦ誘
導体を暗号化するＤＮＡを組み込んだｐＧＲＦ２−１５
（特願昭８２−３０２１５６）およびｐＳＧｌ−１２（
特願昭６３−２９３３８９）を、また、４４個のアミノ
酸よりなるＧＲＦの誘導体を組み込んだｐＧＲＦ４４−
２２　（特願昭６３−２９４２０３）およびｐＧＲＦＭ
４４−６　（特願昭６３−２９４２０４）がある。しか
しながら、このような絽換えプラスミドを有する大腸菌
が作るＧＲＦ誘導体を含んだ組換えタンパク質の分離精
製に関しては、その分離精製方法が確立されておらず、
ＧＲＦ誘導体の組換えＤＮＡ技術を用いた生産を試みる
場合大きな障害であった。

［発明の目的］ このような背景に鑑み２本発明者らは、ＧＲＦ誘導体を
カルボキシ末端側に有するＤＨＦＲ融合タンパク質の分
離精製方法を確立することを目的に、鋭意研究を行い、
融合タンパク質が有するＤＨＦＲ酵素活性を目安に高度
精製を試みた。その結果、ＤＨＦＲとＧＲＦ誘導体との
融合タンパク質が大腸菌菌体中に不溶性タンパク質とし
て大量に蓄積する場合があることをことを見いだした。

可溶性で蓄積した融合タンパク質及び不溶化した融合タ
ンパク質それぞれに関して分離精製方法を開発し、この
知見に従い本発明を完成させた。

［発明の構成］ 本発明に係わるＤＨＦＲとＧＲＦ誘導体との融合タンパ
ク質を発現生産する大腸菌は９本発明者らが既に発明し
ている組換え菌体な用いた。それらは、すべて微工研に
寄託されている。組換えプラスミドｐＧＲＦ２−１５を
含有する大腸菌はＦＥＲＭＢＰｌ　５７８　（以下、大
腸菌１と称する）。

ｐＳＧ１−１２を含有する大腸菌はＦ　Ｅ　ＲＭＢ　Ｐ
２１４９（以下、大腸菌２と称する）、ｐＧＲＦ４４−
２２を含有する大腸菌はＦＥＲＭＢＰ２１５２（以下、
大腸菌３と称する）およびｐＧＲＦＭ４４−６を含有す
る大腸菌はＦＥＲＭＢＰ２１５１（以下、大腸菌４と称
する）であり２本発明では、これらの菌株を用いた。

本発明は、（Ｉ）大腸菌１，２，３．及び４がそれぞれ
生産するＤＨＦＲ−成長ホルモン放出因子誘導体融合タ
ンパク質（以下、それぞれ融合タンパク質１，２，３．
及び４と称する）、　　（ＩＩ）大腸菌１，２，３．及
び４からの融合タンパク質１　ｖ　２＋　：３＋　４の
分離精製方法、（■）融合タンバク質２を用いたＧＲＦ
Ｍ２９の製造方法、および（ＴＶ）融合タンパク質４を
用いたＧＲＦＭの製造方法より成り立っている。以下、
順に構成内容を説明する。

（１−１）大腸菌１が生産する融合タンパク質１融合タ
ンパク質１を暗号化する遺伝子は２組換えプラスミドｐ
ＧＲＦ２−１５中にあり、また。

ｐＧＲＦ２−１５の全塩基配列は既に本発明者らにより
明らかにされている（特願昭６２−３０２１５６）。組
換えプラスミドｐＧＲＦ２−１５の塩基配列を検討する
ことにより融合タンパク質１のアミノ酸配列を決定する
ことができた。

第１図は、　組換えプラスミドｐＧＲＦ２−１５中の融
合タンパク質１を暗号化する部分のＤＮＡ配列とそれが
暗号化するアミノ酸配列を示している。図中番号は１番
目のアミノ酸であるメチオニンを暗号化するＡＴＧコド
ンの”Ａ　Ｉｔを１番として数えた番号を示している。

融合タンパク質１は。

３９３アミノ酸よりなるタンパク質であり２分子量が２
１，７４１ダルトンである。アミノ末端側から数えて、
１から１５９番目までの配列が、大腸菌の野生型ＤＨＦ
Ｒに１箇所アミノ酸置換置換が起こフた（Ｃｙｓ−１５
２（１，１ｉｌｄ　ｔｙｐｅ）　→Ｇｌｕ−１５２）配
列であり、１６５＠目から１９３番目までがＧＲＦ２９
の配列である。１６１から１６・４番目のイソロイシン
−グルタミン酸−グリシン−アルギニンの配列は、牛血
液凝固因子Ｘａの認識切断配列であり、最終的に牛血液
凝固因子Ｘａて処理することにより、ＧＲＦ２９を切り
出すことを可能としている。１６０番目の配列は、ＤＨ
ＦＲ遺伝子とＧＲＦ２９遺伝子との結合の際に生じた配
列である。

融合タンパク質１は、新規なタンパク質である。

融合タンパク質はＤＨＰＲのカルボキシ末端側に。

ＧＲＦ２９が融合した構造をしているにもかかわらず、
ＤＨＦＲＢ素活性を有する。

（Ｉ−２）大腸菌２が生産する融合タンパク質２融合タ
ンパク質２を暗号化する遺伝子は、絹換えプラスミドｐ
ｓＧ１−１２中にあり、また、ｐＳＧＩ−１２の全塩基
配列は既に本発明者らにより明らかにされている（特願
昭６３〜２９３３８９）。■換えプラスミドｐｓＧ１−
１２の塩基配列を検討することにより融合タンパク質２
のアミノ酸配列を決定することができた。

第２図は、　組換えプラスミドｐｓＧ１−１２中の融合
タンパク質２を暗号化する部分のＤＮＡ配列とそれが暗
号化するアミノ酸配列を示している。

図中番号は１番目のアミノ酸であるメチオニンを暗号化
するＡＴＧコドンの”Ａ”を１番として数えた番号を示
している。融合タンパク質２は、１９１アミノ酸よりな
るタンパク質であり２分子量が２Ｌ　　７３２である。

アミノ末端側から数えて。

１から１６０番目までの配列は、融合タンパク質１の１
６０番目までの配列と同一であり、１６３番目から１９
１番目までがＧＲＦＭ２９の配列である。１６２番目の
アミノ酸がメチオニンであり。

融合タンパク質２をブロムシアンで処理することにより
、このところで特異的に切断を行い、Ｔｌｉ、合タンパ
ク質２からＧＲＦＭ２９を切り出すことが可能にしてい
る。

融合タンパク質２は、新規なタンパク質である。

融合タンパク質はＤＨＦＲのカルボキシ末端側に。

ＧＲＦＭ２９が融合した構造をしているにもかかわらず
、ＤＨＦＲ酵素活性を有する。

＜ｒ−３）大腸菌３が生産する融合タンパク質３融合タ
ンパク質３を暗号化する遺伝子は、■換えプラスミドｐ
ＧＲＦ４４−２２中にあり、また。

ｐＧＲＦ４４−２２の全塩基配列は既に本発明者らによ
り明らかにされている（特願昭６３−２９４２０３）。

組換えプラスミドｐＧＲＦ４４−２２の塩基配列を検討
することにより融合タンパク質３のアミノ酸配列を決定
することができた。

第３図は、　組換えプラスミドｐＧＲＦ４４−２２中の
融合タンパク質３を暗号化する部分のＤＮＡ配列とそれ
が暗号化するアミノ酸配列を示している。図中番号は１
番目のアミノ酸であるメチオニンを暗号化するＡＴＧコ
ドンの！ｌＡｌ１を１番として数えた番号を示している
。融合タンパク質３は、２０８アミノ酸よりなるタンパ
ク質であり。

分子量が２３，６２５ダルトンである。アミノ末端側か
ら数えて、１から１６０番目までの配列は。

融合タンパク質１の１６０番目までの配列と同一であり
、１６５番目から２０８番目までがＧＲＦＭの配列であ
る。１６１から１６４番目のイソロイシン−グルタミン
酸−グリシン−アルギニンの配列は、牛血液凝固因子Ｘ
ａの認識切断配列であり、最終的に牛血液凝固因子Ｘａ
で処理することにより、ＧＲＦＭを切り出すことを可能
としている。

融合タンパク質３は、新規なタンパク質である。

融合タンパク質はＤＨＦＲのカルボキシ末端側に。

ＧＲＦＭが融合した構造をしているにもかかわらず、Ｄ
ＨＦＲ酵素活性を有する。

（１−４）大腸菌４が生産する融合タンパク質４融合タ
ンパク質４を暗号化する遺伝子は２組換えプラスミドｐ
ＧＲＦＭ４４−６中にあり、また。

ｐＧＲＦＭ４４−６の全塩基配列は既に本発明者らによ
り明らかにされている（特願昭６３−２９４２０４）。

組換えプラスミドｐＧＲＦＭ４４−６の塩基配列を検討
することにより融合タンパク質４のアミノ酸配列を決定
することができた。

第４図は、　組換えプラスミドｐＧＲＦＭ４４−６中の
融合タンパク質４を暗号化する部分のＤ　ＮＡ配列とそ
れが暗号化するアミノ酸配列を示している。図中番号は
１番目のアミノ酸であるメチオニンを暗号化するＡＴＧ
コドンのｊｔ　Ａ　ｌｔを１番として数えた番号を示し
ている。融合タンパク質４は、２０６アミノ酸よりなる
タンパク質であり。

分子量が２３，４１４である。アミノ末端側から数えて
、１から１６０番目までの配列は、融合タンパク質１の
１６０番目までの配列と同一であり。

１６３＠目から２０６番目までがＧＲＦＭの配列である
。１６２番目のアミノ酸がメチオニンであり、融合タン
パク質４をブロムシアンで処理することにより、このと
ころで特異的に切断を行い。

融合タンパク質４からＧＲＦＭを切り出すことが可能に
している。

融合タンパク質４は、新規なタンパク質である。

融合タンパク質はＤＨＦＨのカルボキシ末端側に。

ＧＲＦＭ２９が融合した構造をしているにもかかねらず
、ＤＨＦＲ酵素活性を有する。

（ＩＩ）大腸菌１．２．３．及び４からの融合タンパク
質１．２．３．４の分離精製方法 大腸菌１，２，３．及び４は、それぞれ融合タンパク質
’１．２，３．及び４を菌体内に大量に発現・蓄積する
が、その存在状態（可溶性タンパク質で蓄積するのか、
また不溶性タンパク質となるのかなど）培養温度により
異なる。各タンパク質の菌体内での存在状態に依存して
、以下の分離精製方法を適用する。

融合タンパク質１は、不溶性タンパク質として蓄積する
割合が少なく、大半が可溶性タンパク質として蓄積する
。が融合タンパク質２，３．及び４は、培養温度を高温
にすると２発現する各融合タンパク質のほとんどが、不
溶性タンパク質として、菌体内に蓄積する。融合タンパ
ク質１の分離精製は、大腸菌面体の破砕液の可溶性タン
パク質画分を出発材料として、また、融合タンパク質２
゜３、及び４は大腸菌菌体の破砕液の不溶性タンパク質
画分を出発材料として行うことが好都合であり、以下に
その分離精製方法を記す。

（Ｉｆ−１）大腸菌１からの融合タンパク質１の分離精
製方法 大腸菌１の培養は、ＹＴ＋Ａｐ培地く培地ｌｌ中に、５
ｇのＮａＣ１，８ｇのトリ゛ブトン、　　５ｇのイース
トエキスおよび５０ｍｇのアンピシリンナトリウムを含
む液体培地。）で培養することができる。培地としては
、この他にＳＴ＋Ａｐ培地（培地１１中に＋２ｇのグル
コース、１ｇのリン酸２カリウム、５ｇのポリペプトン
、５ｇのイーストエキスおよび５０ｍｇのアンピシリン
ナトリウムを含む液体培地。）など２面体が成長する培
地であれば、どの様な培地でも用いることができるが、
調べた限りでは、ＹＴ＋Ａｐ培地を用いた場合融合タン
パク質１の菌体内蓄積量が最大であった。また、ＹＴ＋
Ａｐ培地を用いて培養した場合、培養温度を３７℃にす
ると発現する融合タンパク質１の一部（２０〜５０％）
が不溶性タンパク質として蓄積するが、３０℃以下で培
養した場合、はとんど全てが可溶性タンパク質として回
収できる。従って、培養温度としては、３０℃もしくは
、それ以下が望ましい。

大腸菌１を、培地に接種し、３０℃で対数成長期の後期
もしくは定常期まで培養する。培養した菌体は、５，０
００回転／分の遠心分離により集める。培地１１より湿
重量２から５ｇの面体が得られる。

集菌およびこれ以後の操作は、特に断わらない限り低温
（０から１０℃の間、４℃が望ましい）で行う。なお、
融合タンパク質１の回収は、各処理をして得られる融合
タンパク質１溶液中のＤＨＦＲ酵素活性を測定すること
により求めることができる。

培養して得られた菌体を、湿重量の３倍の緩衝ｆｆｌ　
（０，１ｍＭ　　エチレンジアミン４酢酸ナトリウム（
ＥＤＴＡ）を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝Ｗ、ｐＨ
７，０）に懸濁し、フレンチプレスを用いて菌体を破砕
する。面体破砕液を、１５゜０００回転、２０分間遠心
分離し、上清を得る（無細胞抽出液）。　無細胞抽出液
に、最終濃度１゜９％になるように硫酸ストレプトマイ
シンを加え。

２０分攪はんする。その後、１５，０００回転。

２０分間遠心分離することにより生じた沈澱を除き上清
を得る（ストレプトマイシン処理上清）。

この処理は、混在する核酸成分を除去することが目的で
あり、用いられるストレプトマイシン硫酸の濃度は、融
合タンパク質１の回収率が減少しない限り増減しても以
下の操作には問題がない（例えば、２．５％を越えると
回収率は極端に減少する）。

ストレプトマイシン処理上清１容に、飽和硫安溶液０．
９容を攪はんしながら静かに加え、更に２０分攪はんす
る。その後、１５，０００回転。

２０分間遠心分離し、沈澱を除き上清を得る（硫安処理
上清）。この操作は、４０〜５０％程度の飽和硫安で沈
澱するタンパク質及び核酸等を除去することが目的であ
り、加える飽和硫安の量は。

融合タンパク質１の回収率が減少しない限り増減しても
問題がない（例えば、加える飽和硫安の量が１，５容を
越えると回収率が極端に減少する）。

硫安処理上清を、あらかじめ緩衝液１で平衡化したＭＴ
Ｘ結合アガロースーアフィニティ力ラムに吸着させる。

吸着後、ＩＭのＫＣＩを含む緩衝ｔ＆２　（０，１ｍＭ
　　ＥＤＴＡを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐ
Ｈ８，５）で洗う。洗いは。

カラムからの溶出液の２８０ｎｍの吸光度を測定し、吸
光度が０．１以下になるまで同瑳衝液を流し続ける。酵
素の溶出は、ＩＭのＫＣＩと３ｍＭの葉酸を含む緩衝液
２を用いて行い、溶出液を一定量ずつフラクションコレ
クターを用いて分画する。分画した溶出液についてＤＨ
ＦＲ活性を測定し、酵素活性が含まれる画分を集める。

得られた酵素液を、緩衝液１に対して、３回透析する。

この段階で、高純度の融合タンパク質１が得られる。

用いられるＭＴＸ−を結合したアガロースゲル担体は、
市販品（例えば、シグマ社で販売）を利用することがで
きる。

（ＩＩ−２）大腸菌２からの融合タンパク質２の分離精
製方法 大腸菌２を３７℃で培養することにより、融合タンパク
質２のほとんどが菌体内に不溶性タンパク質として発現
蓄積し、また、培養温度を４２℃に上げると菌体の成長
は停止するが、融合タンパク質の含量が増大する。この
ことを利用して、大腸菌２の培養は、ＹＴ＋Ａｐ培地（
培地ｌｌ中に。

５ｇのＮａＣ１，５ｇの酵母エキス、８ｇのトリプトン
、及び５０ｍｇのアンピシリンナトリウムを含む液体培
地）を用いておこなう。培地としては、この他にＳＴ＋
Ａｐ培地（培地ｌｌ中に、２ｇのグルコースｔ　　１ｇ
のリン酸２カリウム、５ｇのポリペプトン、５ｇのイー
ストエキスおよび５０ｍｇのアンピシリンナトリウムを
含む液体培地。

）など、面体が成長する培地であれば、どの様な培地で
も用いることができるが、調べた限りでは。

ＤＨＦＲ融合タ融合タンパ土質にはＹＴ＋Ａｐ培地が最
適であった。

大腸菌２を培地に接種し２通常３７℃で対数成長期の後
期もしくは定常期まで培養する。培養した菌体は、５０
００回転／回転速心分離により集める。培地１１より湿
重量２から５ｇの菌体が得られる。

集菌およびこれ以後の操作は、特に断わらない限り低温
（０から１０℃の間、４℃が望ましい）で行う。

培養して得られた菌体を、湿重量の２倍の緩衝１１　（
０，１ｍＭ　　エチレンジアミン４酢酸ナトリウムを含
む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７，０）に懸濁
し、フレンチプレスを用いて菌体を破砕する。菌体破砕
液を、５，０００から１ｏ、ｏｏｏ回転で１０分間遠心
分離し沈澱を得る。

得られた沈澱を洗浄する目的で、緩衝液１に懸濁し、５
，０００から１０，０００回転回転下１０分間遠心分離
し沈澱を得る（沈澱の洗浄）。この洗浄の操作を２ない
し３回繰り返す。得られたタンパク質画分を不溶化画分
と称する。この操作により、不溶化融合タンパク質の純
度が約５０から９０％程度になる。

得られた不溶化画分を用いた菌体の湿重量のグラム数と
同量の尿素水溶液に溶解する。尿素に不溶の物質を遠心
分離により取り除く。得られた上清を尿素可溶化画分と
称する。用いる尿素の濃度は４Ｍ以上が効果的である。

この操作により、目的融合タンパク質の純度が、約８０
％以上に高まる。

尿素可溶化画分に、１０倍容の緩衝液１ｆ２加え尿素を
希釈することにより、変性状態で可溶化した融合タンパ
ク質２を再活性化することができる。

希釈により再活性化された融合タンパク質２の高度精製
は、ＤＨＦＲ活性を目安に、メソトリキセート（以下、
ＭＴＸと略す）を結合したアフィニティクロマトグフィ
を用いて達成される。

再活性化された融合タンパク質１溶液を、あらかじめ緩
衝液１で平衡化したＭＴＸ−アガロースアフィニティ力
ラムに吸着させる。吸着後、ＩＭのＫＣＩを含む緩衝液
１で洗う。洗いは、カラムからの溶出液の２８０ｎｍの
吸光度を測定し、吸光度が０．１以下になるまで同緩衝
液を流し続ける。酵素の溶出は、ＩＭのＫＣＩと３ｍＭ
の葉酸を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ９゜
０を用いて行い、溶出液を一定量ずつフラクションコレ
クターを用いて分画する。分画した溶出液についてＤＨ
ＦＲ活性を測定し、酵素活性が含まれる画分を集める。

得られた酵素液を、緩衝液１に対して、３回透析する。

この操作により、目的融合タンパク質は、完全に純化す
ることができる。

なお、透析して得られる酵素液中には、透析が不完全な
場合には８葉酸が含まれており、このため、２８０ｎｍ
の吸光度を利用したタンパク質量の検定等の障害となる
ことが考えられる。そのために、ここでは、ＤＥＡＥ−
）ヨバール力ラムクロマトグラフィーの利用方法を記載
するが２本方法の使用は、融合タンパク質の分離及び高
度精製方法を限定しない。

透析した酵素液を、あらかじめ緩衝液１で平衡化したＤ
ＥＡＥ−）ヨバール力ラムに吸着させる。

吸着後、Ｏ，ＩＭのＫＣＩを含む緩衝液１て洗う。

洗いは、カラムからの溶出液の２８０ｎｍの吸光度を測
定し、吸光度が０．０１以下になるまで同緩衝液を流し
続ける。酵素の溶出は、緩衝液１を用いて０．１Ｍから
０．３ＭのＫＣｉの直線濃度勾配を用いて行い、溶出液
を一定量ずつフラクションコレクターを用いて分画する
。分画した溶出液について２８０ｎｍの吸光度とＤＨＦ
Ｒ活性を測定する。酵素活性／　２８０　ｎ　ｍの吸光
度の値が。

一定な両分を集める。この操作により、再現性良く２葉
酸を取り除くことができる。

ＤＨＦＲ酵素活性は２反応液　（０，０５ｍＭのジヒド
ロ葉酸、０．０６ｍＭのＮＡＤＰＨ，１２ｍＬｉの２−
メルカプトエタノール、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ
７，０））を、１ｍ、１のキュベツトとり、これに酵素
液を加え、３４０ｎｍの吸光度の時間変化を３０℃で測
定することにより行う。酵素１ユニツトは、上記反応条
件において。

１分間に１マイクロモルのジヒドロ葉酸を還元するのに
必要な酵素量として定義する。この測定は。

分光光度計を用いて容易に行うことができる。

（ＩＩ−３）大腸菌３からの融合タンパク質３の分離精
製方法 融合タンパク質３は、菌体として大腸菌３を用いる以外
は、融合タンパク質２の分離精製方法と全く同様に行う
。

（ＩＩ−４）大腸菌４からの融合タンパク質４の分離精
製方法 融合タンパク質４は、菌体として大腸菌４を用いる以外
は、融合タンパク質２の分離精製方法と全く同様に行う
。

（ｍ）融合タンパク質２を用いたＧＲＦＭ２９の製造方
法 精製して得られた融合タンパク質２を凍結乾燥し、これ
に１から１０ｍｇタンパク質／ｍｌとなるように７０％
蟻酸を加え、溶かした後、タンパクＭ量の約２０倍量の
結晶ブロムシアンを加え密栓し、窒素雰囲気下、１０〜
室温で攪拌しながら２４時間反応させる。反応液を１０
倍の水で希釈した後、凍結乾燥し過剰の試薬を除く。乾
燥試料を１から１０ｍｇタンパク質／ｍｌとなるように
３０％酢酸に溶かす。溶かした試料をＨＰＬＣ装置（高
滓Ｌ　Ｃ−４Ａ、　１ｎｅｒｔｓｉｌ−ＯＤＳカラム）
を用いて、０．１％トリフルオロ酢酸中、２７．５％か
ら４２．５％のアセトニトリルの直線濃度勾配を用いて
溶出・分離することができる。溶出物は、２２０ｎｍに
おける吸光度を測定することにより検出することができ
る。第５図は、ブロムシアン処理したタンパク質２試料
の高速液体クロマトグラムを示している。試利注人後約
４７分のピークがＧＲＦＭ２９である。このピーク画分
を分離する。

分離した溶出液をエバボレーターで乾燥後、少量の水を
加え凍結乾燥し溶媒を除き、ＧＲＦＭ２９を得ることが
できる。また、得られたペプチドを酸加水分解後、アミ
ノ酸分析することによりアミノ酸組成を確かめることが
できる。

（■）融合タンパク質４を用いたＧＲＦＭの製造方法 精製して得られた融合タンパク質４を凍結乾燥し、これ
に１からｌ０ｍｇタンパク！／ｍｌとなるように７０％
蟻酸を加え、溶かした後、タンパクＭ量の約２０倍量の
結晶ブロムシアンを加え密栓し、窒素雰囲気下、１０〜
室温で攪拌しながら２４時間反応させる。反応液を１０
倍の水で希釈した後、凍結乾燥し過剰の試薬を除く。乾
燥試料を１から１０ｍｇタンパク質／ｍｌとなるように
３０％酢酸に溶かす。溶かした試料をＨＰＬＣ装置（高
滓ＬＣ−４Ａ、　　１ｎｅｒｔｓｉｉＯＤ５カラム）を
用いて、０．１％トリフルオロ酢酸中、２７．５％から
４２．５％のアセトニトリルの直線濃度勾配を用いて溶
出・分離することができる。溶出物は、２２０ｎｍにお
ける吸光度を測定することにより検出することができる
。第６図は、ブロムシアン処理したタンパク質２試料の
高速液体クロマトグラムを示している。試料注入後約２
１分のピークがＧＲＦＭである。このピーク画分を分離
する。分離した溶出液をエバボレーターで乾燥後、少量
の水を加え凍結乾燥し溶媒を除き、ＧＲＦＭを得ること
ができる。また、得られたペプチドを酸加水分解後、ア
ミノ酸分析することによりアミノ酸組成を確かめること
ができる。

本発明に用いられる試薬、装置等は、特に限定して記載
した以外は２通常の市販品を利用することができる。ま
た、ここに記載した種々の操作は。

この分野の当業者であれば、なんの問題もなく再現よく
行うことができる。なお、用いられる市販の試薬品は、
特級以上の品質が要求される。

次に本発明の実施例を示す。

実施例１ 融合タンパク質１の分離精製 融合タンパク質１は２Ｍｉ換えプラスミドｐＧＲＦ２−
１５上に暗号化されており、微工研寄託番号ＦＥＲＭＢ
Ｐ’−１５７８の大腸菌（以下、　ＢＰ−１５７８株と
略す）が生産する融合タンパク質である。

ＢＰ−１５７８株は、ＹＴ＋Ａｐ培地を用いた場合、３
７°Ｃでは融合タンパク質」の４０％が不溶性タンパク
質として蓄積するが、３０℃ではほとんど１００％が可
溶性タンパク質として菌体内に蓄積する。従って、ＹＴ
＋Ａｐ培地３１を用いて、：３０℃で１８時間培養した
。培養後、１５゜０００回転／分、１０分間の遠心分離
により菌体な集め、菌体を３００ｍ１の緩衝液１に懸濁
し。

再び５，０００回転／分、１０分間の遠心分離を行い菌
体な集めた。その結果、湿重量約１３ｇの菌体が得られ
た。得られた菌体を約２６ｍ１の緩衝液１に懸濁し、フ
レンチプレスを用いて菌体を破砕し、得られた菌体破砕
液を、１５，０００回転／分、２０分間の遠心分離し、
上清を集めた（約３０　ｍ　ｌ　、回収活性　１６９３
ユニツト（１００％））。上清に、０．５７ｇのストレ
ブ）・マイトン碩酸を加え、２０分間攪拌し、１５，０
００回転／分、２０分間の遠心分離し、上清を集めた（
約２８ｍ１．回収活性　１６０８ユニツト（９５％））
。これに、２５ｍ・１の飽和硫安溶液を攪拌しながら徐
々に加え、２０分間攪拌し、１５゜０００回転／分、２
０分間の遠心分離し、上清を集めた（約５０ｍＩｙ回収
活性　１４４８ユニツト（８６％））。これに約１０ｇ
のあらかじめ緩衝液１で平衡化したＭＴＸ−アガロース
ゲルを加え、緩やかに攪はんしながら１時間放置し、融
合タンパク質をＭＴＸアガロースゲルに吸着させた。

この操作をしたゲルをカラムにつめ、上澄み液を。

カラムに通した後、ＩＭのＫＣＩを含む緩衝液１で洗っ
た。洗いは、カラムからの溶出液の２８０％ｍの吸光度
を測定し、吸光度が０．１以下になるまで同緩衝液を流
し続けた（約１５０ｍ１）。

酵素の溶出は、１ＭのＫＣＩと３ｍＭの葉酸な含む１０
ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ９，０を用いて行い、
溶出液を一定ｍ＜約５ｍ１）をフラクションコレクター
を用いて分画した。分画した溶出液についてＤＨＦＲ活
性を測定し、酵素活性が含まれる両分を集めた（約２５
ｍ１）。得られた酵素液を、緩衝液１に対して、３回透
析した。

透析した標品を、５ＤＳ−ＰＡＧＥで調べたとこ・ろ、
均一なタンパク質標品であることが示された。

この標品は、８６９ユニツトのＤＨＦＲ活性（回収率５
１％）、また約２２　ｍ　ｇの融合タンパク質を含んで
いた。

実施例２ 融合タンパク質２の分離精製 ＤＨＦＲ−中成長ホルモン放出因子フラグメント融合タ
ンパク質は１組換えプラスミドｐｓｃｌ−１２上に暗号
化されており、微工研寄託番号ＦＥＲＭＢＰ−２１４９
の大腸菌（以下、ＢＰ−２１４９株と略す）が生産する
融合タンパク質である。

ＢＰ−２１４９株は、ＹＴ＋Ａｐ培地を用いた場合、３
７℃では９０％が、また３０℃では約５０％の融合タン
パク質２が不溶化するが、２０℃ではほとんど１００％
が可溶性タンパク質として菌体内に蓄積する。従って、
ＹＴ＋Ａｐ培地３１を用いて、３７℃で１６時間培養し
た後、４２℃で更に１時間培養を行った。培養後、５，
０００回転／分、１０分間の遠心分離により菌体を集め
。

菌体な３００　ｍ　ｌの緩衝液１に懸濁し、再び５゜０
００回転／分、１０分間の遠心分離を行い菌体を集めた
。その結果、湿重量約１１．　ｇの菌体が得られた。得
られた面体を約２２ｍ１の緩衝液１に懸濁し、フレンチ
プレスを用いて菌体を破砕し。

得られた菌体破砕液を、５，０００回転／分、１０分間
の遠心分離し、沈澱を集めた。沈澱は、白色をしており
、これを３０ｍ１の緩衝液１に懸濁し、再び５，０００
回転／分、１０分間の遠心分離を行い沈澱を集めた。得
られた沈澱を、１１ｍ１の４Ｍ尿素を含む緩衝液１に溶
解し、不溶性部分を、１５，０００回転／分、１５分間
の遠心分離により沈澱として取り除き、上清を得た（約
１１　ｍ　ｌ　）　ｏ上清に、１０倍量（１１０ｍｌ）
の緩衝液１を加え希釈した。希釈した溶液中には、３２
２２ユニツトのＤＨＰＲ活性が含まれていた。

これに約１０ｇのあらかじめ緩衝液１で平衡化したＭＴ
Ｘ−アガロースゲルを加え、緩やかに攪はんしながら一
晩放置し、融合タンパク質をＭＴＸアガロースゲルに吸
着させた。この操作をしたゲルをカラムにつめ、上澄み
？夜をカラムに通した後。

ＩＮｌのＫＣＩを含む緩衝液１て洗った。洗いは。

カラムからの溶出液の２８０ｎｍの吸光度を測定し、吸
光度が０．１以下になるまで同緩衝液を流し続けた（約
１５０ｍ１）。＃素の溶出は、１ＭのＫＣＩと３ｍＭの
葉酸を含む１０ｍＭリン酸力、リウム援衝液、ｐＨ９，
０を用いて行い、溶出液を一定量（約５ｍ１）をフラク
ションコレクターを用いて分画した。分画した溶出液に
ついてＤＨＦＲ活性を測定し、酵素活性が含まれる画分
を集めたく約２５　ｍ　ｌ　）。得られた酵素液を、緩
衝液１に対して、３回透析した。透析した標品を、５Ｄ
Ｓ−ＰＡＧＥで調べたところ、均一なタンパク質標品で
あることが示された。この標品は、１５７９ユニツトの
ＤＨＦＲ活性（回収率４９％）。

また約４０　ｍ　ｇの融合タンパク質を含んでいた。

実施例３ 融合タンパク質３ 融合タンパク質３は４組換えプラスミドｐＧＲＦ４４−
２２上に暗号化されており、微工研寄託番号ＦＥＲＭＢ
Ｐ−２１５２の大腸菌（以下、ＢＰ−２１５２株と略す
）が生産する融合タンパク質である。

培地としてＹＴ＋Ａｐ培地を用いた場合、３７℃では約
９０％が、３０℃では約４０％が不溶性タンパク質とし
て蓄積するが、２０℃ではほとんど１００％が可溶性タ
ンパク質として菌体内に蓄積する。従って、ＹＴ＋Ａ、
ｐ培地３１を用いて。

３７℃で１６時間培養を行った後、４２℃で更に２時間
培養を行った。培養後、５，０００回転／分、１０分間
の遠心分離により菌体を集め、菌体を３００ｍ１の緩衝
液】に懸濁し、再び５，０００回転／分、１０分間の遠
心分離を行い菌体を集めた。その結果、湿重量１３ｇの
菌体が得られた。

得られた菌体な２６ｍ１の緩衝液１に懸濁し、フレンチ
プレスを用いて面体を破砕し、得られた菌体破砕液を、
５，０００回転／分、１０分間の遠心分離し、沈澱を集
めた。沈澱は、白色をしており、これを３０ｍ１の緩衝
液１に懸濁し、再び５゜０００回転／分、１０分間の遠
心分離を行い沈澱を集めた。この操作を、３回繰り返し
た。得られた沈澱を、１３ｍ１の４Ｍ尿素を含む緩衝液
１に溶解し、不溶性部分を、１５，０００回転／分。

１５分間の遠心分離により沈澱として取り除き。

上清を得た（約１３ｍ１）。上清に、１０倍量（１３０
ｍｌ）の緩衝液１を加え希釈した。希釈した溶液中には
、９２７ユニツトのＤ　ＨＦ　Ｒ活性が含まれていた。

これに１０ｇのあらかじめ緩衝液１て平衡化したＭＴＸ
−アガロースゲルを加え。

緩やかに攪はんしながら一晩放置し、融合タンパク質を
ＭＴＸアガロースゲルに吸着させた。この操作をしたゲ
ルをカラムにつめ、１澄み液をカラムに通した後、ＩＭ
のＭＣＩを含む緩衝液１で洗った。洗いは、カラムから
の溶出液の２８０ｎｍの吸光度を測定し、吸光度が０．
１以下になるまで同緩衝液を流し続けた（約１５０ｍ１
）。酵素の溶出は、ＩＭのＫＣＩと３ｍＭの葉酸を含む
１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ９，０を用いて行
い、溶出液を一定ｆｌ（約５ｍ１）をフラクションコレ
クターを用いて分画した。分画した溶出液についてＤＨ
ＦＲ活性を測定い酵素活性が含まれる両分を集めた（約
２５ｍ１）。得られた酵素液を、緩衝液１に対して、３
回透析した。透析した標品を、５ＤＳ−ＰＡＧＥで調べ
たところ。

均一なタンパク質標品であることが示された。この標品
は、４４５ユニットのＤＨＦＲ活性（回収率４８％）、
また約１２ｍｇの融合タンパク費を含んでいた。

実施例４ 融合タンパク質４ 融合タンパク質４は９組換えプラスミドｐＧＲＦＭ４４
−８上に暗号化されており、微工研寄託番号ＦＥＲＭＢ
Ｐ−２１５１の大腸菌（以下、ＢＰ−２１５１株と略す
）が生産する融合タンパク質である。

ＢＰ−２１５１株は、￥Ｔ＋Ａｐ培地を用いた場合、３
７℃でほとんど全ての融合タンパク質が不溶化するが、
３０°Ｃでは約６５％が不溶化し。

２０℃ではほとんど１００％が可溶性タンパク質として
菌体内に蓄積する。従って、ＹＴ＋Ａｐ培地３１を用い
て、３７℃で１６時間培養を行った。

培養後、５，０００回転／分、１０分間の遠心分難によ
り菌体を集め、菌体を３００ｍ１の緩衝液１に懸濁し、
再び５，０００回転／分、１０分間の遠心分離を行い面
体を集めた。その結果、湿重量１３ｇの菌体が得られた
。得られた菌体を２６ｍ１の緩衝液１に懸濁し、フレン
チプレスを用いて菌体を破砕し、得られた菌体破砕液を
、５，０００回転／分、１０分間の遠心分難し、沈澱を
集めた。沈澱は、白色をしており、これを３０ｍ１の緩
衝液１に懸濁し、再び５，０００回転／分。

１０分間の遠心分離を行い沈澱を集めた。この操作を、
３回繰り返した。得られた沈澱を、１３ｍ１の４Ｍ尿素
を含む緩衝液１に溶解し、不溶性部分を、１５，０００
回転／分、１５分間の遠心分離により沈澱として取り除
き、上清を得た（約１４ｍ１）。上清に、１０倍量（１
４０ｍｌ）の緩衝液１を加え希釈した。希釈した溶液中
には、９３７ユニツトのＤＨＦＲ活性が含まれていた。

これに１０ｇのあらかじめ緩衝液１で平衡化したＭＴＸ
−アガロースゲルを加え、緩やかに攪はんしながら一晩
放置し、１合タンパク質をＭＴＸアガロースゲルに吸着
させた。この操作をしたゲルをカラムにつめ、・上澄み
液をカラムに通した後、ＩＭのＫＣＩを含む緩衝液１で
洗った。洗いは、カラムからの溶出液の２８０ｎｒｎの
吸光度を測定し。

吸光度が帆　１以下になるまで同緩衝液を流し続けた（
約１５０ｒｎｌ）。酵素の溶出は、ＩＭのＫＣｌと３ｍ
Ｍの葉酸を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ９
，０を用いて行い、溶出液を一定量（約５ｍ１）をフラ
クションコレクターを用いて分画した。分画した溶出液
についてＤＨＦＲ活性を測定し、酵素活性が含まれる画
分を集めた（約２５ｍ１）。得られた酵素液を、緩衝液
１に対して、３回透析した。透析した標品を、５ＤＳ−
ＰＡＧＥで調べたところ、均一なタンパク質標品である
ことが示された。この標品は、４７３ユニツトのＤＨＦ
Ｒ活性（回収率５１％）、また約２０ｍｇの融合タンパ
ク質を含んでいた。

実施例５ 融合タンパク質２からのＧＦＲＭ２９の分離上記実施例
２で得られた高度精製融合タンパク質２　（５ｍｇ）を
、凍結乾燥し、これを約２ｍｌの７０％蟻酸に溶かし、
これに約１００ｍｇのブロムシアンを加え溶かした後、
窒素雰囲気下に密栓し、１０℃で２４時間反応させた。

反応後、２０ｍ１の水を加え、その後凍結乾燥した。凍
結乾燥して得られた標品を、１ｍｌの３０％酢酸に溶か
した。そのうちの、０．５ｍｌをとり、高速液体クロマ
ドグフィー装置（高滓ＬＣ−６Ａ）を用いＩｎｅｒｔｓ
ｉｌ−ＯＤＳ　５μｍ（７，６ｘ２５０ｍｍ）カラムで
分離した。溶出は、流速２ｍｌ／ｍｉ　ｎで０．１％ト
リフルオロ酢酸中、アセトニトリルの濃度勾配（２７，
５％から４２．５％）をかけることにより行った。０か
ら５分までは、２７．５％のアセニトリルを用い、５分
から８０分までは、２７．５％から４２．５％のアセト
ニトリルの直線濃度勾配をかけた。８０分から１００分
の間は、５０％の濃度を用い、その後は２７．５％のア
セトニトリル濃度を用いた。溶出物は、２２０ｎｍの吸
光度を測定することにより行った。その結果、第５図に
示すような溶出曲線が得られた。試料注入後約４７分後
のピーク画分を分離し１分離した溶出液をエバホレータ
ーで乾燥後、少量の水を加え凍結乾燥し溶媒を除き、ペ
プチドを得た。得られたペプチドを酸加水分解後、その
４分の１をアミノ酸分析に用いた。

その結果、得られたアミノ酸組成は、ＧＲＦＭ２９の配
列から予想される組成と一致することが示された。また
、アミノ酸分析に用いた試料中には１９％ｍｏｌｅのＧ
ＲＦＭ（６６μｇ、０．４１ｍｇの融合タンパク質２に
相当）が含まれていることが明かとなった。この結果か
ら、精製均一化した融合タンパク質２用いて、ブロムシ
アン処理した標品をＨＰＬＣを用いて分離することによ
り収率的６６％でＧＲＦＭ２９を回収できた。

実施例６ 融合タンパク質４からのＧＦＲＭの分離上記実施例２で
得られた高度精製融合タンパク質２（１０ｍｇ）を、凍
結乾燥し、これを約２ｍｌの７０％蟻酸に溶かし、これ
に約２００ｍｇのブロムシアンを加え溶かした後、窒素
雰囲気下に密栓し、１０℃で２４時間反応させた。反応
後。

２０ｍ１の水を加え、その後凍結乾燥した。凍結乾燥し
て得られた標品を、１ｍｌの３０％酢酸に溶かした。そ
のうちの、０．１ｍｌをとり、高速液体クロマドグフィ
ー装置（高滓ＬＣ−８Ａ）を用い！ｎｅｒｔｓｉ　Ｉ　
−０Ｄ５５μｍ（４，６ｘ１５０ｎ＋＋ｎ）カラムで分
離した。溶出は、流速１　ｍ　ｌ　／　ｍ　ｉ　ｎで０
・　１％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリルの濃度勾
配（２７，５％から４２．５％）をかけることにより行
った。０から２分までは、２７．５％のアセニトリルを
用い、２分から３２分までは、２７．５％から４２．５
％のアセトニトリルの直線濃度勾配をかけた。３２分か
ら３５分の間は、５０％の濃度を用い、その後は２７．
５％のアセトニトリル濃度を用いた。溶出物は、２２０
ｎｍの吸光度を測定することにより行った。その結果、
第６図に示すような溶出曲線が得られた。試料注入後約
２１分後のピーク画分を分離し９分離した溶出液をエバ
ホレーターで乾燥後、少量の水を加え凍結乾燥し溶媒を
除き、ペプチドを得た。得られたペプチドを酸加水分解
後、その８分の１をアミノ酸分析に用いた。

その結果、得られたアミノ酸組成は、ＧＲＦＭ２９の配
列から予想される組成と一致することが示された。また
、アミノ酸分析に用いた試料中には２．２％ｍＯ１ｅの
ＧＲＦＭ　（１１ｔｔｇ、　５１μｇの融合タンパク質
２に相当）が含まれていることが明かとなった。この結
果から、精製均一化した融合タンパク質２用いて、ブロ
ムシアン処理した標品をＨＰＬＣを用いて分離すること
により収率的４１％でＧＲＦＭを回収できた。

［発明の効果］ 本発明に従えば、ＧＲＦ誘導体の生産が容易になり、生
産されたＧＲＦ誘導体利用の道が開けることになる。ま
た、ＧＲＦ誘導体をカルボキシ末端側に有するＤＨＦＲ
融合タンパク質が酵素活性を保ったまま単離できること
が示され、一つで２つの機能を発現することが可能な部
分を有するタンパク質、いわゆる多機能タンパク質とし
ての利用の可能性があり、その利用が期待される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｐＧＲＦ２−１５中に存在する融合タンパク
質１を暗号化する部分の塩基配列およびタンパク質のア
ミノ酸配列を示す図である。図中符号は、核酸塩基およ
びアミノ酸を表し、Ａはアデニンを、Ｃはシトシンを、
Ｇはグアニンを、Ｔはチミンを、Ａｌａはアラニンを、
Ａｒｇはアルギニンを、Ａｓｎはアスパラギンを、Ａｓ
ｐはアスパラギン酸を、ＣｙＳはシスティンを、Ｇｉｒ
ｔはグルタミンを、Ｇｌｕはグルタミン酸を、Ｇｌｙは
グリシンを、Ｈｉｓはヒスチジンを、ｌｉｅはイソロイ
シンを、Ｌｅｕはロイシンを、Ｌｙｓはリジンを、Ｍｅ
ｔはメチオニンを、Ｐｔｔｅはフェニルアラニンを、Ｐ
ｒｏはプロリンを、Ｓｅｒはセリンを、Ｔｈｒはトレオ
ニンを、Ｔｒｐはトリプトファンを、Ｔｙｒはチロシン
を＋　　Ｖ　ａ　１はバリンを示している。図中番号は
、１番目のアミノ酸であるメチオニンを暗号化するＡＴ
Ｇコドンの”Ａ”を１番として数えた番号を示している
。 第２図は、ｐＳＧ１−１２中に存在する融合タンパク質
２を暗号化する部分の塩基配列およびタンパク質のアミ
ノ酸配列を示す図である。図中符号は、第１図と同様で
ある。 第３図は、ｐＧＲＦ４４−２２中に存在する融合タンパ
ク質３を暗号化する部分の塩基配列およびタンパク質の
アミノ酸配列を示す図である。図中符号は、第１図と同
様である。 第４図は、ｐＧＲＦＭ４４−６中に存在する融合タンパ
ク質４を暗号化する部分の塩基配列およびタンパク質の
アミノ酸配列を示す図である。図中符号は、第１図と同
様である。 第５図は、ブロムシアン処理した融合タンパク質２試料
の高速液体クロマトグラムを示している。 横軸は試料注入後の時間を分単位で、縦軸は、２２０　
ｎ　ｍの吸光度を任意単位で表現している。矢印で示し
たピークがＧ　ＲＦ　Ｍ　２９の溶出ピークである。 第６図は、ブロムシアン処理した融合タンパク質４試料
の高速液体クロマトダラムを示している。 横軸は試料注入後の時間を分単位で、縦軸は、２２０　
ｎ　ｒｎの吸光度を任意単位で表現している。矢印で示
１ノたビークがＧＲＦＭの溶出ビークである。 第 図 手 続 補 正 ！（方式） １、事件の表示 ２、発明の名称 平成１年特許園第７９４６２号 成長ホルモン放出因子誘導体 肌 ４゜ 補正をする者 事件との関係　　特許出願人 東京都千代田区霞が関１丁目３番１号 （１１４）工業技術院長　杉　浦　　賢指定代理人 ５、補正命令の日付 ６、補正の対象 ７、補正の内容 平成１年７月４日　（発送口） 平成元年３月３０日付は提出の図面 図面が剥離していたため、第１図〜第 ６図を別紙のとおり全図訂正しまず。 第 ！ 図 第 図 第 図 第 図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ｐＧＲＦ２−１５を含有する大腸菌が生産するジヒ
   ドロ葉酸還元酵素−成長ホルモン放出因子誘導体融合タ
   ンパク質。 ２、ｐＳＧ１−１２を含有する大腸菌が生産するジヒド
   ロ葉酸還元酵素−成長ホルモン放出因子誘導体融合タン
   パク質。 ３、ｐＧＲＦ４４−２２を含有する大腸菌が生産するジ
   ヒドロ葉酸還元酵素−成長ホルモン放出因子誘導体融合
   タンパク質。 ４、ｐＧＲＦＭ４４−６を含有する大腸菌が生産するジ
   ヒドロ葉酸還元酵素−成長ホルモン放出因子誘導体融合
   タンパク質。 ５、ジヒドロ葉酸還元酵素−成長ホルモン放出因子誘導
   体融合タンパク質のジヒドロ葉酸還元酵素酵素活性を目
   安に、ｐＧＲＦ２−１５を含有する大腸菌の菌体破砕液
   を遠心分離して得られる上清画分にストレプトマイシン
   硫酸処理、硫安処理をして得られる酵素液をメソトリキ
   セート結合アフィニティカラムクロマトグラフィーを用
   いて高度に精製することを特徴とするジヒドロ葉酸還元
   酵素−成長ホルモン放出因子誘導体融合タンパク質の分
   離精製方法。 ６、ｐＳＧ１−１２を含有する大腸菌の菌体破砕液を遠
   心分離して得られる沈澱画分を尿素で可溶化し、緩衝液
   で希釈することにより、ジヒドロ葉酸還元酵素−成長ホ
   ルモン放出因子誘導体融合タンパク質のジヒドロ葉酸還
   元酵素酵素活性を活性化し、該酵素活性を目安に、メソ
   トリキセート結合アフィニティカラムクロマトグラフィ
   ーを用いて高度に精製することを特徴とするジヒドロ葉
   酸還元酵素−成長ホルモン放出因子誘導体融合タンパク
   質の分離精製方法。 ７、ｐＧＲＦ４４−２２を含有する大腸菌の菌体破砕液
   を遠心分離して得られる沈澱画分を尿素で可溶化し、緩
   衝液で希釈することにより、ジヒドロ葉酸還元酵素−成
   長ホルモン放出因子誘導体融合タンパク質のジヒドロ葉
   酸還元酵素酵素活性を活性化し、該酵素活性を目安に、
   メソトリキセート結合アフィニティカラムクロマトグラ
   フィーを用いて高度に精製することを特徴とするジヒド
   ロ葉酸還元酵素−成長ホルモン放出因子誘導体融合タン
   パク質の分離精製方法。 ８、ｐＧＲＦＭ４４−６を含有する大腸菌の菌体破砕液
   を遠心分離して得られる沈澱画分を尿素で可溶化し、緩
   衝液で希釈することにより、ジヒドロ葉酸還元酵素−成
   長ホルモン放出因子誘導体融合タンパク質のジヒドロ葉
   酸還元酵素酵素活性を活性化し、該酵素活性を目安に、
   メソトリキセート結合アフィニティカラムクロマトグラ
   フィーを用いて高度に精製することを特徴とするジヒド
   ロ葉酸還元酵素−成長ホルモン放出因子誘導体融合タン
   パク質の分離精製方法。 ９、ｐＳＧ１−１２を含有する大腸菌が生産するジヒド
   ロ葉酸還元酵素−成長ホルモン放出因子誘導体融合タン
   パク質を分離精製し、単離したジヒドロ葉酸還元酵素−
   成長ホルモン誘導体融合タンパク質をブロムシアン処理
   した後、逆相高速液体クロマトグラフィにより成長ホル
   モン放出因子誘導体を分離精製することを特徴とする成
   長ホルモン放出因子誘導体の製造方法。 １０、ｐＧＲＦＭ４４−６を含有する大腸菌が生産する
   ジヒドロ葉酸還元酵素−成長ホルモン放出因子誘導体融
   合タンパク質を分離精製し、単離したジヒドロ葉酸還元
   酵素−成長ホルモン誘導体融合タンパク質をブロムシア
   ン処理した後、逆相高速液体クロマトグラフィにより成
   長ホルモン放出因子誘導体を分離精製することを特徴と
   する成長ホルモン放出因子誘導体の製造方法。