JPH022590B2

JPH022590B2 -

Info

Publication number: JPH022590B2
Application number: JP56055907A
Authority: JP
Inventors: Yukihiko Kameda; Satoshi Horii
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1981-04-13
Filing date: 1981-04-13
Publication date: 1990-01-18
Also published as: JPS57169446A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、新規アミノシクリトール、即ち５−
アミノ−１−ヒドロキシメチル−１，２，３，４
−シクロヘキサンテトロール（以下“バリオール
アミン”と称す）、その製造法およびα−グルコ
シダーゼ阻害剤に関する。本発明者等は、ストレプトマイセス・ハイグロ
スコピクス・バール・リモネウス
（Streptomyces hygroscopicus var.limoneus）
を好気条件下に培養することによつて得られる
種々の化合物のなかに、上記バリオールアミン存
在し、かつα−グルコシダーゼ阻害剤作用を有す
ることを見い出し、さらに鋭意研究を続けた結
果、本発明を完成した。即ち本発明は、(1)バリオ
ールアミンまたはその塩、(2)バリオールアミンを
含有するα−グルコシダーゼ阻害剤、(3)ストレプ
トマイセス属に属し、バリオールアミンを生産す
る能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中
にバリオールアミンを生成蓄積せしめ、これを採
取することを特徴とするバリオールアミンの製造
法に関する。本発明のアミノシクリトール即ちバリオールア
ミンの理化学的性質は次の通りである。 (1) 外観吸湿性の白色粉末 (2) 元素分析値（分子式） C₇H₁₅NO₅・H₂O 計算値(%)：Ｃ、39.80；Ｈ、8.11；Ｎ、6.63 実験値(%)：Ｃ、39.35；Ｈ、7.82；Ｎ、6.59 (3) 比旋光度〔α〕²⁰ _D＋18.8゜（Ｃ＝１、H₂O） (4) 紫外線吸収スペクトル水溶液は200〜360nｍの間の領域で特微的な
吸収極大を示さず、末端吸収を示すのみであ
る。 (5) 赤外線吸収スペクトル KBr法により測定したスペクトルを第１図
に示す。また主な吸収極大の波数を下に示す。 3340、2920、1575、1500〜1300、1090、
1045、910、815cm^-1 (6) ¹H核磁気共鳴スペクトル重水中、100MHzで測定したスペクトルを第
２図に示す。またケミカルシフトδ値（ppm）
および結合定数Ｊ（Hz）を下に示す。 δ；1.65（1H、クアルテツト、Ｊ＝3.8、15.2）、
1.90（1H、クアルテツト、Ｊ＝2.9、15.2）、
3.33（1H、マルチプレツト）、3.40（1H、ダブ
レツト、Ｊ＝9.5）、3.48（2H）、3.56（1H、ク
アルテツト、Ｊ＝3.8、9.5）、3.83（1H、トリ
プレツト、Ｊ＝9.5）。 (7) ¹³C核磁気共鳴スペクトル重水中、100MHzで測定したデカツプル条件
下でのケミカルシフトδ値（ppm）およびオフ
レゾナンス条件下で測定した分裂のパターンを
次に示す。 δ：35.06（トリプレツト）、52.94（ダブレツ
ト）、68.24（トリプレツト）、73.88（ダブレツ
ト）、76.30（ダブレツト）、76.47（ダブレツ
ト）、78.71（シングレツト）。 (8) 溶剤に対する溶解性水、ジメチルスルホキシド、メタノールに可
溶。エタノール、酢酸エチル、クロロホルム、ア
セトンに難溶または不溶。 (9) 呈色反応ニンヒドリン反応：陽性グレイグ・リーバツク（Greig−Leaback）試薬による反応：陽性ナフトレゾルシン−硫酸反応：陰性 (10) 薄層クロマトグラフイー TLCプレート・シリカゲル・60F₂₅₄（メルク
社製、西ドイツ）で、展開液としてｎ−プロピ
ルアルコール・酢酸・水（４：１：１）を用い
て測定したときのRf値を下に示す。バリオールアミン（valiolamine） 0.44 バリダミン（validamine） 0.47 バリエナミン（valienamine） 0.55 (11) ガスクロマトグラフイーカラム：充填剤１％シリコンOV−１（シリ
コン系）／クロモソルブ、タイプＷ AW−
DMCS（ケイソウ土系）、いずれもジヨンズ・
マンヴイル（Johns−Manville）社製、米国、
ガラスカラム100×0.3cm カラム温度：180℃ キヤリヤーガス：N₂60ml／分検出器：水素炎イオン化検出器試料の調製：下記のアミノシクリトールにピ
リジンを加えた後、ビス（トリメチルシリル）
アセトアミドおよびトリメチルクロルシランの
混合物を加え、70℃で30分間加熱し試料とす
る。保持時間（分）バリオールアミン 4.4 バリエナミン 2.4 バリダミン 2.2 本発明のα−グルコシダーゼ阻害剤は、人間お
よび人間以外の動物の炭水化物の代謝を抑制する
ために、例えば血糖上昇抑制作用を有しており、
過血糖症状および過血糖に起因する種々の疾患、
例えば、肥満症、脂肪過多症、過脂肪血症（動脈
硬化症）、糖尿病、前糖尿病、口腔微生物による
糖代謝に起因する疾病、例えば虫歯の予防に有用
な化合物である。またバリオールアミンを添加し
て製造した食品は、代謝異常の患者食として、お
よび代謝異常予防として健康な人にも適してい
る。また、低脂肪の良質の食用獣肉を得るための
家畜類の飼育添加剤としても有用である。したが
つて本発明のα−グルコシダーゼ阻害剤は医薬品
および食品添加物、動物用飼料添加物として有用
である。本発明のα−グルコシダーゼ阻害剤は経
口または非経口的に、好ましくは経口的に投与す
る。バリオールアミンは毒性もほとんどなく（ラツ
トLD₅₀500mg／Kg以上）、遊離塩基または水和物
として用いることができ、通常の方法により薬学
的に許容できる酸との任意の無毒性の酸付加塩と
して用いることができる。このような酸として
は、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、
硝酸などの無機酸、酢酸、プロピオン酸、りんご
酸、くえん酸、フマル酸、マレイン酸、アスコル
ビン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸などの有
機酸等が用いられる。バリオールアミンは単独ま
たは無毒性担体と混合して用いる。例えばコーヒ
ー、清涼飲料水、果汁、ビール、牛乳、ジヤム、
生あん等の液状或いは固状の食品、調味料、或い
は種々の主食並びに副食等と共に用いてもよく、
直接あるいは食品添加剤の形で用いることがで
き、あるいは食前または食後に服用することがで
きる。さらには低脂肪の良質の食用獣肉を得るた
めの家畜類の飼料添加剤等とすることもできる。本発明のα−グルコシダーゼ阻害剤は、例え
ば、水、エタノール、エチレングリコール、ポリ
エチレングリコール等の液状担体、澱粉、セルロ
ース、ポリアミド粉末等の固型担体等の無毒性担
体で希釈して、アンプル剤、顆粒剤、錠剤、丸
剤、カプセル剤、シロツプ剤等に常法にしたがつ
て調整し上記種々の用途に供することができる。
また、甘味剤、保存剤、分散剤、着色剤も共用す
ることができる。具体的には、例えば、バリオールアミン約20〜
500mgを含有する製剤を毎食後服用することによ
り、喫食による血中のグルコースの濃度の増加を
抑制することができる。また、例えば食品中の炭
水化物の含量の0.01〜１％程度のバリオールアミ
ンを種々の食品に添加してもよい。飼料に混ぜる場合は、飼料中の炭水化物含量の
0.001〜１％が望ましい。本発明のバリオールアミンは、文献未記載の新
規化合であり、例えば次のような方法によつて製
造される。即ち、ストレプトマイセス属に属する
ストレプトマイセス・ハイグロスコピクス・バー
ル・リモネウス（Streptomyces hygroscopicus
var.limoneus）を好気条件下に培養することによ
つてバリオールアミンが得られる。ストレプトマイセス・ハイグロスコピクス・バ
ール・リモネウスは、財団法人発酵研究所に
IFO12703、工業技術院微生物工業技術研究所に
FermNo.468、ジ・アメリカン・タイプ・カルチヤ
ー・コレクシヨン（The American Type
Culture Collection）にATCC 21431としてそれ
ぞれ寄託されている。なお、上記の菌株も微生物の一般的性質として
自然的に、または変異剤によつて変異を起し得
る。たとえばＸ線、ガンマー線、紫外線等の放射
線の照射、更には単胞子分離、種々の薬剤による
処理、または薬剤を含有する培地上での培養、そ
の他の手段で変異させて得られる変異株、あるい
は自然的に得られる突然変異株であつてもバリオ
ールアミンを生産する性質を有するものはすべて
本発明の方法に利用し得る。本発明の方法における上記の微生物の培養に用
いられる培地は上記の菌株が利用し得る栄養源を
含むものなら、液状でも固状でもよいが、大量を
処理するときには液状培地を用いるのがより適当
である。培地には上記の微生物が同化し得る炭素
源、消化し得る窒素源、無機物質、微量栄養素等
が適宜配合される。炭素源としては、例えばブド
ウ糖、乳糖、シヨ糖、麦芽糖、デキストリン、で
ん粉、グリゼリン、マンニトール、ソルビトー
ル、油脂類（例えば、大豆油、ラード油、チキン
油など）、窒素源としては、例えば肉エキス、酵
母エキス、乾燥酵母、大豆粉、コーン・スチー
プ・リカー、ペプトン、綿実粉、廃糖蜜、尿素、
アンモニウム塩類（例えば、硫酸アンモニウム、
塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アン
モニウムなど）、その他が用いられる。更に、ナ
トリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウ
ム、鉄、マンガン、亜鉛、コバルト、ニツケルな
どの金属塩類、リン酸、ホウ酸などの無機酸の塩
類、酢酸、プロピオン酸などの有機酸の塩類が適
宜用いられる。その他、アミノ酸（例えば、グル
タミン酸、アスパラギン酸、アラニン、バリン、
リジン、メチオニン、プロリンなど）、ペチプド
（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）、ビタ
ミン類（例えば、B₁、B₂、ニコチン酸、B₁₂、Ｃ
など）、核酸類（例えば、プリン、ピリミジンお
よびその誘導体など）を含有させてもよい。もち
ろん培地のPHを調節する目的で無機または有機の
酸、アルカリ類、緩衝剤等を加えても、あるいは
消泡の目的で油脂類、表面活性剤などの適量を添
加しもよい。培養の手段としては、静置培養、振盪培養ある
いは通気撹拌培養法などの手段が用いられる。大
量の処理には、いわゆる深部通気撹拌培養による
のが望ましいことはいうまでもない。培養の条件
は培地の状態や組成、菌株の種類、培養の手段な
どによつて一定しないのは当然であるが、それら
は通常20゜〜40℃の温度で、初発PH６〜８付近に
選択するのがよい。とりわけ、培養中期の温度は
24゜〜37℃、また初発PHは6.5〜8.5の条件が望まし
い。培養時間も前記の諸条件により一定しない
が、バリオールアミンの濃度が最大となるまで培
養するのがよい。これに要する時間は液体培地を
用いる振盪培養または通気撹拌培養の場合は通常
24〜192時間程度であり、好ましくは72〜168時間
程度である。なお、本発明で用いられる「培養
物」とは、上記の培養で得られるものをいう。培
養物のなかにはアミノシクリトール類が含まれて
おり、そのまゝまたは適宜精製してα−グルコシ
ダーゼ阻害剤として用いることもできる。反応液中から目的物を採取するには、通常微生
物代謝物を採取するのに用いられる手段が単独あ
るいは任意の順序に組み合わせて、または反復し
て用いられる。すなわち、例えば、濾過、遠心分
離、濃縮、乾燥、凍結乾燥、吸着、脱着、各種溶
媒に対する溶解度の差を利用する方法（例えば、
沈澱、結晶化など）、クロマトグラフイーなどが
用いられる。またバリオールアミンが水溶性の塩
基性物質であることを利用して、いわゆる水溶性
塩基性物質の単離精製に用いられる方法、例えば
イオン交換樹脂、活性炭、ハイポーラスポリマ
ー、セフアデツクス、セフアデツクスイオン交換
体、セルローズ、イオン交換セルローズ、シリカ
ゲル、アルミナどを用いるクロマトグラフイーや
吸脱着法が有利に用いられる。更に具体的には、例えば、培養液より遠心分離
あるいは濾過によつて菌体を除去し、好ましくは
上澄みあるいは濾液のPHを塩基性に調整した後、
目的物を活性炭のクロマトカラムに吸着させ、例
えばメタノール、エタノール、ｎ−プロピルアル
コール、iso−プロピルアルコール、ｎ−ブチル
アルコールなどの低級アルコールあるいはアセト
ンなどの含有する水溶液で溶出することができ
る。また目的物を陽イオン交換樹脂（例えばアン
バーライトIRC−50などのカルボン酸型のイオン
交換樹脂、ダウエツクス50W×８などのスルホン
酸型のイオン交換樹脂など）に吸着させ、酸（例
えば塩酸）あるいはアルカリ（例えばアンモニア
水や水酸化ナトリウム溶液）を用いて溶出するこ
ともできる。このようにして得られた溶出液は減
圧濃縮後、必要ならば更に活性炭クロマトグラフ
イーあるいはイオン交換樹脂を用いるクロマトグ
ラフイーを適宜繰り返し、あるいは組み合わせて
精製することができる。またダウエツクス１×２
（OH^-）のような陰イオン交換樹脂を用いるクロ
マトグラフイーに付し、例えば水で溶出すること
によつて目的物を精製単離することができる。以下に参考例、実施例を記載してこの発明の内
容を詳述する。参考例グルコシダーゼ阻害活性の測定方法基質としてマルトースおよびシヨ糖を用いた場
合のα−グルコシダーゼ（酵母、タイプ、シグ
マ社製、米国）および豚の小腸の粘膜から調製し
たマルターゼおよびサツカラーゼ〔ボルグストレ
ム（B.Borgstro¨m）およびダールクイスト（A.
Dahlqvist）によつてアクタ・ケミカ・スカンジ
ナビカ（Acta Chemica Scandinavica）12巻、
1997〜2006頁、1958年に記載の方法に従つて調
製〕に対する阻害活性は、0.02Mリン酸緩衝溶液
（PH6.8）で適当に希釈した酵素溶液0.25mlに試験
すべき阻害物質の同緩衝溶液0.5mlおよび基質の
0.05Mマルトースあるいは0.05Mシヨ糖の同緩衝
溶液0.25mlを加え、この混合物を37℃で10分間反
応させ、グルコースＢ−テスト試薬（ブドウ糖測
定用グルコースオキシダーゼ試薬、和光純薬製、
日本）３mlを加え、更に37℃で20分間加温し、反
応液の505nmにおける吸光度を測定して算出す
る。基質としてｐ−ニトロフエニル−α−Ｄ−グル
コピラノシドを用いた場合のα−グルコシダーゼ
（酵母、タイプ、シグマ社製、米国）およびグ
ルコアミラーゼ（クモノスカビ、シグマ社製、米
国）に対する阻害活性はα−グルコシダーゼを
0.005mg／ml含有する0.02Mリン酸緩衝液（PH6.8）
0.25mlに阻害物質の同緩衝溶液0.5mlおよび0.01M
ｐ−ニトロフエニル−α−Ｄ−グルコピラノシド
の同緩衝溶液．25mlを加えて37℃で15分間反応さ
せて後、0.1M炭酸ナトリウム水溶液３mlを加え
て反応を停止させ、反応後の400nｍにおける吸
光度を測定して算出する。50％阻害濃度は、３な
いし５種の異なつた濃度の阻害物質の試料につい
て阻害率（％）を求めて算出する。第１表にバリオールアミンの各種α−グルコシ
ダーゼに対する50％阻害濃度（IC₅₀）を示す。

【表】実施例１ (a) 滅菌した２坂口フラスコ中の培地（グルコ
ース３％、生大豆粉2.2％、ペプトン0.3％、炭
酸カルシウム0.4％、水500ml、PH７）に、グル
コース・アスパラギン寒天培地上で培養したス
トレプトマイセス・ハイグロスコピクス・バー
ル・リモネウス（IFO、12703、Ferm.468、
ATCC、21431）の１白金耳を接種し、往復振
盪機上で28℃で48時間培養した。この培養液
500mlを、滅菌した50ステンレス・スチール
醗酵槽中の培地（グルコース５％、生大豆粉
3.6％、ペプトン0.5％、炭酸カルシウム0.4％、
水30、PH７）に移植し、28℃で114時間通気
撹拌下に培養した。 (b) 実施例(a)で得られた培養液をPH９に調節後、
濾過助剤を加えて濾過し、濾液（25）を活性
炭のカラム（10）に吸着させ、水洗後、７％
ｎ−ブチルアルコール水で溶出した。溶出液は
減圧濃縮し、濃縮液をアンバーライトCG−50
（NH₄ ⁺型、ローム・アンド・ハース社製、米
国）のカラム（５）に吸着させ、水洗後、
0.1Nアンモニア水で溶出した。溶出液を減圧
濃縮し、濃縮液をダウエツクス１×２（OH^-
型、ダウ・ケミカル社製、米国、１）のカラ
ムクロマトに付し、水で溶出し、溶出区分を減
圧濃縮乾固して、バリオールアミンを得た。こ
のようにして得られたバリオールアミンは下記
の構造式で表わされる。実施例２実施例１で得られたバリオールアミン（1.0ｇ）
を水（10ml）に溶解し、Ｎ硫酸でPH３に調節後、
活性炭のカラムクロマトグラフイー（250ml）に
付し、水で溶出する。溶出画分を集め、減圧濃縮
後、凍結乾燥するとバリオールアミン硫酸塩が得
られる。元素分析：C₇H₁₅NO₅・1/2H₂SO₄・H₂O 計算値(%)：Ｃ、32.30；Ｈ、6.97；Ｎ、5.38 実験値(%)：Ｃ、31.83；Ｈ、7.19；Ｎ、5.19 〔α〕²³ _D＋11.0゜（Ｃ＝１、1/10Ｎ硫酸）実施例３実施例１で得られたバリオールアミン（1.0ｇ）
を水（10ml）に溶解し、Ｎ塩酸でPH３に調節後、
活性炭のカラムクロマトグラフイー（250ml）に
付し、水で溶出する。溶出画分を集め、減圧濃縮
後、凍結乾燥するとバリオールアミン塩酸塩が得
られる。元素分析：C₇H₁₅NO₅・HCl・H₂O 計算値(%)：Ｃ、33.95；Ｈ、7.32；Ｎ、5.66 実験値(%)：Ｃ、33.73；Ｈ、7.61；Ｎ、5.46 〔α〕²³ _D＋12.4゜（Ｃ＝１、1/10Ｎ塩酸）実施例４果汁入飲料200mlに対してバリオールアミン・
塩酸塩50mgを加えて撹拌溶解し、果汁入飲料を得
る。実施例５常法によるアンズ・ジヤム製造工程（煮熱処
理）終了後、品温が約55℃以下に低下したときバ
リオールアミンをできあがり製品重量に対して
0.1％の割合で均一に混合したのち、冷却してア
ンズ・ジヤム製品を得る。実施例６バリオールアミン・硫酸塩１重量部乳糖 100重量部を均一に混合し、粉末または細粒状として散剤と
する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、バリオールアミンの赤外線吸収スペ
クトル図、第２図はバリオールアミンの核磁気共
鳴スペクトル図を示す。

Claims

【特許請求の範囲】１５−アミノ−１−ヒドロキシメチル−１，
２，３，４−シクロヘキサンテトロールまたはそ
の塩。２５−アミノ−１−ヒドロキシメチル−１，
２，３，４−シクロヘキサンテトロールまたはそ
の塩を含有するα−グルコシダーゼ阻害剤。３ストレプトマイセス属に属し、５−アミノ−
１−ヒドロキシメチル−１，２，３，４−シクロ
ヘキサンテトロールを生産する能力を有する微生
物を培地に培養し、培養物中に５−アミノ−１−
ヒドロキシメチル−１，２，３，４−シクロヘキ
サンテトロールを生成蓄積せしめ、これを採取す
ることを特徴とする５−アミノ−１−ヒドロキシ
メチル−１，２，３，４−シクロヘキサンテトロ
ールの製造法。