JPH08188580A

JPH08188580A - 新規物質ヒドロキシアカロン及びその用途

Info

Publication number: JPH08188580A
Application number: JP37695A
Authority: JP
Inventors: Hitoshi Izumida; 仁泉田; Hiroshi Sano; 浩佐野; Toshiaki Iwasaki; 敏明岩崎; Katsunori Kita; 克則北; Akira Mihara; 明見原; Kazuo Yamaguchi; 和夫山口; Toru Yasuzawa; 亨安澤; Akimasa Nakamura; 昭正中村
Original assignee: KAIYO BIO TECHNOL KENKYUSHO KK; Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KAIYO BIO TECHNOL KENKYUSHO KK; KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1995-01-05
Filing date: 1995-01-05
Publication date: 1996-07-23

Abstract

(57)【要約】【構成】次式（Ｉ）：【化３】で表される新規物質ヒドロキシアカロン、並びに該物質
の用途及び製造方法。【効果】強力な阻害活性を持つ新規物質ヒドロキシア
カロンを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規物質ヒドロキシア
カロン、並びに該物質を有効成分とするキサンチンオキ
シターゼ（以下「ＸＯＤ」という。）阻害剤及びアグロ
バクテリウム属に属する微生物を用いた該物質の製造方
法に関する。ヒドロキシアカロンは、その優れたＸＯＤ
阻害作用により高尿酸血症の改善、予防及び痛風治療薬
として有効である。

【０００２】

【従来の技術】アデニン、グアニン等のプリン体はキサ
ンチンを経て人体内最終代謝産物である尿酸にまで代謝
される。このプリン代謝によって生成された尿酸は腎臓
等から適宜排泄されるので、通常であれば、体内の尿酸
値は一定である。しかし、プリン代謝に異常が生じて尿
酸が過剰に生産されたり、尿酸が適当に排泄されない場
合には、体内に尿酸が蓄積し、高尿酸血症や痛風を引き
起こす。このような場合、上記のプリン代謝に関与する
酵素活性を阻害し、尿酸の生成経路を遮断することが有
効である。プリン代謝に関与する酵素は、幾つか知られ
ているが、ＸＯＤは、最後の段階でキサンチンを尿酸に
変換する酵素であり、プリン代謝において中心的な役割
を果たすものである。このため従来より、ＸＯＤ阻害剤
は、高尿酸血症の改善、予防及び痛風の治療薬として広
く用いられてきた。しかし、現在実用化されているＸＯ
Ｄ阻害剤であるアロプリノールは、副作用、患者のアレ
ルギー、長期服用による薬効の減退などの問題がある。
このため、ＸＯＤ阻害作用を持つアロプリノール以外の
新規な物質が開発されることが望まれていた。

【０００３】本発明者等は、このような要請に応えるべ
く鋭意検討を重ねた結果、アロプリノールより強力なＸ
ＯＤ阻害活性を有する新規物質アカロンを見出し、この
物質に関する特許出願を行った（特開平５−３１０７４
２号、特開平５−３１７０７０号公報）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、前記
アカロンより更にＸＯＤ阻害活性が強い、新規物質を提
供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、新規なＸ
ＯＤ阻害物質探索のために種々の物質を検定した結果、
アグロバクテリウム属に属する微生物の生産する、新規
物質４−アミノ−６−ヒドロキシ−１Ｈ−ピラゾロ
〔３，４−ｄ〕ピリミジン−３−オンがＸＯＤに対し極
めて強い阻害活性を有することを見出し、この物質をヒ
ドロキシアカロンと命名し、本発明を完成するに至っ
た。

【０００６】すなわち、本発明は、次式（Ｉ）：

【０００７】

【化２】

【０００８】で表される新規物質ヒドロキシアカロンで
ある。また、本発明はヒドロキシアカロンを含有するこ
とを特徴とするＸＯＤ阻害剤である。更に、本発明は、
アグロバクテリウム属に属し、ヒドロキシアカロン生産
能を有する微生物を培地で培養し、培養物からヒドロキ
シアカロンを採取することを特徴とするヒドロキシアカ
ロンの製造方法である。

【０００９】なお、塩基配列決定法および抗ウイルス剤
として出願された特開昭６３−２７５５９８号公報に
は、請求の範囲記載の化合物を製造するための中間体が
一般式で記載されており、その一般式には本発明のヒド
ロキシアカロンも包含される。しかし、前記公報には、
ヒドロキシアカロン自体についての記載はなく、また、
その中間体がキサンチンオキシダーゼ阻害活性を有する
ことについても何ら記載はない。

【００１０】以下本発明を詳細に説明する。ヒドロキシ
アカロンの理化学的性質は以下の通りである。１．色性状：白色針状結晶２．分子量：１６７３．分子式：Ｃ₅Ｈ₅Ｎ₅Ｏ₂ ４．ＵＶスペクトル：λmax 298nm (pH12.6) ５．水素核磁気共鳴スペクトル（重ジメチルスルホキシ
ド中, pD12.6, δ ppm）：6.40(br s,2H),9.32(br s,1
H),11.00(br ,2H) ６．炭素核磁気共鳴スペクトル（重水中, pD12.6,δ p
pm）：106.2, 151.9, 161.6, 166.9, 167.9 ７．高分解能質量分析スペクトル，ネガティブＦＡＢ：
m/z 166.0339 （計算値：166.0345）Ｃ₅Ｈ₅Ｎ₅Ｏ₂ ヒドロキシアカロンは、アグロバクテリウム属に属し、
ヒドロキシアカロン生産能を有する微生物を培地で培養
し、その培養物から得ることができる。

【００１１】微生物としては、アグロバクテリウム属に
属し、ヒドロキシアカロン生産能を有するものであれ
ば、いずれの菌株でも用いることができる。また、これ
らの微生物の人工的変異方法、例えば紫外線照射、Ｘ線
照射、変異誘起剤処理など、あるいは自然発生による変
異株、また遺伝子操作、細胞融合による変異株でもヒド
ロキシアカロンを生産するものであればいずれも本発明
に用いることができる。このようなヒドロキシアカロン
生産能を有する菌株を選定するには、試験例に示すよう
に菌体の培養物を取り出し、そのＸＯＤ阻害活性を測定
することにより行うことができる。ヒドロキシアカロン
生産菌株のうち、代表的な菌株としては、アグロバクテ
リウム・アウランティアカスN-81106 株を挙げることが
できる。

【００１２】アグロバクテリウム・アウランティスアカ
スN-81106 株の菌学的性質について以下に示す。（１）形態菌の形・大きさ：桿状、0.9 μm ×1.2 μm 運動性：あり鞭毛：周毛あり細胞の多形成：なし胞子の形成：なしグラム染色：陰性（２）各培地における生育状況肉汁寒天平板培養：非拡散性で光沢を有する、橙色の円
形コロニーを形成する。肉汁寒天斜面培養：非拡散性で光沢を有する、橙色の帯
状に生育する。肉汁液体培養：培地全体に均一に生育し、橙色を示す。肉汁ゼラチン穿刺培養：穿刺孔を中心に表面に生育す
る。（３）生理学的性質硝酸塩の還元：陽性脱窒反応：陰性インドールの生成：陰性クエン酸の利用：陰性色素の生成：脂溶性の赤橙色色素ウレアーゼ活性：陰性オキシダーゼ活性：陽性カタラーゼ活性：陽性 β−グルコシダーゼ活性（エスクリン分解性）：陽性 β−ガラクトシダーゼ活性：陽性生育の範囲：ｐＨ５〜９、温度10〜40℃ 酸素に対する態度：好気性海水耐性：陽性Ｏ−Ｆテスト：酸化糖類の同化能：陽性：Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクト
ース、Ｄ−フルクトース、乳糖、麦芽糖、ショ糖、グリ
コーゲン、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン陰性：Ｌ−アラビノース、Ｄ−マンニトール、イノシト
ール、Ｌ−ラムノース、Ｄ−ソルビトール有機酸の同化能：陽性：乳酸塩陰性：クエン酸塩、リンゴ酸塩、グルコン酸塩、カプリ
ン酸塩、コハク酸塩、アジピン酸塩他の有機物の資化能陽性：イノシン、ウリジン、グルコース−１−リン酸、
グルコース−６−リン酸陰性：ゼラチン、Ｌ−アルギニン、ＤＮＡ、カゼインＧ＋Ｃ含量 67.4％ユビキノンの型Ｑ−10 以上の菌学的性質をバージーズ・マニュアル・オブ・シ
ステマチック・バクテリオロジーにもとづき検索し、本
菌株をアグロバクテリウム・アウランティアカスに属す
るものと同定した。また、本菌株は、工業技術院生命工
学工業技術研究所にFERM P-14023号として寄託されてい
る（原寄託日：平成5 年12月16日）。

【００１３】まず、本発明の微生物の培養法について述
べる。培養には、アグロバクテリウム属に属する微生物
に常用される培養法を用いることができる。培地として
は資化可能な炭素源、窒素源、無機物および必要な生
育、生産促進物質を程よく含有する培地であれば、合成
培地、天然培地いずれでも使用可能である。炭素源とし
ては、グルコース、澱粉、デキストリン、マンノース、
フラクトース、シュクロース、ラクトース、キシロー
ス、アラビノース、マンニトール、糖蜜などを単独また
は組合せて用いられる。更に、菌の資化能によっては炭
化水素、アルコール類、有機酸なども用いられる。窒素
源としては塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸
ナトリウム、尿素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、
乾燥酵母、コーン・スチーブ・リカー、大豆粉、カザミ
ノ酸などが単独または組合わせて用いられる。そのほ
か、食塩、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カル
シウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウ
ム、硫酸第一鉄、塩化カルシウム、硫酸マンガン、硫酸
亜鉛、硫酸銅などの無機塩類や海水を必要に応じて加え
る。更に使用菌の生育やヒドロキシアカロンの生産を促
進する微量成分を適当に添加することができる。

【００１４】培養法としては、一般の培養方法が用いら
れるが、液体培養法、とくに深部通気攪拌培養法がもっ
とも適している。培養温度は16〜37℃、特に22〜30℃が
適当であり、培養中の培地のpHはアンモニア水や炭酸ア
ンモニウム溶液、塩酸溶液などを添加して、4〜10、特
に6 〜8 に維持することが望ましい。液体培養で通常1
〜8 日培養を行うと、目的物質のヒドロキシアカロンが
菌体外に生成される。培養物中の生成量が最大に達した
ときに培養を停止する。

【００１５】培養物からのヒドロキシアカロンの分離、
精製は、微生物代謝生産物をその培養物から単離精製す
るために常用される方法に従って行われる。例えば培養
物を濾過により培養濾液と菌体に分け、培養濾液の脂溶
性画分を有機溶剤（例えば、ヘキサン、ベンゼン、クロ
ロホルム、アセトン、エーテル、酢酸エチル等）で取り
除く。ついで、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾
過、逆相カラムクロマトグラフィー等でヒドロキシアカ
ロンを分離、精製する。

【００１６】ヒドロキシアカロンを痛風薬等の医薬とし
て製剤するには周知の方法を用いることができ、有効成
分であるヒドロキシアカロンに賦形剤を加えて製剤する
のが好ましい。例えば、固体組成物を調製する場合タル
ク、ステアリン酸マグネシウム、硫酸カルシウム、スタ
ーチ、ラクトース、メチルセルロース等の賦形剤または
担体と混合する。流体組成物を調製するには、砂糖、芳
香フレーバー剤および保存剤等とともに水性ビヒクルに
溶解してシロップとする。また剤形および投与形態とし
ては、周知である個々の適用形態を用いて行うことがで
き、例えばヒドロキシアカロンの適量を含有する錠剤、
カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、点眼剤、座薬、エア
ロゾル、エマルション、液剤、懸濁剤等のごとき適用形
態に処方できる。製剤全体におけるヒドロキシアカロン
の含有量は、特に限定されず広範囲に選択できるが、通
常0.１から70重量％にするのが好ましい。投与方法は、
限定されるものではなく例えば、経口投与、非経口投
与、局所投与、経直腸投与、吸入投与等の方法を用いる
ことができる。臨床投与量は用法、患者の年齢、性別そ
の他の条件、疾患の程度等により便宜選択されるが、通
常ヒドロキシアカロンの量は一日当たり体重１kg当たり
0.１〜200mg の範囲であり、通常１日１〜５回投与する
のが好ましい。

【００１７】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳細に説明
するが、本発明はこれに限定されるものではない。〔実施例１〕ペプトン10g/L 、酵母エキス2g/L、グルコ
ース4g/L、リン酸第二鉄0.01g/L 、天然海水1000mlの組
成を有する前培養培地（殺菌前pH7.5 ）200ml を500ml
フラスコに加え、種菌としてアグロバクテリウム・アウ
ランティアカスN-81106 株を植菌し、25℃、72時間培養
した。このようにして得られた前培養液を2000L 容量の
発酵槽中の上記組成と同一組成の培地1000L に5%v/v の
割合で植菌し、25℃で通気攪拌方式（回転数100rpm、通
気量0.7vvm）により48時間培養を行った。

【００１８】得られた培養液1000L をウェストファリア
遠心分離器で遠心分離し、培養上清を得た。上清を2.5
倍に希釈後、DIAION SK104(H⁺) （三菱化成社製）を充
填したカラム50L に付し、水洗後、2Nアンモニア水200L
で溶出した。溶出した活性画分を薄膜式濃縮機（大川原
製作所社製）を用いて1Lまで濃縮し、ODS カラムクロマ
ト（YMC-AQ-50 ワイエムシイ社製）に付した。次いで、
イオン交換水を用いて展開し、6Lずつ分取した。阻害活
性のあったフラクション5 〜8 を500ml まで濃縮後、10
mM酢酸アンモニウム溶液（pH 8.5）で平衡化したゲル濾
過カラム（Sephadex G-25 、ファルマシア社製) を充填
したカラムに付し、同溶液を用いて展開して10mlずつ分
取した。Sephadex G-25 によるゲル濾過の活性画分
（フラクション 46 〜60）を集め、減圧濃縮により50ml
とし、5 ℃で一晩放置した。生じた白色沈殿をイオン交
換水で洗浄後、真空乾燥機で40℃、16時間乾燥した。そ
の結果、ヒドロキシアカロン159mg を得た。

【００１９】このようにして精製したヒドロキシアカロ
ンの水素核磁気スペクトル、炭素核磁気スペクトル、質
量分析スペクトルは前記理化学的性質に示した通りであ
る。〔実施例２〕ヒドロキシアカロン、アカロンおよびアロ
プリノールのＸＯＤ阻害活性について以下のように測定
した。

【００２０】最初に、以下のように試料溶液、酵素溶
液、基質溶液を調製した。試料溶液：微生物を常法により培養後、培養物を遠心分
離し、その上清を試料溶液とした。酵素溶液：牛ミルク由来ＸＯＤ(6.6units/ml)100μl を
50mMリン酸緩衝液(pH7.5)2.9mlに溶解し、酵素溶液とし
た。

【００２１】基質溶液：キサンチンナトリウム4.0mg を
50mMリン酸緩衝液(pH7.5)200mlに溶解し、基質溶液とし
た。次に、石英セル中で試料溶液 0.5ml、リン酸緩衝液0.9m
l 、酵素溶液0.1ml を25℃で15分間インキュベートした
後、この溶液の入った石英セルを恒温セルホルダー付き
分光光度計（島津製作所社製）にセットし、予め25℃に
インキュベートしておいた基質溶液1.5ml を加え、スタ
ーラーで攪拌しながら、25℃でタイムスキャンし、30秒
から90秒の290nm の吸光度の傾きを求めた。

【００２２】これらの測定値を用いて次式によりＸＯＤ
の阻害率を求めた。この方法により阻害率が０％より大きい菌株をＸＯＤ阻
害活性がある菌株、すなわちヒドロキシアカロン生産能
を有する菌株とした。またこの方法によりアロプリノー
ル、アカロン及びヒドロキシアカロンが５０％阻害率と
なる濃度を求めた。その結果、アロプリノールは4.0μM
、アカロンは2.0 μM 、ヒドロキシアカロンは1.4 μM
であった。即ち、ヒドロキシアカロンは、アロプリノ
ールよりも約３倍強い阻害活性を示し、また、アカロン
よりも阻害活性が強かった。〔実施例３〕以下の処方により、ヒドロキシアカロンを
有効成分とする錠剤を調製した。

【００２３】

【００２４】

【発明の効果】本発明は、従来より知られているＸＯＤ
阻害物質よりも、更に強力な阻害活性を持つ新規物質ヒ
ドロキシアカロンを提供すると共に該物質を微生物を利
用して製造する方法をも提供する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者岩崎敏明静岡県駿東郡長泉町下土狩1188 協和醗酵工業株式会社医薬研究所内 (72)発明者北克則静岡県駿東郡長泉町下土狩1188 協和醗酵工業株式会社医薬研究所内 (72)発明者見原明静岡県駿東郡長泉町下土狩1188 協和醗酵工業株式会社医薬研究所内 (72)発明者山口和夫静岡県駿東郡長泉町下土狩1188 協和醗酵工業株式会社医薬研究所内 (72)発明者安澤亨静岡県駿東郡長泉町下土狩1188 協和醗酵工業株式会社医薬研究所内 (72)発明者中村昭正静岡県駿東郡長泉町下土狩1188 協和醗酵工業株式会社医薬研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】次式（Ｉ）：【化１】で表される新規物質ヒドロキシアカロン。
【請求項２】ヒドロキシアカロンを有効成分として含
有することを特徴とするキサンチンオキシターゼ阻害
剤。
【請求項３】アグロバクテリウム属に属し、ヒドロキ
シアカロン生産能を有する微生物を培地で培養し、培養
物からヒドロキシアカロンを採取することを特徴とする
ヒドロキシアカロンの製造方法。