JPH02266262A - 細胞蛋白質の免疫検定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般に免疫検定法に関し、特に細胞培養基中で
増殖させた宿主細胞から得られる細胞蛋白質４測定する
のに用いられる免疫検定法に関する。宿主細胞は一般に
治療用に分離、精製された蛋白質をつくるのに使用され
てきた。治療用の蛋白質は一般に組換えＤＮＡ技術によ
り宿主細胞に組み込まれる。

これを要約すれば本発明は哺乳類の細胞培養基から精製
された生成物中に不純物として存在する細胞蛋白質の免
疫検定法に関する。哺乳類の細胞培養基には蛋白質を含
む培地を使用する必要があるから、この検定法において
は細胞蛋白質は認識するが培地蛋白質に対してはそうで
はないという特徴をもっていなければならない。これは
培地蛋白質に比べ抗血清をより選択的に細胞蛋白質に吸
着させることにより達成される。この検定の定量化は高
度の免疫原性をもっこ七が知られている精製された抗原
、即ちフィブロネクチンを使用することにより改善する
ことができる。

免疫検定は当業界では公知である。これらの検定におい
ては試料中の成る与えられた抗原の量を測定するために
抗体を使用する。サンドウィッチＥＬＩＳＡ法（酵素と
結合させる免疫吸着検定法）として一般に知られている
典型的な免疫検定の形式においては、検出の目的に酵素
と結合した抗体を使用する。ある形式においては、この
検出用の抗体を検出すべき抗原と結合させる。先ず「捕
獲」抗体を例えばプラスチックス板の凹みに被覆するこ
とにより固定する。次に未知量の抗原を含む試料を塗布
する。抗原は板の上で抗体に捕獲される。他の蛋白質お
よび他の材料がなくなるまで板を洗滌する。次に検出用
の抗体を塗布し、これを捕獲抗体に捕獲された抗原と結
合させる。この検出用の抗体は予め基質と反応したとき
に発色する化学標識、典型的には酵素とカップリングさ
せておく。

別法として検出用の抗体はビオチンとカップリングさせ
ることができ、酵素と複合化させたストレプタヴイディ
ンおよびアヴイディンを用いて抗体を検出する。次いで
複合体に結合した検出用の抗体の量を比色法により決定
する。

この形式のＥＬＩＳＡ法は、抗原が２枚の抗体のパンの
間に挟まれた１枚の肉に似ているので「サンドウィッチ
ＪＥＬＩＳＡ法と呼ばれる。この形式の検定では通常捕
獲抗体および検出抗体に同じ多クローン性抗血清を使用
する。単クローン性抗体は抗原の異なった部位と反応す
ることが見出だされている場合だけ、捕獲および検出抗
体の両方に使用される。

種々の酵素を用いる免疫検定法の総説はパルチン・オヴ
・ダヴリュー・エイチ・オー（Ｂｕｌｌ、　Ｗ、　Ｈ，
Ｏ。

）６３巻（４号）７９３〜８１１頁（１９８５）のカー
スタック（Ｋｕｒｓｔａｋ）の「酵素免疫検定法の進歩
、実験設計および解釈」と題する論文に記載されている
。組換えＤＮＡ産生物の製造に使用される免疫検定法の
特殊な例は、ジャーナル・オヴ・イムノロジカル・メソ
ッヅ（Ｊ、　　１ｍｍｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈｏｄｓ）９
７巻２１５〜２２０頁（１９８７）の７エリユア（Ｆｅ
ｒｒｕａ）等の「サンドウィッチ酵素免疫検定法による
ピコモル濃度のインターロイキン２の検出」と題する論
文に記載されている。

アニセッティ等はジャーナル・オヴ・イムノロジカル・
メソッヅ、９１巻２１３〜２２４頁（１９８６）の「人
の成長ホルモンから誘導される組換え体ＤＮＡ中の大腸
菌蛋白質」と題する論文において、人の組換え体成長ホ
ルモン中の大腸菌宿主細胞蛋白質の定量を行うためのＥ
ＬＩＳＡ検定法を報告している。これは免疫親和性を用
いて精製した多クローン性抗体を用いる多重抗原免疫検
定法である。大腸菌は蛋白質を含む媒質中では増殖せず
、細胞ペーストから処理されるから、この論文にはこの
抗体から抗培地抗体を除去すべきか、または除去できる
かについて何の示唆もなされていない。この論文に記載
された一連の実験において、抗血清を参照大腸菌蛋白質
を含むクロマトグラフ・カラムに通して精製する。この
検定には固定された大腸菌蛋白質に結合した抗体のみが
使用されている。

リューカス（Ｌｕｃａｓ）等はジャーナル・オヴ・イム
ノロジカル・メソッヅ、１１３巻１１３〜１２２（１９
８８）の［組換え体蛋白質の免疫親和性による精製の際
に生じる不純物を決定するための酵素結合免疫吸着検定
法（ＥＬＩＳＡ法）」という論文において、ｒＤＮＡ中
の不純物蛋白質および哺乳類動物の細胞培養基中に生じ
る単クローン性抗体生成物を決定するＥＬＩＳＡ検定法
を記載している。しかしこれらの検定法は成る特定の蛋
白質、例えば牛の胎児の血清中に含まれる牛のＩｇＧに
対する直接検定法である。このＩｇＧに対して特異な抗
体が使用される。

成る種の検定においては抗体除去を行った抗血清が使用
ている。ランドブラッド（Ｌｕｎｄｂ　１ａｄ）等はＶ
ｏｘ、　Ｓａｎｇ、５巻１２２〜１３７頁（１９６０）
の「熱処理されたヒトの血漿蛋白質の抗原性」と題する
論文において、オフテルロニー検定における特異な抗原
の存否を決定するために一般的な意味で抗体除去を行っ
た抗血清を使用することを記載している。

ジェー・ジー・ギッディングズ（Ｊ、　Ｇ、　Ｇｉｄｄ
ｉｎｇｓ）は血液学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｈ
ａｅｍａｔｏｌｏｇｙ）、第５巻、第４章の「因子■お
よび１ｘの精製並びに特異な抗血清の生成」の中で因子
■：ＲＡｇの不足した血漿を用い因子■：ＲＡｇに対す
る抗血清を吸着させることを記載している。これは因子
■：ＲＡｇに特異な抗血清をつくために行われた。

他の検定法においても抗体除去が行われた抗血清がすで
に使用されている。例えばヴエン（Ｖｅｎｎ）等のジャ
ーナル・オヴ・イムノロジカル・メソッヅ、１０２巻１
９５〜２０４頁のｒｌｇＧ−抗１ｇＧリューマドイド因
子を生成する溶血プラーク検定の限界」の論文参照のこ
と。

本発明は哺乳類の細胞培養基中の生成物を汚染する宿主
細胞蛋白質の測定法に関する。哺乳類の細胞培養基には
牛の胎児の血清のような蛋白質を含む培地、または本発
明に関連して用いられるような例えばヒトの蛋白質、例
えばヒトの血清アルブミンを含む培地を使用する必要が
ある。特に哺乳類の宿主細胞、例えば嬰児のハムスター
の腎臓（ＢＨＫ）の細胞をヒトまたは動物の血漿蛋白質
を含む培地中で増殖させなければならない。

哺乳類の宿主細胞蛋白質は動物に免疫を与えて抗血清を
つくり、これを所望の生成物を汚染する宿主細胞蛋白質
の免疫検定に使用することができる。この抗血清はまた
必ず培地蛋白質に対する抗体を含んでいる。この培地蛋
白質は動物で高度の免疫原性をもっているが、ヒトの培
地蛋白質の場合にはヒトに対する免疫原性はない。従っ
て汚染の原因となる宿主細胞蛋白質の検定を行う際に、
これらのヒトの培地蛋白質の測定を行うことは不必要で
あり、また望ましいことではない。

本発明によれば宿主細胞蛋白質に対する定量的で且つ培
地蛋白質が測定にかからない検定法が提供される。これ
は宿主細胞蛋白質および培地蛋白質の両方に対してつく
られた抗血清を固定された培地蛋白質に吸着させ、培地
蛋白質に対する抗体を抗血清から除去することにより行
われる。次にこの抗血清をサンドウィッチＥＬ　Ｉ　Ｓ
Ａ検定に使用する。抗血清は多クローン性抗体であり、
抗原混合物は複合体であるから、同じ抗血清を捕獲抗体
および検出抗体として使用することができる。

本発明方法においては、宿主細胞蛋白質を先ず培地蛋白
質から部分的に精製する。次いで標準的な方法でウサギ
の中でこの調製物に対する抗血清をつくる。固定された
免疫抗原を含むカラムを通してこの抗血清を免疫精製す
る。次にこの抗血清を細胞の増殖に使用されていない、
従って細胞蛋白質を含んでいない培地蛋白質の上に通し
て抗体除去を行う。この抗体除去を行った抗血清を用い
て宿主細胞蛋白質を定量する。この定量法の重要な点は
、成る種の宿主細胞蛋白質が他のものより免疫原性が大
きく、従って抗血清中での分析値が生成調製物を汚染す
る恐れのある宿主細胞蛋白質中での存在量を正しくは反
映していないということを認識することである。

例えばフィブロネクチンは測定された宿主細胞蛋白質の
僅かの部分にしか対応しないが、宿主細胞蛋白質に対す
る抗血清はこの蛋白質に対する抗体の高い値を示すこと
がある。この場合には宿主細胞蛋白質を少量含みその宿
主細胞蛋白質の僅かの部分がフィブロネクチンである高
度に精製された調製物は、フィブロネクチンが強い免疫
応答性をもっているため全宿主細胞蛋白質よりも遥かに
高い値を示すであろう。本発明によればこの効果を修正
する方法が提供される。

本発明の好適具体化例にはネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）
誌、３１２巻３２６〜３３０頁（１９８４年）記載のよ
うに因子■に対する遺伝子で形質転換した嬰児のハムス
ターの腎臓細胞（ＢＨＫ−２１）が使用される。

実施例１：　ＤＥＡＥ溶出抗原の調製 組換え体因子■（ｒＦ■）の大量生産に使用するための
細胞は、適当な当該生物地区管轄官庁（Ｏｆｆｉｃｅ　
ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ　Ｐｏ１ｎｔｓ　ｔｏ　Ｃｏ
ｎ５ｉｄｅｒ）によりつくられた主細胞バンクから選ん
だ。ダルベツコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）法で変性したイー
グル（Ｅａｇｌｅ）およびハム（Ｈａｍ）のＦ１２基礎
培地に、透析した牛の胎児の血清（ＦＢＳ）７．５％お
よびメントレキセートＩＯμモルを加えた培地の中に凍
結したアンプルから細胞を展開した。２週間後、または
３〜４継代の後、３〜４日（ｌ継代）間細胞を増殖培地
に移す。この培地はＤＭ／Ｆ　１２および７％のＦＢＳ
を含んでいる。次に４ｇ／Ｑの血漿蛋白質画分［カッタ
ー・プラズマネート［Ｆ］（Ｃｕｔｔｅｒ　ＰＩａｓｍ
ａｎａｔｅ）］、５ｍｇＩＱのインシュリンおよび２．
５ｍｇ／Ｑのトランスフェリンを含む培地に移す。回転
層から４８時間の間隔で試料を採取する。

４個の採取試料をジャーナル・オヴ・バイオロジカル・
ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）２５２
巻３２８５−３２９０頁（１９８７）記載のイートン（
Ｅａｔｏｎ）等の方法で個別的に部分精製を行った（Ｄ
ＥＡＥ溶出段階に用いるため）。

実施例２：免疫精製した抗血清の調製 ＤＥＡＥ溶出液（実施例１で得られたもの、溶出緩衝液
：　０．０１モルのＣａＣＩ　２．５％のグリセリン、
０．０２モルのイミダゾール、０．２５モルのＮａＣＩ
、ｐＨ７，０）を用いて１２匹のウサギに免疫を付与し
た（回転瓶から採取された採取試料４種をそれぞれ３匹
ずつに投与）。最初の注射は完全７０インドアジユバン
ト中に１１００ｔ１の蛋白質（１％Ｅ　Ａ、、。＝１０
．０を用いＡ、。に関し）を含む液を用いて行った。５
週間の間、１週間間隔で追加免疫を行い、６週間目以降
採血を行っＩこ　。

これらの採取物は４８時間間隔で採取した。生成実験（
ＰＲ）２２からの４回目の採取では因子■の濃度が非常
に低かったので、前の実験ＰＲ１７からの４回目の採取
物を用いた。各採取物の因子■の濃度、Ａ２ａＯによる
蛋白質およびハムスターのフィブロネクチン濃度（検定
方法については後の説明参照のこと）を下記第１表に示
す。

第１表 ＰＲ２２Ｈｌ　　　２４．４μ／ｄ２　　　１．７２　
　　４．９　　　　　　３ｐＲ２２Ｈｌ　　２７．６μ
／ｍＱ　　　　１．２２　　　６．６　　　　　　３Ｐ
Ｒ２２Ｉ３　　１６．０μ／ｍｆｆ　　　　１．１７　
　　２１．２　　　　　　３ＰＲ１７Ｈ４２３，２μ／
ｄ　　　　１．３２　　　４３．６　　　　　　３次い
で下記のようにしてウサギから抗血清を採取した。１２
匹の各ウサギから採取した等容積のウサギの血清を集め
、−緒にし、ジャーナル・才ヴ・イムノロジカル・メソ
ッヅ、９６巻２７１〜２７８頁（１９８７）のマッキニ
−（ＭｃＫ　１ｎｎｅｙ）とパーキンスン（Ｐａｒｋｉ
ｎｓｏｎ）の論文記載の方法でカプリル酸を用いて沈澱
させる。これにさらに４５％の硫酸アンモニウムを加え
て沈澱させ、０．０５モルのトリス（Ｔｒｉｓ）、０．
０５モルのＮａＣｌおよび帆０２％のＮａＮ　３の中へ
と透析を行い、第１表に示したＤＥＡＥ溶出物中に存在
する蛋白質をカップリングさせた一定の細孔をもつガラ
ス［シグマ（Ｓｉｇｍａ　ＣＰＧ）］の樹脂に塗布する
。上記４種の採取物の等容混合物中に存在する蛋白質は
ジャーナル・オヴ・クロマトグラフィー３０３巻２２５
〜２２８頁（１９８４）のニス・ケー・ロイ（Ｓ、　Ｋ
、　Ｒｏｙ）、デイ−・ヴイー・ウェーバ−（Ｄ、　Ｖ
、　Ｗｅｂｅｒ）およびダヴリュー・シー−７ツグレガ
ー（Ｗ、　Ｃ，ｌＪｃＧｒｅｇｏｒ）の論文記載の方法
でカップリングさせた。抗体の免疫精製を行うために樹
脂１ｍ＜１当たり４−１５ｍｇの蛋白質（Ａ２．。

単位）を含む１２ｍｆ２のカラムを用いた。０．２５モ
ルのグリシン−〇ＣＩ、　ｐＨ＝２．９を用い抗体（固
定されたＤＥＡＥ溶出蛋白質に結合したもの）を溶出さ
せ、これをｐＨ８，５の１モルのトリス緩衝液１／１０
容に採り、ｐＨの中和を行った。

実施例３：精製した抗血清の抗体除去処理培地蛋白質お
よび因子■：Ｃに対する反応性をもった抗体を除去する
のに必要であったため、製造培地からつくられた溶出物
中に存在する蛋白質をＤＥＡＥ溶出物、Ｉ４１１１．６
脂２１６単位、１６ｇ　ＣＰＧ、　７．２Ｂ／ｍＱとし
てカップリン効率９２．８％でカップリングさせ（８１
脂１８ｍＱ）、またコート（ｌｏａｔｅ）■ＡＨＦ濃縮
粉末４　、７ｍｇ／ｒｎＱから３ｍ＋２のカラムを用い
て得られるＤＥＡＥ溶出物としてカップリング効率９６
．３％においてカップリングさせた。製造培地は細胞の
培養に使用したものではなく、従って実施例１記載の組
成物によるものであった。

これらのＤＥＡＥ溶出物は実施例１記載の方法によりつ
くられたものである。−緒にした樹脂を混合し、ＤＥＡ
Ｅ溶出物として、即ち部分精製された１３ＯＡ２、。単
位の培地蛋白質および１４Ａｚａｏ単位の血漿から誘導
された因子■を含む２１ｍＱの単一カラムの中に充填す
る。

１回当たり１０ｍｇのＩｇＧの割合で実施例２の免疫精
製された抗血清を除去処理用の樹脂に通し、これを−緒
にして濃縮し、再び樹脂に通して４回繰り返す。

因子■の除去を測定するために、各除去処理段階におい
てＰＢＳ／ＫＣＩ緩衝液（１４当たりＮａＣｌ　８ｇＳ
ＮａｇＨＰＯ４１，０５ｇ、　ＮａＨ２ＰＯｔ　０．２
ｇ、　ＫＣＩ　Ｏ，２ｇ、　ｐＨ＝７．３）中に希釈す
ることによりＮＵＮＣマイクロタイターの各凹みにｌμ
ｇ／ｍ（２（１００μＱ）の割合で被覆する。洗滌を行
った後、免疫精製したｒＦ■［デイ−・エル・イートン
（Ｄ、　Ｌ、　Ｅａｉｏｎ等のジャーナル・オヴ・バイ
オロジカル・ケミストリー、２６２巻３２８５〜３２９
０頁（１９８７）参照Ｊをマイクロタイターの凹みに加
える（緩衝液：　０．０２モルのトリス、０．５モルの
ＮａＣ１，０，５％のトウィーン（Ｔｖｅｅｎ）２０．
０．０１％のチメロサル、ｐｕ＝８．０）。抗体と結合
した因子■の検出は、基質として３．３′−テトラメチ
ルベンチジンを用い西洋ワサビのパーオキシダーゼと複
合化させた因子■：ＣのＬ鎖に対する単クローン性抗体
であるＣ７Ｆ７（上記ネイチャー誌の論文参照）によっ
て行った。

因子■：Ｃに対する抗体が生じ次いでこれが除去される
状況は第２表に示されている。

第２表 ２．５　　　１．２０３　　０．２７６　　０．２４２
　　０．１？５１．２５　　　０．６８２　　　０．１
４７　　　０．１４１　　　０．０８７０．６１　　　
０．３８９　　０．０９５　　　０．０７９　　　０．
０４５０．３１　　０．２２０　　０．０４９　　０．
０３６　　０．０２１第２表の各行は免疫親和性を用い
て精製した抗血清（ＩＡＰ）を種々の濃度に希釈したも
のに対応している。第１欄は原料中の因子■活性の単位
を示している。’Ａ４５Ｏ値／２０分」の標題をもつ欄
はＣ７Ｆ７により検出されたＩＡＰと結合したｒＦ■の
量を示している。従って順次除去処理が行われるにつれ
た抗血清中の抗因子■の濃度が減少している。因子■は
宿主細胞蛋白質免疫検定において際表処理を行われたＩ
ＡＰ自身によっては検出されない。

実施例４：フィブロネクチンの存在 検定基準として使用される一緒にしたＤＥＡＥ溶出液中
に存在するフィブロネクチンをどのように検出するかを
次に示す。

培養基中のＢＨＫ細胞はフィブロネクチンを分泌するこ
とが知られている［ケイ・セキグチ（Ｋ、　Ｓｅｋｉｇ
ｕｃｈｉ）、エム・フクダ（Ｍ、　Ｆｕｋｕｄａ）およ
びエスリ）フモリ（Ｓ、　Ｈａｋｏｍｏｒｉ）のジャー
ナル・オヴ・バイオロジカル・ケミストリー、２５６巻
６４５２〜６４６２頁（１９８１）の論文参照１゜上記
実施例２のウサギに免疫を付与するのに使用したＤＥＡ
Ｅ溶出液を還元ゲル（ＳＯ５／ＰＡＧＥ）中でウェスタ
ーン法によって検査した場合、約２００Ｋｄにおいて主
バンドが見られる。ＤＥＡＥ溶出液として処理された対
照の培地蛋白質はこのようなバンドを示さない。ゲル濾
過セファロースの上を通すとゲルおよびスポットの中に
見られるようにこのバンドは消失する（データは示さず
）。

ゲル濾過セファロース・クロマトグラフはＢＨＫ細胞フ
ィブロネクチンを精製するのに使用されてきた。前記セ
キグチなどの論文参照。前述のことからハムスターのフ
ィブロネクチンは細胞培養液からのＤＥＡＥ溶出液中に
存在すると結論される。

第１図はプラスカル（Ｐｌｕｓｋａｌ）等のバイオテク
ニックス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、４巻２７２
〜２８３頁（１９８６）記載の方法ｌ：よって行ったウ
ェスターン法の結果を示す。中間の純度をもつＤＥＡＥ
溶出液混合物に対するレーンｌおよび対照の培地に対す
るレーン２はル−ン当たり５μｇの全蛋白質を用いて実
験を行った結果である。実施例３でつくられたような免
疫精製され抗培地反応性を除去した抗Ｂ）ＩＫ蛋白質抗
体を用いてゲル上のスポットの発現を行った。対照の培
地に対するレーンにバンドは見られなかった。

分子量約２００ｋｄの所のバンドは採取を重ねるにつれ
て増加することが観測された（データは示さない）。

実施例５：検定の定量化 本実施例はこの検定においてＢＨＫ蛋白質の定量を行う
のに基準をどのようにして用いるかを示す。

先ずセキグチ等のゲル濾過セファロース法（前記）によ
りつくられた精製ハムスター・フィブロネクチンはＢＨ
Ｋ蛋白質ＥＬＩＳＡ検定において強いシグナルを示す。

フィブロネクチンは実施例１に実質的に記載した方法で
増殖させたｒＦ■で形質転換した細胞から精製したが、
この際懸濁培養基を用いた。

ゲル濾過クロマトグラフ法を２段階行い細胞蛋白質を分
離した。実施例２記載のようにこの５０μｇの精製フィ
ブロネクチンを免疫剤として用いて抗体をつくった。こ
れらの抗体を使用してハムスター・フィブロネクチンの
定量ＥＬＩＳＡ検定を行っ藝た。

第２Ｂ図はハムスターのフィブロネクチンＥＬ　Ｉ　Ｓ
Ａ検定における投与応答曲線を示す。精製したハムスタ
ーのフィブロネクチンおよび前記のＢＨＫ蛋白質／培地
蛋白質混合物（即ちＤＥＡＥ溶出液）の両方を異なった
蛋白質濃度において検定し、蛋白質濃度（横軸）はブラ
ッド７オード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）蛋白質試験によって
決定した。＾、ｓ０値はＥＬ　Ｉ　ＳＡ検定のシグナル
を表す。ゲル濾過セファロース・カラム（ＲＩＯＧＳ−
ＦＴ）を通すとシグナルは９６．５％減少する。これは
実質的な量のフィブロネクチンが除去されたことを示す
。このことは黒丸の点が白丸の点に対して移動すること
により示される。第２Ａ図は同様にＢＨＫ蛋白質ＥＬＩ
ＳＡ検定における投与応答曲線を示す。

精製フィブロネクチンはこの濃度のＢＨＫ蛋白質抗体と
結合し、ハムスターのフィブロネクチンに特異な抗体に
関する第２Ａ図に見られるのと極めて類似しｔ；投与応
答曲線を示す。ＢＨＫ／培地蛋白質混合物（ＲＩＯＤＥ
ＡＥ）Ｉ製物も同様に結合してハムスターのフィブロネ
クチン抗体に見られるような曲線になるが、ゲル濾過セ
ファロース・カラムに通してフィブロネクチンを除去す
ることによるシグナルの減少はフィブロネクチンＥＬＩ
ＳＡ検定における９６゜５％ではなく　５９．６％に過
ぎない。このことはＢＨＫ蛋白質ＥＬＩＳＡ検定におい
てフィブロネクチン以外の抗原も測定されることを示し
ている。

ゲル濾過セファロース・カラムからのＢＨＫ／培地蛋白
質混合物（ＲＩＯＤＥＡＥ溶出液）の蛋白質溶出曲線は
画分３の周りに１個のシグナル・ピークを与える。

４モルの尿素による溶出ピークは純粋なハムスターのフ
ィブロネクチンを含むことが示された（培地蛋白質はこ
のカラムに結合しない）。このピークは一緒にされた抗
原混合物中に存在する全蛋白質の２％をなしている（多
数の実験の平均値、Ａ２．。

で表す）。しかしＢＨＫ蛋白質のＥＬ　Ｉ　ＳＡ活性の
７５％はこのピークの中に存在することが見出だされた
。

ＥＬＩＳＡ活性の７５％は２％の蛋白質によるものであ
るとされるから、検定標準中の全ＢＨＫ蛋白質濃度は２
８．３μｇ／＋ｏＱであると決定された。例えばもし標
準中の全蛋白質濃度＝１．０６ｍｇ＃ｏ１２標準中に存
在するフィブロネクチンの量−２％フィブロネクチンに
由来する検定シグナルの割合・７５％ であるとすると、 １．０６ｍｇ／ｍ＜２　Ｘ　Ｏ，０２０＋　０．７５　
＝　２８．３μｇ／ｍＱこの考え方は非フィブロネクチ
ン活性の２５％がＥＬＩｓＡ検定による比例シグナルを
与えることを仮定している。

実施例６：検定の応用 本実施例は生成物を生成する種々の段階において細胞蛋
白質の不純物を監視する例を示めす。因子■の生成の途
中の３段階におけるＢＨＫ蛋白質のデータを第３表に示
す。

第３表 （１）ＤＥＡＥ　　　　　　　　　４２００　　　３３
４２　　　２９４０（２）Ｃ７Ｆ７　　　　　　　　　
　１．６　　　２　　　　　２．３（３）　ＩＦ／ＤＦ
　Ｐｏｏｌ　　　　　０．５２　　１　　　０．６３Ｂ
ＨＫ値はｎｇ／ｍＱ単位で与える。第３表は精製工程で
逐次行われる（任意に）選ばれた３段階を通じＢＨＫ蛋
白質が減少していることを示している。

因子■の他の調製物は（第３図参照）、種々の精製段階
を経るに従い平行な投与応答曲線が得られることを示し
ている。このことはＥＬＩＳＡ検定において、非フィブ
ロネクチン性の不純物もフィブロネクチンと同様な応答
を示すことを示している。

第３図の二つの曲線のデータ点は試料を希釈して得られ
た。Ｃ７Ｆ７材料も他のゲル濾過セファロース・カラム
を通すことによりフィブロネクチンが除去されている。

以上上記実施例において本発明の好適具体化例を説明し
た。この具体化例は因子■遺伝子で形質転換されたＢＨ
Ｋ細胞の哺乳類細胞培養基中でＢＨＫ蛋白質を検出する
方法に関するものである。ここで培養は主培地蛋白質と
してプラズマネート■を含む培地中で行われる。プラズ
マネート■はヒトの血漿の画分Ｖから誘導され通常の血
清アルブミンを約８５％含んでいる。本発明の範囲内に
おいて種々の変形を行うことができる。所望の生成物に
対する多くの可能な遺伝子コードで形質転換された多く
の他の細胞系を多くの培地組成物の中で増殖させること
ができる。種々の免疫検定の形式を用いることができる
。種々の「標識」、例えばビオチンおよび西洋ワサビの
パーオキシダーゼを検出抗体と結合させることができる
。

従って本発明は添付特許請求の範囲記載の事項以外上記
特定の具体化例に限定されるものではない。

本発明の主な特徴及び態様は次の通りである。

１、　（ａ）培地蛋白質から細胞蛋白質を分離し、（ｂ
）工程（ａ）から得られる細胞蛋白質に対する抗血清を
つくり、 （ｃ）工程（ｂ）の抗血清から培地蛋白質に対する抗体
を除去した抗血清をつくり、 （ｄ）工程（ｃ）の抗体除去が行われた抗血清を細胞蛋
白質の公知希釈剤と反応させて細胞蛋白質の定量検定を
行う培地蛋白質中で増殖させた哺乳類細胞から誘導され
る蛋白質調製物中の細胞蛋白質を測定する方法。

２、該除去処理は基質上に固定された培地組成物上に該
抗血清を通すことにより行われる上記第１項記載の方法
。

３、該定量化においては細胞蛋白質中の特定の抗原の定
量濃度を決定する段階を含んでいる上記第１項記載の方
法。

４、該特定の抗原は細胞フィブロネクチンである上記第
３項記載の方法。

５、該反応をＥＬ　Ｉ　ＳＡ検定システムにおいて行う
上記第１項記載の方法。

６、哺乳類の細胞蛋白質に結合する検出抗体、ラベルさ
れた捕獲抗体、定量的検出装置から成り、該検出抗体は
培地蛋白質を除去された細胞蛋白質に対する抗体から成
る免疫検定システム。

７、該検出抗体と該捕獲抗体とが同一である上記第６項
記載の免疫検定システム。

８、該捕獲抗体を標識体に結合させ、該検出装置中にお
いて発色反応を行わせる上記第６項記載の免疫検定シス
テム。

【図面の簡単な説明】

第１図は宿主細胞蛋白質と培地蛋白質との部分的に精製
した混合物を抗宿主細胞抗体を用いてスポットの発現を
行うウェスターン検定の結果を示し、第２Ａ図はフィブ
ロネクチンおよび宿主細胞蛋白質と抗ＢＨＫ抗体との結
合を示すグラフであり、第２Ｂ図はフィブロネクチンお
よび宿主細胞蛋白質と抗フィブロネクチン抗体との結合
を示すグラフであり、第３図は精製工程の二つの異なっ
た段階における宿主細胞蛋白質の投与応答曲線である。 ７７！）量、□。−３ ＝　１１６ ― ＩｍＩｓ　　　　−３２ レーン斗 蓼１　図 Ａ４５０ｎｍ Ａ４５０ｎｍ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）培地蛋白質から細胞蛋白質を分離し、（ｂ）
   工程（ａ）から得られる細胞蛋白質に対する抗血清をつ
   くり、 （ｃ）工程（ｂ）の抗血清から培地蛋白質に対する抗体
   を除去した抗血清をつくり、 （ｄ）工程（ｃ）の抗体除去が行われた抗血清を細胞蛋
   白質の公知希釈剤と反応させて細胞蛋白質の定量検定を
   行うことを特徴とする培地蛋白質中で増殖させた哺乳類
   細胞から誘導される蛋白質調製物中の細胞蛋白質を測定
   する方法。 ２、哺乳類の細胞蛋白質に結合する検出抗体、ラベルさ
   れた捕獲抗体、定量的検出装置から成り、該検出抗体は
   培地蛋白質を除去された細胞蛋白質に対する抗体から成
   ることを特徴とする免疫検定システム。