JPH02268200A - 新規な蛋白質因子ｓｋ―ｇおよびそれを有効成分とする細胞増殖剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 皮呈上皇剋朋分互 本発明は新規な蛋白質因子（ＳＫ−Ｇと仮称）およびそ
れを有効成分とする細胞増殖剤に関する。

この蛋白質因子は細胞増殖作用を有するので、無血清細
胞培養のための血清代替物質として無血清培地成分に利
用でき、また、細胞増殖による組織機能の回復が期待で
きることから、治療薬としての利用が考えられる。

ｌ米ｑ返止 従来、ＤＮＡ合成促進作用及び細胞増殖促進作用を有す
る物質としてＥ　Ｇ　Ｆ　（Ｅｐｉｄｅｒｓ＋ａｌ　Ｇ
ｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ）　、Ｉ　Ｇ　Ｆ　Ｉ　（Ｉｎ
ｓｕｌｉｎ−１ｉｋｅ　Ｇｒｏ＠ｔｈＦａｃｔｏｒ　Ｉ
　）、Ｉ　Ｇ　Ｆ　ＩＩ　（Ｉｎｓｕｌｉｎ−１ｉｋｅ
　ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ　Ｕ　）　、Ｐ　Ｄ　Ｇ　
Ｆ　（Ｐｌａｔｅｌｅｔ　Ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｇｒｏｗｔ
ｈＦａｃｔｏｒ）　、ａｃｉｄｉｃＦ　Ｇ　Ｆ　（Ｆｉ
ｂｒｏｂｌａｓｔ　ＧｌｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ）　、ｂ
ａｓｉｃ　Ｆ　Ｇ　Ｆ　（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　Ｇｒ
ｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ）　、Ｐ　Ｄ　−Ｅ　ＣＧ　Ｆ　
（Ｐｌａｔｅｌｅｔ　ＤｅｒｉｖｅｄＥｎｄｏｔｈｅｒ
ｉａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ）　、
Ｔ　Ｇ　Ｆ　−ａ（Ｔｒａｎｓｆｏｒｖ＋ｉｎｇ　　　
Ｇｒｏｗｔｈ　　Ｆａｃｔｏｒ）　　、　ＴＧ　　Ｆ　
−β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａ
ｃｔｏｒ）　　、ＧＨ（ＧｒｏｗｔｈＨｏｒｍｏｎｅ）
、Ｎ　Ｇ　Ｆ　（Ｎｅｒｖｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔ
ｏｒ）、レノトロピン（Ｒｅｎｏｔｒｏｐｉｎ　）など
が知られている。

一方、付着依存性細胞を用いて有用物質の生産を行なわ
せるための大量培養法において、例えば動物血清を培地
に添加した血清培地を用いているが、血清のロフト間の
品質の同一性、血清からの混入成分の、除去等の問題が
あり、無血清培養に適する適切な細胞株の樹立を必要と
した。

この目的のために、ヒト腎癌組織から血液細胞の分化増
殖因子であるＣ３Ｆの産生機能を持つ付着依存性細胞を
分離してＴＲＣ−２９Ｒ細胞（Ｆ　ＥＲＭ−９１−２３
７５）　’ｆｉｒｔｌｉｌ立ｔ、、更ニコノＴＲＣ−２
９Ｒ細胞を、例えばＩ　ＰＥＧ−培地（馴化用無血清培
地〕を用いて継代を繰り返して無血清馴化株ＴＲＣ−２
９ＳＦ細胞が得られることが知られている。（財団法人
日本産業技術振興協会及びバイオテクノロジー開発技術
研究組合主催「第２回次世代産業基盤技術シンポジウム
−バイオテクノロジー」予稿集Ｐ２Ｏ５〜２１７、同「
第３回次世代産業基盤技術シンポジウム−バイオテクノ
ロジー」予稿集Ｐ１７１〜１８２参照）が　°　しよう
とする　　占 これらのいずれの樹立株においても、例えば動物血清を
添加する代わりに増殖因子を添加したＲＰＭＩ−１６４
０培地が用いられているもので、ＥＧＦ、インシュリン
、トランスフェリンなどが増殖因子として十分量添加さ
れているが、増殖速度は満足のいくものでなく、また、
培養基質のロフト変動などによって細胞増殖が著しく影
響を受けやすい、この様にＴＲＣ−２９Ｒ細胞、ＴＲＣ
−２９ＳＦ細胞などの種々の細胞の安定した培養成績を
得るために有効な増殖因子の発見が望まれていた。

。　占を　゛するための 本発明者等はＴＲＣ−２９Ｒ細胞に対する、少なくとも
ＥＧＦ及びインシュリンを含をする無血清培地を用いて
、この培地に０．１％程度の微量の動物血清を添加する
と更に増殖が促進することを見い出し、該血清中に新た
な増殖因子の存在するものと推定した。この様な知見に
基き、少なくともＴＲＣ−２９Ｒ細胞の増殖促進を指標
に動物血清から活性物質の分離を行い本発明の蛋白質因
子ＳＫ−Ｇを得た。ＳＫ−Ｇと従来の細胞増殖促進作用
を有する物質とをＴＲＣ−２９Ｒ細胞に対する作用と物
性の両面から比較すると、３に−Ｇは従来の細胞増殖促
進物質のいずれにも該当しない増殖因子であると推定さ
れる。

本発明のＳＫ−Ｇは分子量２２．０００±２０００（Ｓ
ＤＳ−Ｐ、＋６Ｃ；Ｅ）　、等電点ｐ１５±ｏ、　ｉの
蛋白質で、ｐＨ４〜９（３７℃、１５時間）で９０％以
上活性維持するｐＨ安定性を示し、また、ＧＩＨ７，０
，６０℃、３０分間の熱処理に対して安定で、純水また
は１％ＳＤＳ水溶液に実質的に不溶性の特徴を有する。

ＴＲＣ−２９Ｒ細胞増殖に対して約１１００ｎ／ｍｌの
濃度で単独でも増殖効果はあるが、ＥＧＦとの共存に於
て著しく促進することが特徴である。

詳しくは、本発明の蛋白質因子ＳＫ−Ｇの性状は下記の
如くである。

■　分子量Ｓ　２００００±２０００　（ＧＰＣ）。

２２０００±２２００ （ＳＯＳ　ＰＡＧＥり　　。

■　等電点；ｐ１５±０．１゜ ■　紫外部吸収スペクトル；λｗａｘ　２　Ｂ　０ｎｓ
＋、λｍａｘ　３３　Ｑｎｍ。

■　呈色反応；６Ｎ　　Ｉ（ＣＩ、１０５℃で一昼夜酸
加水分解処理物のニンヒド リン反応は陽性。

■　溶解性；純水および１％ＳＤＳ水溶液に実質的に不
溶性（不溶性ないし難溶 性）、少なくとも１０〜２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝 液に可溶性である。

■　細胞増殖作用；少なぐともＴＲＣ−２９Ｒ細胞の細
胞増殖を促進する。

■　ｐ１１安定性；ｐＨ４〜９（３７°Ｃ１１５時間）
にて９０％以上の細胞増殖作用 を保持する。

■　熱安定性；６０℃（ｐＨ７，０，３０分間）で１０
０％の細胞増殖作用を保持 する。

■　酵素阻害作用；トリプシン阻害作用はない。

１隻■ 本発明の蛋白質因子ＳＫ−Ｇの精製例、及び細胞増殖活
性測定に使用した測定法に関して以下に詳細に述べるが
、本発明は実施例に限定されるものではない。

１〕細胞増殖活性測定法 ｌＯ％血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地で継代維持して
いるＴＲＣ−２９Ｒ細胞（ＦＥＲＭ−９Ｐ−２３７ダ）
を使用した。該細胞をＩ　ＰＥＧ−８５培地を用いて２
代継代し、血清による増殖への影響を低減させた後、Ｉ
ＰＥＧ−８５培地に懸濁させて均一な細胞浮遊液を調整
した。この細胞浮遊液を終濃度１０　’Ｃｅ１ｌｓ／ｄ
／　ｗｅｌｌになるように２４穴のマルチプレートに播
種し、被験サンプル５０μｌを添加した後、３７℃、５
％ＣＯ鵞のインキユベーターで６日間培養した。培養後
の細胞は０．３”／ｄのナガーゼ溶液を用いて剥離分散
させた後コールタ−カウンター（商品名：米国コールタ
−社製）を用いて、細胞数を測定し、増殖細胞数を算定
した。コントロールとしてＰＢＳ溶液および終濃度が０
．１％になるように調整したＦＣ３溶液を使用した。

２〕増殖活性測定に使用したＴＲＣ−２９Ｒ細胞の性質
、細胞増殖活性評価に使用したＴＲＣ−２９Ｒ細胞は以
下のような特性を持つ細胞である。

■　ヒト腎細胞癌組織から樹立した細胞株である。

■　上皮様の増殖形態をとる付着依存性細胞で、ヒトＣ
３Ｆ　（Ｍ−、Ｇ−、ＣＭ−、Ｃ３Ｆ）を生産する。

■　継代用培地：ｌＯ％ＦＣ３含有ＲＰＭＩ−１６４０
培地 ■　染色体モード２７４本 ■　倍加時間：２９±６時間 〔培地の説明〕 尚、Ｉ　ＰＥＧ−８５培地はＲＰＭＩ−１６４０を基本
として、インシュリン、ＥＧＦ、）ランスフェリン、葉
酸を補填した培地（第１表参照）であり、ＴＲＣ−２９
Ｒ細胞の増殖に対して１０％牛脂児血清（Ｆｅ２）添加
ＲＰＭＩ−１６４０培地と同等の増殖性をもたらす無血
清培地である。

第１表 ＊ ＲＰＭＩ−１６４０培地としては、米国ＧＩＢＣＯ社製
の市販の培地を用いた。

３）ＳＫ−Ｇの精製 動物血清、例えばヒト、牛などの血清を用いれば良く、
牛胎児血清を精製原料として行なったＳＫ−Ｇの精製方
法は第１図に示した精製工程に基いて行なった。

（１）　　硫安分画 牛胎児血清１　ｊ！　（Ｂｉｏｃｅｌｌ　（ＵＳＡ）　
、Ｌｏｔ＃２０１４０２０）に等量の飽和硫安水を加え
、３時間撹拌した後、生じた沈澱を遠心除去した。氷冷
した上清に結晶硫安（３９６ｇ）を加えて８０％飽和に
し、１５時間撹拌後に遠心分離して５０−８０％飽和硫
安画分を得た。

（２）クロマトグラフによる精製 １０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）に平衡化した
ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ６Ｂカラム（φ３０Ｘ１５
３ｍｓ）に、同じ緩衝液に透析した血清硫安画分（トー
タルＡｔ８゜＝１７．３９４）を吸着させた後、カラム
ボリュームの５倍の同じ緩衝液で洗浄した。吸着蛋白質
の溶出には同一の緩衝液を用い、０から４００ｍＭの塩
化ナトリウムの直線的濃度勾配で溶出させ、５ｍｉのフ
ラクションで分画した結果、フラクションＮａ７５−１
０５に活性が検出された。

ＤＥＡＥ−セファロースのクロマトで得られた活性画分
を集め、アミコン（Ａ＋＠１ｃｏｎ）　ＹＭ　−１０メ
ンプランを用いて濃縮（限外濾過）したのち１２０ｍＭ
の塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）に対して透析した。透析液を同一緩衝液に平
衡化したＱ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）カ
ラム（φ３０Ｘ１２０＋ｕ＋）を通過させ活性のない不
純蛋白質を除去した。

Ｑ−セファロース処理後の活性画分（素通り画分）をア
ミコン（Ａｍｉｃｏｎ）　ＹＭ　−１０メンフ゛ランで
濃縮した後、その溶液５ｍｌ！、（トータルＡ！、。

−３０４）を１５０ｍＭ塩化ナトリウム含有の１０ｍＭ
）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化したウルトロ
ゲル（Ｕｌｔｒｏｇｅｌ）　Ａ　ｃ　Ａ　４４　（Ｌ　
Ｋ　Ｂ　）カラム（φ２５Ｘ８８０ｉｗ＊）に負荷し、
同一緩衝液を用いてゲル濾過のクロマトグラフを行った
。

細胞増殖活性は３つのピークに分かれたが、初めの２つ
のピークは活性が低くかつ多量の蛋白質部分と重なるた
め精製対象から外し、３番目の主要な活性ピーク画分（
フラクションＮα６５−７８．１フラクション５ｍｌ１
）を分離の対象とした。このクロマトグラフを繰り返し
行って活性画分を集め、アミコン（Ａｓｉｃｏｎ）　Ｙ
Ｍ　−１０メンプランで濃縮したのち同一条件で再クロ
マトグラフを行った。フラクションＮ１１０付近及びフ
ラクシジンＮα７０付近に蛋白質部分のピークが認めら
れるが、フラクシリンＮａ７０付近（フラクションＮｏ
ｓ、　６５−７３）の小さな蛋白質ピークと活性の主要
ピークが一致しており、フラクションＮ１１５０付近の
蛋白質ピークとは分離されることが判明した。

分子量既知のマーカー蛋白質との相対溶出位置から分子
量を計算した結果、活性ピークは分子量的２０．０００
であることが推定された。

Ｌｌｌｔｒｏｇｅｌ　　Ａ　ｃ　Ａ　４４の再クロマト
グラフで得た活性フラクション（Ｎａ６５〜７３）を集
め、Ａｍｉｃｏｎ　　ＹＭ　　１０メンプランで濃縮し
たのち１０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐ）１７．０）に対
して透析した。透析した濃縮液の５００　ｕ　１　（ｔ
ｏｔａｌＡ！、。−０，４０２）を同一の緩衝液で平衡
化した第４級アミンのイオン交換体カラム（Ｍｏｎｏ　
Ｑ　ｌｌＲ１０／１０、Ｐｈａｒａ＋ａｃｉａ　　１０
φＸ１００ｍ）に負荷し、カラムに吸着した蛋白質はＮ
ａＣ１２の直線的濃縮勾配（０〜２００ｍＭ）で溶出速
度４ｍｌ！／分にて溶出させた。溶出開始後１２分付近
に小さなピークが現れ、１５分から１８分にかけて２つ
の蛋白質ピーク（ＰｉおよびＰ２）が現れるが、ピーク
部分の溶出液を分取して活性を調べた結果、１６分付近
のピーク（ＰＩ）にのみ細胞増殖活性のあることが確認
された。　Ｍｏｎｏ　Ｑカラムによるクロマトグラフを
繰り返し行ってＰ１両分を集め、濃縮および透析を行っ
たのち同一条件で再クロマトグラフを行った結果、全（
同じ溶出位置にシングルピークに近い形で溶出されるこ
とが判明した。

Ｍｏｎｏ　Ｑカラムのクロマトグラフで得た活性ピーク
画分の純度を調べるために、Ａｓｐｈｏｌｉｎｅ　Ｐ　
Ａ　Ｇプレート（ＬＫＢ）を用いた等電点電気泳動にお
ける挙動を検討した。　２ｎｄ　Ｍｏｎｏ　Ｑで得たシ
ングルピーク（Ｐｌ）のｐ１４．０〜６．５の泳動では
２本のバンドが確認されたことから、少なくとも２種類
の蛋白質が含まれることが判明した。したがって、この
２本のバンドのどちらに活性があるかを決定するために
、ｐ１４．０〜６．５のＡａ＋ｐｈｏｌｉｎｅ　Ｐ　Ａ
Ｇプレートを用いて電気泳動したのち、ｐＨ勾配に垂直
方向に２．５１１１ｍ幅にゲルをスライスし、ＰＢＳ（
リン酸緩衝生理食塩水）を加えてホモジナイズして抽出
し、抽出液の細胞増殖活性を測定した。

その結果、ｐ１１５付近の蛍白質バンドに高い活性が確
認され、単離すべき蛋白質と染色バンドとの関係が明ら
かになった。

（３）等電点電気泳動による精製 ２ｎｄ　Ｍｏｎｏ　Ｑクロマトグラ、フで得た標品には
２種類の蛋白質が含まれ、等電点電気泳動でのみ確認し
得ることから、多量のサンプル負荷が可能なインモビラ
イン（Ｉａｖ＋ｏｂｉｌｉｎｅ）プレート（ｐ１４．５
〜５．５、ＬＫＢ）を用いて等電点電気泳動による分離
を試みた。インモビライン（Ｉａ＋ｍｏｂｉｌｉｎｅ）
プレート（１２ｃ＋ａ幅）に２　ｎｄ　Ｍｏｎｏ　Ｑ標
品（トークルＡ露・・−０，７３５）を負荷し、１０℃
、５．０００Ｖ、３．０Ｗのコントロールのもとに１５
　時間り動を行った。泳動後のゲルの一部を切り取って
蛋白質バンドを染色したのち、残りのゲルについて活性
バンド部分を切断し、ゲルに含まれる蛋白質を電気的抽
出法で抽出した。その結果、Ａ１．。値を指標にした蛋
白質として０．１３４（Ａ、。。）が回収され、電気泳
動を行なった結果、単一のバンドであることが確認され
、はぼ純粋なＳＫ−Ｇ標品として取得することができた
。また、ＳＫ−Ｇのバンドが検出されるゲル表面のｐＨ
を測定した結果、５．０６であったことからＳＫ−Ｇの
等電点はｐｌＳ±０．１であると判断した。

純粋なＳＫ−Ｇ標品を得るまでの精製ステップにおける
蛋白質（Ａｏ、値）の収量を第２表に示した。最終精製
標品の回収率は０．００５２％であった。

（４）　　紫外部吸収スペクトル １０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）のＳＫ−Ｇ
溶液を用いて紫外部吸収スペクトルを測定した結果を第
６図に示す、２Ｂ０ｎｓ及び３３０ｎｓ＋付近に極大吸
収を示した。

第２表 ＳＫ−Ｇ精製の要約 （５）　　Ｓ　Ｋ　−Ｇの分子量およびアミノ酸組成Ｓ
Ｋ−Ｇのおおよその分子量はＵｌｔｒｏｇｅｌ　ＡｃＡ
４４のクロマトグラフに於ける活性溶出位置から約２０
．０００であると推定されたが、等電点的に精製した標
品を用いて、常法に従い５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動による分子量測定を行った。ＳＫ−Ｇは還元
剤の存在下でシングルバンドになり、同時に泳動した分
子量既知のマーカー蛋白質との相対移動度から分子量を
推定した結果、２２，０００±２０００であることが明
らかになった。これらの結果から、通常ＳＫ−０分子は
単量体で存在するものと思われる。

（６）　　Ｓ　Ｋ　−Ｇの安定性試験 ＳＫ−ＧのｐＨ安定性を調べるために、種々のｐＨの１
０ｍＭ緩衝液を用いて２００　ｕ　ｇ／ｐｄのＳＫ−Ｇ
溶液を調整し、３７℃で１５時間インキエベートしたの
ち１００ｍＭのリン酸緩衝液で１００倍に希釈して中和
し、その５０μ２を被検サンプルとして細胞増殖活性を
測定した。ｐＨ７，０の１０１トリス塩酸緩衝液で４°
Ｃ１１５時間放置したときの活性を１００％として比較
した結果、第２図に示すようにｐＨ４，０〜９．０の範
囲で安定であることがわかった。

熱に対する安定性は、ＳＫ−Ｇを２μｇ／１１１の１０
ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）溶液に調整し、３
７℃１５時間、６０°Ｃ３０分間および１００℃５分間
の処理を行ったのちの残存活性を調べた。

その結果、第３表に示したように、６０℃３０分間で１
００％活性が保持され、１００℃５分間の処理でも約５
０％の活性が保持されることがわかって、生理活性蛋白
質としてはかなり安定であることが明らかになった。

第３表　ＳＫ−Ｇの熱安定性 試料は１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）で処理
された。

ＴＲＣ−２９Ｒ細胞の増殖に対する作用ＴＲＣ−２９Ｒ
細胞の増殖に対するＳＫ−Ｇの濃度の影響を調べるため
に、ＳＫ−Ｇを含むＩＰＥＧ−８５培地１ｍに接種した
細胞（ＩＸＩＯ’）を５％ＣＯ□、９５％空気中で３７
℃、６日間培養した。トリプシンで分解させた後、増殖
した細胞をコールタ−カウンターで計測して細胞増殖促
進活性を測定した。ＴＲＣ−２９Ｒ細胞浮遊液の調整、
及び細胞播種濃度については前記の細胞増殖活性測定法
に従った。０．１％のＦｅ２を添加したときの細胞増殖
を１００％として表示すると、第３図に示すような容量
依存的な増殖促進作用が認められ、約１１００ｎ／ｉｄ
“でほぼ１００％の増殖に達することが明らかになった
。なお、この濃度はＳＫ−Ｇの分子量を２２．０００と
して換算すると４．５ｎＭになる。（注＊　：　Ａ　、
、、　ｔｍ　ｌの溶液を１■／ａｔとして概算した） ＴＲＣ−２９Ｒ細胞用の無血清壇地ＩＰＥＧ−８５（第
１表）には、ペプチド性の増殖因子としてＥＧＦ及びイ
ンシュリンがそれぞれ１０ｎｇ／ａｌｌ及び５ａｇ／ａ
ｌ添加されていることから、これらの増殖因子とＳＫ−
Ｇとの相互作用について検討した。

ＥＧＦ及びインシュリンを含まないＩＰＥＧ−８５培地
を調整し、増殖因子の組合せ添加に於ける細胞増殖をＳ
Ｋ−Ｇ　（１００ｎｇ／ｉｄ）の存在下と非存在下で調
べた。２４−ウェル培養皿にＳＫ−Ｇ　（１００ｎｇ／
ｍ）と共にＥＧ　Ｆ　（１０ｎｇ／ａｄりインシュリン
（５７７ｇ／ｊｄ）、トランスフェリン（１μｇ／−）
を加えた生長因子不含ＩＰＥＧ−８５培地ｌ−に細胞（
ＩＸＩＯ’）を接種した。

培養皿を５％ＣＯ，，９５％空気中で６日間、３７℃で
インキユベートした。トリプシン（０，１％）で分解し
た後、増殖した細胞をコールタ−カウンターで計測して
、結果を第４図に示した０図中の１はＳＫ−Ｇ存在下で
の細胞増殖、口はＳＫ−Ｇが存在しない時の細胞増殖を
示す。

ＥＧＦはこの細胞増殖に強く作用しており、さらにＳＫ
−Ｇの存在下では増殖効果がより一層強められる傾向が
認められた。

またＥＧＦとＳＫ−Ｇとの相互作用を明確にするために
、ＥＧＦの濃度に対して増殖細胞数をプロットした結果
、第５図に示す通りＳＫ−ＧはＥＧＦが共存しなくても
増殖促進作用が認められるが、ＥＧＦ濃度が５ｎｇ／ｄ
以上になると共役的に作用してさらに増殖を促進させる
ことが明らかになった。なおＥＧＦとＳＫ−Ｇとの相互
作用の確認は、細胞（ＩＸＩＯ’）をＥＧＦの種々の濃
度で３７℃、６日間、ＩＰＥＧ−８５培地１４で培養し
、トリプシン（０，１％）で分解後、増殖した細胞をコ
ールタ−カウンターを用いて計測したもので、その第５
図中の＋はＳＫ−Ｇ存在下で、−〇−はＳＫ−Ｇが存在
しない時の細胞増殖におけるＥＧＦの効果を示す。

（７）本発明の蛋白質因子ＳＫ−Ｇの上記及びその他判
明した性状は下記の如く要約できる。

■　分子量：２０．ＯＯＯ±２０００　（ＧＰＣ）。

２２．０００±２０００　（ＳＯ３ＰＡＧＥ）■　等電
点：　　ｐ１５±０．１゜ ■　紫外部吸収スペクトル：λａａｘ　２８０ｎｔｓｓ
λｗａｘ　　３．３　０ｎａｉ。

■　呈色反応：６Ｎ　　ＨＣｌ、１０５℃で一昼夜酸加
水分解物のニンヒドリン 反応は陽性。

■　溶解性：純水及び１％ＳＤＳ水溶液に実質的に不溶
性（不溶性乃至難溶性）。

１０〜２０ｍＭトリス−塩酸緩衝 液、およびリン酸緩衝液に可溶性。

■　ＳＫ−ＧはＥＧＦと共役的に作用し、少なくともＴ
ＲＣ−２９Ｒ細胞の増殖を促進する。

■　９１１安定性：ｐＨ４−９，３７°Ｃ１１５時間に
て９０％以上の細胞増殖作用を 保持する。

ｐＨ７，０，６０°Ｃ１３０分間にて １００％の細胞増殖作用を保持 する。

ｐＨ７，０，１００°Ｃ，５分間にて ５５．４％の細胞増殖作用を保持 する。

■　熱安定性：ｐＨ１，０，６０°Ｃ５３０分間にて１
００％の細胞増殖作用を保持 する。

■　酵素阻害作用ニトリプシン阻害作用はない。

０　既知の細胞増殖因子とは性状が異なる。

■　細胞障害性：ＳＫ−Ｇの高濃度においても培養細胞
に対する顕著な障害 は認められなかった。従って 本ＳＫ−Ｇの毒性はないもの と推定される。

また、第４表に示すように、ＳＫ−Ｇの性状は既知の細
胞増殖因子の性状と異なる。

第 表 又貝至勿ｌ 上記から増殖細胞数はＳＫ−Ｇ無添加の場合の１、５〜
２倍になる。既知の増殖因子を添加してもこの様な著し
い促進効果は認められない。

又、本ＳＫ−Ｇは細胞あるいは組織特異的に細胞増殖作
用を持つことも考えられ、そのために作用する組織が特
定されるため副作用が出にくく医薬品としての利用が期
待できる。

構造解析、遺伝子クローニングを行えば遺伝子操作によ
るＳＫ−Ｇ大量生産も期待できる。

【図面の簡単な説明】

第１図はＳＫ−Ｇの単離工程図、第２図はＳＫ−Ｇのｐ
Ｈ安定性を示すグラフ、第３図はＳＫ−Ｇ濃度によるＴ
ＲＣ−２９Ｒ細胞の増殖パターンを示すグラフ、第４図
はＴＲＣ−２９Ｒ細胞の増殖における生長因子の効果を
示すグラフ、第５図はＴＲＣ−２９ＳＦＩＢ胞の増殖に
おけるＥＧＦの効果を示すグラフ、第６図は紫外部吸収
スペクトルを示すグラフである。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）少なくとも下記の理化学的性状を有する蛋白質因
   子ＳＫ−Ｇ。 ［１］分子量；２００００±２０００（ＧＰＣ）２２０
   ００±２２００（ＳＤＳ　ＰＡＧＥ）。 ［２］等電点；ｐＩ５±０．１。 ［３］紫外部吸収スペクトル；λｍａｘ２８０ｎｍ、λ
   ｍａｘ３３０ｎｍ。 ［４］呈色反応；６Ｎ　ＨＣｌ、１０５℃で一昼夜酸加
   水分解処理物のニンヒドリン反応は陽性。 ［５］溶解性；純水および１％ＳＤＳ水溶液に実質的に
   不溶性、少なくとも１０〜２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
   、リン酸緩衝液に可溶性である。 ［６］細胞増殖作用；少なくともＴＲＣ−２９Ｒ細胞の
   細胞増殖を促進する。 ［７］ｐＨ安定性；ｐＨ４〜９（３７℃、１５時間）に
   て９０％以上の細胞増殖作用を保持する。 ［８］熱安定性；６０℃（ｐＨ７．０、３０分間）で１
   ００％の細胞増殖作用を保持する。 ［９］酵素阻害作用；トリプシン阻害作用はない。
2. （２）少なくとも下記の理化学的性状を有する蛋白質因
   子ＳＫ−Ｇを有効成分とする細胞増殖剤。 ［１］分子量；２００００±２０００（ＧＰＣ）。 ２２０００±２２００（ＳＤＳ　ＰＡＧＥ）。 ［２］等電点；ｐＩ５±０．１０ ［３］紫外部吸収スペクトル；λｍａｘ２８０ｎｍ、λ
   ｍａｘ３３０ｎｍ。 ［４］呈色反応；６Ｎ　ＨＣｌ、１０５℃で一昼夜酸加
   水分解処理物のニンヒドリン反応は陽性。 ［５］溶解性；純水および１％ＳＤＳ水溶液に実質的に
   不溶性、少なくとも１０〜２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
   、リン酸緩衝液に可溶性である。 ［６］細胞増殖作用；少なくともＴＲＣ−２９Ｒ細胞の
   細胞増殖を促進する。 ［７］ｐＨ安定性；ｐＨ４〜９（３７℃、１５時間）に
   て９０％以上の細胞増殖作用を保持する。 ［８］熱安定性；６０℃（ｐＨ７．０、３０分間）で１
   ００％の細胞増殖作用を保持する。 ［９］酵素阻害作用；トリプシン阻害作用はない。