JPH0227986A - フェノールオキシダーゼ遺伝子（２） - Google Patents
フェノールオキシダーゼ遺伝子（２）Info
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- JPH0227986A JPH0227986A JP63175236A JP17523688A JPH0227986A JP H0227986 A JPH0227986 A JP H0227986A JP 63175236 A JP63175236 A JP 63175236A JP 17523688 A JP17523688 A JP 17523688A JP H0227986 A JPH0227986 A JP H0227986A
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- dna
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- oxidase gene
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業の利用分野〕
本発明は、フェノールオキシダーゼ遺伝子（ＩＩ）に関
するものであり、更に詳しくは、フェノールオキシダー
ゼ産生、分泌能を有する白色腐朽菌〔特にアラゲカワラ
タケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｈｉｒｓｕＬｕｓ ＩＦＯ４
９１７） ］の］メツセンジー１−−ＲＮＡ以下、ｍＲ
ＮＡと略す）由来のフェノールオキシダーゼ遺伝子（■
）に関する。
するものであり、更に詳しくは、フェノールオキシダー
ゼ産生、分泌能を有する白色腐朽菌〔特にアラゲカワラ
タケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｈｉｒｓｕＬｕｓ ＩＦＯ４
９１７） ］の］メツセンジー１−−ＲＮＡ以下、ｍＲ
ＮＡと略す）由来のフェノールオキシダーゼ遺伝子（■
）に関する。
本フェノールオキシダーゼ遺伝子（ＩＩ）はイントロン
を含んでおらず種々の生物に組換えることにより、バイ
オロジカルパルピングやバイオブリーチングや工場廃水
の脱色や木材糖化の前処理や臨床試験用試薬として利用
することができるフェノールオキシダーゼを生産するこ
とができる。
を含んでおらず種々の生物に組換えることにより、バイ
オロジカルパルピングやバイオブリーチングや工場廃水
の脱色や木材糖化の前処理や臨床試験用試薬として利用
することができるフェノールオキシダーゼを生産するこ
とができる。
フェノールオキシダーゼは分子状酸素の存在下でフェノ
ール類を酸化し、０−キノンあるいはｐ−キノンを生成
する酵素であり、補欠分子団として銅を含むことが知ら
れている。フェノールオキシダーゼは、動植物界に広く
分布しているが特に白色腐朽菌と呼ばれる一部の菌類の
生産するフェノールオキシダーゼは産業上有用であると
考えられる。
ール類を酸化し、０−キノンあるいはｐ−キノンを生成
する酵素であり、補欠分子団として銅を含むことが知ら
れている。フェノールオキシダーゼは、動植物界に広く
分布しているが特に白色腐朽菌と呼ばれる一部の菌類の
生産するフェノールオキシダーゼは産業上有用であると
考えられる。
白色腐朽菌は木材等のリグノセルロース物質中のリグニ
ンを分解する能力が高いことが知られており、この白色
腐朽菌をリグノセルロース物質に接種、培養し、リグニ
ンの一部を分解させバルブを製造するバイオロジカルパ
ルピングの試ミカなされている（特開昭５０−４６９０
３号）。しかし、白色腐朽菌はリグニンを分解するだけ
でなく、パルプの原料となるセルロースやヘミセルロー
スをも分解する能力を有しており、バルブ収率の低下と
いう問題点を侍っている。また、白色腐朽菌のリグニン
分解が二次代謝的に生育後期に起こるため時間がかかる
という問題点もあった。
ンを分解する能力が高いことが知られており、この白色
腐朽菌をリグノセルロース物質に接種、培養し、リグニ
ンの一部を分解させバルブを製造するバイオロジカルパ
ルピングの試ミカなされている（特開昭５０−４６９０
３号）。しかし、白色腐朽菌はリグニンを分解するだけ
でなく、パルプの原料となるセルロースやヘミセルロー
スをも分解する能力を有しており、バルブ収率の低下と
いう問題点を侍っている。また、白色腐朽菌のリグニン
分解が二次代謝的に生育後期に起こるため時間がかかる
という問題点もあった。
白色腐朽菌のリグニン分解力は、白色腐朽菌が生産分泌
するフェノールオキシダーゼによるものが大きいと考え
られており、その遺伝子をクローニングする試みも行な
われているが、いまだ成功していない。また、白色腐朽
菌のフェノールオキシダーゼと類似の活性を持っている
ラフカーゼについては、ノイロスポラ°クラッサ（Ｎｅ
ｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ）のラッカーゼ遺伝子の
クローニング（Ｕ、Ｓ。
するフェノールオキシダーゼによるものが大きいと考え
られており、その遺伝子をクローニングする試みも行な
われているが、いまだ成功していない。また、白色腐朽
菌のフェノールオキシダーゼと類似の活性を持っている
ラフカーゼについては、ノイロスポラ°クラッサ（Ｎｅ
ｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ）のラッカーゼ遺伝子の
クローニング（Ｕ、Ｓ。
Ｇｅｒｍａｎｎ、に、Ｌｅｒｃｈ；（１９８８） Ｊ、
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、Ｊｆ）ｌ＋ ８８５−５９６）が
報告されているが、そのアミノ酸配列は本発明のフェノ
ールオキシダーゼのアミノ酸配列とは、異なるものであ
り、ノイロスポラ・クラッサのラッカーゼによるリグニ
ン分解についても、まだ報告されていない。
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、Ｊｆ）ｌ＋ ８８５−５９６）が
報告されているが、そのアミノ酸配列は本発明のフェノ
ールオキシダーゼのアミノ酸配列とは、異なるものであ
り、ノイロスポラ・クラッサのラッカーゼによるリグニ
ン分解についても、まだ報告されていない。
本発明は、前述の従来の問題点を解消し、フェノールオ
キシダーゼだけを生産する様々な新規生物を作り出せる
ようにすることを目的とするものである。
キシダーゼだけを生産する様々な新規生物を作り出せる
ようにすることを目的とするものである。
自然界におけるリグニンの生分解は、数種の酵素が関与
していると考えられているが白色腐朽菌が生産するフェ
ノールオキシダーゼはその中で中心的役割を果たしてお
り、リグニン分解の研究においても必須の酵素となって
いる。
していると考えられているが白色腐朽菌が生産するフェ
ノールオキシダーゼはその中で中心的役割を果たしてお
り、リグニン分解の研究においても必須の酵素となって
いる。
したがって、リグニン分解能力だけを効率的に発現する
新規生物としてフェノールオキシダーゼ生産能力を付与
した生物が考えられ、本発明は、フェノールオキシダー
ゼ生産能力を付与する為に必要な白色腐朽菌のｍＲＮＡ
由来のフェノールオキシダー・ゼ°遺伝子（Ｉｆ）を提
供するものである。
新規生物としてフェノールオキシダーゼ生産能力を付与
した生物が考えられ、本発明は、フェノールオキシダー
ゼ生産能力を付与する為に必要な白色腐朽菌のｍＲＮＡ
由来のフェノールオキシダー・ゼ°遺伝子（Ｉｆ）を提
供するものである。
本発明は、次式、
ＶａｌＡｓｎＡｓｐＧｌｎ
ＰｈｅＳｅｒ ＩＩ ｅＡｓｐＧ Ｉ ｙＨ１ｓＡｓｐ
ＬｅｕＴｈｒ Ｉ ｌｅｌ ｌ ａＧ １ｕＶａ ｌ
Ａｓｐ：ｉｅｒ〔式中Ｘは、ＡｌａまたはＰｒｏ ） のアミノ酸配列をコードするＤＮＡからなるフェノール
オキシダーゼ遺伝子（ｎ）に関する。
ＬｅｕＴｈｒ Ｉ ｌｅｌ ｌ ａＧ １ｕＶａ ｌ
Ａｓｐ：ｉｅｒ〔式中Ｘは、ＡｌａまたはＰｒｏ ） のアミノ酸配列をコードするＤＮＡからなるフェノール
オキシダーゼ遺伝子（ｎ）に関する。
なお、上式におけるＸがＡｌａのものをフェノールオキ
シダーゼ遺伝子（ｎ） （ＯＪ−ＰＯＭ ５）とし、Ｘ
がＰｒｏのものをフェノールオキシダーゼ遺伝子（ｎ）
（ＯＪ−ＰＯＯ２０とする。
シダーゼ遺伝子（ｎ） （ＯＪ−ＰＯＭ ５）とし、Ｘ
がＰｒｏのものをフェノールオキシダーゼ遺伝子（ｎ）
（ＯＪ−ＰＯＯ２０とする。
さらに本発明は、上記ＤＮＡにハイブリッドするＤＮＡ
配列であって、天然、合成、もしくは半合成によって得
られるものであり、請求項１記載のＤＮＡ配列に対して
、ヌクレオチドの置換、ヌクレオチドの挿入及びヌクレ
オチド配列の逆位その他の変異によって関連づけられて
おり、かつ、フェノールオキシダーゼ活性を有するポリ
ペプチドをコードするＤＮＡからなるフェノールオキシ
ダーゼ遺伝子（ｎ）に関する。
配列であって、天然、合成、もしくは半合成によって得
られるものであり、請求項１記載のＤＮＡ配列に対して
、ヌクレオチドの置換、ヌクレオチドの挿入及びヌクレ
オチド配列の逆位その他の変異によって関連づけられて
おり、かつ、フェノールオキシダーゼ活性を有するポリ
ペプチドをコードするＤＮＡからなるフェノールオキシ
ダーゼ遺伝子（ｎ）に関する。
さらに、本発明は上記フェノールオキシダーゼ遺伝子（
ｎ）をベクターＤＮＡに連結した組換えＤＮＡに関する
。
ｎ）をベクターＤＮＡに連結した組換えＤＮＡに関する
。
さらに、本発明はフェノールオキシダーゼ遺伝（ｎ）
が次式
％式％
ＴＣＧＧＴＡＡＣＴＡＣＴＧＧＡＴＴＣＧＣＧＣＣＡＡ
ＣＣＣＣＡＡＣＴＴＣＧＧＣＡＡまたは、 次式（ＯＪ−ＰＯＭ ＴＴＴＧＴＧＡＡＣＣＡＧＴＧＣＣＣＴＡＴＴＴＣＣＴ
ＣＴＧＧＧＣＡＣＴＣＧＴＴＣＣＴＣＧＧＴＡＡＣＴＡ
ＣＴＧＧＡＴＴＣＧＣＧＣＣＡＡＣＣＣＣＡＡＣＴＴＣ
ＧＧＣＡ＾ＴＣＧＡＴＧＴＣＡＡＣＧＡＣＣＡＧ のＤＮＡ配列を有するものであるフェノールオキシダー
ゼ遺伝子（ＩＩ）に関する。
ＣＣＣＣＡＡＣＴＴＣＧＧＣＡＡまたは、 次式（ＯＪ−ＰＯＭ ＴＴＴＧＴＧＡＡＣＣＡＧＴＧＣＣＣＴＡＴＴＴＣＣＴ
ＣＴＧＧＧＣＡＣＴＣＧＴＴＣＣＴＣＧＧＴＡＡＣＴＡ
ＣＴＧＧＡＴＴＣＧＣＧＣＣＡＡＣＣＣＣＡＡＣＴＴＣ
ＧＧＣＡ＾ＴＣＧＡＴＧＴＣＡＡＣＧＡＣＣＡＧ のＤＮＡ配列を有するものであるフェノールオキシダー
ゼ遺伝子（ＩＩ）に関する。
次に本発明の詳細な説明する。
＜ＤＮＡプローブの合成）
白色腐朽菌のｍＲＮＡ０中にフェノールオキシダーゼ遺
伝子（ＩＩ）由来のｍＲＮＡが含まれることを確認する
為とｃＤＮＡライブラリーからフェノールオキシダーゼ
遺伝子をクローニングする為に必要となるＤＮＡプロー
ブは、フェノールオキシダーゼの部分アミノ酸配列をも
とに合成する。
伝子（ＩＩ）由来のｍＲＮＡが含まれることを確認する
為とｃＤＮＡライブラリーからフェノールオキシダーゼ
遺伝子をクローニングする為に必要となるＤＮＡプロー
ブは、フェノールオキシダーゼの部分アミノ酸配列をも
とに合成する。
フェノールオキシダーゼの部分アミノ酸配列は、特開昭
６１−２８５９８９号、特開昭６２−２２０１８９号及
び特開昭６２−２２０１９０号の方法で生産、精製した
フェノールオキシダーゼのＮ末端からのアミノ酸配列と
枦製したフェノールオキシダーゼをＢｒＣＮ分解（Ｃｏ
ｌｅ、Ｒ，Ｄ、： Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｗｏｌ、
１１，３１５−３１７ （１９６７））またはトリプ
シン分解（Ｌｉｎ、Ｌ、−Ｎ、＆ Ｂｒａｎｄｔｓ。
６１−２８５９８９号、特開昭６２−２２０１８９号及
び特開昭６２−２２０１９０号の方法で生産、精製した
フェノールオキシダーゼのＮ末端からのアミノ酸配列と
枦製したフェノールオキシダーゼをＢｒＣＮ分解（Ｃｏ
ｌｅ、Ｒ，Ｄ、： Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｗｏｌ、
１１，３１５−３１７ （１９６７））またはトリプ
シン分解（Ｌｉｎ、Ｌ、−Ｎ、＆ Ｂｒａｎｄｔｓ。
Ｊ、Ｆ、： Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２２．５５３
（１９８３）） Ｌ、分離したポリさプチドのＮ末端か
らのアミノ酸配列をエドマン分解法（Ｅｄｎ＋ａｎ、Ｐ
、＆ Ｈｅｎ５ｃｈｅｎ、Ａ、Ｐｒｏｔｅｉｎ−５ｅｑ
ｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｒ＋＋＋１ｎａｔｉｏｎ、
２’ｎｄ ｄｅ、、 Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａ
ｇ、Ｂｅｒｌｉｎ、 ｐｐ ２３２〜２７９（１９７５
）参照〕によって決定する。
（１９８３）） Ｌ、分離したポリさプチドのＮ末端か
らのアミノ酸配列をエドマン分解法（Ｅｄｎ＋ａｎ、Ｐ
、＆ Ｈｅｎ５ｃｈｅｎ、Ａ、Ｐｒｏｔｅｉｎ−５ｅｑ
ｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｒ＋＋＋１ｎａｔｉｏｎ、
２’ｎｄ ｄｅ、、 Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａ
ｇ、Ｂｅｒｌｉｎ、 ｐｐ ２３２〜２７９（１９７５
）参照〕によって決定する。
ＤＮＡプローブの合成は、フォスフオシエステル法、フ
ォスフオトリエステル法、フォスファイト法およびその
改良法のアミダイト法のいずれかの方法でも行なうこと
ができる。
ォスフオトリエステル法、フォスファイト法およびその
改良法のアミダイト法のいずれかの方法でも行なうこと
ができる。
（ｍＲＮＡの調製〉
本発明に用いることができる生物は、フェノールオキシ
ダーゼを有するものであれば、全て可能であるが特に酵
素活性が高いフェノールオキシダーゼを生産し、分泌す
る白色腐朽菌〔例えば、アラゲカワラタケ（ＩＦＯ４９
１７）、カワラタケ（ＩＦＯ３０３４０）、カイガラタ
ケ（ＩＰＯ８７１４））が良い。
ダーゼを有するものであれば、全て可能であるが特に酵
素活性が高いフェノールオキシダーゼを生産し、分泌す
る白色腐朽菌〔例えば、アラゲカワラタケ（ＩＦＯ４９
１７）、カワラタケ（ＩＦＯ３０３４０）、カイガラタ
ケ（ＩＰＯ８７１４））が良い。
白色腐朽菌を生育繁殖させる培地の組成は、白色腐朽菌
がフェノールオキシダーゼを生産する培地であればどの
ような培地でも良い。
がフェノールオキシダーゼを生産する培地であればどの
ような培地でも良い。
主炭素源としては、グルコースを使用するが白色腐朽菌
が資化可能な他の炭素源を使用してもよく、主窒素源と
しては酵母エキス、ポリペプトンを使用するが白色腐朽
菌が資化可能なアンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素
化合物、尿素、カゼインなどの有機窒素含有物も使用す
ることができる。その他、カルシウム塩、マグネシウム
塩、カリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩
などの無機塩やコーンステイープリカー、ビタミン類、
アミノ酸類、核酸類などの栄養物質、生長促進物質を添
加することも可能である。
が資化可能な他の炭素源を使用してもよく、主窒素源と
しては酵母エキス、ポリペプトンを使用するが白色腐朽
菌が資化可能なアンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素
化合物、尿素、カゼインなどの有機窒素含有物も使用す
ることができる。その他、カルシウム塩、マグネシウム
塩、カリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩
などの無機塩やコーンステイープリカー、ビタミン類、
アミノ酸類、核酸類などの栄養物質、生長促進物質を添
加することも可能である。
前期の培地に白色腐朽菌を接種し、培養する。
培養液中のフェノールオキシダーゼ活性が最大になった
時、集菌し、液体窒素中で凍結する。
時、集菌し、液体窒素中で凍結する。
白色腐朽菌から、フェノールオキシダーゼ等の蛋白質に
対応する全ｍＲＮＡの抽出は、常法によって行なえばよ
い。たとえば、白色腐朽菌体を２〜５容のＮＰ−４０，
ＳＯ５，Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００などの界面活性剤と
フェノール溶液を混合してホモジナイザーや凍結融解な
どの物理的方法を用いて細胞を破砕。
対応する全ｍＲＮＡの抽出は、常法によって行なえばよ
い。たとえば、白色腐朽菌体を２〜５容のＮＰ−４０，
ＳＯ５，Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００などの界面活性剤と
フェノール溶液を混合してホモジナイザーや凍結融解な
どの物理的方法を用いて細胞を破砕。
可溶化し、遠心した後の上清に冷エタノールを加えてＲ
ＮＡを沈澱させる方法がある。また、グアニジンチオシ
アネート溶液中で組織を破砕し、エタノール沈澱後に、
塩酸グアニジンで沈澱の溶解をくり返して全ｍＲＮＡを
抽出するＧＴＣ法等もある。また、Ｂｒｏｄａ等の方法
（Ｊ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 Ｍｅ−ｔｈｏｄｓ、 ４
．（１９８５） １５５−１６２３や市販のＲＮＡ抽出
キット〔アマジャム・ジャパン■社製ＲＰＮ、１２６４
）を用いて、全ｍＲＮＡを抽出することもできる。
ＮＡを沈澱させる方法がある。また、グアニジンチオシ
アネート溶液中で組織を破砕し、エタノール沈澱後に、
塩酸グアニジンで沈澱の溶解をくり返して全ｍＲＮＡを
抽出するＧＴＣ法等もある。また、Ｂｒｏｄａ等の方法
（Ｊ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 Ｍｅ−ｔｈｏｄｓ、 ４
．（１９８５） １５５−１６２３や市販のＲＮＡ抽出
キット〔アマジャム・ジャパン■社製ＲＰＮ、１２６４
）を用いて、全ｍＲＮＡを抽出することもできる。
また、必要に応じてフェノールオキシダーゼに対応する
抗体を用いてフェノールオキシダーゼ合成途上のポリゾ
ームを沈澱させ、これよりｍＲＮＡを界面活性剤などで
抽出する方法も行なうことができる。
抗体を用いてフェノールオキシダーゼ合成途上のポリゾ
ームを沈澱させ、これよりｍＲＮＡを界面活性剤などで
抽出する方法も行なうことができる。
本発明のポリ （Ａ） ｍ ＲＮ Ａの精製については
、オリゴ（ｄＴ）セルロース、ポリ（Ｕ）セルロースな
どの吸着カラムによる精製法、シｇ糖密度勾配遠心法に
よる分画等によって行なうことが出来る。
、オリゴ（ｄＴ）セルロース、ポリ（Ｕ）セルロースな
どの吸着カラムによる精製法、シｇ糖密度勾配遠心法に
よる分画等によって行なうことが出来る。
上記の如くして得られた全ｍＲＮＡの中に、目的とする
フェノールオキシダーゼに対応するｍＲＮＡの存在を確
認するためには、ｍＲＮＡをタンパク質に翻訳させ、そ
の抗体等を用いてそのタンパク質を同定する等の方法を
行なえばよい。たとえば、ｍＲＮＡをタンパク質に翻訳
するのによく用いられる系であるＲｅ ｔ ｉｃｕ １
ｏｃｙ ｔｅ−１ｙｚａ ｔｅ （網状赤血球ライゼー
ト）、賀ｈｅａｔ ｇｅｒｍ（コムギ胚芽）などの無細
胞系でタンパク質に翻訳させ、フェノールオキシダーゼ
に対応するｍＲＮＡが活性を有することを確認すること
が可能である。
フェノールオキシダーゼに対応するｍＲＮＡの存在を確
認するためには、ｍＲＮＡをタンパク質に翻訳させ、そ
の抗体等を用いてそのタンパク質を同定する等の方法を
行なえばよい。たとえば、ｍＲＮＡをタンパク質に翻訳
するのによく用いられる系であるＲｅ ｔ ｉｃｕ １
ｏｃｙ ｔｅ−１ｙｚａ ｔｅ （網状赤血球ライゼー
ト）、賀ｈｅａｔ ｇｅｒｍ（コムギ胚芽）などの無細
胞系でタンパク質に翻訳させ、フェノールオキシダーゼ
に対応するｍＲＮＡが活性を有することを確認すること
が可能である。
また、フェノールオキシダーゼのＤＮＡプローブを用い
たドツト・ハイブリダイゼーションまたは、ノーザン・
プロット・ハイブリダイゼーションを行なうことによっ
ても確認することが可能である。
たドツト・ハイブリダイゼーションまたは、ノーザン・
プロット・ハイブリダイゼーションを行なうことによっ
ても確認することが可能である。
上述のようにして得られたｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒ
。
。
でｃＤＮＡを合成し、適当なベクターなどに組み込み、
フェノールオキシダーゼ遺伝子（ｎ）をクローニングす
るためのｃＤＮＡライブラリーを構築するのに使用する
ことができる。
フェノールオキシダーゼ遺伝子（ｎ）をクローニングす
るためのｃＤＮＡライブラリーを構築するのに使用する
ことができる。
（ｃＤＮＡの合成〉
ｃＤＮＡの合成法としては、Ｇｕｂｌｅｒ−Ｈｏｆｆｍ
ａｎの方法、ランド法、岡山・Ｂｅｒｇ法やこれらの変
法などがある。たとえば、試験管内で次のような方法で
行なうことができる。上記のｍＲＮＡを鋳型とし、オリ
ゴ（ｄＴ）をプライマーとして、ｄＮＴＰ （＝ｄＡＴ
Ｐ、 ｄＧＴＰ、 ｄＣＴＰ、 ｄＴＴＰ）の存在下で
逆転写酵素（全酒造■社製２６１ＯＡ）によりｍＲＮＡ
と相補的な単鎖ｃＤＮＡを合成する０次いで、ＲＮａｓ
ｅＨ（全酒造■社製２１５０Ａ ）でｍＲＮＡに切れ目
を入れ、ｍＲＮＡをブライマーとし、ｄＮＴＰの存在下
でＤＮＡポリメラーゼＩ〔全酒造■社製２１４０Ａ ）
を用いて二重鎖ｃＤＮＡを合成する。この合成法はｃＤ
ＮＡ合成キットとして、アマジャム・ジャパン■（ＲＰ
Ｎ、 １２５６Ｙ） 、ベーリンガー・マンハイム山之
内■（１０１３８８２） 、より市販されており、使用
することができる。
ａｎの方法、ランド法、岡山・Ｂｅｒｇ法やこれらの変
法などがある。たとえば、試験管内で次のような方法で
行なうことができる。上記のｍＲＮＡを鋳型とし、オリ
ゴ（ｄＴ）をプライマーとして、ｄＮＴＰ （＝ｄＡＴ
Ｐ、 ｄＧＴＰ、 ｄＣＴＰ、 ｄＴＴＰ）の存在下で
逆転写酵素（全酒造■社製２６１ＯＡ）によりｍＲＮＡ
と相補的な単鎖ｃＤＮＡを合成する０次いで、ＲＮａｓ
ｅＨ（全酒造■社製２１５０Ａ ）でｍＲＮＡに切れ目
を入れ、ｍＲＮＡをブライマーとし、ｄＮＴＰの存在下
でＤＮＡポリメラーゼＩ〔全酒造■社製２１４０Ａ ）
を用いて二重鎖ｃＤＮＡを合成する。この合成法はｃＤ
ＮＡ合成キットとして、アマジャム・ジャパン■（ＲＰ
Ｎ、 １２５６Ｙ） 、ベーリンガー・マンハイム山之
内■（１０１３８８２） 、より市販されており、使用
することができる。
＜ｃＤＮＡライブラリーの構築〉
上記二本鎖ｃＤＮＡは、両末端に合成リンカ−を連結す
るかまたは、ターミナルトランスフェラーゼ〔全酒造■
社製２２３０Ａ ）で適切な足部（例えば、ポリＣ）を
付加し、プラスミドベクターやλフアージベクターに結
合させ、ｃＤＮＡライブラリーを構築することができる
。
るかまたは、ターミナルトランスフェラーゼ〔全酒造■
社製２２３０Ａ ）で適切な足部（例えば、ポリＣ）を
付加し、プラスミドベクターやλフアージベクターに結
合させ、ｃＤＮＡライブラリーを構築することができる
。
例えば、二本鎖ｃＤＮＡにＥｃｏＲＩ Ｌｉｎｋｅｒを
Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼで連結し、次いで制
限酵素ＥｃｏＲＩ （全酒造■社製１０４０Ｓ ）で
切断し、ＥｃｏＲＩ粘着末端を持った二本鎖ｃＤＮＡと
し、ファージベクターλｇｔｌｌのＢｃｏＲ１部位に組
込み、ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージング〔アマジャム・
ジャパン■社製Ｎ、３３４Ｙ、プロメガ・バイオチック
社製Ｐ３１５１ ）を行なうことによりｃＤＮＡライブ
ラリーを構築する。
Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼで連結し、次いで制
限酵素ＥｃｏＲＩ （全酒造■社製１０４０Ｓ ）で
切断し、ＥｃｏＲＩ粘着末端を持った二本鎖ｃＤＮＡと
し、ファージベクターλｇｔｌｌのＢｃｏＲ１部位に組
込み、ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージング〔アマジャム・
ジャパン■社製Ｎ、３３４Ｙ、プロメガ・バイオチック
社製Ｐ３１５１ ）を行なうことによりｃＤＮＡライブ
ラリーを構築する。
また、市販されているλｇｔｌｌやλｇｔｌｏのｃＤＮ
Ａライブラリー・キット〔アマジャム・ジャパン■社製
ＲＰＮ、１２８０． ＲＰＮ、１２５７．プロメガ・バ
イオチック社製Ｐ３０１０）も使用することができる。
Ａライブラリー・キット〔アマジャム・ジャパン■社製
ＲＰＮ、１２８０． ＲＰＮ、１２５７．プロメガ・バ
イオチック社製Ｐ３０１０）も使用することができる。
〈フェノールオキシダーゼ遺伝子（１１）のクローニン
グ〉 ｃＤＮＡライブラリーから放射性同位元素で標識化した
フェノールオキシダーゼのＤＮＡプローブを用いて、ブ
ラークハイプリダイゼーシジンやコロニーイ１イブリダ
イゼーションによりフェノールオキシダーゼのｍＲＮＡ
由来ｃ由来Ａをクローニングする。
グ〉 ｃＤＮＡライブラリーから放射性同位元素で標識化した
フェノールオキシダーゼのＤＮＡプローブを用いて、ブ
ラークハイプリダイゼーシジンやコロニーイ１イブリダ
イゼーションによりフェノールオキシダーゼのｍＲＮＡ
由来ｃ由来Ａをクローニングする。
〈サブクローニング〉
得られたフェノールオキシダーゼ遺伝子（ｎ）のサブク
ローニングは以下のように行なう、フェノールオキシダ
ーゼ遺伝子（■）を含むＤＮＡ及びベクターＤＮＡを制
限酵素で切断してｃＤＮＡ断片及びベクターＤＮＡ断片
を調製する０次いで両者の混合物をＴ４ＤＮＡリガーゼ
〔全酒造■社製２０１１Ａ）で処理する。用いられるベ
クターＤＮＡとしては、ｐＢＲ３２２、ｐｕｃｔｅ、ｐ
Ｕｃ１９、ｐＵｃｌｌＢ（全酒造■社製３０５０．３２
１８．３２１９．３３１８）等があげられる。また制限
酵素としては１ＩｉｎｄＩ［［、ＥｃｏＲＩ、Ｐｓｔ
Ｉ 、 ＢａｍＨＩ等〔全酒造■社製１０６０Ｓ、 １
０４０Ｓ。
ローニングは以下のように行なう、フェノールオキシダ
ーゼ遺伝子（■）を含むＤＮＡ及びベクターＤＮＡを制
限酵素で切断してｃＤＮＡ断片及びベクターＤＮＡ断片
を調製する０次いで両者の混合物をＴ４ＤＮＡリガーゼ
〔全酒造■社製２０１１Ａ）で処理する。用いられるベ
クターＤＮＡとしては、ｐＢＲ３２２、ｐｕｃｔｅ、ｐ
Ｕｃ１９、ｐＵｃｌｌＢ（全酒造■社製３０５０．３２
１８．３２１９．３３１８）等があげられる。また制限
酵素としては１ＩｉｎｄＩ［［、ＥｃｏＲＩ、Ｐｓｔ
Ｉ 、 ＢａｍＨＩ等〔全酒造■社製１０６０Ｓ、 １
０４０Ｓ。
１０７３５、１０１０５）があげられる。
（フェノールオキシダーゼ遺伝子（ｎ）の塩基配列の決
定〉 クローニングしたｃＤＮＡを、プラスミドベクターｐＵ
ｃ１１ＢまたはｐＵｃ１１９、またはｐＵｃ１８． ｐ
Ｕｃ１９またはＭ１３ファージにサブクローニングする
。
定〉 クローニングしたｃＤＮＡを、プラスミドベクターｐＵ
ｃ１１ＢまたはｐＵｃ１１９、またはｐＵｃ１８． ｐ
Ｕｃ１９またはＭ１３ファージにサブクローニングする
。
サブクローニングしたＤＮＡ断片は、原理的にＨｅｎ１
ｋｏｆｆの方法およびＹａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎの
方法（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｓ、（１９８４）Ｇｅｎｅ、
２８．３５１〜３５９ Ｙａｎｔｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ
、Ｃ，、Ｖｉｅｉｒａ、Ｊ、ａｎｄ Ｍｅｓｓｉｎｇ＋
Ｊ、（１９８５）Ｇｅｎｅ＋３３．１０３〜１１９ ）
でデリーションミュータントを作成するが市販のデリー
シジン・キット〔全酒造■社製６０３０ ）も使用でき
る。
ｋｏｆｆの方法およびＹａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎの
方法（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｓ、（１９８４）Ｇｅｎｅ、
２８．３５１〜３５９ Ｙａｎｔｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ
、Ｃ，、Ｖｉｅｉｒａ、Ｊ、ａｎｄ Ｍｅｓｓｉｎｇ＋
Ｊ、（１９８５）Ｇｅｎｅ＋３３．１０３〜１１９ ）
でデリーションミュータントを作成するが市販のデリー
シジン・キット〔全酒造■社製６０３０ ）も使用でき
る。
デリーションミュータントは、ジデオキシ法（Ｓａｎｇ
ｅｒ、Ｐ、（１９８１） ５ｃｉｅｎｃｅ、２’１４．
１２０５〜１２１０）により塩基配列を決定する。市販
のシーフェンシング・キット（全酒造■社製６０１０Ａ
、 ６０１５Ａ、ニラポン・ジーン■社製３１７−０１
１２１）も使用できる。
ｅｒ、Ｐ、（１９８１） ５ｃｉｅｎｃｅ、２’１４．
１２０５〜１２１０）により塩基配列を決定する。市販
のシーフェンシング・キット（全酒造■社製６０１０Ａ
、 ６０１５Ａ、ニラポン・ジーン■社製３１７−０１
１２１）も使用できる。
フェノールオキシダーゼ遺伝子（ＩＩ）を含むアラゲカ
ワラタケのｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡはプラスミドｐＵｃ
１９または、ｐＵｃｌｌＢのマルチクローニング部位内
のＨｃｏＲＩ部位にサブクローニングした形態で大腸菌
ＪＭ１０９またはＭＶｌ１８４に常法〔例えば、Ｌｅｄ
ｅｒｂｅｒｇ、Ｅ、Ｍ、＆ Ｃｏｈｅｎ、Ｓ、Ｎ、Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉ−ｏｌｏｇｙ、−■
１．１０７２〜１０７４（１９７４） ）により形質転
換し、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託した。
ワラタケのｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡはプラスミドｐＵｃ
１９または、ｐＵｃｌｌＢのマルチクローニング部位内
のＨｃｏＲＩ部位にサブクローニングした形態で大腸菌
ＪＭ１０９またはＭＶｌ１８４に常法〔例えば、Ｌｅｄ
ｅｒｂｅｒｇ、Ｅ、Ｍ、＆ Ｃｏｈｅｎ、Ｓ、Ｎ、Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉ−ｏｌｏｇｙ、−■
１．１０７２〜１０７４（１９７４） ）により形質転
換し、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託した。
この形質転換大腸菌ＯＪ−ＰＯＭ−５，ＯＪ−ＰＯＭ−
２は工業技術院微生物工業技術研究所に寄託し、それぞ
れその寄託番号は、微工研菌寄第１００５５号（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１００５５）及び微工研菌寄第１００６１号（
ＦＥＲＭ Ｐ−１００６１）である。
２は工業技術院微生物工業技術研究所に寄託し、それぞ
れその寄託番号は、微工研菌寄第１００５５号（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１００５５）及び微工研菌寄第１００６１号（
ＦＥＲＭ Ｐ−１００６１）である。
〈組換えＤＮＡ）
このようにして得られたフェノールオキシダーゼ遺伝子
（ｎ）の利用法は、微生物（特に原核生物）、植物およ
び動物のベクターＤＮＡ等に組込み、微生物、植物およ
び動物に導入し、フェノールオキシダーゼまたは、この
改良タンパク質を著量生産する新規な生物を作成するこ
とを可能ならしめることにある。フェノールオキシダー
ゼ遺伝子（ｎ）をベクターに組込む方法はベクターを適
当な制限酵素で切断し、必要により適当なリンカ−また
はアニーリング可能な組み合せの塩基を複数個重合せし
める。このように加工した二重鎖ＤＮＡとベクターＤＮ
Ａを混合し、リガーゼを用いて接続せしめる。
（ｎ）の利用法は、微生物（特に原核生物）、植物およ
び動物のベクターＤＮＡ等に組込み、微生物、植物およ
び動物に導入し、フェノールオキシダーゼまたは、この
改良タンパク質を著量生産する新規な生物を作成するこ
とを可能ならしめることにある。フェノールオキシダー
ゼ遺伝子（ｎ）をベクターに組込む方法はベクターを適
当な制限酵素で切断し、必要により適当なリンカ−また
はアニーリング可能な組み合せの塩基を複数個重合せし
める。このように加工した二重鎖ＤＮＡとベクターＤＮ
Ａを混合し、リガーゼを用いて接続せしめる。
得られた組換えＤＮＡはベクターの宿主微生物に導入す
る。宿主微生物としてはエシェリヒア・コリ等のエシェ
リヒア属の微生物、バチルス・ズブチリス等のバチルス
属の微生物、サツカロミセス・セレビシェ等のサツカロ
ミセス属の微生物などが好適である。これらの微生物に
使用されるベクターを以下に例示する。（蛋白質核酸酵
素、２８巻、４号（１９８１）参照）。
る。宿主微生物としてはエシェリヒア・コリ等のエシェ
リヒア属の微生物、バチルス・ズブチリス等のバチルス
属の微生物、サツカロミセス・セレビシェ等のサツカロ
ミセス属の微生物などが好適である。これらの微生物に
使用されるベクターを以下に例示する。（蛋白質核酸酵
素、２８巻、４号（１９８１）参照）。
ＥＫ系プラスミドベクター（ストリンジェント型）のｐ
ｓｃｌｏｌ、 ｐＲＫ３５３． ｐＲＫ６４６． ｐＲ
Ｋ２４８． ｐＤＦ４１等、ＥＫ系プラスミドベクター
（リラックスト型）のＣａ１Ｅ１゜ｐＶＨ５１，ｐＡｃ
１０５． Ｒ５Ｆ２１２４． ｐｃＲｌ、 ｐＭＢ９．
ＢＲ３１３，ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２４，ｐＢＲ３
２５，ｐＢＲ３２７，ｐＢＲ３２８，ｐＫＹ２２８９゜
ｐＫＹ２７００． ｐＫＮ８０． ｐＫｃ？、 ｐＫＢ
１５Ｂ、 ｐＭＸ２００４． ｐＡｃＹｃｌ。
ｓｃｌｏｌ、 ｐＲＫ３５３． ｐＲＫ６４６． ｐＲ
Ｋ２４８． ｐＤＦ４１等、ＥＫ系プラスミドベクター
（リラックスト型）のＣａ１Ｅ１゜ｐＶＨ５１，ｐＡｃ
１０５． Ｒ５Ｆ２１２４． ｐｃＲｌ、 ｐＭＢ９．
ＢＲ３１３，ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２４，ｐＢＲ３
２５，ｐＢＲ３２７，ｐＢＲ３２８，ｐＫＹ２２８９゜
ｐＫＹ２７００． ｐＫＮ８０． ｐＫｃ？、 ｐＫＢ
１５Ｂ、 ｐＭＸ２００４． ｐＡｃＹｃｌ。
ｐＡｃＹｃ１８４． λｄｕ１等、λｇｔ系ファージ
ベクターのλｇｔ・λＣ，λｇｔ・λＢ、λ−ＥＳ・λ
Ｂ、λＺＪｖｉｒ・λＢ、λ八ＬＯへλＢ、λＷＥＳ
−Ｔａ２０５．λＤａｍ、λｇｔｌ１等、シャロンベク
ターのシャロン４Ａ、シャロン３Ａ、 シャロン１６
Ａ、シャロン１３Ａ、シャロン１４八、シャロン１５Ａ
、シャロン８、シャロン１０．シャロン１７．シャロン
２０等、チオライス（Ｔｉｏｌａｉｓ）グループベクタ
ーのＬ５１２．λＺＥＱＳ。
ベクターのλｇｔ・λＣ，λｇｔ・λＢ、λ−ＥＳ・λ
Ｂ、λＺＪｖｉｒ・λＢ、λ八ＬＯへλＢ、λＷＥＳ
−Ｔａ２０５．λＤａｍ、λｇｔｌ１等、シャロンベク
ターのシャロン４Ａ、シャロン３Ａ、 シャロン１６
Ａ、シャロン１３Ａ、シャロン１４八、シャロン１５Ａ
、シャロン８、シャロン１０．シャロン１７．シャロン
２０等、チオライス（Ｔｉｏｌａｉｓ）グループベクタ
ーのＬ５１２．λＺＥＱＳ。
λＺＹＶ５φ、、、 ＪＺＵＶφ２． 、ＪＺＵＶφ３
． ＪＹＥＱＳφ１． ＪＹＥＱＳφ。
． ＪＹＥＱＳφ１． ＪＹＥＱＳφ。
λＹＥＱＳφ３１λ３ａｌｌ１１λＳ５１等、枯草菌の
プラスミドベクターｐＴＡ１０１５． ｐＬｓ１５．
ｐＴ＾１０２０． ｐＬＳ２８． ｐＬｓ１３゜ｐＴＡ
１０５０． ｐＴＡ１０６０． ｐＴＡ１０３０． ｐ
ＴＡ１０３１等、スタフィロコッカス由来のプラスミド
ベクターｐＴ１２７． ｐｃ１９４、 ｐｃ２２１．
ｐＣ２２３，ｐＵＢ１１２． ｐＵＢｌｌｏ、 ｐｓＡ
Ｏ５０１，ｐｓＡ。
プラスミドベクターｐＴＡ１０１５． ｐＬｓ１５．
ｐＴ＾１０２０． ｐＬＳ２８． ｐＬｓ１３゜ｐＴＡ
１０５０． ｐＴＡ１０６０． ｐＴＡ１０３０． ｐ
ＴＡ１０３１等、スタフィロコッカス由来のプラスミド
ベクターｐＴ１２７． ｐｃ１９４、 ｐｃ２２１．
ｐＣ２２３，ｐＵＢ１１２． ｐＵＢｌｌｏ、 ｐｓＡ
Ｏ５０１，ｐｓＡ。
５０１、 ｐｓＡ２１００． ｐＥ１９４．ρＴＰ４．
ｐｉｐｓ等、酵母ベクタｐＪＤＢ２１９． ＹＥｐ１
３． ＹＲｐ７． Ｙｌｐｌ、 ｐＹＣ，ｐＴＣ２。
ｐｉｐｓ等、酵母ベクタｐＪＤＢ２１９． ＹＥｐ１
３． ＹＲｐ７． Ｙｌｐｌ、 ｐＹＣ，ｐＴＣ２。
微生物のベクター、例えばｐＢＲ３２２などのＰｓｔｌ
あるいはＥｃｏＲＩ ５ｉｔｅなど目的に応じた個所に
大腸菌由来のプロモーター領域、例えばｌａｃ、 ｔｒ
ｐおよびｔａｃなどにｉｎ−ｆｒａｍｅに接続し組み込
み、適当な宿主に形質転換してそのフェノールオキシダ
ーゼを宿主中で発現させることができる。
あるいはＥｃｏＲＩ ５ｉｔｅなど目的に応じた個所に
大腸菌由来のプロモーター領域、例えばｌａｃ、 ｔｒ
ｐおよびｔａｃなどにｉｎ−ｆｒａｍｅに接続し組み込
み、適当な宿主に形質転換してそのフェノールオキシダ
ーゼを宿主中で発現させることができる。
また、植物においてはＴｉ−プラスミド由来のＴ−ＤＮ
Ａのｔｗｒｊｉｌ域を含むｐＡＬ１０５０ベクターなど
これに類する方法を用いて遺伝子を植物に導入する。
Ａのｔｗｒｊｉｌ域を含むｐＡＬ１０５０ベクターなど
これに類する方法を用いて遺伝子を植物に導入する。
組み変えＤＮＡを挿入する場合、ｔｍｒのリーダー配列
にｉｎ−ｆｒａｍｅに接続し、終止コドンもｔｍｒのも
のを利用する。
にｉｎ−ｆｒａｍｅに接続し、終止コドンもｔｍｒのも
のを利用する。
本発明において、アミノ酸、ポリペプチドはｒｕｐＡｃ
−ｔｕｅ生化学委員会（ＣＢＮ）ｔ’採用サすタ方法に
より略記するものとし、たとえば下記の略号を用いる。
−ｔｕｅ生化学委員会（ＣＢＮ）ｔ’採用サすタ方法に
より略記するものとし、たとえば下記の略号を用いる。
＾１ａ Ｌ−アラニン
Ａｒｇ Ｌ−アルギニン
＾ｓｎ Ｌ−アスパラギン
Ａｓｐ Ｌ−アスパラギン酸
Ｃｙｓ Ｌ−システィン
Ｇｌｎ Ｌ−グルタミン
Ｇｌｕ Ｌ−グルタミン酸
ｃｔｙ グリシン
１１ｉｓ Ｌ−ヒスチジン
１１ｅ Ｌ−イソロイシン
Ｌｅｕ Ｌ−ロイシン
Ｌｙｓ Ｌ−リジン
Ｍｅｔ Ｌ−メチオニン
Ｐｈｅ Ｌ−フェニルアラニン
Ｐｒｏ Ｌ−プロリン
Ｓｅｒ Ｌ−セリン
Ｔｈｒ、、Ｌ−スレオニン
Ｔｒｐ Ｌ−トリブトファン
Ｔｙｒ Ｌ−チロシン
Ｖａｌ Ｌ−バリン
また、ＤＮＡの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
下記の略号を用いる。
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
下記の略号を用いる。
Ａ アデニン（デオキシアデニル酸を示す。）Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル酸を示す。）Ｇ グアニン（デオ
キシグアニル酸を示す。）Ｔ チミン （デオキシチ
ミジル酸を示す。）〔実施例〕 以下実施例により、白色腐朽菌のｍＲＮＡ由来のフェノ
ールオキシダーゼ遺伝子（ＩＩ）のクローニング及び塩
基配列の決定について詳細に説明する。
ン（デオキシシチジル酸を示す。）Ｇ グアニン（デオ
キシグアニル酸を示す。）Ｔ チミン （デオキシチ
ミジル酸を示す。）〔実施例〕 以下実施例により、白色腐朽菌のｍＲＮＡ由来のフェノ
ールオキシダーゼ遺伝子（ＩＩ）のクローニング及び塩
基配列の決定について詳細に説明する。
実施例１
＜ＤＮＡプローブの合成〉
ＤＮＡプローブの合成は、アミダイト法により、ＤＮＡ
合成機（日本ゼオン＋ＧｅｎｅｔＡ −１［［）を用い
て行なった。
合成機（日本ゼオン＋ＧｅｎｅｔＡ −１［［）を用い
て行なった。
３種の白色腐朽菌〔アラゲカワラタケ（ＩＦＱ ４９１
７）。
７）。
カワラタケ（ＩＦＯ３０３４０）、カイガラタケ（ＩＦ
Ｏ８７１４） ）から精製したフェノールオキシダーゼ
のＮ末端からのアミノ酸配列をエドマン分解法で２５段
目まで分析した結果を次に示す。
Ｏ８７１４） ）から精製したフェノールオキシダーゼ
のＮ末端からのアミノ酸配列をエドマン分解法で２５段
目まで分析した結果を次に示す。
Ｎ末１段目
カワラタケ ＾１ａ−八ｒｇへＧｌｎ−＾１ａ
−Ｖａｔカイガラタケ ＾Ｉａ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ
−八Ｉａ−Ｖａｌ−上記配への１７段目のＰｒｏから２
５段目のＶａｌ に対応するように、次のＤＮＡプロー
ブを合成した。
−Ｖａｔカイガラタケ ＾Ｉａ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ
−八Ｉａ−Ｖａｌ−上記配への１７段目のＰｒｏから２
５段目のＶａｌ に対応するように、次のＤＮＡプロー
ブを合成した。
但し■はデオキシイノシン。
２６ｍｅｒ−Ｃ（１６＊ｉｘ） ３’−ＣＣＩ−ＧＡ
Ｃ−ＧＧＩ−ＴＴＣ−ＧＣＩ−八Ｇ＾−ＣＡ＾−ＧＣＩ
−ＧＴ−５゜Ｔ Ｔ ＧＧ また、３種の白色腐朽菌のフェノールオキシダーゼをＢ
ｒＣＮで分解し、逆相系高速液体クロマトグラフィー〔
溶出条件、カラム： Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷ ＲＰ（東
洋ソーダ社製）、 溶出液２０％アセトニトリル１０
．１％ＴＦＡから７５％アセトリトリル１０，１％ＴＦ
Ａへの濃度勾配溶出１室温〕で分離したポリペプチドの
アミノ酸配列をエドマン分解法で分析した結果を次に示
す。
Ｃ−ＧＧＩ−ＴＴＣ−ＧＣＩ−八Ｇ＾−ＣＡ＾−ＧＣＩ
−ＧＴ−５゜Ｔ Ｔ ＧＧ また、３種の白色腐朽菌のフェノールオキシダーゼをＢ
ｒＣＮで分解し、逆相系高速液体クロマトグラフィー〔
溶出条件、カラム： Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷ ＲＰ（東
洋ソーダ社製）、 溶出液２０％アセトニトリル１０
．１％ＴＦＡから７５％アセトリトリル１０，１％ＴＦ
Ａへの濃度勾配溶出１室温〕で分離したポリペプチドの
アミノ酸配列をエドマン分解法で分析した結果を次に示
す。
アラゲカワラタケ Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａ
ｓｎ−Ｐｈｅ力７ラタケ Ｍｅｔ−Ａｌａ
−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｈｅｈイガラタケ Ｍ
ｅｔ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ上記アミノ酸配
列に対応するように次のＤＮＡプローブを合成した。
ｓｎ−Ｐｈｅ力７ラタケ Ｍｅｔ−Ａｌａ
−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｈｅｈイガラタケ Ｍ
ｅｔ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ上記アミノ酸配
列に対応するように次のＤＮＡプローブを合成した。
以上の結果から白色腐朽菌が生産、分泌するフェノール
オキシダーゼのアミノ酸配列の相同性は非常に高く、本
発明で使用するＤＮＡプローブを用いることにより、い
かなる白色腐朽菌のフェノールオキシダーゼ遺伝子（ｎ
）をもクローニングすることができる。したがって以下
の実施例では、アラゲカワラタケのフェノールオキシダ
ーゼ遺伝子（ＩＩ）のクローニング方法について説明す
る。
オキシダーゼのアミノ酸配列の相同性は非常に高く、本
発明で使用するＤＮＡプローブを用いることにより、い
かなる白色腐朽菌のフェノールオキシダーゼ遺伝子（ｎ
）をもクローニングすることができる。したがって以下
の実施例では、アラゲカワラタケのフェノールオキシダ
ーゼ遺伝子（ＩＩ）のクローニング方法について説明す
る。
実施例２
＜ｍＲＮＡの調製〉
アラゲカワラタケ（ＩＦＯ４９１７）を１１のＹＰＤ培
地（酵母エキス１０ｇ／ ｌ 、ポリペプトン２０ｇ／
Ｉ！ 、グルコース２０ｇ／β）が入った５１容三角
フラスコに植菌し、２７°Ｃ，６日間振盪培養した。培
養液中にフェノールオキシダーゼを生産１分泌している
ことを確認した後、集菌し、液体窒素中で凍結りまた結
果、約２０ｇの凍結菌体を得た。
地（酵母エキス１０ｇ／ ｌ 、ポリペプトン２０ｇ／
Ｉ！ 、グルコース２０ｇ／β）が入った５１容三角
フラスコに植菌し、２７°Ｃ，６日間振盪培養した。培
養液中にフェノールオキシダーゼを生産１分泌している
ことを確認した後、集菌し、液体窒素中で凍結りまた結
果、約２０ｇの凍結菌体を得た。
Ｂｒｏｄａ等の方法により、凍結菌体５ｇから１１ ｍ
ｇの全ｍＲＮＡを抽出した。凍結菌体５ｇを液体窒素を
加えた１００−のワーリングブレンダーで破砕し、３倍
量のＴＮＳ緩衝液〔１χｔｒｉ−ｉｓｏ−Ｐｒｏｐｙｌ
ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ ５ｕｌｐｈｏｎｉｃ ａｃｉ
ｄ＋ ２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１＋２５ｍＭ ＥＧ
ＴＡ （ｐＨ７，８）、２５０ｍＭ ＮａＣ＋ ）に溶
かす。遠心分離によりペレットを除き、上清１ｄにつき
、０．５ｇのフェノールを加え、５〜１５°Ｃに保ち溶
解する。全てのフェノールが溶けたらη量のクロロホル
ムを加え、遠心分離後、上清を回収し、クロロホルムで
２回抽出した後、エタノール沈澱により全ｍＲＮＡ１１
ｍｇを回収した。
ｇの全ｍＲＮＡを抽出した。凍結菌体５ｇを液体窒素を
加えた１００−のワーリングブレンダーで破砕し、３倍
量のＴＮＳ緩衝液〔１χｔｒｉ−ｉｓｏ−Ｐｒｏｐｙｌ
ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ ５ｕｌｐｈｏｎｉｃ ａｃｉ
ｄ＋ ２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１＋２５ｍＭ ＥＧ
ＴＡ （ｐＨ７，８）、２５０ｍＭ ＮａＣ＋ ）に溶
かす。遠心分離によりペレットを除き、上清１ｄにつき
、０．５ｇのフェノールを加え、５〜１５°Ｃに保ち溶
解する。全てのフェノールが溶けたらη量のクロロホル
ムを加え、遠心分離後、上清を回収し、クロロホルムで
２回抽出した後、エタノール沈澱により全ｍＲＮＡ１１
ｍｇを回収した。
また、市販のＲＮＡ抽出キット〔アマジャム・ジャパン
■社製〕を用いた場合は、３ｇの凍結菌体から６．７■
の全ｍＲＮＡを抽出することができた。
■社製〕を用いた場合は、３ｇの凍結菌体から６．７■
の全ｍＲＮＡを抽出することができた。
上述の２方法で回収した全ｍＲＮＡは、フェノールオキ
シダーゼのＤＮＡプローブによるノーザン・プロット・
ハイブリダイゼーション法（Ｔｈｏ−ｍａｓ＋Ｐ、Ｓ、
、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ ７
７、５２０１ （１９８０）〕により、フェノールオキ
シダーゼ遺伝子（ＩＩ）由来のｍＲＮＡを含むことを確
認した。
シダーゼのＤＮＡプローブによるノーザン・プロット・
ハイブリダイゼーション法（Ｔｈｏ−ｍａｓ＋Ｐ、Ｓ、
、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ ７
７、５２０１ （１９８０）〕により、フェノールオキ
シダーゼ遺伝子（ＩＩ）由来のｍＲＮＡを含むことを確
認した。
全ｍＲＮＡ５１１ｇをオリゴ（ｄＴ）セルロースカラム
を使用するＭａｎｉａｔｉｓ等の方法（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ（ｔｈｇ、Ｍｏ１ｅ−ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｒｙ Ｍａｎｕａｌ＋１９７〜１９
９．１９８２）を用いてポリ （Ａ） ｍ ＲＮ Ａの
分離・精製を行ない、約１００μｇのポリ （Ａ） ｍ
ＲＮ Ａを精製した。
を使用するＭａｎｉａｔｉｓ等の方法（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ（ｔｈｇ、Ｍｏ１ｅ−ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｒｙ Ｍａｎｕａｌ＋１９７〜１９
９．１９８２）を用いてポリ （Ａ） ｍ ＲＮ Ａの
分離・精製を行ない、約１００μｇのポリ （Ａ） ｍ
ＲＮ Ａを精製した。
実施例３
（ｃＤＮＡの合成〉
白色腐朽菌アラゲカワラクケ由来ポリ （Ａ）ｍＲＮＡ
よりｃ ＤＮＡの合成は、ＧｕｂｌｅｒとＨｏｆｆｍａ
ｎの方法（Ｕ、Ｇｕｂｉｅｒ ＆ Ｂ、Ｊ、Ｈｏｆｆｍ
ａｎ ； Ｇｅｎｅ、２５，２６３〜２６９（１９８３
）参照〕に従い、アマジャム・ジャパン製ｃＤＮＡ合成
キットを用いておこなった。
よりｃ ＤＮＡの合成は、ＧｕｂｌｅｒとＨｏｆｆｍａ
ｎの方法（Ｕ、Ｇｕｂｉｅｒ ＆ Ｂ、Ｊ、Ｈｏｆｆｍ
ａｎ ； Ｇｅｎｅ、２５，２６３〜２６９（１９８３
）参照〕に従い、アマジャム・ジャパン製ｃＤＮＡ合成
キットを用いておこなった。
５μｇのポリ （Ａ） ｍ ＲＮ Ａに５０ユニツトの
ヒト胎児由来ＲＮａｓｅ阻害酵素（ＨＰＲＩ）の存在下
５μｇの０１１ｇｏ（ｄＴ） １２〜１８（ファルマシ
ア社製２７−７８５８−０１）を加え１００ユニツトの
逆転写酵素を４２°Ｃで１．５時間反応させて約３０％
の収率で１本１ｉｃＤＮＡを合成した。この反応液に４
ユニツトの大腸菌リボヌクレアーゼＨと１１５ユニツト
の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを加え１２℃で１時間、
２２°Ｃで１時間反応させた後７０°Ｃで１０分間放置
して酵素を失活させた。その後ＩＯユニットのＴ４ＤＮ
Ａポリメラーゼを加え３７″Ｃで１０分間反応させて、
約９５％の収率で２末鎖ｃＤＮＡを得た。
ヒト胎児由来ＲＮａｓｅ阻害酵素（ＨＰＲＩ）の存在下
５μｇの０１１ｇｏ（ｄＴ） １２〜１８（ファルマシ
ア社製２７−７８５８−０１）を加え１００ユニツトの
逆転写酵素を４２°Ｃで１．５時間反応させて約３０％
の収率で１本１ｉｃＤＮＡを合成した。この反応液に４
ユニツトの大腸菌リボヌクレアーゼＨと１１５ユニツト
の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを加え１２℃で１時間、
２２°Ｃで１時間反応させた後７０°Ｃで１０分間放置
して酵素を失活させた。その後ＩＯユニットのＴ４ＤＮ
Ａポリメラーゼを加え３７″Ｃで１０分間反応させて、
約９５％の収率で２末鎖ｃＤＮＡを得た。
実施例４
（ｃＤＮＡライブラリーの構築〉
市販のλｇｔｌｌクローニングシステム〔アマジャム・
ジャパン■社製〕を用いて、ｃＤＮＡライブラリーを構
築した。
ジャパン■社製〕を用いて、ｃＤＮＡライブラリーを構
築した。
１００μｇの２本１１ｃＤＮＡを２０ユニツトのＥｃｏ
ＲＩメチラーゼを３７°Ｃで１時間反応させた後、Ｅｃ
ｏＲＩリンカ−を結合させた、これに１６ユニフトのＥ
ｃｏＲＩを加え３７°Ｃで２時間反応させた後、５ｅｐ
ｈａｒｏｓｅ ＣＬ４Ｂカラムを通し、純化した。λｇ
ｔｌｌアーム１μｇとの連結反応後、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
パッケージング〔＾。
ＲＩメチラーゼを３７°Ｃで１時間反応させた後、Ｅｃ
ｏＲＩリンカ−を結合させた、これに１６ユニフトのＥ
ｃｏＲＩを加え３７°Ｃで２時間反応させた後、５ｅｐ
ｈａｒｏｓｅ ＣＬ４Ｂカラムを通し、純化した。λｇ
ｔｌｌアーム１μｇとの連結反応後、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
パッケージング〔＾。
Ｂｅｃｋｅｒ ＆ Ｍ、Ｇｏｌｄ；Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＬＩＳ＾、 ７２．５８１（１９
７５）参照〕を行ない、１０＆個の組換え体λファージ
を得て、アラゲカワラタケのｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡラ
イブラリーとした。
、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＬＩＳ＾、 ７２．５８１（１９
７５）参照〕を行ない、１０＆個の組換え体λファージ
を得て、アラゲカワラタケのｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡラ
イブラリーとした。
実施例５
くフェノールオキシダーゼ遺伝子（ＩＩ）のクローニン
グ〉 実施例４で得られたアラゲカヮラタケのｍＲＮＡ由来の
ｃＤＮＡライブラリーを大腸菌Ｙ１０９０株に感染させ
、プラークを形成させた。
グ〉 実施例４で得られたアラゲカヮラタケのｍＲＮＡ由来の
ｃＤＮＡライブラリーを大腸菌Ｙ１０９０株に感染させ
、プラークを形成させた。
フェノールオキシダーゼ遺伝子（ｎ）を含むクローンは
、放射性同位元素〔γ）”Ｐ）ＡＴＰ〔アマジャム・ジ
ャパン■社製ＰＢ１０１６８）とＴ４ポリヌクレオチド
キナーゼ〔宝酒造■社製２０２１Ａ）を用いて標識化（
Ｒｉｃｈａｒｄ ｓｏｎ、Ｃ，Ｃ，（１９６５）、 Ｐ
ｒｏｃ。
、放射性同位元素〔γ）”Ｐ）ＡＴＰ〔アマジャム・ジ
ャパン■社製ＰＢ１０１６８）とＴ４ポリヌクレオチド
キナーゼ〔宝酒造■社製２０２１Ａ）を用いて標識化（
Ｒｉｃｈａｒｄ ｓｏｎ、Ｃ，Ｃ，（１９６５）、 Ｐ
ｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、 ５４．
１５８〜１６１参照〕した実施例１の合成りＮＡプロー
ブを用いてＢｅｎ ｔｏｎとＤａｖｉｓのプラークハイ
ブリダイゼーション法〔−０Ｄ、Ｂｅｎｔｏｎ ＆ Ｒ
，Ｗ、 Ｄａｖｉｓ： ５ｃｉｅｎｃｅ、 １９６ １
８０（１９７７）参照〕に従って２種のクローンを選別
した。
１５８〜１６１参照〕した実施例１の合成りＮＡプロー
ブを用いてＢｅｎ ｔｏｎとＤａｖｉｓのプラークハイ
ブリダイゼーション法〔−０Ｄ、Ｂｅｎｔｏｎ ＆ Ｒ
，Ｗ、 Ｄａｖｉｓ： ５ｃｉｅｎｃｅ、 １９６ １
８０（１９７７）参照〕に従って２種のクローンを選別
した。
フェノールオキシダーゼ遺伝子（ＩＩ）を含む７ｇ ｉ
ｌｌ ファージからのＤＮＡの精製は、Ｔｈｏｍａｓと
Ｄａｖｉｓの方法（Ｍ、Ｔｈｏｍａｓ ＆ Ｒ，Ｗ、Ｄ
ａｖｉｓ ； Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、 ９１．３１５（１９７４）参照
）により行なった。
ｌｌ ファージからのＤＮＡの精製は、Ｔｈｏｍａｓと
Ｄａｖｉｓの方法（Ｍ、Ｔｈｏｍａｓ ＆ Ｒ，Ｗ、Ｄ
ａｖｉｓ ； Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、 ９１．３１５（１９７４）参照
）により行なった。
実施例６
くフェノールオキシダーゼ遺伝子（ＩＩ）の塩基配列の
決定Σ 実施例５で得られたフェノールオキシダーゼ遺転子（Ｉ
Ｉ）を含む２クロ一ンλｇｔｌｌ Ｄ Ｎ Ａを制限酵
素ＥｃｏＲＩで切断し、挿入されていたフェノールオキ
シダーゼ遺伝子を切り出し、プラスミドベクターｐＵｃ
１９とｐＵｃ１１８のＥｃｏＲｒ部位にサブクローニン
グした。
決定Σ 実施例５で得られたフェノールオキシダーゼ遺転子（Ｉ
Ｉ）を含む２クロ一ンλｇｔｌｌ Ｄ Ｎ Ａを制限酵
素ＥｃｏＲＩで切断し、挿入されていたフェノールオキ
シダーゼ遺伝子を切り出し、プラスミドベクターｐＵｃ
１９とｐＵｃ１１８のＥｃｏＲｒ部位にサブクローニン
グした。
ρ［ＩＣ１９にサブクローニングしたクローンをＯＪ−
ＰＯＭ５としｐｕｃｉ １８にサブクローニングしたク
ローンをＯＪ−ＰＯＭ２とした。
ＰＯＭ５としｐｕｃｉ １８にサブクローニングしたク
ローンをＯＪ−ＰＯＭ２とした。
サブクローニングしたｃＤＮＡの制限酵素切断地図を常
法により作成し、図１に示す。
法により作成し、図１に示す。
ＯＪ−ＰＯＭ５とＯＪ−ＰＯＭ２の制限酵素地図は同じ
であった。
であった。
サブクローニングしたｃＤＮＡから市販のプリージョン
キット〔宝酒造■社製］を用いてデリーションミュータ
ントを作製し、市販のＭ１３シークエンシングキット〔
宝酒造■社製〕を用いてジデオキシ法によりフェノール
オキシダーゼ遺伝子（ＩＩ）の塩基配列を決定した。同
時にフェノールオキシダーゼの全アミノ酸配列も決定し
た。フェノールオキシダーゼの塩基配列と全アミノ酸配
列を第２図（ＯＪ−ＰＯＭ ５）及び第３図（ＯＪ−Ｐ
ＯＭ ２）に示す。
キット〔宝酒造■社製］を用いてデリーションミュータ
ントを作製し、市販のＭ１３シークエンシングキット〔
宝酒造■社製〕を用いてジデオキシ法によりフェノール
オキシダーゼ遺伝子（ＩＩ）の塩基配列を決定した。同
時にフェノールオキシダーゼの全アミノ酸配列も決定し
た。フェノールオキシダーゼの塩基配列と全アミノ酸配
列を第２図（ＯＪ−ＰＯＭ ５）及び第３図（ＯＪ−Ｐ
ＯＭ ２）に示す。
ＯＪ−ＰＯＭ５とＯＪ−ＰＯＭ２は、１７個の塩基が異
なっていたが、アミノ酸は、１つ異なっているだけであ
った。
なっていたが、アミノ酸は、１つ異なっているだけであ
った。
本発明により、次の効果がある。
■ フェノールオキシダーゼの全アミノ酸配列の提供に
よりリグニン分解におけるフェノールオキシダーゼの役
割が解明され、バイオロジカルパルピングに応用できる
。
よりリグニン分解におけるフェノールオキシダーゼの役
割が解明され、バイオロジカルパルピングに応用できる
。
■ フェノールオキシダーゼをコードしているＤＮＡは
、他の生物に様々な方法（例えば、プラスミド、コスミ
ド、ファージ、ウィルスなどのベクターに連結し、形質
転換や形質導入で組換え体を作成する方法、または、Ｄ
ＮＡ断片を直接エレクトロポレーションなどで導入し組
換え体を作成する方法）で組換えることができ、フェノ
ールオキシダーゼを著量生産する新規な生物を作成する
ことができる。
、他の生物に様々な方法（例えば、プラスミド、コスミ
ド、ファージ、ウィルスなどのベクターに連結し、形質
転換や形質導入で組換え体を作成する方法、または、Ｄ
ＮＡ断片を直接エレクトロポレーションなどで導入し組
換え体を作成する方法）で組換えることができ、フェノ
ールオキシダーゼを著量生産する新規な生物を作成する
ことができる。
■ フェノールオキシダーゼをコードしているＤＮＡを
組換えた新規生物を用いて著量生産したフェノールオキ
シダーゼはセルラーゼやヘミセルラーゼの混入がなく、
バイオロジカルパルピングに利用でき、かつ、パルプ収
量の低下がない。
組換えた新規生物を用いて著量生産したフェノールオキ
シダーゼはセルラーゼやヘミセルラーゼの混入がなく、
バイオロジカルパルピングに利用でき、かつ、パルプ収
量の低下がない。
■ フェノールオキシダーゼをコードしているＤＮＡを
ｍ換えた新規生物で生産させたフェノールオキシダーゼ
は、純度が高く、酵素活性測定用試薬や基質、またビリ
ルビン定量用試薬など、臨床試験用試薬としてすぐれた
品質の酵素として利用できる。
ｍ換えた新規生物で生産させたフェノールオキシダーゼ
は、純度が高く、酵素活性測定用試薬や基質、またビリ
ルビン定量用試薬など、臨床試験用試薬としてすぐれた
品質の酵素として利用できる。
第１図は、アラゲカワラタケのｍ ＲＮ Ａ由来のフェ
ノールオキシダーゼ遺伝子（ＩＩ）の制限酵素切断地図
を示す、斜線部分にフェノールオキシダーゼがコードさ
れている。 第２図は、フェノールオキシダーゼ遺伝子（ＩＩ）（Ｏ
Ｊ−ＰＯＭ ５）の塩基配列と全アミノ酸配列を示し、
第３図はフェノールオキシダーゼ遺伝子（ＩＩ）（ＯＪ
−ＰＯＭ ２）の塩基配列と全アミノ酸配列を示す。 第 ２ 図 （その１） Ａ１ａＩ１ｅＧ１ｙＰｒｏＴｈｒＡ１ａＡｓｐＬｅｕＴ
ｈｒＩ１ｅＳｅｒＡｓｎ八ＩａＧ１ｕＶａＩＳｅｒＰｒ
ｏＡｓｐＧ１ｙＰｈｅＡ１ａＡｒｇＧ１ｎＡ１ａＶａＩ
ＶａＩＶａＩＡｓｎＡｓｒｉＶａｌＴｈｒＰｒｏＧ１ｙ
ＰｒｏＬｅｕＶａ１八］ａＧ１ｙＡｓｎＬｙｓＧ１ｙＡ
ｓｐＡｒｇＰｈｅＧ１ｎＬｅｕＡｓｎＶａＩＩ１ｅＡｓ
ｐＡｓｎＬｅｕＴｈｒＡｓｎＨｉｓＴｈｒＭｅｔＬｅｕ
ＬｙｓＳｅｒＴｈｒＳｅｒＩ１ｅＨｉｓＴｒｐＨｉｓＧ
１ｙＰｈｅＰｈｅＧ１ｎＬｙｓＧ１ｙＴｈｒＡｓｎＴｒ
ｐ’Ａ１ａＡｓｐＧ１ｙＰｒｏＡ１ａＰｈｅＶａＩＡｓ
ｎＧ１ｎＣｙｓＰｒｏＩ １ｅＳｅｒＳｅｒＧ１ｙＨｉ
ｓＳｅｒＰｈｅＬｅｕＴｙｒＡｓｐＰｈｅＧ１ｎＶａＪ
．ＰｒｏＡｓｐＧ１ｎＡｌａＧ１ｙＴｈｒＰｈｅＴｒｐ
ＴｙｒＨｉｓＳｅｒＨｉｓＬｅｕＳｅｒＴｈｒＧ１ｎＴ
ｙｒＣｙｓＡｓｐＧ１ｙＬｅｕＡｒｇＧ１ｙＰｒｏＰｈ
ｅＶａＩＶａＩＴｙｒＡｓｐＰｒｏＡｓｎＡｓ，ｐＰｒ
ｏＨｉｓＡＩａＳｅｒＬｅｕＴｙｒＡｓｐＶａＩＡｓｐ
ＡｓｎＡｓｐＡｓｐＴｈｒＶａＩＩ１ｅＡｓｎＬｅｕＡ
１ａＡｓｐＴｒｐＴｙｒＨｉｓＴｈｒＡ１ａＡ１ａＬｙ
ｓＬｅｕＧ１ｙＰｒ０八１ａＰｈｅＰｒｏＬｅｕＧ１ｙ
Ａ１ａＡｓｐＡ１ａＴｈｒＴｈｒＡ１ａＡ１ａＡｓｐＬ
ｅｕＡ１ａＶａＩ Ｉ １ｅＡｓｎＶａＩＴｈｒＬｙｓ
Ｇ１ｙＬｙｓＡｒｇＴｙｒＡｒｇＰ｝ｉｅＡｒｇＬｅｕ
第 ２ 図 （その２） Ｖａ Ｉ ＳｅｒＬｅｕＳｅｒＣｙｓ Ａｓ ｐＰｒｏ
Ａｓ ｎＨ ｉ ｓ Ｔｈｒ−ＰｈｅＳｅｒ Ｉ １
ｅＡｓ ｐＧ １ ｙＨ ｉ ｓ Ａｓ ｐＬｅｕＴｈ
ｒＩ １ ｅＩ １ｅＧ １ ｕＶａ ＩＡｓｐＳｅｒ
Ｉ １ｅＡｓｎＳｅｒＧ１ ｎＰｒｏＬｅｕＶａ Ｉ
Ｖａ Ｉ ＡｓｐＳｅｒＩ １ｅＧ １ ｎ Ｉ １ｅ
ＰｈｅＡ ｌａＡ １ ａＧ １ ｎＡｒｇＴｙｒｓｅ
ｒＰｈｅＶａ Ｉ ＬｅｕＡｓｎＡ １ ａＡｓ ｐＧ
１ ｎＡｓｐＶａ Ｉ Ｇ １ ｙＡｓｎＴｙｒＴｒ
ｐ Ｉ １ ｅＡ ｒｇＡ １ ａＡｓ ｎＰｒｏＡｓ
ｎＰｈｅＧ １ ｙＡｓｎＶａ Ｉ Ｇ １ ｙＰｈｅ
Ａ １ ａＧ １ ｙＧ １ ｙ Ｉ １ ｅＡｓｎＳ
ｅｒＡ １ ａ Ｉ １ ｅＬｅｕＡｒｇＴｙｒＡｓ
ｐＧ ｌ ｙＡ １ ａＡｓ ｐＰｒｏＶａ Ｉ Ｇ
１ ｕＰｒｏＴｈｒＴｈｒＴｈｒＧ １ ｎＴｈｒＴｈ
ｒＰｒｏＴｈｒＬｙｓ ＰｒｏＬｅｕＡｓｎＧ１ｕＶａ
ＩＡｓｐＬｅｕＨｉｓＰｒｏＬｅｕＡ１ａＴｈｒＭｅｔ
八１ａＶａＩＰｒｏＧ１ｙＳｅｒＰｒｏＶａＩＡ１ａＧ
１ｙＧ１ｙＶａｌＡｓｐＴｈ−ｒＡ１ａＩ １ｅＡｓｎ
ＭｅｔＡＩＧ １ ｙＡ １ ａＳｅｒＰｈｅＶａ Ｉ
ＰｒｏＰｒｏＴｈｒＶａＡｓｎＡｌａＧ１ｎＡｓｐＬ
ｅｕＬｅｕＰｒｏｓｅｒＧＩＧ １ ｕ Ｉ １ ｅＳ
ｅｒＰｈｅＰｒｏＡ １ ａＴｈｒＡ １ ａＡ １第
３ 図 （その３）
ノールオキシダーゼ遺伝子（ＩＩ）の制限酵素切断地図
を示す、斜線部分にフェノールオキシダーゼがコードさ
れている。 第２図は、フェノールオキシダーゼ遺伝子（ＩＩ）（Ｏ
Ｊ−ＰＯＭ ５）の塩基配列と全アミノ酸配列を示し、
第３図はフェノールオキシダーゼ遺伝子（ＩＩ）（ＯＪ
−ＰＯＭ ２）の塩基配列と全アミノ酸配列を示す。 第 ２ 図 （その１） Ａ１ａＩ１ｅＧ１ｙＰｒｏＴｈｒＡ１ａＡｓｐＬｅｕＴ
ｈｒＩ１ｅＳｅｒＡｓｎ八ＩａＧ１ｕＶａＩＳｅｒＰｒ
ｏＡｓｐＧ１ｙＰｈｅＡ１ａＡｒｇＧ１ｎＡ１ａＶａＩ
ＶａＩＶａＩＡｓｎＡｓｒｉＶａｌＴｈｒＰｒｏＧ１ｙ
ＰｒｏＬｅｕＶａ１八］ａＧ１ｙＡｓｎＬｙｓＧ１ｙＡ
ｓｐＡｒｇＰｈｅＧ１ｎＬｅｕＡｓｎＶａＩＩ１ｅＡｓ
ｐＡｓｎＬｅｕＴｈｒＡｓｎＨｉｓＴｈｒＭｅｔＬｅｕ
ＬｙｓＳｅｒＴｈｒＳｅｒＩ１ｅＨｉｓＴｒｐＨｉｓＧ
１ｙＰｈｅＰｈｅＧ１ｎＬｙｓＧ１ｙＴｈｒＡｓｎＴｒ
ｐ’Ａ１ａＡｓｐＧ１ｙＰｒｏＡ１ａＰｈｅＶａＩＡｓ
ｎＧ１ｎＣｙｓＰｒｏＩ １ｅＳｅｒＳｅｒＧ１ｙＨｉ
ｓＳｅｒＰｈｅＬｅｕＴｙｒＡｓｐＰｈｅＧ１ｎＶａＪ
．ＰｒｏＡｓｐＧ１ｎＡｌａＧ１ｙＴｈｒＰｈｅＴｒｐ
ＴｙｒＨｉｓＳｅｒＨｉｓＬｅｕＳｅｒＴｈｒＧ１ｎＴ
ｙｒＣｙｓＡｓｐＧ１ｙＬｅｕＡｒｇＧ１ｙＰｒｏＰｈ
ｅＶａＩＶａＩＴｙｒＡｓｐＰｒｏＡｓｎＡｓ，ｐＰｒ
ｏＨｉｓＡＩａＳｅｒＬｅｕＴｙｒＡｓｐＶａＩＡｓｐ
ＡｓｎＡｓｐＡｓｐＴｈｒＶａＩＩ１ｅＡｓｎＬｅｕＡ
１ａＡｓｐＴｒｐＴｙｒＨｉｓＴｈｒＡ１ａＡ１ａＬｙ
ｓＬｅｕＧ１ｙＰｒ０八１ａＰｈｅＰｒｏＬｅｕＧ１ｙ
Ａ１ａＡｓｐＡ１ａＴｈｒＴｈｒＡ１ａＡ１ａＡｓｐＬ
ｅｕＡ１ａＶａＩ Ｉ １ｅＡｓｎＶａＩＴｈｒＬｙｓ
Ｇ１ｙＬｙｓＡｒｇＴｙｒＡｒｇＰ｝ｉｅＡｒｇＬｅｕ
第 ２ 図 （その２） Ｖａ Ｉ ＳｅｒＬｅｕＳｅｒＣｙｓ Ａｓ ｐＰｒｏ
Ａｓ ｎＨ ｉ ｓ Ｔｈｒ−ＰｈｅＳｅｒ Ｉ １
ｅＡｓ ｐＧ １ ｙＨ ｉ ｓ Ａｓ ｐＬｅｕＴｈ
ｒＩ １ ｅＩ １ｅＧ １ ｕＶａ ＩＡｓｐＳｅｒ
Ｉ １ｅＡｓｎＳｅｒＧ１ ｎＰｒｏＬｅｕＶａ Ｉ
Ｖａ Ｉ ＡｓｐＳｅｒＩ １ｅＧ １ ｎ Ｉ １ｅ
ＰｈｅＡ ｌａＡ １ ａＧ １ ｎＡｒｇＴｙｒｓｅ
ｒＰｈｅＶａ Ｉ ＬｅｕＡｓｎＡ １ ａＡｓ ｐＧ
１ ｎＡｓｐＶａ Ｉ Ｇ １ ｙＡｓｎＴｙｒＴｒ
ｐ Ｉ １ ｅＡ ｒｇＡ １ ａＡｓ ｎＰｒｏＡｓ
ｎＰｈｅＧ １ ｙＡｓｎＶａ Ｉ Ｇ １ ｙＰｈｅ
Ａ １ ａＧ １ ｙＧ １ ｙ Ｉ １ ｅＡｓｎＳ
ｅｒＡ １ ａ Ｉ １ ｅＬｅｕＡｒｇＴｙｒＡｓ
ｐＧ ｌ ｙＡ １ ａＡｓ ｐＰｒｏＶａ Ｉ Ｇ
１ ｕＰｒｏＴｈｒＴｈｒＴｈｒＧ １ ｎＴｈｒＴｈ
ｒＰｒｏＴｈｒＬｙｓ ＰｒｏＬｅｕＡｓｎＧ１ｕＶａ
ＩＡｓｐＬｅｕＨｉｓＰｒｏＬｅｕＡ１ａＴｈｒＭｅｔ
八１ａＶａＩＰｒｏＧ１ｙＳｅｒＰｒｏＶａＩＡ１ａＧ
１ｙＧ１ｙＶａｌＡｓｐＴｈ−ｒＡ１ａＩ １ｅＡｓｎ
ＭｅｔＡＩＧ １ ｙＡ １ ａＳｅｒＰｈｅＶａ Ｉ
ＰｒｏＰｒｏＴｈｒＶａＡｓｎＡｌａＧ１ｎＡｓｐＬ
ｅｕＬｅｕＰｒｏｓｅｒＧＩＧ １ ｕ Ｉ １ ｅＳ
ｅｒＰｈｅＰｒｏＡ １ ａＴｈｒＡ １ ａＡ １第
３ 図 （その３）
Claims (5)
- （１）次のアミノ酸配列をコードするＤＮＡからなるフ
ェノールオキシダーゼ遺伝子（II）。 【遺伝子配列があります】 〔式中Ｘは、ＡｌａまたはＰｒｏ〕 - （２）請求項１記載のＤＮＡにハイブリッドするＤＮＡ
配列であって、天然、合成、もしくは半合成によって得
られるものであり、請求項１記載のＤＮＡ配列に対して
、ヌクレオチドの置換、ヌクレオチドの挿入及びヌクレ
オチド配列の逆位その他の変異によって関連づけられて
おり、かつ、フェノールオキシダーゼ活性を有するポリ
ペプチドをコードするＤＮＡからなるフェノールオキシ
ダーゼ遺伝子（II）。 - （３）請求項１乃至２のいずれかの項に記載のフェノー
ルオキシダーゼ遺伝子（II）をベクターＤＮＡに連結し
た組換えＤＮＡ。 - （４）フェノールオキシダーゼ遺伝子（II）が次式（Ｏ
Ｊ−ＰＯＭ５）のＤＮＡを有するものである請求項１記
載のフェノールオキシダーゼ遺伝子（II）。 【遺伝子配列があります】 - （５）フェノールオキシダーゼ遺伝子（II）が次式（Ｏ
Ｊ−ＰＯＭ２）のＤＮＡを有するものである請求項１記
載のフェノールオキシダーゼ遺伝子（II）。 【遺伝子配列があります】
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63175236A JPH0227986A (ja) | 1988-07-15 | 1988-07-15 | フェノールオキシダーゼ遺伝子（２） |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63175236A JPH0227986A (ja) | 1988-07-15 | 1988-07-15 | フェノールオキシダーゼ遺伝子（２） |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0227986A true JPH0227986A (ja) | 1990-01-30 |
Family
ID=15992640
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63175236A Pending JPH0227986A (ja) | 1988-07-15 | 1988-07-15 | フェノールオキシダーゼ遺伝子（２） |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0227986A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6008029A (en) * | 1995-08-25 | 1999-12-28 | Novo Nordisk Biotech Inc. | Purified coprinus laccases and nucleic acids encoding the same |
-
1988
- 1988-07-15 JP JP63175236A patent/JPH0227986A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6008029A (en) * | 1995-08-25 | 1999-12-28 | Novo Nordisk Biotech Inc. | Purified coprinus laccases and nucleic acids encoding the same |
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